DETERMINAZIONE SPETTROFOTOMERTRICA DELLA COSTANTE

DI DISSOCIAZIONE ACIDA DELL’UMBELLIFERONE (ESP: 2)

Obiettivo:
Determinare per via spettrofotometrica la Ka dell’indicatore umbelliferone (7-idrossicumarina)

Principi teorici:
L’umbelliferone è una molecola che in soluzione acquosa è in
equilibrio con la sua base coniugata secondo:
−¿ ¿
+¿+Umb ¿
HUmb ⇌ H
K a =¿ ¿
Umbelliferone in forma associata
(HUmb)
Si calcolano le concentrazioni dell’umbelliferone e della sua
base coniugata a partire dalle misure dell’assorbanza delle loro soluzioni a pH diversi, usando le
lunghezze d’onda λ1=325nm e λ2=365nm che rappresentano rispettivamente il massimo
d’assorbimento per la forma associata (HUmb) e dissociata dell’indicatore (Umb-).
Si utilizza la Legge di Lambert Beer per costruire un sistema che mi permette di ricavare le
concentrazioni:
Metodo 1¿ ¿
In alternativa si può usare una versione modificata del precedente sistema in virtù del fatto che la
somma delle concentrazioni delle due forme dell’umbelliferone è costante e si avrebbe un sistema
del tipo:
Metodo 2 ¿ ¿

Strumentazione:
 Spettrofotometro UV-Vis
 pH-Metro
 Soluzione standard di Umbelliferone 10-3 M
 Soluzioni Tampone a differente pH

Procedura:
Si preparano 9 soluzioni a pH differenti prelevando per ciascuna 2 mL di soluzione tampone
(differenti per caso), 0.5 mL di soluzione standard di Umbelliferone, e si trasferiscono in un
matraccio da 10 mL, portando a volume con acqua distillata. La soluzione più acida viene
preparata con un tampone Fosfato, quella più basica con un tampone ammoniacale, invece quelle
intermedie con tamponi di TRIS a pH diversi. Una volta preparate le soluzioni si misura il pH delle
stesse con l’ausilio di un pH-metro e si registrano tali valori. Successivamente effettuare
l’operazione di baseline dello strumento ponendo in entrambi gli alloggiamenti 2 cuvette
contenenti acqua distillata, lo spettrometro con questa operazione correggerà la linea di base
nell’intervallo di lunghezze d’onda su cui operiamo. Una volta preparato lo strumento si analizzano
le soluzioni riempiendo di volta in volta la cuvetta dell’alloggiamento più vicino all’operatore con la
soluzione da analizzare. Le prime soluzioni da analizzare sono quella più acida e quella più basica
poiché ci permetteranno di ottenere l’assorbività di entrambe le forme dell’indicatore valutando
l’assorbanza a 325nm e a 365nm, questo accade poiché nell’a soluzione acida l’umbelliferone è
presente solo nella sua forma associata (HUmb) mentre nella soluzione basica è presente solo la
forma dissociata (Umb-).

Dati ed Elaborazione:
Assorbanz Assorbanz
pH prova pH effettivo
a (325 nm) a (365 nm)
6 5,86 0,531 0,015
7,1 7,03 0,438 0,121
7,3 7,27 0,444 0,19
7,5 7,27 0,443 0,203
7,7 7,64 0,39 0,343
7,9 7,75 0,358 0,379
8,1 8,01 0,328 0,458
8,9 9,1 0,267 0,681

Il primo passo è quello di trovare la concentrazione totale di umbelliferone presente nelle

soluzioni

C0 V agg 10−3 M ∗5∗10−4 mL −5

C= = −2
=5∗10 M
Vt 10 mL
Si procede calcolando le assorbività molari delle due forme dell’umbelliferone alle due lunghezze
d’onda di lavoro tramite le formule:
Prova a pH=6
Umbelliferone presente solo∈forma associata

{
HUmb
A ( 325 )=ε ( 325 )∗C Assorbivi
HUmb ε Humb ε Umb-
A ( 365 )=ε ( 365 )∗C tà
325 nm 10620 5340
Prova a pH=8.9
365 nm 300 13620
Umbelliferone presente solo∈forma dissociata
¿

Si procede quindi al calcolo dei valori delle concentrazioni con il primo metodo:

METODO 1)
 ¿

pH eff [Umb-] [Humb] log([Humb]/[Umb-])

7,03 8,06488E-06 3,71877E-05 0,663801505
7,27 1,31751E-05 3,51831E-05 0,42658013
7,27 1,41424E-05 3,46026E-05 0,388586317
7,64 2,46477E-05 2,43297E-05 -0,005638722
7,75 2,73875E-05 1,99388E-05 -0,137853125
8,01 3,33157E-05 1,41332E-05 -0,37241012
8,3 3,6548E-05 1,07188E-05 -0,532718792

Una volta ottenuti i valori delle concentrazioni si prosegue con il calcolo della retta di regressione:
[ HUmb]
pH= pK a + log
¿¿

8.4
8.2
f(x) = − 0.918021357255931 x8+ 7.64072398779643
R² = 0.998193355400347
7.8
7.6
7.4
pH

7.2
7
6.8
6.6
6.4
-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8
log([Humb]/[Umb-])

Pendenza Interc
Valore -0,91802 7,640
Errore (S) 0,017466 0,007

student con n=7 e α=0.05 ⇒ t5,0.975=2.57

Il pKa sarà quindi l’intercetta della retta di regressione, si calcola l’intervallo di fiducia con la t di

pK a ± S a∗t α =7.6407 ± 2.57∗0.00727=7.6407 ± 0.0187 pK =7.64 ± 0.02

n−2 ,1− a , met 1
2

Alla stessa maniera si prosegue con il secondo metodo:

METODO 2)
¿
Scelgo il sistema di equazioni con le variabili relative a 365 nm perché la differenza tra le
assorbività molari è maggiore, e ciò permette risultati più precisi.
¿

pH eff [Umb-] [Humb] log([Humb]/[Umb-])

7,03 7,61494E-06 4,23851E-05 0,745546146
7,27 1,36494E-05 3,63506E-05 0,425396916
7,27 1,45833E-05 3,54167E-05 0,385350881
7,64 2,46408E-05 2,53592E-05 0,012480585
7,75 2,7227E-05 2,2773E-05 -0,077579948
8,01 3,29023E-05 1,70977E-05 -0,284288521
8,12 3,59914E-05 1,40086E-05 -0,409803115

8.4
8.2
8
f(x) = − 0.972665599931482 x + 7.69504494499364
R² = 0.989340201511322
7.8
7.6
7.4
pH

7.2
7
6.8
6.6
6.4
-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
log([Humb]/[Umb-])

Pendenza Intercetta
Valore -0,9726656 7,695044945
Errore (S) 0,045152336 0,018223316
pK a ± S a∗t α =7.6 95 0 4 ±2.57∗0.0 182 2=7.6 9 504 ± 0.0 4683 pK =7.6 9 ± 0.0 5
n−2 ,1− a , met 2
2

Infine per confermare che i metodi matematici siano equivalenti si effettua un confronto statistico

pH eff Metodo 1 Metodo 2

7,03 0,663802 0,745546
7,27 0,42658 0,425397
7,27 0,388586 0,385351
7,64 -0,00564 0,012481
7,75 -0,13785 -0,07758
8,01 -0,37241 -0,28429
8,12 -0,53272 -0,4098
 1

0.8

f(x) = 0.9354271482649410.6
x + 0.0563634996980548
R² = 0.991084082082737
0.4

0.2
2

0
-0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8
-0.2

-0.4

-0.6
1

Pendenza Intercetta
Valore 0,935427 0,056363
Errore (S) 0,039678 0,016532
Note le deviazioni standard consideriamo quindi un intervallo di fiducia della nostra retta y=a+bx:
a ± S a∗t α =0.056363+0.016532∗2.57=0.05 ± 0.04
n−2 , 1−
2

b ± S b∗t α =0.935 427 ± 0.039678∗2.57=0.9 ± 0.1

n−2 , 1−
2

Conclusioni:
Dai calcoli risultano quindi 2 valori di pKa dell’umbelliferone:
pK a , met 1=7.64 ± 0.02

pK a , met 2=7.69 ± 0.05

Confrontandoli con il valore vero della pKa riportato dalla letteratura (pKa25°C = 7.7) si nota che solo
nell’intervallo di fiducia relativo al secondo metodo tale valore risulta essere contenuto.
Questo risulta in un errore che si può notare ulteriormente osservando il test tra i due metodi,
ovvero la retta di regressione non contiene il valore 0.0 nell’intervallo di fiducia dell’intercetta. C’è
anche da considerare che i valori ottenuti si discostino leggermente da 7.7 poiché nel corso
dell’esperienza la temperatura dell’ambiente di lavoro non era propriamente 25°C
Osservando la convoluzione dei 9 spettri si può osservare inoltre che il punto isosbestico, ovvero la
lunghezza d’onda alla cui le assorbività molari delle specie risultano uguali, risulta leggermente
difficile da individuare.
Questi errori posso essere attribuiti ad alcune imprecisioni nella preparazione delle soluzioni di
umbelliferone (quindi è probabile che la C concentrazione totale di Umbelliferone non sia stata
uguale e precisa per tutte e 9 le soluzioni).