CROMATOGRAFIA

PRINCIPI GENERALI
I metodi cromatografici sfruttano le diverse affinità delle molecole e degli
ioni nei confronti di due fasi diverse, le sostanze sa separare vengono
trasferite da una fase all’altra e separate da altre sostanze che sono più
solubili nella fase da cui si effettua l’estrazione
Con questi metodi però è impossibile lavorare con micro campioni
Nella cromatografia ci sono due fasi:
-fase stazionaria o fissa
-fase mobile o eluente che viene fatta scorrere in modo continuo sulla
prima realizzando così un’estrazione dinamica
La separazione cromatografica dei componenti viene attribuita alla diversa
affinità delle sostanze nei confronti delle due fasi, più una sostanza è
affine alla fase stazionaria più viene trattenuta rallentandone lo
scorrimento
ESPERIMENTO FONDAMENTALE
1. la fase stazionaria viene inserita in una colonna e immersa nella fase
mobile
2. la miscela da separare viene depositata in testa alla colonna
3. l’eluente trascina con se in modo selettivo i diversi componenti della
miscela
4. si formano così delle bande lungo la colonna
Questo procedimento consente l’eluizione continua delle sostanze lungo la
colonna e anche il loro recupero dalle frazioni diluite
Dinamica elementare
Durante l’eluizione, in ogni punto della colonna la sostanza è coinvolta in
un processo dinamico di trasferimento tra le due fasi: fase fissa fase
mobile
Ogni componente della miscela tende a distribuirsi fra le due fasi
passando attraverso una serie infinita di stati di equilibrio che si realizzano
in ogni strato di spessore infinitamente piccolo della colonna
Il tempo di eluizione in un esperimento cromatografico dipende dal tempo
che ogni sostanza trascorre nella fase stazionaria, mentre il tempo
trascorso nella fase mobile è lo stesso per tutti i componenti della miscela
Meccanismi chimico-fisici della separazione
Le interazioni che si verificano tra la sostanza e le due fasi non sono
sempre descrivibili in modo completo, ma si tratta di interazioni deboli
Oltre al meccanismo principale, basato su un solo tipo di interazione fra la
sostanza da separare e le due fasi, ci sono anche dei meccanismi
secondari:
~ Adsorbimento: la fase stazionaria è un solido in polvere, sulla
superficie di essa si trovano dei siti attivi che stabiliscono legami
deboli con le molecole. A seconda della fase mobile si hanno diversi
 tipi di cromatografia di adsorbimento:
-cromatografia gas-solido (GSC)
-cromatografia liquido-solido (LSC)
-cromatografia di interazione idrofobica (HIC)
~ Ripartizione: la fase stazionaria è un liquido che impregna un solido
granulare inerte in cui le sostanze da separare si solubilizzano. Durante
l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente, questo
meccanismo viene sfruttato in:
-cromatografia gas-liquido (GLC)
-cromatografia liquido-liquido (LLC)
~ Scambio ionico: la fase stazionaria è costituita da macromolecole con
siti attivi ionizzati, su questo meccanismo si basa la cromatografia di
scambio ionico (IEC)
~ Esclusione: la fase stazionaria è un solido poroso o un gel con pori, le
molecole dell’analita penetrano nei pori rimanendovi per un certo
tempo, le molecole più grandi vengono escluse dai pori e pertanto
escono dalla colonna in tempi più brevi. Da qui è basata la
cromatografia di esclusione (SEC)
~ Affinità: vengono usate reazioni di tipo biochimiche, reversibili e
molto specifiche, da qui deriva la cromatografia di affinità
Tecniche cromatografiche
La cromatografia può essere di vari tipi e tutte servono per separare i
componenti di una miscela in base alle loro affinità per due fasi una
stazionaria e l’altra mobile
Planare
caratterizzata dal fatto che la fase stazionaria è distribuita su una
superficie piana, le principali sono la TLC e la PC
la TLC serve per separare i componenti di una miscela omogenea
utilizzando una lastrina di vetro (che serve da supporto) su cui c’è il gel di
silice che viene chiamato fase stazionaria. La lastrina viene inseminata dal
campione e poi si mette all’interno dell’eluente, ovvero la fase mobile.
Nel momento in cui l’eluente incomincia a salire sulla lastrina per
capillarità i componenti della miscela possono avere una maggiore o
minore affinità con esso. Quelli più affini per l’eluente andranno verso
l’alto mentre quelli più affini al gel di silice tendono a rimanere piu in
basso
la PC la fase stazionaria è costituita da un foglio di carta apposita
Su colonna
la fase stazionaria è contenuta all’interno di una colonna che funge da
supporto e può essere di vetro o di metallo, mentre la fase mobile, un
fluido, viene iniettata attraverso la colonna con vari sistemi
Questa tecnica è stata inventa a fine 800 da Tswett per separare i pigmenti
delle foglie, aveva preso un tubo, macinato finemente delle conchiglie con
le quali aveva riempito la colonna
le cromatografie su colonne possono essere divise in base alla:
1. Velocità in cui si effettua la separazione (classica, HPLC, LC, UFC)
2. Natura delle fasi (la fase stazionaria può essere solida o liquida e la
fase mobile può essere un liquido o un gas
Gascromatografia
una colonna viene riempita in modo compatto dalla fase stazionaria, la
fase mobile è costituita da un gas sotto pressione che trascina con se il
campione
In fase supercritica o a fluido supercritico
la fase mobile è costituita da un fluido portato appena al di sopra del punto
critico, per tanto esso non può essere liquefatto per compressione e le sue
caratteristiche sono intermedie tra quelle dei gas e quelle dei liquidi
CROMATOGRAMMA

è un diagramma in cui è presente sull’asse delle x il tempo, e su quello

delle y viene registrato il segnale del rivelatore, esso descrive l’andamento
del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente a
partire dall’istante in cui la miscela viene introdotta nella colonna.
Ogni sostanza quando esce dalla colonna genera un picco, le due
grandezze principali di esso sono:
-l’altezza che va dalla linea di base e il massimo del picco
-l’ampiezza è la larghezza del picco (curva) che viene calcolata tramite la
tangente al punto di flesso, quindi si fa la concavità con la derivata 2, le
tangenti incrociano le linee di base e vanno a determinare la larghezza del
picco
idealmente il picco è una Gaussiana in cui è possibile determinare i punti
di flesso, quindi dove la funzione cambia segno. Queste grandezze
possono essere ricavate dal cromatogramma stesso
Il tempo di ritenzione (t ) è il tempo impiegato da ciascuna sostanza per
R

scorrere attraverso la colonna, per si traccia una retta a partire dal

massimo del picco fino all’asse x, ogni composto ha un suo tempo di
ritenzione
In alternativa viene misurato il volume di ritenzione; entrambi sono
importanti per l’analisi qualitativa perché danno indicazione sul grado di
affinità della sostanza nei confronti della fase stazionaria
Se c’è una sostanza che non ha nessuna affinità per la fase stazionaria, il
suo tempo impiegato a uscire dalla colonna viene chiamato tempo morto.
Per tanto il tempo morto è il tempo necessario alla sostanza che non viene
trattenuta per uscire dalla colonna. Il tempo di ritenzione (t ) corretto
1
R
sarebbe Tr-Tm
Dall’ampiezza e dall’altezza del picco si può calcolare l’area che è
direttamente proporzionale alla concentrazione della miscela.
Quindi il tempo di ritenzione e l’area del picco sono i due parametri che
vengono usati nelle analisi, il primo serve per identificare la sostanza
(analisi qualitativa), il secondo serve per l’analisi quantitativa
I rivelatori possono essere di vario tipo a seconda del tipo di sostanza da
determinare
PARAMETRI
Servono per fare una riflessione sul cromatogramma e si dividono in:
∗ Costante di distribuzione tra le fasi: la sostanza che si vuole separare ha
diversa concentrazione nella fase mobile e nella fase stazionaria, a
seconda dell’affinità sarà più o meno distribuita tra le due fasi. Tra le
due fasi si instaura un equilibrio di conseguenza si può calcolare la
costante di equilibrio
à
Questa costante si chiama coefficiente di distribuzione, se è maggiore
di 1 è più presente nella fase stazionaria, se è minore è più presente
nella fase mobile.
In conclusione si chiama così perché ci dice come la sostanza è
distribuita tra le due fasi, è importante conoscere il suo valore perché
permette di capire quale sostanza è più affine alle fasi

∗ Selettività: capacità della colonna di separare le due sostanze e di

fornire picchi ben distanziati. Dipende dalla temperatura e delle
interazioni tra la sostanza e la fase stazionaria

∗ Efficienza: capacità della colonna di eluire una singola sostanza con un

picco molto stretto, quindi quando la sostanza scende nella colonna
rimane compatta e quindi esce tutta insieme

L’efficienza della colonna cromatografica viene riportata in termini di

piatti teorici (N), cioè possiamo immaginarci che dentro una colonna
ci siano dei piatti e quella che ne contiene di più. Però per poter
confrontare le colonne si utilizza l’altezza dei piatti teorici (h) che si
calcola facendo la lunghezza della colonna diviso il numero di piatti
teorici. Per calcolare l’altezza c’è un’equazione che prende il nome di
Van Deemter e mette in relazione le caratteristiche della fase
 stazionaria con la velocità fi flusso
∗ Risoluzione: tiene conto dei due parametri sopra e se due picchi sono
risolti vuol dire che sono ben separati tra di loro. Questo parametro
può essere calcolato e se il valore trovato è superiore a 0,8 si ha una
buona risoluzione
L’esame di questi parametri è fondamentale per la scelta delle colonne

GAS CROMATOGRAFIA
In questa tecnica la fase mobile è un gas (detto carrier) che fluisce
attraverso una colonna in cui è posta la fase stazionaria. Un rivelatore
fornisce il gascromatogramma in cui la quantità di sostanza eluita si trova
in funzione del tempo impiegato a percorrere la colonna
La gas cromatografia viene divisa in cromatografia gas solido (GSC) e
cromatografia gas liquido (GLC), e la sua unica limitazione consiste nella
necessità di rendere volatili i campioni da analizzare
Schema a blocchi

Gas
C’è una bombola sottopressione che contiene il gas, sulla quale vengono
montati:
-manometro, permette la lettura della pressione interna
-riduttore di pressione, permette di regolare la pressione
Il gas (azoto o idrogeno) deve essere inerte, non reagire, ha la funzione di
trascinare i componenti della miscela in analisi lungo la colonna
cromatografica e di alimentare la fiamma del detector del FID
Iniettore
Assicura l’istantanea vaporizzazione del campione ed è il luogo in cui
viene iniettato il campione mediante una microsiringa, che va sempre
avvinata per essere sicuri che ci sia la soluzione da iniettare, poi si aspira
anche un po’ d’aria e infine si inietta nel forellino dell’iniettore. Sotto di
esso c’è un setto poroso per far in modo che non fuoriescano i gas o il
liquido. L’ago deve essere a fetta di salame ovvero che all’estremità non
deve essere piatto ma tagliato obliquamente.
L’iniettore split splittless serve per iniettare quantità molto piccole di
campione e ha un volume molto preciso che permette l’iniezione precisa
Colonna
Luogo in cui avviene la separazione: a seconda dell’affinità i componenti
di un miscuglio vengono trattenuti uscendo in tempi diversi. Appena esce
un composto organico diverso, il segnale del composto cambia e quindi si
nota un picco grazie al quale si possono mettere in relazione i tempi di
ritenzione
La colonna può essere di due tipi:
 ∗ Impaccata: ha un diametro maggiore, ma una lunghezza minore fino a
4m, viene riempita con la fase stazionaria. Il cromatogramma
∗ Capillare: ha un diametro minore e una lunghezza maggiore fino ai
100m, la fase stazionaria è posizionata solamente sulle pareti della
colonna e il gas di trasporto corrono più facilmente all’interno. La
quantità di campione da iniettare è piccola e viene eluita prima. Il
cromatogramma
le colonne vengono messe in una camera termostatica che scalda, e regola
la temperatura a seconda di come si opera con lo strumento:
-programmata: la temperatura viene fatta variare
-isoterma: la temperatura è costante
Rivelatori o detector
Possono essere di vario tipo a seconda delle sostanze che si vuole
separare, si distinguono in:
-universali: vanno bene per tutte le sostante
-selettivi: specifico, sono più sensibili
oppure possono essere:
-distruttivi: il campione non può essere riutilizzato
-non distruttivi
I principali rivelatori sono a ionizzazione di fiamma (FID) a cattura di
elettroni (ECD) a termoconducibilità (HWD)
Rivelatore a cattura di elettroni (ECD)
Si tratta di un rivelatore selettivo, specifico per le sostanze che
contengono alogeni e data la sua selettività riesce a determinare
concentrazioni minime nelle sostanze
Ha una sorgente di nichel 63 che emette radiazioni beta, nella sostanza c’è
un elemento elettron-attrattore che cattura gli elettroni primari emanati
dalla sorgente radioattiva con la formazione di elettroni secondari e ioni
positivi (corrente di fondo)
Gli elettroni primari sono quelli prodotti dalla sorgente, mentre quelli
secondari vengono prodotti dagli elettroni primari
Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID)
Questo è un rilevatore universale e distruttivo a causa della presenza di
una fiamma alimentata con dei gas che sotto ha un elettrodo caricato
negativamente mentre sopra uno carico positivamente
La fiamma fornisce energia alle sostanze che vengono bruciate
provocando la ionizzazione, gli elettroni si staccano, vanno verso il basso
e si crea una corrente elettrica. Questo è il segnale che esce e sul
cromatogramma viene identificata come linea di base, quando esce
un’altra sostanza la produzione di ioni aumenta e aumenta anche la
corrente all’interno del rivelatore
Rivelatore a termoconducibilità (HWD)
Anch’esso è un rivelatore universale, ma meno usato, è basato su due
sensori contenenti un filamento la cui resistenza elettrica varia al variare
della temperatura
N.B. Anche l’iniettore e il detector vengono riscaldati a T>50°C rispetto a
quella della colonna per evitare che ci sia un ristagno del liquido da
analizzare
FASE MOBILE
∗ è un gas
∗ deve avere un’elevata inerzia chimica e quindi non deve reagire
∗ non deve essere segnalato dal rivelatore
∗ deve avere un elevato grado di purezza
FASE STAZIONARIA
∗ può essere solida (silice, allumina, carbone attivo) o liquida che viene
supportato da materiale solido tramite una reazione chimica
∗ il liquido di ripartizione deve possedere bassa tensione di vapore ed
elevata stabilità termica, ovvero che non cambia la sua composizione
chimica
∗ le particelle devono essere di dimensioni regolari
CAMPIONI
Devono essere in fase gassosa oppure devono essere portati in quella fase
senza subire modifiche che cambino le loro caratteristiche. Per tanto è
necessario fare alcuni trattamenti al campione per renderlo un gas, i
principali sono:
Derivatizzazione
Questo metodo consiste nell’ l’utilizzo di reagenti specifici per far
avvenire una reazione che elimina i gruppi OH, NH, COOH per
trasformarli in un sale per ottenere delle sostanze che possono essere
passate allo stato gassoso. Viene fatta su sostanze molto altobollenti,
ovvero che per passare allo stato gassoso necessitano di temperature molto
elevate con il rischio di decomposizione
Gas cromatografia dello spazio di testa (HSGC)
Si usa nel caso di matrici solidi che contengono gas volatili. Ci sono dei
contenitori/fialette chiamati vial, chiusi con un tappo ermetico, se nel
composto sono presenti componenti volatili andranno a occupare il
restante spazio
Se una sostanza è molto volatile ha una tensione di vapore elevata,
viceversa se è poco volatile ne ha una bassa; la tensione di vapore è la
pressione esercitata dal gas su una superficie del suo liquido all’equilibrio
Con una miscela ricca del componente volatile si fa penetrare la siringa e
si preleva solo la miscela gassosa introducendola nel gascromatografo
Questa analisi viene sfruttata per analizzare matrici solide che contengono
sostanze volatili, ad esempio con gli idrocarburi si preleva un campione
che viene messo nella vial e poi si preleva con la siringa per vedere se
effettivamente ci sono dei contaminanti
N.B bisogna avere sempre le stesse condizioni di temperatura, per questo
le vial vanno termostatate
PRATICA
Parametro analisi qualitativaàtempo di ritenzione
Parametro analisi quantitativaàarea del picco
A seconda delle sostanze che bisogna determinare va scelta una colonna
adatta, e cambia l’interazione con la fase stazionaria e il numero di piatti
teorici (efficienza). Bisogna inoltre sapere a che temperature operare, il
rivelatore, carrier (pressione)