INTRODUZIONE

Da molti secoli, i microrganismi probiotici sono stati utilizzati in modo

empirica, nella produzione di alimenti come ad esempio diversi prodotti lattiero-caseari e
vegetali fermentati (Chukeatirote. 2003). Questi alimenti apportano caratteristiche
organolettiche, in base alla presenza di determinati microorganismi.

Negli ultimi anni si è dimostrato un interesse specifico per questi microorganismi

poiché il suo utilizzo può migliorare la salute e prevenire malattie (Felleyet al.,
2001; Reid, 2008).

Anticamente gli alimenti venivano conservati attraverso un processo di essiccazione o di

fermentazione naturale tra gli altri. Gli uomini hanno imparato a produrre la gran parte di
alimenti fermentati, come birra, vino, olive, ecc. (Rodríguez 2009).

L'acido lattico è un prodotto della fermentazione fornita dai batteri del genere
Lactobacillus è di ampio uso nell'industria grazie alle sue caratteristiche benefiche,
utilizzandolo così nell'industria alimentare (nelle bevande e come conservante), in
farmacia, medicina, tessitura, nell'industria della pelle e per la produzione di plastiche
biodegradabili (Estela et al., 2007).

In questa esperienza di laboratorio conosceremo metodologie per l'isolamento, la

selezione e caratterizzazione di specie di batteri dell'acido lattico (genere
Lactobacillus), così come il fondamento dei test biochimici che ci permetteranno di
differenziazione batterica.
Batteri dell'acido lattico - Genere Lactobacillus: Isolamento, selezione e
caratterizzazione.

OBIETTIVI

Obiettivo generale:

Aislar, selezionare e caratterizzare, mediante prove biochimiche, batteri del genere

Lactobacillus.

Obiettivi specifici:

Aislar batteri provenienti da campioni di alimenti e bevande ottenuti da

fermentazione spontanea e commerciale.
Descrivere e identificare le caratteristiche culturali delle colonie batteriche
aumento.
Differenziare e caratterizzare i batteri lattici mediante prove biochimiche.

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Batteri dell'acido lattico - Genere Lactobacillus: Isolamento, selezione e
caratterizzazione.

PROCEDIMENTO

Aislamiento primario

Procedura a partire da campioni di alimento:

La campione biologico erano una salsiccia huachana, chicha di jora artigianale e

tocosh; tutti questi campioni sono stati ottenuti da luoghi in cui erano manipolati senza
condizioni di sterilità.
Da ciascuno dei campioni è stata prelevata circa 1 g che è stata triturata e si
omogeneizzo in 9 mL di soluzione salina, ottenendo una diluizione 1/10, poi si
furono effettuate diluizioni successive fino alla diluizione 1/1000.
Con l'aiuto di una pipetta sono stati inoculati 0,1 ml della diluizione 1/1000 in Agar Man
Rogosa Sharpe e Agar LAPTg e fu seminato per disseminazione con una spatola di
Drigalsky.
Sono state incubate a 30 ºC per 48 ore in condizioni di microaerofilia.
2) Diagnosi presuntiva:
Si sono osservate le colonie e sono state descritte le caratteristiche culturali di ognuna.
Sono state scelte colonie che presentavano una crescita simile a quella che, secondo teoria, si
conoscevo i batteri lattici (selezione di colonie tipiche).
È stata eseguita una colorazione di Gram su ognuna delle colonie scelte.
Si realizza il test della catalasi mettendo un po' di inoculo su un vetrino con una
goccia di perossido di idrogeno.
Si sono seminati i colonie tipiche in brodo MRS e sono state incubate a 30ºC per 24 ore.
Si prelevò un inoculo della crescita in brodo e si seminò nella batteria biochimica
preparata per la caratterizzazione delle colonie isolate.
3) Selezione di colonie tipiche:
Sono state selezionate due colonie tipiche di Lactobacillus da ciascun campione e si
sembraron in caldo MRS e si incubarono per 24 ore a 30ºC.
4) Prove differenziali
Ottenere i coltivazioni in brodo dei ceppi tipici in fase esponenziale.
Lavare le cellule batteriche con soluzione salina sterile (0,85%) due volte. La
La centrifugazione sarà effettuata a 3500 rpm per 10 minuti.
A partire dal pacchetto cellulare, preparare la sospensione batterica (D.O.: 0.6 a 560 nm).
Aggiungere a 5mL di mezzo di fermentazione dei carboidrati e al mezzo Gluconato di
Potassio, 300uL (0.3mL) della sospensione cellulare. In quest'ultimo mezzo di coltura,
aggiungere VASPAR (2mL) per creare condizioni anaerobiche e osservare la produzione
di gas.
Incubare a 30ºC per 24-96 ore.
Eseguire la lettura e verificare il profilo biochimico secondo le tabelle di
differenziazione biochimica del manuale di Berguey.

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caratterizzazione.

RISULTATI

Caratteristiche culturali delle colonie di batteri lattici:

MOSTRA DI SALSICCIA HUACHANA:

In agar Man Rogosa Sharpe: Colonies translucide (chiare), circolari, a forma di

rocío, bordo intero, lisce, opache e elevate. (fig.1)

In agar LAPTg: Colonies circolari, traslucide/chiare, a forma di rugiada, bordo intero,

lisas, cremosi e elevato. (fig.2)

MISCELA DI TOCOSH

In agar Man Rogosa Sharpe: Non ci sono state colonie di alcun tipo. (fig. 3)

In agar LAPTg: Non c'è stata crescita di batteri lattici. (fig.4)

MOSTRA DI CHICHA DI JORA

In agar Man Rogosa Sharpe: Colonies traslucide (chiare), circolari, a forma di

rocío, bordo intero, lisce, opache e elevate. (fig.5)

In agar LAPTg: Colonies circolari, traslucide/chiare, a forma di rugiada, bordo intero,

lisas, cremosi e elevate. (fig.6)

Nei mezzi di coltura provenienti dai campioni di Chicha de Jora e salsiccia

huachana, oltre ai batteri lattici, sono cresciuti lieviti: le caratteristiche
le colture di lieviti sono: colonie circolari di 1-2 mm di diametro di colore
crema, convessa, mucosa, opaca e odore rancido.

Diagnosi presuntiva:

Delle lastre con mezzi di coltivazione.

Agar MRS Agar LAPTg

Grammo Bacilli fini + Bacilli fini + Salsiccia
catalasi - - huachana
Gram Bacilli + Bacilli + Chicha di
catalasi - - jora

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caratterizzazione.

Crescita in brodo MRS:

Il brodo è diventato torbido, il che ci indicava che c'era stata una crescita di batteri.
sembradas.

Diagnosi differenziale:

Messe sperimentali

Fonti Medio di fermentazione dei carboidrati Mezzo di fermentazione dei carboidrati

carbonadas (aerobiosi) (anaerobiosi)
fruttosio + +
glucosio + +
Lattosio + +
ino + +

Mentre campioni:

Mostra 1 Mostra 2 Mostra 3

Medio di fermentazione Mezzo di fermentazione Mezzo di fermentazione
Fonti
di carboidrati di carboidrati di carboidrati
carbonadas
(condizioni aerobiche) (condizioni aerobiche) (condizioni aerobiche)
Galattosio + + +
Maltosio + + +
Lattosio + + +
Rafinosa + + +
Ribosa + - +
Saccarosio + + +
Arabinosa + - +
Glucosio + + +
Amigdalina - - -
Manitolo - - +

Medio Gluconato
Senza gas Senza gas Con gas
di Potassio

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caratterizzazione.

DISCUZIONE

Le caratteristiche dei mezzi di coltura in cui è stato effettuato l'isolamento primario

inibiva la crescita della maggior parte dei microrganismi poiché l'Agar MRS e il
LAPTg sono mezzi con un pH acido (6.5) e hanno componenti come il monoleato di
sorbitano, magnesio, manganese e acetato, che possono inibire lo sviluppo di alcuni
microorganismi e il citrato di ammonio che agisce come agente inibitore della crescita
dei batteri Gram-negativi. È così che la maggior parte dei microrganismi
gli accompagnatori rimangono inibiti lasciando crescere solo i batteri lattici e le
lieviti (che sopportano il pH del mezzo di coltura). Ma non tutti i microrganismi
sono inibiti, è per questo che nella piastra con il campione di Tocosh sono cresciute tre colonie
che non erano né batteri lattici né lieviti.

Nelle piastre seminate con campioni di Chicha di jora e salsiccia huachana ci sono state
crescita massiccia delle colonie, tra cui quelle che erano più notevoli per le dimensioni e la
l'abbondanza era quella dei lieviti, ma nonostante ciò, ci fu una crescita regolare di
colonies tipiche del genere Lactobacillus. Poi è stata verificata mediante l'identificazione
presuntiva per prove di catalasi e colorazione di Gram.

Delle piastre seminate con campioni di Tocosh solo una ha mostrato crescita di
batteri, ma questi erano diversi dai Lactobacilli e lieviti; questo a causa del carico
la batterica era povera perché il campione non era omogeneo al momento della raccolta
inoculo. Un'altra causa può essere dovuta al fatto che la spatola di Drigalsky sterile si è contaminata al

momento di togliere l'involucro e non lo infiammiamo con l'accendino perché si supponeva che
era sterile, il che favorì l'emergere delle tre colonie contaminanti.

La lettura dei nostri risultati nei mezzi per i test biochimici è stata errata
poiché l'indicatore del pH non reagiva adeguatamente, per questo motivo si
hanno utilizzato campioni di riferimento che ci permettano di differenziare l'attività dei batteri del

genereLactobacillus di fronte a diversi zuccheri.

L'indicatore di pH utilizzato è stato il purpureo di bromcresolo, il quale in basicità e in

Lo stato normale è viola/morato e in acido è giallo. L'acidità significa che quella
I batteri sono stati in grado di metabolizzare il carboidrato e produrre acido lattico.

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caratterizzazione.

Con questi risultati e confrontando con le tabelle di differenziazione delle specie del
generoLactobacillussecondo il metabolismo degli zuccheri siamo giunti alla conclusione di
che il campione di riferimento 1 può corrispondere a Lactobacillus fermentum.

BIBLIOGRAFIA

Libri

1. Madigan, M et al. 2009. Brock Biologia dei microrganismi. Pearson educazione,

S.A. 12ª edizione. Madrid, Spagna. Pp 492-493.
2. Koneman, E. et al. 2006. Diagnostico microbiologico testo atlas a colori. Editoriale
Médica Panamericana S.A. 6ª edizione. Argentina. Pp 593-630.

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2014]

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Articoli

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Complutense di Madrid. Dipartimento di Nutrizione e Bromatologia III (Igiene e
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6. Rodríguez M. 2009. Aislamiento e selezione di ceppi del genere Lactobacillus con
capacità probiotica e immunomodulatrice. Facoltà di bioscienze, Dipartimento di
genetica e microbiologia. Università autonoma di Barcellona. Tesi di dottorato.

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7. Ortiz M.2006. Identificazione biochimica di batteri lattici isolati da

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acido lattico da Lactobacillus plantarum L10 in colture batch e continue.

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