GLI ORGANISMI E

LE BIOTECNOLOGIE
Lorenzo Grasso VBS
 I VIRUS

I virus sono parassiti intracellulari obbligati incapaci di riprodursi al di

fuori di una cellula.
Quando un virus incontra una cellula adatta, le aderisce e
introduce all’interno il proprio genoma, con il quale prende il
controllo della cellula ospite.
 I VIRUS

Un virus è formato da un capside

proteico dentro al quale è
contenuta una molecola di
materiale genetico (DNA o RNA)
che può essere a singolo o doppio
filamento. Questo non basta a
renderlo una vera e propria forma
di vita, poiché non può riprodursi
autonomamente.
 I VIRUS

Dopo aver infettato una cellula, i virus possono avere diversi cicli
vitali.

Nel ciclo litico, la cellula infettata è usata immediatamente per

replicare le particelle virali, ma il DNA non viene mai integrato nel
genoma batterico.

Nel ciclo lisogeno, l’acido nucleico virale si integra nel genoma

dell’ospite, dove può rimanere quiescente anche per molto
tempo per poi riattivarsi a seguito di precisi segnali molecolari.
CICLO LITICO E LISOGENO
 I VIRUS
I virus a DNA degli animali compiono un ciclo litico simile a quello
dei fagi con eccezione che nell’ospite non entra solo l’acido
nucleico ma l’intero virus.

I virus a RNA possono comportarsi come il virus dell’influenza, in cui

RNA è trascritto in mRNA e poi tradotto in proteine, oppure come i
retrovirus che contengono l’enzima trascrittasi inversa, il quale gli
permette il passaggio inverso da RNA a DNA, usando un filamento
di RNA come stampo per sintetizzarlo.
 LA RIPRODUZIONE DEI BATTERI
I batteri si riproducono per scissione batterica, che permette loro di
moltiplicarsi in modo esponenziale(riproduzione asessuata che da vita
a colonie). Esiste però anche una sorta di riproduzione sessuata, simile
al crossing over negli eucarioti.

•trasformazione, un batterio incorpora DNA presente nel terreno di

coltura;
•trasduzione, un batteriofago trasporta materiale genetico da una
cellula batterica all’altra
•coniugazione, trasferimento diretto di DNA da un batterio all’altro;
 LA TRASFORMAZIONE
Nel 1928 il medico Frederick Griffith stava studiando il batterio
responsabile della polmonite e scoprì che ne esistevano due ceppi
diversi. Il ceppo S, virulento, che dava origine a colonie con superficie
liscia, ed il ceppo R, non virulento, che dava origine a colonie con
superficie ruvida. La virulenza era dovuta al fatto che il ceppo S
possiede una capsula protettiva che li proteggeva dal sistema
immunitario della cellula ospite, che manca nel ceppo R.
 LA TRASFORMAZIONE
Griffith eseguì diversi esperimenti utilizzando topi da laboratorio, i risultati
sono:
1. Inoculando il ceppo S, i topi morivano di polmonite
2. Inoculando il ceppo R, i topi sopravvivevano
3. Inoculando un miscuglio di S uccisi col calore e R vivi, i topi morivano

Ciò che Griffith aveva osservato

era il fenomeno della
trasformazione batterica, per cui,
quando un batterio muore, parti
del suo DNA possono essere
rilasciate all’esterno ed
incorporate da altri batteri.

Egli trovò infatti batteri del

ceppo R che possedevano una
capsula protettiva, diede a
questo fenomeno il nome di
fattore trasformante.
 L’ESPERIMENTO DI HARSEY E CHASE

fago T2 E. coli

Il risultato dell’esperimento di Hershey e Chase indicava che anche nei

batteriofagi il materiale ereditario (il principio trasformante) fosse il DNA
e non le proteine. Il messaggio genetico è veicolato dal DNA, che è
proprio il fattore trasformante.
 LA TRASDUZIONE
Un altro meccanismo di ricombinazione genica nei batteri è la
trasduzione, cioè il trasferimento di un frammento di DNA batterico
effettuato per mezzo dei fari, durante il ciclo riproduttivo virale.

I fagi litici effettuano la trasduzione generalizzata, nella quale un

frammento qualsiasi del cromosoma di un batterio infettato può essere
trasferito in un altro batterio, permette di trasferire qualsiasi gene.

I fagi lisogeni, effettuano la trasduzione specializzata, in cui viene trasferito

un frammento particolare del cromosoma batterico, cioè quello vicino al
punto di inserzione del genoma fagico, permette quindi di trasferire solo
geni specifici.
 LA CONIUGAZIONE
Anche i batteri, possono svolgere una sorta di riproduzione sessuata,
chiamata coniugazione, che avviene attraverso ponti citoplasmatici
che uniscono due batteri. La coniugazione generalmente dipende da
un plasmide chiamato fattore di fertilità o fattore F che è presente nelle
cellule donatrici (F +) ma non nelle cellule riceventi (F −).
Nel plasmide sono presenti
geni per la congiunzione tra
qui quelli che sintetizzano il
pilo sessuale, che
stabiliscono dei contatti con
le cellule recipienti
riconoscendo dei recettori
specifici presenti in
superficie, permettendo il
passaggio di un filamento
del fattore F.
 LA CONIUGAZIONE
Se il fattore F è presente nel cromosoma batterico, può essere
trasferito assieme ad esso, poichè il cromosoma verrà aperto proprio
in sua prossimità e lo porterà in coda, il passaggio al nuovo batterio
del fattore F dipenderà però da quanto tempo il ponte citoplasmatico
permarrà, dovesse chiudersi anticipatamente e trasferirsi soltanto
 I PLASMIDI
I batteri contengono un solo cromosoma, formato da una molecola
di DNA circolare a doppio filamento.
Sono presenti anche piccole molecole circolari di DNA a doppio
filamento, chiamate plasmidi.

Sia nel cromosoma sia nei plasmidi la replicazione parte da un solo

punto di origine (sito ori).
 I PLASMIDI
Gli studi effettuati hanno rivelato che possono contenere vari tipi di
informazioni genetiche, pertanto, determinano l’acquisizione di
particolari caratteristiche quando vengono trasferiti.

[Link] F, sono i fattori di fertilità, regolano la capacità di produrre

tubi di coniugazione
[Link] metabolici, permettono il trasferimento di capacità
metaboliche
[Link] R, portano i fattori di resistenza come per gli antibiotici
 I PLASMIDI
L’uso di antibiotici per curare sia patologie umane che animali, ha
determinato l’insorgenza di batteri super resistenti, poiché il contatto
con l’antibiotico agisce da fattore selettivo nero confronti dei
batteri a esso resistenti, resistenza che viene passata da un batterio
all’altro.
 LA STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

Il DNA è un polinucleotide,
cioè un polimero di
nucleotidi, ognuno formato
da tre parti:

1. Uno zucchero C5 detto

desossiribosio; lo zucchero
del DNA è il 2-deossiribosio
(2-deossi significa che sul
carbonio 2 manca l’atomo
di ossigeno).

2. Un gruppo fosfato;

3. Una base azotata.

 LA STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

Esistono quattro diversi tipi di basi

azotate.

L’adenina (A) e la guanina (G)

sono caratterizzate da un doppio
anello e sono chiamate purine.

La timina (T) e la citosina (C) sono

caratterizzate da un anello singolo
e sono chiamate pirimidine.
 LA STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

L’RNA differisce dal DNA per il tipo di zucchero C5 che contiene, il ribosio,
e perché al posto della base azotata timina contiene un’altra pirimidina,
l’uracile (U).
 LA STRUTTURA DEL DNA

Il DNA ha la forma di una doppia elica di nucleotidi in cui la base

Adenina (A) è sempre accoppiata alla base Timina (T), e la base
Citosina (C) con la base Guanina (G). Legati tra loro mediante legami ad
idrogeno. Due legami legano Adenina e Timina, mentre tre legami
legano Guanina e Citosina.
 LA STRUTTURA DEL DNA
La doppia elica consiste di due filamenti
appaiati di DNA che formano una lunga
scala a chiocciola i cui gradini sono le
quattro basi A, G, C e T.
Le forze attrattive che tengono appaiati i
due filamenti sono prevalentemente legami
a idrogeno tra le basi azotate dei due rami.
L’RNA è invece costituito da un singolo 3’ 5’

filamento.

5’ 3’
 LA DUPLICAZIONE DEL DNA
La duplicazione del DNA è
semiconservativa e coinvolge una
dozzina di enzimi che formano il
complesso di duplicazione.
Il processo è suddiviso in due fasi
principali:
1. Divisione della doppia elica: la
doppia elica si despiralizza e la
molecola si apre come una cerniera
lampo via via che i due filamenti si
separano.
2. Sintesi dei nuovi filamenti: ciascuno
dei due filamenti funziona come uno
stampo per la produzione di un
nuovo filamento complementare.
 LA DUPLICAZIONE DEL DNA
La duplicazione del DNA si può suddividere in tre stadi:

1. srotolamento e apertura dei filamenti;

2. appaiamento delle basi complementari;

3. unione dei due nuovi filamenti.

Gli stadi 2 e 3 sono assistiti da un complesso enzimatico chiamato DNA

polimerasi.
 LA DUPLICAZIONE DEL DNA

La DNA polimerasi può unire nucleotidi

solo all’estremità 3’ del filamento in
formazione.
Essa non è in grado di iniziare dal nulla
la sintesi di una nuova catena di
nucleotidi, ma ha bisogno di un
frammento di partenza chiamato primer
a cui possa aggiungere nucleotidi.

I telomeri sono speciali sequenze di

nucleotidi, che non codificano alcuna
proteina.
 LA DUPLICAZIONE DEL DNA
Il filamento guida viene duplicato a partire dal primer verso la forcella di
duplicazione, mentre l’altro filamento deve essere copiato nella direzione
opposta. Quindi, man mano che il DNA originale si srotola, la
duplicazione viene avviata molte volte e procede per piccoli segmenti: il
filamento sintetizzato viene detto filamento in ritardo.
 LA SINTESI PROTEICA

Il linguaggio dei geni è scritto i nsequenza di basi azotate lungo la catena

di DNA.
Una proteina è invece una lunga catena di amminoacidi.

Le cellule passano dal linguaggio del DNA a quello delle proteine

attraverso l’acido ribonucleico o RNA, che si presenta sotto forma di
singola catena di nucleotidi e contiene lo zucchero ribosio e la base
azotata uracile al posto della timina.

Esistono tre diversi tipi di RNA, ognuno con funzioni specifiche:

mRNA (messaggero), tRNA (di trasporto) e rRNA (ribosomiale).
L’rRNA con alcune proteine forma i ribosomi, dove si ha la sintesi proteica.
L’mRNA si forma a partire da una sequenza stampo di DNA durante la
trascrizione; si sposta poi nel citoplasma per dirigere la sintesi proteica.
Il tRNA permette di passare dagli acidi nucleici agli amminoacidi durante
la traduzione.
 LA SINTESI PROTEICA
La trascrizione ha lo scopo di copiare o «trascrivere» il messaggio
contenuto nel DNA in una molecola complementare.
L’RNA è indispensabile nel processo di trascrizione.

Le molecole di RNA messaggero sono copie (o trascritti) di sequenze di

nucleotidi presenti nel DNA.
La trascrizione è catalizzata dall’enzima RNA polimerasi.
L’RNA polimerasi e il DNA scorrono uno sull’altra permettendo così la
sintesi dell’mRNA a partire dal filamento stampo.
 LA TRASCRIZIONE
La trascrizione dà origine a una molecola di mRNA da un filamento
stampo di DNA.
 LO SPILICING

Prima di lasciare il nucleo l’mRNA

viene elaborato.
I geni degli eucarioti sono costituiti
da sequenze nucleotidiche
codificanti chiamate esoni,
intercalate a regioni non
codificanti dette introni.
Vengono anche aggiunti all’RNA
un cappuccio e una coda.
Sia gli esoni sia gli introni vengono
trascritti, e l’RNA messaggero che si
forma viene detto trascritto
primario.
 LA TRADUZIONE

Nella traduzione, ogni RNA di

trasporto (tRNA) veicola un
amminoacido
I tRNA trasferiscono gli amminoacidi
che si trovano nel citoplasma ai
ribosomi, dove l’mRNA viene
trasformato nella sequenza di
amminoacidi che corrisponde a
una proteina.
Gli anticodoni del tRNA si
accoppiano con i codoni
complementari dell’mRNA.
 LA TRADUZIONE
La traduzione ha luogo presso i ribosomi presenti nel citoplasma.

La 1 a fase della traduzione

dell’mRNA in polipeptidi è detta
«inizio».
L’inizio è la fase che mette
insieme tutti i componenti
necessari alla traduzione. Il
codone di inizio è AUG.
Ogni ribosoma ha 3 siti di attacco
per i tRNA: sito E (da exit), sito P
(da peptide) e sito A (da
amminoacido).
 LA TRADUZIONE
La 2a fase della traduzione è l’allungamento
Durante l’allungamento, un tRNA che porta un peptide si trova sul sito
P e un tRNA associato al proprio amminoacido sta arrivando al sito A.
Una volta che il tRNA successivo si aggancia al sito A, il peptide in via
di formazione sarà trasferito a questo tRNA.
Poi, avviene la traslocazione: l’mRNA si sposta in avanti, in modo che il
tRNA che porta agganciato il peptide si trovi ora al sito P del ribosoma.
Infine, il tRNA usato fuoriesce dal sito E.
 LA TRADUZIONE

La 3a fase della traduzione è la terminazione.

Il processo di allungamento e traslocazione si ripete più volte,
con il tRNA usato che fuoriesce dal sito E, mentre sul sito A si
aggancia un nuovo codone, pronto a ricevere un altro tRNA.
Quando il ribosoma raggiunge un codone di terminazione, la
traduzione si conclude con la fase di terminazione, in cui il
polipeptide viene rilasciato.

La trascrizione e la traduzione rendono possibile l’espressione genica.

LA REGOLAZIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI E NEI
PROCARIOTI
 LA REGOLAZIONE GENICA NEI PROCARIOTI
Circa un decennio prima che Watson e
Crick chiarissero la struttura del DNA, i
biologi statunitensi Beadle e Tatum
realizzarono una serie di esperimenti sulla
muffa del pane che portarono a stabilire
la relazione tra il DNA e le proteine.

Questo collegamento DNA-proteine fu

sintetizzato con l’espressione “un gene-un
enzima”: ciascun gene corrisponde ad
un segmento di DNA e contiene le
informazioni necessarie per la sintesi di
una proteina enzimatica.
In seguito gli studi sui genomi dei
procarioti chiarirono che l’espressione dei
geni, cioè la sintesi delle proteine, è
soggetta a meccanismi di REGOLAZIONE
GENICA che consentono alle cellule di
produrre le proteine solo nel momento
opportuno e nella quantità necessaria,
attivando e disattivando geni specifici
 LA STRUTTURA DELL’OPERONE

I batteri vivono abitualmente in

ambienti le cui proprietà cambiano
molto.
Ad esempio, per l’escherichia coli che
vive nel nostro intestino, la presenza
di cibo può variare.

Nel 1961 due biologi francesi; Francois

Jacob e Jacques Monod, compresero
come si comportano i batteri in
presenza o in assenza di lattosio,
preziosa fonte di
energia per loro. In particolare hanno
scoperto il modello dell’operone.
 LA STRUTTURA DELL’OPERONE
La regolazione genica nei procarioti è spiegata dal modello
dell’operone che è composto da un gruppo di geni strutturali, un
promotore e un operatore.
I geni regolatori codificano per proteine che possono inibire o attivare
la trascrizione.
Geni strutturali: codificano per le proteine di
interesse
Operatore: Sito sul DNA riconosciuto dalla
proteina repressore
Promotore: Sito sul DNA cui si lega l’RNA
polimerasi per iniziare la trascrizione dei geni
situati a valle

gene regolatore promotore operatore geni strutturali

operone
 L’OPERONE LAC

L’operone lac è un esempio di operone inducibile nel batterio E. coli.

In assenza di lattosio, l’operone è inattivo; in presenza di lattosio
l’operone si attiva, promuovendo l’espressione di enzimi per digerire il
lattosio.

NO LATTOSIO LATTOSIO
geni per il metabolismo RNA polimerasi
promotore operatore
del lattosio

NESSUNA TRASCRIZIONE

repressore TRASCRIZIONE
lattosio
 L’OPERONE TRIPTOFANO
L’operone trp è un esempio di operone reprimibile nel batterio E. coli,
ovvero sempre acceso ma che può essere spento quando la
sostanza che producono è presente in quantità sufficiente.
In mancanza del triptofano, la RNA polimerasi trascrive i geni
dell’operone affinché la cellula possa sintetizzare il triptofano, che
quando è presente in quantità sufficienti si lega al repressore
attivandolo, per bloccare la RNA polimerasi e quindi la produzione
dell’amminoacido stesso.

NO TRIPTOFANO TRIPTOFANO
RNA polimerasi
geni per la
sintesi del trp

TRASCRIZIONE NESSUNA TRASCRIZIONE

repressore trp attiva il
inattivo repressore
 LA REGOLAZIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI
Negli eucarioti il genoma è più complesso, il numero di cromosomi e
quindi di geni è maggiore rispetto ai procarioti. Inoltre negli eucalipti
pluricellulari, tutte le cellule di un organismo possiedono gli stessi geni
che in risposta a segnali diversi possono esprimere i geni in modo
differenziale.

Gli eucarioti possono usare diversi meccanismi per controllare la loro

espressione genica.

Momento in cui interviene la regolazione Meccanismo di regolazione

Rimodellamento della cromatina e cambiamenti

• prima della trascrizione; epigenetici

Legame tra attivatori/repressori

• durante la trascrizione; Legami tra proteine di regolazione
Produzione di copie multiple di mRNA
Splicing alternativo
• tra la trascrizione e la traduzione; Regolazione della traduzione
Interferenza da RNA

Clivaggio delle proteine

• durante la traduzione; Ubiquitinazione e degradazione nel proteasoma

Attivazione dei geni a effetto materno

• dopo la traduzione. Dei geni per la segmetazione
Dei geni omettici
 LA REGOLAZIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI
Le cellule eucariotiche sono specializzate grazie all’attivazione di
certi geni.

Esempi di espressione genica in cellule specializzate.

 IL DIFFERENZIAMENTO CELLULARE
Il processo di differenziamento dà origine a una grande varietà di
cellule specializzate.
Durante le ripetute divisioni cellulari che portano uno zigote a diventare
un organismo pluricellulare adulto, le singole cellule vanno incontro al
differenziamento e diventano cellule specializzate nella struttura e nelle
funzioni.
 IL RIPIEGAMENTO DEL DNA
La quantità di DNA negli eucarioti è
molto maggiore rispetto ai procarioti. Doppia elica di DNA (2
nm di diametro)
Una cellula umana, contiene una
quantità di DNA circa 1000 volte Istoni
superiore a quella di E. coli. Linker
«Perle di una
collana»
L’impacchettamento del DNA rende il
DNA meno accessibile

TEM
alla RNA polimerasi, di conseguenza, la Nucleosoma

trascrizione negli
eucarioti richiede un corredo di fattori di Fibra elicoidale compatta

trascrizione più complesso.

La spiralizzazione del DNA

tende a ostacolare l'espressione genica Superavvolgimento

impedendo all'RNA polimerasi e alle

altre proteine necessarie alla
trascrizione di legarsi al DNA.
TEM

Cromosoma in metafase
 MODIFICAZIONI CHIMICHE DEL CROMOSOMA

I cromosomi degli eucarioti possono anche essere

modificati chimicamente allo scopo di regolare
l’espressione genica.
Aggiungendo un gruppo metile (-CH3) ad alcuni
amminoacidi si contribuisce a rallentare la
trascrizione.

Aggiungendo invece un gruppo acetile (-COCH3) si

permettere all’ RNA polimerasi di iniziare la
trascrizione.
 EREDITA’ EPIGENICA
Le esperienze fatte nell’ambiente quotidiano
sono in grado di modellare l’attività dei geni,
attraverso le cosiddette modificazioni
epigenetiche.

Le esperienze di cui ognuno è protagonista,

vengono codificate all’interno del nostro DNA
tramite particolari e precisi meccanismi di
regolazione dei geni, che entrano in gioco già
durante lo sviluppo embrionale.

L’epigenetica è una branca di studi che si

occupa dei cambiamenti che influenzano il
fenotipo senza alterare il genotipo.

Consiste in una serie di vie molecolari

attraverso le quali la trascrizione viene
alterata, senza però andare a modificare la
sequenza di DNA sottostante.
 METILAZIONE DEL DNA
La metilazione è considerata come un meccanismo di silenziamento genico.
Per poter iniziare la trascrizione è necessario che il DNA che verrà usato come
stampo sia “accessibile” all’RNA polimerasi e ai fattori di trascrizione. La
metilazione del DNA è una modificazione epigenetica che ne altera
l’accessibilità senza andare a modificare la sequenza di DNA sottostante.
Quando, all’interno di un gene, compare la coppia di basi C – G, la citosina
può essere facilmente metilata dall’azione di un enzima detto DNA
Metiltransferasi che si occupa di aggiungere un gruppo metile a quella
citosina.
Quando una sequenza è metilata, non è possibile trascriverla, ovvero non è
possibile “leggere” quel gene, che rimane quindi silenziato.
La metilazione del DNA è un processo fondamentale durante lo sviluppo,
poiché consente di creare pattern di differenziazione cellulare stabili ed
ereditabili.
 LO SPLICING ALTERNATIVO

Completata la trascrizione, i segmenti non codificanti (introni) vengono

rimossi grazie al processo di splicing. In alcuni casi la cellula svolge lo
splicing in maniera differente (splicing alternativo) che le consente di
generare diversi tipi di mRNA maturo da uno stesso trascritto primario.

Esone

DNA
1 2 3 4 5

Trascritto
di RNA 1 2 3 4 5
Splicing dell’RNA oppur
e

mRNA
1 23 5 1 2 4 5
 RNA NON CODIFICANTE
Soltanto l’ 1,5% del genoma umano codifica per proteine. Una
frazione molto piccola di DNA è costituita dai geni codificanti per
l’RNA ribosomiale e l’RNA di trasporto.
Si pensava che il rimanente DNA non codificante fosse inutile tanto
da chiamarlo DNA spazzatura.

Oggi i biologi ritengono che una

quantità significativa del genoma
possa essere trascritta in molecole di
RNA che non servono per codificare
proteine, ma svolgono un ruolo
importante nella regolazione genica.
Questi prendono il nome di RNA non
codificanti.
 LA TRADUZIONE E GLI STADI SUCCESSIVI

Anche la traduzione e le ultime fasi dell’espressione genica sono

soggette a regolazione.
Dopo che l’RNA è stato modificato e trasferito dal nucleo al
citoplasma, avvengono altre forme di controllo dell’espressione
genica.

I polipeptidi che si formano dopo la traduzione non sempre sono

già funzionali, spesso devono essere modificati, che consiste in un
taglio detto clivaggio.

SH
SH

Ripiegamento del polipeptide S

S

S
e formazione dei legami S—S Taglio

S
SH S S
SH
SH

S S
SH

S S S S

Polipeptide iniziale Polipeptide ripiegato Insulina

(inattivo) (inattivo) (ormone
 LA TRADUZIONE E GLI STADI SUCCESSIVI

Altre proteine vengono distrutte dopo essere

state sintetizzate.
Tramite un complesso multiproteico chiamato
proteasoma, presente nel citoplasma che
riconosce le proteine da degradare.
Questo è possibile grazie all’ubiquitina che è
un enzima che agisce come un marcatore,
che si lega alle proteine che devono essere
distrutte.

Ciò permette alla cellula di adeguare il tipo e la

quantità di proteine ai cambiamenti ambientali e
di mantenerle in uno stato di funzionamento
ottimale, demolendo o sostituendo quelle
danneggiate.
 LE BIOTECNOLOGIE

Il termine biotecnologie indica l’insieme di tutte le applicazioni

tecnologiche che si servono dei sistemi biologici, degli
organismi viventi o di derivati di questi, per produrre o
modificare prodotti o processi per un fine.

In questo senso l’origine delle biotecnologie è molto antica,

dall’agricoltura selezionando le varietà più appetibili,
all’allevamento cercando di far riprodurre maggiormente gli
animali che sembravano più produttevoli.
 IL DNA RICOMBINANTE
Oggi è possibile effettuare interventi mirati, che permettono di
modificare il genoma manipolando direttamente il DNA, in questo
modo è possibile decidere a priori quali caratteristiche introdurre
agendo così a monte sul patrimonio genetico.
L’insulina è stata la prima proteina ricombinante, prodotta tramite dei
microrganismi modificati geneticamente in cui è stato introdotto il
gene dell’insulina umana.

Lo sviluppo dell’ingegneria genetica o DNA ricombinante, si basa su

tre fattori principali:
1. L’universalità del codice genetico, letto nello stesso modo in tutte
le cellule
2. La scoperta degli enzimi di restrizione, capaci di tagliare e unire
molecole di DNA
3. La messa a punto della tecnica chiamata PCR, che permette di
riprodurre una duplicazione artificiale del DNA
 GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE
I ricercatori Arber, Nathans e Hamilton, ricevettero il Premio Nobel per la
medicina grazie alla scoperta degli enzimi di restrizione.
Sono capaci di tagliare il DNA virale penetrato in un batterio
rendendolo inoffensivo senza però intaccare il DNA batterico.

Gli enzimi di restrizione sono ampiamente utilizzati il laboratorio per le

tecniche di manipolazione genetica poiché capaci di tagliare in modo
specifico il DNA in particolari punti, detti siti di restrizione.
Questi siti sono palindromici presentano infatti la stessa sequenza di basi
su entrambi i filamenti.
 GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE
Sono noti centinaia di enzimi di restrizione, suddivisi in tre categorie
indicate con i numeri romani e prendono il nome dal batterio in cui
sono stati trovati.
Ogni enzima riconosce sequenze diverse e agisce in modo differente,
esistono infatti due tipologie di taglio:

1. Il taglio sfalsato, che da origine a due estremità a singolo filamento,

dette coesive, poiché complementari, e quindi, possono interagire
tra loro mediante legami ad idrogeno tra le basi
2. Il taglio piatto, che da origine a due estremità nette a doppio
filamento, dette non coesive.
I frammenti di DNA tagliati vengono chiamati frammenti di restrizione.
 IL DNA RICOMBINANTE

La scoperta degli enzimi di restrizione ha reso possibile il taglio del DNA

in punti specifici. I frammenti di DNA così ottenuti possono essere uniti
utilizzando l’enzima DNA ligasi.
Usando in sequenza enzimi di restrizione e ligasi è possibile isolare un
frammento di DNA da un organismo e inserirlo in un altro, per formare
una nuova molecola chiamata DNA ricombinante.
Affinché il legame tra i frammenti sia possibile è necessario che
presentino estremità coesive identiche, oppure estremità non coesive.
 IL CRISPR/CAS9

Il Crispr-Cas9 è una tecnologia all’avanguardia(nel settore

dell’ingegneria genetica) che consente di realizzare interventi di
microchirurgia sui geni, modificando una sequenza di DNA in un punto
preciso del cromosoma con precisione e facilità mai raggiunte prima.

Mentre le vecchie tecniche genomiche si limitano ad aggiungere

materiale genetico, CRISPR permette anche di intervenire per
cancellare o modificare sezioni specifiche di DNA, offrendo la possibilità
di riscrivere il genoma secondo le proprie esigenze.

Il sistema CRISPR–Cas9, scoperto nel 2005 nell'ambito delle applicazioni

biotecnologiche per la produzione casearia, è un meccanismo di
difesa immunitaria utilizzato dai batteri per resistere alle infezioni dei virus
batteriofagi.
 IL CRISPR/CAS9
Per Crispr si intende Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats, locuzione che indica segmenti di DNA che contengono brevi
sequenze regolari e ripetute. Si tratta di sequenze particolarmente
frequenti in natura: sono state osservate, infatti, in circa il 40 % dei
genomi batterici sottoposti a sequenziamento.
Le sequenze Crispr sono partcolarmente importanti per l’ingegneria
genetica perché a esse è associato un complesso di geni, il Cas
(ovvero Crispr-ASsociated) che codificano enzimi in grado di tagliare il
DNA.
Una sorta di sistema immunitario per gli elementi genetici: le sequenze
Crispr-Cas riconoscono il DNA estraneo (per esempio quello dei virus
ba:eriofagi) e lo tagliano ed eliminano.
 IL CRISPR/CAS9
Crispr-Cas è un sistema fatto da due componenti:

1. un enzima capace di tagliare il DNA (nel caso specifico quello

del virus, (ma può essere utilizzato per tagliare il DNA di altri
organismi), la Cas9 endonucleasi;

2. una molecola di RNA (guida) ogni volta diversa, che serve ad

indirizzare l’enzima CAS9 su una sequenza corrispondente nella
doppia elica del virus, dove avverrà l’incisione.

Crispr/Cas9, l’acronimo sta per l’enzima

prodotto dal gene Cas9 e i Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats, le ripetizioni palindromiche di gruppi
di DNA estraneo (di virus o quant’altro) disposti
a intervalli regolari.
 ANALISI DEL DNA MEDIANTE ELETTROFORESI
Una volta tagliato il DNA mediante gli enzimi di restrizione, i singoli
filamenti possono essere separati utilizzando l’elettroforesi su gel.
Questa tecnica consiste nel far migrare i filamenti di DNA attraverso una
matrice gelatinosa, sottoponendoli ad un campo elettrico.

Il DNA infatti possiede una carica negativa grazie alla presenza dei
gruppi fosfato e si muove verso il polo positivo.
I frammenti di DNA attraverseranno la matrice con diverse velocità a
seconda della propria lunghezza, i frammenti più piccoli infatti
risulteranno più vicini al polo positivo rispetto a quelli più grandi.

Il polimero utilizzato per il gel,

solitamente è l’agarosio, che
forma maglie in grado di separare i
filamenti di DNA.
A seconda della concentrazione di
agarosio si formano maglie più o
meno ampie, capaci di separare
frammenti più o meno grandi.
 ANALISI DEL DNA MEDIANTE ELETTROFORESI
I frammenti di DNA si localizzano in punti
diversi del gel e dato che il DNA è
trasparente, per poterli visualizzare è
necessario colorarli artificialmente.

Quello che si osserva è quindi una serie di bande fluorescenti, costituite

da frammenti di DNA della stessa lunghezza.
Per identificare i frammenti, viene utilizzato un miscuglio, chiamato
marcatore di peso molecolare che migrando fornisce una specie di
metro di riferimento.
 LE SONDE NUCLEOTIDICHE
Una sonda nucleotidica è costituita da un frammento di DNA o RNA a
singolo filamento, capace di legarsi con legami a idrogeno a una
sequenza complementare presente lungo un altro acido nucleico,
evidenziandone la presenza grazie a sostanze radioattive o fluorescenti
legate alla sonda stessa.
 LA PCR
I campioni di DNA da analizzare sono spesso in quantità insufficiente
per essere rilevabili con una semplice elettroforesi su gel, anche se è
possibile utilizzare le sonde nucleotidiche, è sempre più utilizzata una
nuova tecnica che permette di ottenere moltissime copie del tratto
di DNA di interesse.

Questa tecnica è chiamata PCR, reazione a catena della DNA

polimerasi.

La reazione è catalizzata da una DNA-polimerasi particolare, la Taq-

polimerasi, ricavata da un batterio termofilo che resiste alle alte
temperature.

Per copiare in modo specifico il tratto di dna si utilizzano delle

molecole chiamate primer che delimitano la parte di DNA che la
Taq-polimerasi dovrà copiare.
 LA PCR
La PCR prevede tre passaggi che si ripetono per più cicli:

1. Denaturazione: si alza la temperatura sopra i 90°C per rompere i

legami a idrogeno e separare le due emieliche del DNA;

2. Ibridazione: la temperatura viene abbassata fino a una temperatura

di 40-65°C per permettere l’ibridazione dei primer con il DNA;

3. Allungamento: la temperatura viene alzata a 72°C per far agire la

Taq-polimerasi che avvia la sintesi dei due filamenti a partire dal primer.
 IL SEQUENZIAMENTO DEL DNA
Sequenziare il DNA significa determinare la sequenza in cui sono disposti
i nucleotidi che lo compongono, ovvero l’ordine con cui compaiono le
basi azotate.

Prima di sequenziare il DNA occorre amplificare la sequenza tramite la

PCR, successivamente denaturare le copie amplificate.
Si aggiungono poi la DNA-polimerasi che sintetizza i nucleotidi a partire
dal filamento stampo, un primer che si lega al DNA da sequenziare, poi
servono i desossiribonucleotiditrifosfato che trasportano le quattro basi
azotate, ed infine una piccola quantità di nucleotidi modificata.

La modifica riguarda lo zucchero che compone il nucleotide, manca il

gruppo ossidrile in posizione 3’, ed è legato ad un marcatore
fluorescente.
 IL SEQUENZIAMENTO DEL DNA
Si avvia la sintesi, la DNA-polimerasi si lega al primer ed aggiunge un
nucleotidi alla volta sempre rispettando la regola di complementarietà
delle basi, quando viene inserito il nucleotide modificato la sintesi si
arresta, poiché la mancanza del gruppo ossidrile impedisce il legame
con il nucleotide successivo e di conseguenza si stacca la DNA-
polimerasi.

L’interruzione della sintesi, formerà filamenti di lunghezze diverse tutti

con un nucleotide modificato.
Si denatura nuovamente il DNA ed i singoli filamenti vengono sottoposti
ad elettroforesi capillare, dov’è possibile analizzarli e ricostruire la
sequenza, che sarà complementare a quella da noi analizzata.
 LA CLONAZIONE DEL DNA

Per ottenere molte copie di un gene che codifica per una particolare
proteina si utilizzano le tecniche del DNA ricombinante.
Il gene di interesse viene isolato(con gli enzimi di restrizione) oppure
viene amplificato (con la PCR) e poi viene inserito nella cellula ospite
tramite un vettore.
 I VETTORI

I vettori sono sistemi utilizzati per trasportare e moltiplicare frammenti

di DNA all’interno delle cellule, devono essere capaci di riprodursi
autonomamente, possono essere:

1. I virus: viene inserito il gene di interesse nel genoma virale e il virus

lo trasferisce nel batterio o nella cellula eucariote che infetta. I virus
utilizzati sono modificati in modo tale da svolgere solo la funzione di
trasporto, perciò innocui. Il DNA si aggiunge al genoma dell’ospite e
si duplicherà insieme a quello proprio della cellula.

2. I plasmidi: si duplicano autonomamente grazie al sito Ori, e grazie

ai parecchi siti per gli enzimi di restrizione è possibile inserirvi tratti di
DNA, i quali geni saranno espressi grazie al promotore. Sono i
principali vettori utilizzati per far produrre ai batteri le proteine
ricombinanti.
 LA CLONAZIONE CON I PLASMIDI
I plasmidi batterici sono il principale vettore utilizzato per far riprodurre ai
batteri o ai lieviti proteine ricombinanti.
Ottenuto un plasmide ricombinante lo si inserisce in batteri ospiti che
possono sintetizzare la proteina umana grazie all’ universatilità del
codice genetico. Moltiplicandosi per scissione binaria, il batterio
produce figlie identiche, che sintetizzeranno la proteina, che poi sarà
possibile estrarre.
 LA CLONAZIONE DEGLI ORGANISMI EUCARIOTI
L’ esperimento di Wilmut, dimostrò che anche le cellule adulte di
mammifero mantengono nel proprio nucleo il potenziale per dare
origine a un nuovo organismo, era la prima volta infatti, che si riusciva a
clonare un mammifero a partire da un individuo adulto.

Wilmut impiegò due varietà diverse di pecore: Dorset, completamente

bianche, e Scottish blackface, con il muso nero.
Prelevò una cellula uovo da una pecora Scottish e le tolse il nucleo
(aploide), e la fuse con il nucleo di una cellula mammaria di una
pecora Dorset (diploide).

La pecorella che nacque apparteneva alla varietà Dorset, era

geneticamente uguale alla pecora donatrice del nucleo diploide.
La pecora, divenuta adulta, ebbe alcune complicazioni di salute e visse
per soli 7 anni.