CROMATINA

Il nome deriva dalle osservazioni di Walther Flemming alla fine dell’Ottocento sulla sostanza nel nucleo in
grado di colorarsi facilmente. Nei primi decenni del Novecento, Heitz fu in grado di distinguere due tipi di
cromatina. Uno in grado di colorarsi più intensamente, eterocromatina, e l’altro meno intensamente,
eucromatina. Da allora i biologi molecolari hanno fornito sempre più approfondimenti sulle proprietà
strutturali e funzionali della cromatina. Sebbene oggi sia chiaro che i domini in cui la cromatina può essere
suddivisa sono molteplici, facendo riferimento ai due tipi classicamente descritti si possono definire alcune
caratteristiche. L’eucromatina è in una conformazione più aperta, meno condensata, mentre
l’eterocromatina è più ricca di sequenze ripetute, è in conformazione più condensata, più chiusa.

La visione dicotomica della cromatina prevede che l’eucromatina replichi in fase iniziale S (dove avviene la
duplicazione), che molti geni all’interno siano trascritti e sia sensibile alle DNasi, quindi abbia una maggiore
accessibilità o cromatina più aperta. L’eterocromatina replica in fase tardiva S, ha pochi geni trascritti ed è
insensibile alle DNasi, con minore accessibilità. L’eterocromatina si suddivide in: facoltativa, che contiene
geni non espressi in un determinato tipo cellulare e potrebbero avere funzione strutturale; costitutiva,
condensata in tutti i tipi cellulari, formata da DNA ripetuto, come esempio i centromeri.

Per cromatina si intende il complesso formato dal DNA genomico con alcune proteine nucleari. DNA
genomico + proteine istoniche o non istoniche + RNA.

L’organizzazione della cromatina non solo permette al DNA genomico di essere compatto all’interno del
nucleo, ma mediante diversi meccanismi molecolari è in grado di influenzare vari aspetti della funzione del
genoma: trasmissione dell’ereditarietà, stabilità del genoma ed espressione genica.
Si possono descrivere vari livelli di organizzazione della cromatina. Mentre per l’unità fondamentale della
cromatina, il nucleosoma, c’è maggior accordo sulla sua organizzazione strutturale, per i livelli superiori c’è
ancora molto dibattito, a tal proposito diversi modelli sono stati proposti. Un aspetto molto importante per
cogliere a pieno il ruolo della cromatina nelle varie funzioni del genoma è il dinamismo della sua struttura.

La prima struttura della cromatina è la struttura a filo di perle visibile al microscopio elettronico.

La struttura a filo di perle è formata da DNA linker che congiunge i due nucleosomi, dove ogni
nucleosoma presenta un core istonico, fatto da proteine istoniche, attorno al quale gira il DNA
nucleosomale.
Le proteine del core istonico sono H2A, H2B, H3 e H4. La struttura di queste proteine si vede
partendo dall’N al C-terminale, dove ci sono strutture ad alfa elica che costituiscono una parte
centrale chiamata histone-fold, parte centrale della proteina che accomuna tutte e quattro le
proteine istoniche. All’N e al C-terminale si aggiungono regioni che le differenziano. La parte N-
terminale viene chiamata anche coda, ed è oggetto massivo di una serie di modifiche post-
traduzionali. Altra caratteristica delle proteine istoniche è che sono fortemente basiche, circa il
20%, della composizione in amminoacidi, risulta essere costituito da amminoacidi basici, ovvero
carichi positivamente (arginina-lisina). Interagendo con il DNA, carico negativamente, è
importante che le proteine istoniche siano cariche positivamente. Il core istonico è fatto da due
copie di ognuno di questi quattro istoni, si parla di ottamero istonico. H3 e H4 si assemblano
formando un dimero, due dimeri formano un tetramero e questo si assembla col DNA genomico,
dopo intervengono H2A e H2B a formare un dimero, i due dimeri di H2A e H2B si uniscono a
formare poi l’interno nucleosoma.
Le interazioni si stabiliscono a livello del solco minore. L’ossigeno del gruppo fosfato carico
negativamente interagisce con la carica positiva degli amminoacidi carichi positivamente degli
istoni stessi. Un riconoscimento sequenza specifica può avvenire in maniera agevole a livello del
solco maggiore, perché lì la zona è più accessibile, si può adattare meglio l’alfa elica.

Le nucleasi
Le nucleasi sono in grado di tagliare il legame fosfodiestere e costituiscono un gruppo variegato che può
comprendere sia proteine che RNA (ribozimi).

- Possono usare come nucleofilo: H2O, il gruppo ossidrilico legato al carbonio 2’ del ribosio, fosfato
inorganico, la catena laterale della tirosina, serina, istidina.
- La catalisi può o meno richiedere ioni metallo.
- Sulla base della preferenza del substrato si parla di DNasi e RNasi.
- Possono determinare la formazione di un prodotto 5’ o 3’ fosfato.
- Possono attaccare il legame fosfodiestere all’interno di una catena polinucleotidica (ENDOnucleasi)
o rimuovere i nucleotidi a partire da una delle due estremità (ESOnucleasi, 5’ – 3’ o 3’ – 5’)

Alcuni esempi di nucleasi:

- ENDOnucleasi: enzimi di restrizione, Cas9, DNasi I, MNasi

- ESOnucleasi: Sub-unità epsilon della DNA polimerasi III di Escherichia coli, DNA polimerasi I di
Escherichia coli.

La struttura canonica del nucleosoma (slide di quello scritto sopra)

Gli istoni del core sono caratterizzati da un contenuto di arginina-lisina di almeno il 20%, sono costituiti da
una struttura conservata formata da 3 alfa-eliche detta histone-fold e da una regione o coda N-terminale.
Gli istoni del nucleosoma sono presenti in due copie per ognuno, l’assemblaggio del nucleosoma prevede
l’associazione ordinata dei vari complessi proteici.
La maggior parte delle interazioni DNA-istoni è stabilita con le regioni strutturate delle proteine.
L’associazione è mediata da un gran numero di legami idrogeno. Le interazioni si stabiliscono a livello del
solco minore.
Le code istoniche di H3 e H2B passano tra le eliche, mentre H2A e H4 sopra e sotto con la loro carica
concorrono a stabilizzare la struttura del nucleosoma. Inoltre, le code istoniche sporgono all’esterno della
struttura nucleosomale e interagiscono con i nucleosomi vicini o con vari fattori nucleari.

Le modifiche istoniche:
- Metilazione della lisina, come si può notare possono essere aggiunti da una a tre gruppi metilici;
- Acetilazione della lisina.
Le modifiche istoniche influenzano la struttura della cromatina, l’effetto più semplice da immaginare è
quello dell’acetilazione che, neutralizzando le cariche positive delle code istoniche, ne diminuisce l’affinità
per l’impalcatura del DNA carica negativamente. Nel complesso, l’effetto delle modifiche istoniche non
incide solo modificando la carica, ma coinvolgendo altre proteine o complessi proteici che hanno capacità
di modificare il compattamento della cromatina.
Le diverse modifiche sono a carico di diversi enzimi e sono reversibili. Gli istoni modificati sono riconosciuti
da proteine con specifici domini. (Writing, Erasing, Reading)
Il 50% delle posizioni dei nucleosomi è prevedibile mediante modelli che considerano solo i meccanismi
intrinseci, cioè la sequenza di DNA (lievito). Il posizionamento del nucleosoma con meccanismi estrinseci
avviene grazie alla creazione di barriere o vincoli da parte di: proteine di legame al DNA, come fattori di
trascrizione; fattori di rimodellamento, proteine o complessi proteici coinvolti nella strutturazione della
cromatina; RNA polimerasi, enzimi che effettuano la trascrizione.
Le modifiche istoniche e le varianti istoniche non interferiscono con il posizionamento in senso stretto,
bensì sulla stabilità e dinamicità del nucleosoma. Ad esempio, influenzano l’interazione DNA-nucleosoma,
l’interazione inter-nucleosomale, l’interazione con i fattori di rimodellamento.

La metilazione del DNA può alterare la preferenza dei nucleosomi per determinate sequenze.
Nello schema semplificato mostrato, un attivatore trascrizionale lega il DNA e recluta un enzima che
modifica gli istoni, istone metiltrasferasi. L’acetilazione degli istoni a livello del promotore richiama un
complesso di rimodellamento della cromatina, dotato di brodominio. Il CRC rimuove o sposta i nucleosomi
rendendo accessibile il DNA per l’interazione con fattori di trascrizione e RNA polimerasi.

Possiamo avere modifiche post-traduzionali non solo alla coda N-terminale ma anche alla C-
terminale. La codina istonica è quella maggiormente carica positivamente. Se io, ad esempio,
neutralizzo le cariche con un’acetilazione, vedo che le interazioni con il DNA sono meno stabili.
Nella realtà dei fatti è che ci sono altre proteine che con dei domini stabiliscono delle interazioni
con le codine modificate piuttosto che con quelle non modificate. Per comprendere
funzionalmente, bisogna andare oltre il piccolo tratto di genoma.

LIVELLI DI COMPATTAMENTO E INFLUENZA SUL FUNZIONAMENTO DEL GENOMA

Nella descrizione di alcuni processi molecolari che vedono protagonista il genoma eucariotico, per
semplificazione si riduce la rappresentazione del processo a relativamente pochi elementi. Nella realtà dei
fatti, tali processi molecolari si devono svolgere all’interno del nucleo e tenendo conto dell’organizzazione
del genoma in cromatina. L’ambiente nucleare è estremamente denso e le funzioni del DNA sono
fortemente influenzate dalla cromatina.

Livelli di compattamento
Un modello che rappresenta il livello di compattamento superiore alla fibra da 10 nm è quello della fibra da
30 nm. Per tale modello è importante l’istone H1 (detto anche istone linker) che partecipa a tale ulteriore
impacchettamento. Due modelli di organizzazione sono stati proposti per la fibra da 30 nm: solenoide, zig-
zag.
Nonostante il grado di compattezza, la struttura della cromatina è molto più dinamica di quanto
immaginato prima. Una grande variabilità si può avere già a livello di un singolo nucleosoma.
In Drosophila
La caratterizzazione delle specifiche combinazioni di proteine a livello di diverse regioni genomiche ha
mostrato una maggiore complessità della cromatina. Alcune proteine marcano solo un tipo di cromatina,
altre sono condivise da più tipi.

TECNICHE PER LO STUDIO DELLA CROMATINA

Il saggio dell’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica che permette di studiare in vivo le
interazioni proteina-DNA, in particolare di identificare regioni di DNA che interagiscono con una specifica
proteina di cui è disponibile un anticorpo. La proteina può essere, per esempio, un attivatore trascrizionale
o un istone modificato (H3K4me3, istone H3 trimetilato a livello della lisina 4)

Altre tecniche per lo studio della cromatina:

- MNasi nucleasi micrococcica, è un enzima che taglia preferenzialmente il DNA linker e permette di
ottenere mononucleosomi. Dopo il taglio il DNA estratto viene analizzato mediante HTS (High-
Throughput Sequencing)
- DNasil è un enzima che taglia il DNA nella cromatina in funzione della sua accessibilità. Dopo il
taglio il DNA estratto viene analizzato mediante HTS.