LEZIONE N°5 30/03/2017

Vucciria: Renato Guttuso

La volta scorsa abbiamo fatto un excursus per avere una base di come si fa un esame
istologico. Abbiamo parlato dell’esame istologico definitivo cioè della fissazione in formalina e
della processazione, quindi utilizzando una metodica che ha a che fare con la chimica e
abbiamo visto anche che è possibile fare un esame istologico estemporaneo cioè fare delle
sezioni (frozen section dygnosis) utilizzando del tessuto che è stato refrigerato; in questa
metodica si utilizza il freddo in quanto il freddo permette una solidificazione del tessuto il
quale, all’interno di un sistema refrigerante (a -20°C) che si chiama criostato e che contiene
una lama, può essere tagliato in delle sezioni.
Abbiamo visto poi come sia le sezioni ottenute con l’esame istologico definitivo sia quelle con
la metodica al congelamento si colorano; esistono dei coloranti tra cui quello base routinario
che si usa in tutto il mondo che è l’ematossilina (colora in blu) e l’eosina (colora in rosa).
Poi esistono tantissimi altri coloranti! La colorazione di Papanicolau (per il Pap-test),
colorazioni usate più nella diagnostica ematologica come la McGrumwald-Giemsa, esiste la
colorazione PAS (acido periodico-reattivo di Schiff) che mette in evidenza là dove c’è
accumulo di glicogeno.

Per voi in medicina basta sapere che esistono delle colorazioni che noi chiamiamo colorazioni
istochimiche perchè usiamo dei coloranti nei confronti delle sezioni istologiche e poi, quando
sono un po’ particolari, noi chiamiamo colorazioni istochimiche speciali per dire che non è la
classica ematossilina-eosina ma sono la PAS, McGrumwald-Giemsa, Blu di toluidina, la Masson,
Von-Gieson ecc ecc.
Il prof si trova però benissimo con la routinaria perchè secondo lui se non capisce una cosa
con ematossilina ed eosina non è che facendo le altre colorazioni risolve il problema.
Oggi invece vi voglio raccontare la storia di un muro! Che significa la storia di un muro?
Significa questo! Pensate che, da quando è nata questa disciplina prima chiamata Patologia e
poi Anatomia Patologica mentre negli Stati Uniti diventa Surgical patology, è sempre stata
quella disciplina che cerca di trovare nei tessuti una spiegazione alle malattie e quindi cerca le
basi delle malattie a livello microscopico.
Cosa voglio darvi come prima idea?
E’ chiaro che ogni verità è frutto del tempo in cui questa verità è concepita, la verità è storia.
Allora voi immaginate la storia…intanto si scoprono le lenti di ingrandimento, intanto si crea un
microscopio ottico quindi si scopre per la prima volta che noi siamo fatti di tessuti, scopriamo
che siamo fatti di cellule e poi, grazie al microscopio elettronico, si scopre che nelle cellule ci
sono tanti compartimenti; tutto questo è frutto di 250 anni quindi siamo piuttosto recenti, la
storia della base microscopica è recente quindi purtroppo l’umanità ha bisogno di tempi, non è
che ci si alza la mattina e si è dei geni alla Einstein!
La sintesi è che fino agli Anni’70 facevamo una descrizione dettagliata istologica delle
malattie, qualche colorazione ecc..
Certamente capite che se prendete un testo di anatomia patologica degli Anni’60/70 vedete
che sì, tante cose erano state dette e fatte ma, se andate a vedere qualche classificazione
dei linfomi degli Anni’60 sorridete perchè ci sono 4 linfomi con nomi inventate; addirittura
immaginate che esisteva il cosiddetto Linfosarcoma che è una chimera perchè per noi oggi è
impossibile che ci sia un tumore che è sia fatto da linfociti neoplastici che da cellule
mesenchimali neoplastiche! Il linfosarcoma per noi non esiste oggi, sarebbe come dire “uomo
albero”.
All’epoca c’erano i carcinomi, i sarcomi e se c’era qualcosa che non si capiva era linfosarcoma.
Allora che cosa succede? Dov’è il muro che ci ha permesso di porre le basi e di cambiare il
modo di vedere le cose?

Raccontiamo dove siamo arrivati adesso; siamo sempre a meno di metà strada! Qual’era il muro
e qual’è il muro che oggi in parte è stato abbattuto?
Il muro era questo! Certamente se io metto al microscopio un tumore che fa ghiandole e che
fa papille e che le cellule costitutive mi ricordano l’epitelio dell’organo in cui originano anche
all’epoca non avevo problemi a dire che era un carcinoma perchè le cellule ricordano le cellule
epiteliali delle ghiandole quindi è un carcinoma.
Se invece le cellule erano fusate a grandi linee si diceva che era un sarcoma e se poi qualche
elemento mi ricordava addirittura la muscolatura striata potevamo dire che probabilmente
era un rabdomiosarcoma.
C’erano dei tumori poi in cui le cellule erano rotonde e assomigliavano ai linfociti e si
chiamavano linfomi. Qual’era però il muro enorme? Ovviamente si tratta di un muro
concettuale!
Il muro era quando io per esempio sono di fronte ad un tumore, ad una neoplasia mangia, la
osservo al microscopio ottico e questa neoplasia è così indifferenziata o poco differenziata.
Apriamo una parentesi: che vuol dire indifferenziata o poco differenziata?
Non necessariamente vuol dire che la neoplasia è costituita da cellule atipiche, “mostruose”
ma indifferenziata vuol dire una neoplasia che non è differenziata o meglio una neoplasia che,
una volta osservata al microscopio, per i miei occhi rimane difficile stabilire la
differenziazione; e cos’è la differenziazione? E’ quella lezione della volta scorsa cioè capire
qual’è la linea differenziativa di quella neoplasia> se è un carcinoma, se un sarcoma, se un
linfoma, se una leucemia mieloide, se un melanoma, se un tumore endocrino, se un tumore
cerebrale. Quindi quello che vi ho detto e cioè le grandi categorie tumorali vengono tutte
messe sotto l’ombrellone della parola “ cancro” ma in realtà cosa sono?
Per dire questo vuol dire che dietro già abbiamo fatto un percorso che ci ha permesso di
stabilire che per ciascuna categoria le cellule mostrano la linea differenziati degli epiteli, dei
mesenchimi, dei linfociti, dei melanociti, delle cellule neuroendocrine,.
Poi a rendere le cose più difficili è il fatto che esistono dei tumori umani che prevalentemente
vengono raggruppati nell’enorme calderone dei sarcomi che sono un gruppo di tumori umani
maligni, spesso aggressivi per i cui non abbiamo trovato di meglio dal dire a istogenesi o a
istologia incerta. Voi immaginate che la scienza non può utilizzare il termine “incerto” ma
invece lo utilizza e questo è un atto di onestà perchè non abbiamo la più pallida idea di quale
possa essere la cellula normale di origine.
Se il carcinoma della mammella io so che origina dalle cellule epiteliali delle unità duttulo-
lobulari, se io so che il carcinoma del colon origina dalle cellule epiteliali delle ghiandole del
colon poi per esempio c’è un tumore maligno molto aggressivo dell’osso e dei tessuti molli tipico
dell’età pediatrica che si chiama sarcoma di Ewing cellule rotonde che non capisci cosa sono,
non sono né epiteliali né mesenchimali né nervose.
Quindi ci sono tante neoplasie che potremmo dire, parafrasando Pirandello, sono “in cerca
d’autore” cioè in cerca di cellule perchè sono neoplasie di cui non si sa quale sia la cellula di
origine e il sarcoma di Ewing è uno dei tanti.

Allora quando utilizzo il termine indifferenziato potrei avere dal punto di vista di significato
due significati: indifferenziato proprio perchè non riesco a capire quale sia la linea
differenziata perchè le cellule per esempio, come nel sarcoma di Ewing, sono tutte
rotondeggianti, non si capisce proprio neppure a quale elemento cellulare io possa rapportarlo
oppure indifferenziato o scarsamente differenziato potrebbe essere un tumore che mostra
delle cellule atipiche, grandi, anaplastiche, “brutte” (termine da non dire all’esame!) che sono
così atipiche che lo osservo al microscopio e mi chiedo se è un carcinoma indifferenziato o la
metastasi di un melanoma, di un sarcoma di un linfoma cioè, quando io osservo i preparati
istologici con l’ausilio della microscopia ottica, io non sono in grado di stabilire con certezza
non solo che tumore è ma neppure qual’è la linea differenziativa! Sono con una barchetta di
carta in un oceano! Ho una vaga idea ma non ne ho la certezza e abbiamo detto la volta scorsa
che un conto è un carcinoma, un conto è un linfoma e non solo un conto sono le singole
categorie ma poi per ognuna dovremmo capire quale sottotipo è quindi la cosa diventa più
complessa.
Questo è un muro! Quando il patologo si trova di fronte ad una neoplasia indifferenziata o
perchè le cellule sono molto atipiche oppure anche se non sono molto atipiche ma in ogni caso il
tema di fase comune è “io non sono in grado con la semplice morfologia di dire che cos’è”,
anche se vi dissi che conosciamo per forma stavolta la forma non ci aiuta perchè è come se io
vedessi voi come un’ombra appena accennata in una sala buia cioè vedo qualcosa ma non riesco
a individuare, a capire se è maschio o femmina.
Il concetto è neoplasia indifferenziata ma che vuol dire indifferenziata ? Vuol dire che
con la semplice morfologia di base io non sono in grado di stabilire con certezza la linea
differenziativa di quel tumore e questo è il muro.

Oggi siamo negli anni in cui io devo sapere con certezza cos’è questa cosa, devo sapere nome e
cognome e pensate che linfomi addirittura ce ne sono 60 e devo dire esattamente qual’è tra
questi, poi di sarcomi ce ne sono 150! Insomma capite che la cosa diventa complessa!
Quindi io sono arrivato, sono in un fondo, stagnante, è inutile che parlo con le cellule, che
prendo il microscopio e lo sbatto nel muro perchè non avrò alcuna risposta, non posso andare
oltre; anche la microscopia ha un limite per cui arrivo a un punto in cui non sono in grado di
distinguere con la forma chi sei tu.
Ora questo per fortuna non è così frequente infatti nella routine (per es in una biopsia
gastrica) nel 90% dei casi mi basta l’ematossilina-eosina per porre diagnosi ma in ambito
tumorale ho delle difficoltà talora nello stabilire che cos’è> questo muro quindi è
prevalentemente per la patologia tumorale e allora?
Allora cosa possiamo fare?
Cerchiamo intanto di darci una meta e la meta è questa: stabilire la linea differenziativa di
quel tumore “a morfologia indifferenziata” cioè a me interessa stabilire se è un carcinoma, se
è un melanoma o un linfoma.
Questo intanto è il primo step cioè prima devo capire qual’è la categoria e poi mi sofistico e
cerco di dare nome e cognome ma prima cerco di capire con quale categoria tumorale ho a che
fare; come si fa?
Si fa una sorta di interrogazione elle cellule! Come posso interrogare le cellule e farmi
rispondere dalle cellule?
Abbiamo detto che la microscopia elettronica in questo fallisce largamente! Si va bene, ci sono
tutta una serie di segni che ti dicono che per es è più mesenchimali ecc ecc ma abbiamo detto
la volta scorsa che quasi quasi essere troppo vicino alla realtà non ti consente di capirla!
Quindi la microscopia elettronica non ha risolto questo problema, nonostante ci abbia messo
con gli occhi dentro la pancia delle cellule; con la microscopia elettronica sei dentro ma non
riesci a capirle.
Allora dobbiamo cercare qualcosa di diverso! Siamo davanti a qualcosa che dobbiamo
“sbrogliare”, dobbiamo cercare di trovare il filo che ci metta nella giusta via, nella idea vera,
nella natura di questo tumore.
Negli Anni’80 da più parti del mondo si comincia a lavorare e viene fuori una metodica. Molte
metodiche spesso sono frutto di necessità, quando finirà completamente la benzina già ci sarà
la macchina elettrica! Spesso le grandi scoperte sono casuali, spesso possono essere spinte,
guidate dalla necessità.
Allora la metodica trovata negli Anni’80 e che oggi utilizziamo in maniera routinaria quasi
quanto la colorazione immunoistochimica si chiama la METODICA DELLA
IMMUNOISTOCHIMICA.

Se le prime colorazioni si chiamavano istochimiche cioè “colorano i tessuti”, immunoistochimica

vuol dire “coloro i tessuti con qualcosa che ha a che fare con l’immunologia”;
immunoistochimica significa che la mia sezione ha a che fare con l’immunologia.

Concettualiziamo un po’. Come possiamo far parlare le cellule?

Immaginiamo qiuesto; intanto partiamo da qualcosa che possiamo capire. Cosa sono queste
cose proiettate?
Prima di arrivare a capire cos’è l’immunoistochimica partiamo da un concetto base. A livello
embrionale succede che fin dagli inizi si differenziano i tre foglietti (ectoderma, mesoderma
ed endoderma). Che vuol dire ectoderma? che quelle cellule nel loro DNA, nel loro programma
hanno scritto che diventeranno, tra le altre tante cose, cellule epiteliali; mesoderma vuol dire
che c’è scritto in quelle cellule che saranno prevalentemente cellule emsenchimali. Quindi vuol
dire che fin dalle primissime fasi della ontogenesi i tessuti cominciano a dare i primi segnali di
differenziazione (epiteli, mesenchimi ecc).
Se poi andiamo avanti con lo sviluppo embriofetale e passiamo al neonato e poi all’adulto
immaginate come diventiamo. Allora io vorrei fare una osservazione; le nostre cellule epiteliali
sono epiteliali perchè? Perchè non sono mesenchimali, perchè non sono nervose, non sono
leucoitarie, non sono neuroendocrine, non sono glieli ecc ecc ma allora che cosa sono? Le
cellule epiteliali per essere epiteliali che cosa fanno? E’ che hanno delle proteine proteine
particolari che le differenziano da tutte le altre cellule, proteine anche del citoscheletro che
danno una forma a queste cellule ma, insomma, a grandi linee diciamo che una cellula epiteliale
esprime delle proteine, le cellule mesenchimali altre, le cellule neuroendocrine altre cose che
non esprimeranno le cellule epiteliali.
Allora le cellule epiteliali sono tali perchè hanno delle proteine/glicoproteine che sono il
risultato finale di della trascrizione del DNA; la differenziazione infatti non è altro che la
repressione di geni e la attivazione di altri.

Allora per esempio se io sono una cellula epiteliale avrò delle proteine più specifiche, proteine
che non troverò nel linfocita; si tratta di proteine del citoscheletro. Noi siamo all’impiedi
perchè abbiamo uno scheletro così le cellule hanno una forma perchè hanno il citoscheletro
fatto da vari filamenti tra cui quelli intermedi. Se io sono una cellula epiteliale avrò tra i
filamenti intermedi del citoscheletro per esempio queste proteine che si chiamano
citocheratine. Questo significa che se sono una cellula epiteliale ho le citocheratine mentre se
sono un linfocita o un melanocita o una cellula mesenchima non ho le citocheratine. Quindi le
citocheratine sono le proteine che io trovo nel citoscheletro delle cellule epiteliali. Lo stesso
concetto vale per le altre cellule per cui:

-cellule epiteliali: citocheratine>proteine del citocheletro

-cellule mesenchimali: vimentina>proteine del citocheletro (filamenti intermedi)
-cellule del SN: neurofilamenti (neuroni) > proteine del citocheletro
GFAP (glia: astrocita); GFAP sta per glicoproteina fibrillare acida> p. del citosch.
-cellule neuroendocrine: Cromogranina A e Sinaptosifina> non sono proteine dei filamenti
intermedi del citocheletro ma sono parti di sinapsi particolari, le cellule neuroendocrine
hanno questi marker nel citoplasma
-cellule ematopoietiche(linfocita): LCA (antigene leucocitario comune) che è espresso sulla
membrana, CD20, D3, CD56

Quindi il messaggio è il seguente: le diverse linee differenziative che conosciamo hanno anche
una espressione di proteine diverse.
Ma come facciamo poi a sapere se questa cellula ha le citochertine o la vicentina o altro? Ecco
quindi che inizia il percorso che ci porterà alla immunoistochimica.

Introdiuciamo un altro importante concetto; prima ci siamo detti una grande verità e cioè che
ogni linea cellulare, ogni linea di differenziazione cellulare ha delle proteine abbastanza
specifiche che in qualche modo la caratterizzano rispetto ad altre linee; per esempio gli
epiteli hanno le citocheratine e queste proteine sono espresse tipicamente dagli epiteli
mentre la vimentina è tipicamente espressa da tutte le cellule mesenchimali, la cromogranina
A e la sinaptofisina dalle cellule neuroendocrine, la proteina S-100 dalle cellule di Schwann,
dagli adiposità ecc ecc.. Il senso è che ogni linea differenziata ha delle proteine specifiche.
Dov’è allora il fascino di questo concetto?
Il fascino è qui! Abbiamo scoperto che se prendiamo le cellule epiteliali le quali, se sono
epiteliali, devono avere le citocheratine, sia che esse siano embriofetali o adulte o
iperplastiche o neoplastiche Benigne, maligne (carcinomi) e metastatiche ) hanno tutte le
citocheratine; lo stesso concetto vale per tutte le altre linee cellulari (mesenchimale,
neuroendocrina ecc ecc).

Quindi c’è una sorta di filo invisibile che inanella tutte queste cellule cioè basta che io sia una
cellula epiteliale che dall’embrione fino alla metastasi, se sono una cellula epiteliale, devo
esprimere le citocheratine e la stessa identica cosa per le altre linee.

Se volessi meglio dettagliare le cose dobbiamo dire che la cellula muscolare striata non è che
è la stessa di una cellula muscolare liscia pur essendo entrambe cellule mesenchimali e quindi
entrambe avranno la vicentina perchè sono mesenchimali ma avranno pure qualcosa che le
differenzia.
Le cellule mesenchimali infatti sono quelle dell’adipe, le cellule muscolari striate, l’osso, la
cartilagine, il connettivo e tutte queste, essendo mesenchimali, avranno la vimentina ma,
durante il processo evolutivo embriofetale c’è una differenziazione. Se io cellula mesenchima
indifferenziata devo diventare muscolo liscio o muscolo scheletrico, oltre la vicentina che è il
passaporto comune per tutte le cellule mesenchimali, se sono muscolare liscia devo esprimere
delle proteine diverse dalla muscolatura striata.
Quindi adesso è come se io volessi fare un passo ulteriore perchè non mi interessa dire solo
che questa cellula ha la vimentina ma, per sapere se questa cellula mesenchimale è una cellula
muscolare liscia o striata, devo cercare altre proteine oltre la vimentina che è la base.
Tutte le cellule muscolari per esempio, indipendentemente dal fatto di essere lisce o striate,
hanno nel loro citoplasma la proteina che si chiama desmina.
Se sono osso o cartilagine o adipe avrò la vimentina ma non la desmina.
Ancora però non posso dire se sono liscio o striato perchè devo cercare altre proteine; per
esempio se ho la vimentina e la proteina S-100 posso essere una cellula cartilaginea, un
adipocita o una cellula di Schwann (SNP) o un melanocita quindi vuol dire che la S-100 è
espressa in molti tessuti e quindi non è molto specifica.

Abbiamo detto che le cellule epiteliali esprimono le citocheratine ma chiaramente non hanno
solo queste, esprimono altre cose per esempio tutte le cellule epiteliali avranno la proteina
EMA che è una variante della Mucina 1. Le cellule epiteliali esprimono un milione e 400 mila
proteine ma io ve ne spiego due solo quindi vi faccio lo sconto del 99,9%!

Quindi dettagliamo i profili immunofenotipici:

-cellule epiteliali: citocheratine, EMA
-c. muscolare liscia: vimentina, alfa-actina muscolare liscia (dove sono le cellule muscolari
lisce? costituiscono le tonache muscolari dei visceri di tutto il tratto gastroenterico, del
tratto respiratorio fino a un certo punto, il muscolo erettore del pelo, muscoli intrinseci
dell’occhio ma, cosa più importante, nella parete dei vasi, nell’utero).
-c. muscolare striata: vimentina, MyOD1, miogenina (fattore di trascrizione che sta nel
nucleo)
-c. cartilaginea: vimentina, proteina S-100
-linfocita B: LCA, CD20, CD79a
-linfocita T: LCA, CD3(indica linea T) e poi se volete distinguere un T citotossico da un Th
dovete vedere se CD8 o CD4.
(Quanti linfociti abbiamo? B, T e NK e al microscopio non li differenzio! Non differenzio un
piccolo linfocita B e un T in circolo, sono indistinguibili quindi non mi basta solo vederlo con gli
occhi perchè se devo distinguere un linfoma a cellule B da uno a cellule T devo vedere che
esprime)

Quindi per ogni cellula io ho in mente tante proteine che vengono espresse, alcune sono quasi
esclusive mentre alcune sono condivise.
Ogni cellula ha tante proteine diverse. Se io sono una cellula epiteliale non posso avere CD20,
la S-100 altrimenti diventa un mondo chimerico quindi ecco questa prima base: le cellule che
sono ben differenziate si distinguono le une dalle altre per il fatto che esprimono cose
diverse, proteine diverse.
Sulla scorta di questo possiamo fare un altro passo avanti e cioè se per esempio sto
osservando un tumore indifferenziato e quindi non capisco con la semplice morfologia qual’è la
linea differenziata, come posso fare?
Facciamo un’allegoria, una metafora… è come se io dicessi alla cellula sussurrando “tu mi dici
che cellula sei?”
E la cellula mi dice “io esprimo la citocheratina, ho l’EMA ma non ho la viemntina, non ho LCA
ecc ecc” e quindi “allora mi stai dicendo che tu sei un epitelio?” e lei “si”.
Concettualmente il concetto è questo!
“io ho LCA ma non le citocheratine né la vimentina, né l’EMA; chi vuoi che sia ?” “un linfoma!”;
“io ho la Proteina S-100, Hmb45 quindi sono un melanoma” e così via.
Questo vuol dire che i tumori, siccome sono fatti da cellule, anche se io non li capisco alla
morfologia, le cellule, a seconda della loro linea differenziata che io non capisco ma che loro
hanno perchè sono cellule, esprimeranno delle proteine. Il punto è che io devo essere bravo a
cercare la metodica per vedere queste proteine.
Se ho un tumore indifferenziato e scopro che ha le citocheratine e non ha tutto il resto beh
allora dico che è un carcinoma.

In realtà io dico che ognuno di noi è fatto in un certo modo, abbiamo il profilo; il profilo
morfologico è quello che abbiamo con ematossilina-eosina ma, se sono in grado di vedere oltre
e quindi le proteine, allora non è più un profilo morfologico ma io ho in testa di ogni tumore il
profilo che ottengo con la immunoistochimica e allora si dice “peofilo immunoistochimico”.
Quando si parla di profilo istochimico di un tumore si ci riferisce a quali proteine esprime
quel tumore viste con la metodica della immunoistochimica.
Oggi, con questa metodica, sono in grado di poter dire nella maggior parte dei casi almeno la
categoria del tumore quando sono davanti a patologie indifferenziate, talvolta faccio una vera
e propria diagnosi.
Per esempio se c’è un linfoma e a CD20 allora sarà un linfoma a cellule B; poi di linfoma a
cellule B ne esistono 30 e ognuno avrà tante proteine diverse quindi profilo immunoistochimico
perchè il linfoma mantellare è una cosa, il linfoma a grandi cellule B un’altra, l’Hodgkin classico
un’altra cosa, il linfoma a piccoli linfociti/leucemia linfatica cronica è tutt’altra cosa, il linfoma
follicolare è un’altra cosa quindi ognuno ha le sue proteine.

Allora la spieghiamo così l’immunoistochima; come faccio parlare le cellule? come faccio a
sapere quale proteina esprime quella cellula e quindi quel tumore?
Prendo le cellule e le frullo e vedo il DNA, l’RNA con la biologia molecolare? Non è questa la
metodica perchè così perdo tante cose!
Io invece vorrei vedere la mia sezione dove ho fatto la visione morfologica io vorrei avere la
stessa immagine però comincio a chiedere il fuoco agli dei cioè corre vedere le proteine; la
prima follia è questa! Come fai a vedere le proteine? Qualcuno ha visto mai le proteine con gli
occhi?!
In realtà quindi io domando una cosa titanica: vedere nel tessuto le proteine; è come se io
dicessi di voler vedere l’invisibile perchè le proteine non sono visibili all’uomo, tanto meno al
microscopio ottico e manco con quello elettronico ma al massimo, con modelli matematici,
posso ipotizzare una struttura stechiometrica ma non c’è occhio umano né strumento che
possa vedere le proteine quindi io chiedo di vedere l’invisibile.
Allora come facciamo vedere l’invisibile?
In realtà è impossibile però posso fare una cosa; io non voglio vedere la proteina però potrei
vedere la sua esistenza in modo indiretto e qua è teologia! Siccome c’è il mondo che gira e ci
siamo noi allora c’è Dio e questo è un segnale indiretto. Quindi io non voglio vedere la proteina
perchè so che c’è; allora se c’è questa proteina invisibile agli occhi come posso vedere che c’è?
In maniera indiretta.
La proteina è troppo piccola per essere vista e hanno sfruttato una cosa che esiste in natura
per vedere in maniera indiretta le proteine quindi non è stata una creazione. In natura infatti
esiste il sistema immunitario, esiste un sistema immunitario della linea B, della immunità
morale che produce anticorpi, immunoglobuline che sono glicoproteine prodotte contro altre
proteine che sono gli antigeni; io in continuazione vengo in contatto con l’antigene e quindi il
mio sistema immunitario risponde producendo una proteina specifica per quell’antigene.
Il punto è quindi che esiste in natura una reazione antigene-anticorpo che si basa sul fatto
che, se entra un antigene il quale è una cosa sconosciuta, il nostro sistema immunitario
produce delle immunoglobuline che immediatamente vanno a legare questo antigene. Questa
reazione si chiama antigene- anticorpo; l’antigene è la proteina riconosciuta dall’anticorpo.
Fu geniale colui che ebbe questa inspirazione e cioè se le citocheratine, la proteine S-100, la
proteina che voglio cercare in un tessuto cosa sono ? Contettualmente sono antigeni solo che
non ce li ho nel mio corpo ma nella sezione tagliata, nel vetrino; come faccio a legarla questa
proteina? Facciamo finta che la citocheratina è l’antigene, la posso fare riconoscere da un
anticorpo contro la citocheratina? Certamente! Ma da dove lo prendo questo anticorpo?
Faccio un procedimento inverso! Prendo un topo, il coniglio e ci inietto nel Sistema immunitario
la citocheratina umana, la proteina S-100, quello che voglio; il topo e il coniglio, nonostante voi
pensate che siano totalmente diversi, non sono così diversi per cui il loro sistema immunitario
produrrà tanti anticorpi contro quello che gli abbiamo iniettato per esempio contro la
citocheratina umana. Quindi raccogliamo tutte le immunoglobuline che hanno prodotte, le
diluiamo, le mettiamo in una boccetta e le vendiamo, è questo che fanno le ditte!
Quindi io in laboratorio posso ottenere le immunoglobuline teoricamente contro tutte le
proteine umane perchè ogni proteina/glicoproteina è di per sé antigienica cioè evoca la
risposta immunitaria.
Quindi io ottengo gli anticorpi. Se prendo una sezione di tessuto dove ho un tumore
indifferenziato che io continuo a non capire, mi faccio 10 sezioni dove in una mando gli Ab
contro al citocheratina, in un’altra contro la vimentina, in un’altra conta contro l’LCA ecc ecc..
cosa succede? succede quello che accadrebbe nei nostri tessuti cioè succede la reazione
antigene-anticorpo a patto che l’anticorpo ovviamente trovi l’antigene. Se in una sezione io
butto un sacco di Ab contro la citocheratina, sei anticorpi che fanno? Cercano la
citocheratina! Se la trovano la abbracciano, avviene il legame ma se non la trovano, appena
vado a sciacquare, si perderanno.
Quindi l’immunoistochimica è semplicemente una reazione antigene-anticorpo solo che si fa
sulla sezione del tessuto e quindi l’antigene sono le proteine che io voglio andare a cercare.
Quindi se quel tessuto per esempio è un carcinoma avrà le citocheratine, l’EMA e non le altre
cose ma ancora siamo nell’invisibile perchè se io lego la citocheratina con l’anticropo creato
contro questa al microscopio cosa vedo? Niente! Mica se una proteina non la vedo allora se
sono due le vedo!
Quindi la reazione antigene- anticorpo è il grande passo ma ancora è l’1% del genio,
l’ispirazione! Occorre la perspirazione ora, il sudore! Dobbiamo rendere l’invisibile visibile
perché non solo la proteina è invisibile ma anche la reazione Ag-Ab è invisibile e lo facciamo
indirettamente.
Come facciamo a rendere visibile qualcosa che è invisibile?come posso vedere questa cosa al
microscopio?
Ecco la perspiration!
Sull’anticorpo che abbiamo creato per l’antigene che cerchiamo mettiamo una candela (avidina)
e poi un candelabro con 100 candele! Al microscopio quindi mettiamo l’occhio e vediamo la luce
e dove la vediamo?
Allora la mano che tiene il candelabro è l’anticorpo che lega l’antigene e se è fermo nel tessuto
vuol dire che lì c’è l’antigene. Questo è il sistema di rilevazione! Nella immunoistochimica non
usiamo né candele né candelabri ma dei coloranti. Immaginate che io sia un colorante, c’è
tutta una riduzione chimica per cui invece di vedere la luce vedrete che quella cellula si colora
di marrone, voi non vedete la proteine ma un segnale indiretto, una luce, un colore e dove c’è il
colore suo dire che c’è l’anticorpo e dove c’è l’anticorpo vuol dire che c’è l’antigene> là dove c’è
il marrone, se hai mandato per esempio un anticorpo per la citocheratina, là c’è la
citocheratina.
Con questa tecnica sveliamo, capiamo che cellule sono; una tecnica similare è
l’immunofluorescente dove il lampadario è una sostanza fluorescente dove tu vedi verde o
rosso.
Con l’immunoistochimica io sono in grado di sapere cosa esprime il tessuto.
Questa tecnica non solo mi serve per capire la linea differenziata del tumore ma ora io mi
diverto! Oggi infatti non ci basta solo fare diagnosi di carcinoma della mammella ma, ai fini
della terapia, oggi è importante sapere cosa quelle cellule tumorali esprimono (per es
recettori per gli estroni, per il progesterone, c’è l’overexpression di HER2 così posso dare
trastuzumab?) perchè su questo poi si basa la terapia. L’immunoistochimcia quindi non la si usa
come metodica diagnostica ma come metodica che mi aiuta a cercare i fattori predittivi cioè
quelli che predicano la risposta alla terapia. Se il mio recettore per gli estrogeni è l’antigene,
creo l’anticorpo e lo cerco e se lo trovo positivo faccio la terapia.
Questa metodica si fa su tessuti all’inizio non colorato, appena la reazione finisce, si
contrcolora solo con ematossilina quindi lei vede un bluetto e là dove è positivo vede marrone o
rosso.
L’immunoistochimica è straordinaria perchè al contrario della biologia molecolare che ti frulla
tutte le cellule qui invece preserva la forma cioè cedi un preparato istologico come se fosse
all’ematossilina-eosina e vedi i colori e dove c’è il colore vedi dove si trova la proteina cioè vedi
se è nel citoplasma, nel nucleo o lungo la membrana o nella matrice extracellulare.
L’immunoistichimica è una metodica di morfologia molecolare, accoppia la morfologia classica e
in più ti fa vedere qualcosa di molecolare, di infinitamente piccolo, ti fa vedere la proteina nel
tessuto, dove è espressa, quanto è espressa.
L’immunoistichimica tipicamente usa un enzima che si chiama perossidasi quindi la metodica
che utilizziamo frequentemente è l’immunoperossidasi.
Si invia un Anticorpo primario che riconosce l’antigene, poi si ci invia un anticorpo secondario
che riconosce il primario (il candelabro) con una molecola che si chiama biotina la quale a sua
volta è in grado di legare una molecola che si chiama streptavidina che io carico con l’enzima
perossidasi, poi si mette il colorante che si chiama diamminobenzidina (DAB) che è marrone
assieme all’H2O2, succede tutto un meccanismo di ossidoriduzione complicato (ciclizzazione).
La sintesi è che mettendoci l’enzima, questa diamminobenzidina cambia colore, precipita e
dove c’è l’antigene vedi marrone.
Alla fine facciamo la caratterizzazione immunoistochimica delle neoplasie.
Quando parleremo delle singole patologie faremo sempre riferimento ai marcatori
immunoistochimici; il marcatore è l’anticorpo contro l’antigene specifico.