La histologia, es el estudio científico de las estructuras microscópicas de los tejidos y los

órganos del cuerpo. En esta se utilizan diferentes microscopios dependiendo de las

necesidades, en la actualidad se usa mayormente el microscopio óptico porque es más
accesible y fácil de usar, no requiere un entorno altamente especializado, y es suficiente para la
mayoría de los estudios histológicos básicos, o el virtual en el cual se pueden observar las
muestras desde un dispositivo electrónico. Antes se utilizan microscopios electrónicos tanto el
de transmisión como el de barrido ya que ofrecen mayor resolución, aunque son más
complejos y requieren un procesamiento de muestras más elaborado, lo que los hace menos
prácticos para el uso diario en muchos laboratorios, no obstante hoy en dia tenemos el
microscopio de fuerza atómica el cual proporciona imágenes de alta resolución iguales o
incluso mejores que el electrónico.

Preparación del tejido

El primer paso en la preparación de una muestra de tejido u órgano es la fijación para

conservar la estructura, esta por lo general se logra mediante una sustancia química o una
mezcla de estas, la cual conserva de forma permanente la estructura del tejido para cualquier
tratamiento que se vaya a realizar. Las muestras deben de sumergirse en el fijador
inmediatamente se extraigan del cuerpo, esta sirve para detener el metabolismo celular,
impedir que las células y tejidos se descompongan por sí mismos debido a las enzimas que
pueden romper sus estructuras, destruir microorganismos patógenos como bacterias, hongos y
virus, además de endurecer el tejido como resultado de que las proteínas en él se unen entre sí
de una manera que las hace más rígidas o se alteran.

El fijador mas común es la formalina, la cual es una solución acuosa (mezcla en la que una
sustancia (como una sal, un ácido o una base) se disuelve en agua) de formaldehido al 37%
(formol), en diferentes diluciones y en combinación con otras sustancias químicas y
amortiguadores ( importantes para prevenir cambios en el pH que podrían dañar o alterar la
estructura de los tejidos, asegurando que los resultados de la tinción y observación sean
precisos.) El formaldehído ayuda a mantener la forma de las células y sus componentes al
unirse con las proteínas. Aunque actúa lentamente, se infiltra bien en los tejidos. Sin embargo,
no se une a los lípidos, por lo que no es muy bueno para fijar las membranas celulares.

En el segundo paso, la muestra se prepara para su inclusión en parafina con el fin de permitir
su corte, para examinar una muestra, primero se necesita infiltrarla con un material que la
haga más sólida. Esto permite hacer cortes muy finos, generalmente entre 5 y 15 micrones de
grosor, para que se pueda observar con detalle bajo el microscopio. Después de la fijación, la
muestra se lava y se deshidrata con alcohol 100% concentrado para remover el agua. Luego
sigue el aclaramiento, donde se usan solventes como xileno o tolueno para eliminar el alcohol
de la muestra. Luego, la muestra se infiltra con parafina fundida. Cuando la parafina se enfría y
se endurece, se usa un micrótomo, una máquina especial, para cortar la muestra en rebanadas
muy finas. Estas rebanadas se colocan sobre un portaobjetos de vidrio usando un adhesivo
para prepararlas para la observación.

En el tercer paso, la muestra se tiñe para permitir su observación, como los cortes en parafina
no tienen color, la muestra todavía no esta lista para observarse bajo el microscopio óptico.
Para teñir los cortes histológicos, primero hay que disolver la parafina con xileno o tolueno y
rehidratar los tejidos usando soluciones de alcohol de concentración decreciente (que la
concentración de una sustancia disminuye gradualmente). Luego, se tiñen con hematoxilina en
agua. Después, como la eosina se disuelve mejor en alcohol, se vuelve a deshidratar la muestra
con alcohol y se tiñe con eosina. Finalmente, se pasa la muestra por xileno o tolueno y se
coloca un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para crear un
preparado permanente.

Otros fijadores

Los cortes teñidos con hematoxilina y eosina de muestras fijadas en formalina son útiles
porque muestran bien las características generales de los tejidos, pero no revelan detalles
específicos sobre la composición química de las células. Por ejemplo, los alcoholes y solventes
usados en los preparados comunes pueden diluir los lípidos neutros. Para conservar estos
lípidos, se deben hacer cortes de tejido congelado fijado en formalina y usar colorantes que se
disuelvan en grasa. Además, se utilizan fijadores especiales con metales pesados, como el
permanganato y el osmio, que se unen a los fosfolípidos. El tetróxido de osmio es
particularmente eficaz en la microscopía electrónica (ME) porque mantiene muy bien las
membranas celulares, lo que mejora la calidad de las imágenes electrónicas.

Otras técnicas de tinción

La hematoxilina y la eosina se usan principalmente para observas las características

estructurales, a pesar de las ventajas de la tinción de estas, el procedimiento no permite ver de
forma adecuada cierto componentes estructurales de los cortes, como la elastina, las fibras
reticulares, las membranas basales y los lípidos. Para ver estos detalles, se utilizan otras
técnicas de tinción más específicas. Por ejemplo, la orceína y la fucsina son útiles para teñir el
material elástico, la resorcina se emplea para las fibras elásticas, y la impregnación argentina se
usa para resaltar las fibras reticulares y las membranas basales.

Histoquimica y citoquímica

Los procedimientos químicos pueden revelar la función de las células y los componentes de los
tejidos. Los métodos histoquímicos y citoquímicos se basan en la unión específica de un
colorante, en el uso de anticuerpos fluorescentes para detectar componentes celulares
específicos, o en la actividad enzimática de la célula. Además, las macromoléculas en las
células se pueden detectar mediante autorradiografía, donde se incorporan precursores
marcados radioactivamente antes de fijar los tejidos. Estos métodos son útiles tanto en la
microscopía óptica como en la electrónica.

Composición química de las muestras histológicas

Durante la preparación de cortes teñidos con H&E, muchos componentes de los tejidos se
pierden. Aunque los ácidos nucleicos, proteínas y fosfolípidos se conservan, proteínas
pequeñas como el ARN de transferencia y algunas moléculas grandes pueden perderse debido
a las condiciones desfavorables del pH durante la fijación. Además, el glucógeno, los
proteoglucanos y los glucosaminoglicanos suelen perderse, pero pueden conservarse con
fijadores no acuosos o agentes especiales que preservan los carbohidratos. Componentes
solubles como iones y moléculas pequeñas también se pierden durante la preparación con
parafina. Aunque no forman parte de la estructura del tejido, estos elementos están
involucrados en procesos celulares y metabólicos.

Fundamentos químicos de la tinción

Colorantes acidos y básicos

La hematoxilina y la eosina son los colorantes mas utilizados en la histología, un colorante
acido como la eosina , tiene una carga neta egativa en su parte coloreada mientras un
colorante básico tiene una carga neta positiva en su parte coloreada. la hematoxilina no es un
colorante básico pero tiene propiedades semejantes a las de este grupo.

Los colorantes básicos se unen a componentes de las células y tejidos que tienen carga
negativa, como los grupos fosfato de los ácidos nucleicos, los grupos sulfato de los
glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las proteínas. A esto se le llama basofilia. Por
otro lado, los colorantes ácidos reaccionan con grupos con carga positiva, como los grupos
amino de las proteínas, lo que se llama acidofilia. En histología, pocos componentes celulares
son basófilos, pero los colorantes ácidos se pueden combinar, como en la técnica de Mallory,
que utiliza tres colorantes ácidos: azul de anilina, fucsina ácida y naranja G, para teñir
diferentes partes del tejido (el colageno, el citoplasma y los eritrocitos, la fucsina también tiñe
los nucleos).

También existen otras técnicas con varios coloantes acidos, donde la hematoxilina se utiliza
para teñir primero los nucleos y luego se aplican colorantes acidos para teñir el citoplasma y las
fibras extracelulares, La forma en que los colorantes ácidos tiñen las diferentes partes del
tejido depende de cosas como el tamaño de las moléculas del colorante, cuánto se acumulan, y
cuán permeable o denso es el tejido. Estos factores determinan qué tanto se tiñe cada
componente del tejido.

Aunque las combinaciones de los colorantes básicos no son tan frecuentes como las de los
colorantes acidos, estas pueden utilizarse en combinación o de forma secuencial, por ejmplo el
verde de metilo y pironina para estudiar la síntesis y la secreción de proteínas.

Hay pocas sustancias dentro de las células y en la matriz extracelular que muestran basofilia, es
decir, afinidad por colorantes básicos. Entre estas sustancias están la heterocromatina y los
nucleolos en el núcleo (debido a los grupos fosfato de los ácidos nucleicos), los componentes
citoplasmáticos como el ergastoplasma (por los grupos fosfato del ARN ribosómico), y
materiales extracelulares como los carbohidratos complejos en la matriz del cartílago (por los
grupos sulfato ionizados).

La tinción con colorantes ácidos es menos específica, lo que significa que más partes de las
células y la matriz extracelular muestran acidofilia. Esto incluye la mayoría de los filamentos
citoplasmáticos, especialmente en las células musculares, muchos componentes de las
membranas internas de las células, gran parte del citoplasma no especializado, y la mayoría de
las fibras extracelulares, principalmente debido a los grupos amino con carga positiva.

Metacromasia

Ciertos colorantes básicos reaccionan con componentes tisulares que cambian su color normal
de azul a rojo o purpura, este cambio se llama metacromasia. Cuando se tiñen con colorantes
básicos concentrados como el azul de toluidina, las moléculas del colorante pueden agruparse
en pares (dimericos) o en cadenas largas (poliméricos). Este efecto, ocurre en estructuras con
muchas cargas negativas, como la sustancia fundamental del cartílago, los gránulos de heparina
en los mastocitos y el retículo endoplásmico rugoso en los plasmocitos. La metacromasia
cambia el color del colorante, permitiendo que estas estructuras se vean de manera distintiva
bajo el microscopio.
Grupos aldehído y el reactivo de schiff

La fucsina básica decolorada (reactivo de Schiff) reacciona con los grupos aldehído en las
moléculas, produciendo un color rojo distintivo. Esta propiedad es la base de dos técnicas de
tinción importantes: la reacción de ácido peryódico-reactivo de Schiff (PAS) y la reacción de
Feulgen.

La reacción PAS tiñe hidratos de carbono y macromoléculas que los contienen en grandes
cantidades, como el glucógeno en las células, el moco, la membrana basal, y las fibras
reticulares en el tejido conectivo.

La reacción de Feulgen utiliza el reactivo de Schiff para teñir ADN después de una hidrólisis
débil con ácido clorhídrico. Esta técnica es cuantitativa, ya que la intensidad del color
resultante es proporcional a la cantidad de ADN presente, permitiendo medirlo de manera
precisa.

Digestion enzimática

La digestión enzimática ayuda a confirmar qué material específico se ha teñido en una

muestra. Por ejemplo, si una muestra teñida con PAS muestra glucógeno, tratarla con diastasa
o amilasa eliminará la tinción del glucógeno, confirmando su presencia. Para confirmar ADN, se
puede usar desoxirribonucleasa (ADNasa) para eliminar la tinción en la reacción de Feulgen.
Asimismo, tratar con ribonucleasa (ARNasa) evita la tinción del ARN, confirmando que el
material teñido era ARN. Esto asegura que sabemos exactamente qué componente está
presente en la muestra.

Histoquimica enzimática

Las técnicas histoquimicas también se utilizan para identificar y localizar enzima en células y
tejidos. Para localizar enzimas en cortes histológicos, se usa una fijación suave para preservar
su actividad. En lugar de detectar la enzima directamente, se usa un reactivo de captura
(colorante o metal pesado) que fija el producto de la reacción enzimática mediante
precipitación. Por ejemplo, al usar un sustrato y un agente de captura, el producto final
(capturado) se precipita, permitiendo observarlo con microscopía. Este método ha ayudado a
identificar estructuras como los lisosomas y a mostrar enzimas como fosfatasa alcalina y
ATPasas.

Inmunocitoquimica

La inmunocitoquímica se basa en la especificidad de la reacción entre antígenos y anticuerpos.

La fluoresceína es un colorante común que absorbe luz UV y emite luz verde, utilizado para
marcar anticuerpos (inmunoglobulinas).

Existen dos técnicas principales: inmunofluorescencia directa e indirecta. En la

inmunofluorescencia directa, el anticuerpo primario está marcado con fluoresceína y se une
directamente al antígeno en la muestra. En la inmunofluorescencia indirecta, se utiliza un
anticuerpo secundario marcado con fluoresceína que se une al anticuerpo primario,
permitiendo una detección indirecta.
Técnicas de hibridación

La hibridación es una técnica para localizar ARN mensajero o ADN en una muestra. Consiste en
usar una sonda de nucleótidos que tiene una secuencia complementaria a la que se quiere
detectar. La sonda se une a la secuencia de interés mediante la formación de pares de bases
complementarias, permitiendo identificar la ubicación del ARN o ADN específico en la muestra.
La sonda puede estar marcada con sustancias como radioisótopos o colorantes para facilitar la
visualización. En el proceso, se puede hacer directamente en células o tejidos, lo que permite
ver secuencias pequeñas.

La hibridación se puede realizar en una solución o sobre una membrana. En la técnica de

hibridación in situ con fluorescencia (FISH), se usan sondas fluorescentes para estudiar
cromosomas y genes. FISH se aplica en diagnósticos clínicos y en la investigación de
exposiciones a radiación en astronautas.

Autorradiografia

Esta utiliza una emulsion fotográfica que se coloca sobre un corte histologico para localiza
material radioactivo en los tejidos. En la autorradiografía, se usan isótopos radiactivos para
marcar moléculas en tejidos. Los tejidos se exponen a una película o placa que detecta la
radiación emitida por estos isótopos. Esto permite ver dónde están y cuánto hay de ciertas
moléculas en el tejido, ayudando a estudiar la biología celular y molecular.

Microscopia de expansión

La microscopía de expansión (MEx) mejora la resolución de la microscopía óptica al expandir

físicamente la muestra. Aquí se usan hidrogeles que se infiltran en la muestra, creando una red
tridimensional que aumenta su volumen al absorber agua. Esto separa las moléculas dentro de
las células y tejidos, permitiendo observar detalles que normalmente no se ven con
microscopía óptica estándar.

El proceso de MEx incluye:

Fijación: Similar a otros protocolos de microscopía.

Anclaje: Se marca la estructura de interés con sondas moleculares y se mezcla con reactivos de
anclaje y monómeros de gel.

Gelificación: Los monómeros de gel se polimerizan dentro de la muestra, formando una red
densa.

Homogeneización mecánica: Se rompen las células para preparar la muestra para la expansión.

Expansión: Se añade agua para expandir la muestra en todas las direcciones.

Esta técnica permite observar detalles con una resolución mejorada al separar las moléculas
más de lo que es posible con la microscopía óptica tradicional. Además, se pueden realizar
expansiones repetidas para obtener imágenes aún más detalladas.

Microscopia
Microscopia óptica

La microscopía óptica utiliza lentes para ampliar imágenes, permitiendo ver detalles que no son
visibles a simple vista. Puede ser un microscopio simple (con una sola lente) o compuesto (con
múltiples lentes). El ojo humano tiene una resolución de aproximadamente 0,2 mm, limitada
por el espacio entre células fotorreceptoras en la retina. Un microscopio amplía la imagen para
que el ojo pueda distinguir detalles más pequeños.

La resolución de un microscopio óptico, que es la capacidad de ver objetos cercanos como

separados, depende de varios factores: la calidad del sistema óptico, la longitud de onda de la
luz utilizada, el espesor de la muestra, la fijación y la tinción. Un microscopio óptico de campo
claro puede alcanzar una resolución de alrededor de 0,2 micrómetros.

Los componentes básicos de un microscopio óptico incluyen:

Fuente luminosa: Ilumina la muestra.

Lente condensador: Enfoca la luz en la muestra.

Platina: Soporte para el portaobjetos.

Lente objetivo: Recoge la luz que ha pasado a través de la muestra.

Lente ocular: Permite ver la imagen formada por el lente objetivo.

Estudio de un preparado histologico en el microscopio óptico

Cuando se examina un preparado histológico bajo el microscopio, hay que recordar que los
tejidos son tridimensionales, pero los cortes son bidimensionales. Esto hace que sea un reto
imaginar cómo es la estructura completa solo con ver los cortes.

Cada corte muestra una parte diferente del tejido, como cortar una naranja revela distintos
patrones en cada rebanada. Para entender la estructura completa, hay que imaginar cómo
encajan las distintas secciones.

Además, en cada etapa de preparación del tejido pueden surgir errores o artefactos. Estos
pueden ser causados por problemas en la metodología, la calidad de los reactivos, o el equipo
usado. Ejemplos incluyen fijación inadecuada, deshidratación incorrecta, y problemas con la
inclusión o coloración. Por tanto, es crucial estar consciente de estos posibles errores y
familiarizarse con los artefactos comunes para interpretar correctamente los preparados
histológicos.

Otros sistemas ópticos

Microscopio de Contraste de Fases: Permite observar células y tejidos vivos sin teñir. Utiliza
diferencias en el índice de refracción dentro de la muestra para realzar detalles, haciendo
visible la estructura interna de células y tejidos.

Microscopio de Campo Oscuro: Solo captura la luz que ha sido refractada por las estructuras de
la muestra. La luz directa se bloquea, lo que ayuda a visualizar detalles finos y es especialmente
útil para examinar auto-radiografías.

Microscopio de Fluorescencia: Detecta moléculas que emiten luz al ser expuestas a luz
ultravioleta. Ideal para identificar moléculas específicas en muestras mediante tinciones
inmunocitoquímicas, ya que puede visualizar antígenos y anticuerpos etiquetados con
fluoróforos.

Microscopio Ultravioleta: Usa luz UV y lentes de cuarzo para examinar muestras. Es útil para
detectar ácidos nucleicos y proteínas que absorben luz UV, y se aplica en estudios de la
cantidad de ADN en muestras tumorales.

Microscopio con Focal de Barrido: Combina un microscopio óptico con un sistema de barrido
que permite explorar la muestra en profundidad y obtener imágenes en tres dimensiones. Es
útil para observar estructuras complejas en la biología celular.

Microscopio de Polarización: Basado en la rotación del plano de luz polarizada por moléculas
ordenadas. Incorpora filtros de polarización para analizar muestras con estructuras
moleculares alineadas, ayudando a estudiar tejidos y materiales que no se ven bien con
microscopía óptica convencional.

Microscopia de superresolución

La microscopía de superresolución permite observar detalles celulares más finos que los
microscopios ópticos convencionales, que tienen un límite de resolución de unos 200
nanómetros. Utiliza técnicas como PALM y STORM, que emplean moléculas fluorescentes para
lograr resoluciones de 10-20 nanómetros. Otra técnica, SIM, usa patrones de luz para mejorar
la resolución a unos 100 nanómetros. Además, métodos como STED reducen la resolución a
30-80 nanómetros al agotar la emisión de luz. Estas técnicas permiten ver detalles celulares
que antes eran inalcanzables.

Microscopia electrónica

En los microscopios electrónicos, se emplean electrones en lugar de luz para obtener imágenes
de alta resolución. Hay dos tipos:

Microscopía Electrónica de Transmisión (MET): Usa un haz de electrones que atraviesa la

muestra. La óptica del MET es similar a la del microscopio óptico, pero con una resolución
mucho mayor debido al uso de electrones. Esto permite observar estructuras internas de la
muestra con gran detalle.

Microscopía Electrónica de Barrido (MEB): Utiliza un haz de electrones que explora la superficie
de la muestra. Esto produce imágenes tridimensionales que muestran la estructura superficial
de la muestra examinada, revelando detalles que no son visibles con la microscopía óptica.

Microscopia de fuerza atómica

El microscopio de fuerza atómica (MFA) es una herramienta avanzada para estudiar la

topografía superficial con resolución a nivel molecular y atómico. A diferencia de los
microscopios electrónicos, el MFA no utiliza luz ni electrones, sino una sonda que "siente" la
superficie de la muestra, similar a cómo nuestros dedos perciben texturas.

Una de las grandes ventajas del MFA es que no requiere que la muestra esté en vacío; puede
estar en ambientes naturales, incluso en agua. Esto permite observar células vivas y su entorno
sin necesidad de preparaciones complejas.

Microscopia virtual
La microscopía virtual es una técnica que combina la microscopía óptica con tecnología digital.
En lugar de usar un microscopio físico para ver las muestras, se toman imágenes digitales de
alta resolución de los portaobjetos. Estas imágenes se almacenan en servidores y se pueden
ver y analizar en una computadora sin necesidad del microscopio. Esta tecnología permite
explorar y manipular las muestras de manera más flexible y remota, ofreciendo nuevas formas
de estudiar los preparados que no están disponibles con microscopios tradicionales.