MANUALE D’USO HPLC
Filtro
Eluente
Reflui
Loop e scarico
Switch
Detector Iniettore
Pre-colonna
Colonna 0
Pompe
Schema dello strumento.
ACCENSIONE:
Per prima cosa accendere il sistema HPLC ovvero le due pompe, il rilevatore e infine lo
switch.
All’accensione, lo schermo del rilevatore farà tutto il check del suo sistema e della
lampada segnalando eventuali problemi. Quando compare la schermata fissa NORM S
STD è possibile accendere il computer.
Entrare come USERS (non è richiesta la password) e selezionare l’icona del programma Chrompass.
All’avvio esce la seguente schermata dove si dà solo OK. Si apre quindi una schermata bianca, cliccare in
basso a sinistra su SYSTEM e poi spuntare il quadratino in alto. Compare la schermata ‘STATUS OVERVIEW’
ovvero la mappa di tutto il sistema, dove bisogna controllare che tutti i semaforini siano VERDI altrimenti il
semaforo rosso indica la presenza di un problema e dove è localizzato.
CREARE UN METODO:
Seguire il percorso FILE->OPEN->METHOD->Prodotti Mattia e selezionare il file [Link] che è il file
madre.
Il file viene quindi aperto in alto a sinistra mentre sotto ci sono i parametri per acquisizione e il processing
del cromatogramma. Nella parte inferiore, andare su CONTROL. Qui si impostato i parametri sperimentali
principali come la MISCELA ELUENTE e il FLUSSO (sotto la voce PUMPS) e la LUNGHEZZA D’ONDA per il
rilevatore (sotto la voce DETECTORS).
Una volta impostato tutto, fare FILE->SAVE->SAVE METHOD AS, nominare a piacimento e chiudere quindi il
metodo.
[è bene non superare il 40% di ISOPROPANOLO nell’eluente e
massimo del FLUSSO 1.0 soprattutto se si usano colonne H].
MONITOR DELLA LINEA DI BASE:
una volta creato il metodo, bisogna impaccare la colonna prima della vera e propria iniezione. Fare quindi
Acquisition->Monitor in base line. A meno di creare una cartella apposita, i metodi creati come sopra si
trovano nel Project name: prodotti mattia, per il system name lasciare sempre system 1 e infine scegliere il
metodo desiderato nell’ultima tendina.
Una volta dato l’ok, il sistema di pompaggio si aziona e inizia a vedersi la forma della linea di base sul
monitor rispetto al tempo. Di solito basta una 15 di minuti per avere una linea di base ‘piatta’, in generale,
quando si vede che la linea rimane costante si può procedere con l’iniezione vera e propria.
Controllo del metodo scelto
e della pressione interna
NB: se la colonna o i solventi sono stati cambiati, è possibile che ci siano delle bolle d’aria che vengono
rilevate durante il monitoring, quindi lasciare correre l’eluente e aspettare che la linea si stabilizzi.
!!!! importantissimo controllare la pressione della colonna durante l’utilizzo dello strumento (vedi riquadro
pres. in status overview), se la pressione cresce troppo il sistema si arresta automaticamente per evitare
danni alla colonna.
L’aumento di pressione può essere dovuto a:
Condizioni solvente (esempio troppo IPA) e temperatura esterna.
Cristallizzazione del prodotto nell’eluente.
Aria nel sistema.
Impaccamento specifico della colonna (attenzione colonne OD vs OD-H)
Una volta pronti per l’iniezione, fermare il monitoring con il segnale STOP presente nella schermata di
acquisizione.
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE:
il sistema è un HPLC analitico quindi non esagerare nella concentrazione del campione da iniettare per
evitare saturazione del rilevatore e allargamento del segnale.
Concentrazione ideale 1mg in 2 ml di eluente che può essere poi adattata in base alla struttura specifica del
campione tipo: con il rilevatore a 254 nm e 3 gruppi aromatici si può anche diluire un po’ di più il campione
in modo che assorbimento non superi i 200 mV.
Il campione viene preparato e iniettato utilizzando SOLO le siringhe presenti nel primo cassetto sotto la
cappa dell’idrogenatore (2 siringhe da 1ml e 1 siringa da 100 ul).
Pesare quindi circa 1mg di composto in una vial vergine, aggiungere 2 ml di isopropanolo e per aiutare il
discioglimento, usare il sonicatore ed eventualmente diluire il campione e/o scaldare.
Prelevare un ml di soluzione madre, togliere l’ago e mettere il filtro, quindi filtrare in una seconda vial
vergine.
!!!! in HPLC vengono iniettati SOLO SOLUZIONI MICROFILTRATE e SI USANO SOLO SOLVENTRI FOR HPLC !!!!
INIEZIONE DEL CAMPIONE:
Usare la siringa da 100 ul e prelevare anche 60 ul
cercando di non fare bolle.
Inserire la siringa fino in fondo e riempire il LOOP fino a
che non escono le goccioline dallo scarico.
Lasciare dentro la siringa e girare l’iniettore verso il
basso e lasciare tutto il sistema inserito per circa 30
secondi controllando che la linea di base appaia sul
monitor.
Passato quindi il tempo, rigirare l’iniettore verso l’alto
ed estrarre la siringa.
Lavare bene tutte le siringhe utilizzate con isopropanolo
e rimettere il tutto nel cassetto dopo l’uso.
ACQUISIZIONE:
andare su Acquisition->Quick start e come per il monitor in baseline, definire il metodo da utilizzare, poi
inserire tutti i dati utili riguardo al campione nella successiva schermata.
NOME CAMPIONE
Metodo di preparazione (xmg in xml) e colonna utilizzata.
Le info del metodo sono già salvate.
Una volta dato lo START compare la schermata bianca di seguito. Girato l’iniettore, il sistema parte e si vede
la linea di base che inizia a correre.
NOME CAMPIONE
CAMBIARE LA COLONNA:
Utilizzando le chiavi inglesi che si trovano nei cassetti vicino all’idrogenatore, svitare i due bulloni in testa e
coda alla colonna. Sostituire quindi la prima colonna avendo cura di avvitare i tappini che si trovano dentro
la scatola della colonna oppure usare quelli della colonna da montare.
Bulloni da svitare
Montare quindi la nuova colonna avvitando con cura la testa e la coda e ATTENZIONE alla DIREZIONE DEL
FLUSSO cha va dall’iniettore verso il rilevatore come in figura.
Se la colonna viene sostituita mentre HPLC è in funzione, spegnere il sistema di pompaggio dal monitor
(OFF) prima di svitare la colonna, e poi riattivare con ON una volta terminata l’installazione.
NB: prima di sostituire la colonna, fare sempre un MONITOR IN BASELINE per verificare che non sia rimasto
nulla in colonna. Ogni colonna ha il suo eluente di mantenimento che di solito è 80:20
ESANO:ISOPROPANOLO. Verificare le istruzioni o sul sito della colonna o sul foglio che si trova dentro la
confezione per preservare l’efficienza della colonna.
Anche una volta terminata l’iniezione e prima di spegnere il sistema, fare SEMPRE un MONITOR in
BASELINE per pulire la colonna dopo l’utilizzo.