CROMATOGRAFIA

1. ADSORBIMENTO: già fatta

2. RIPARTIZIONE

Fase stazionaria liquida chimicamente legata al supporto solido, detta bonded phase
(BP), immiscibile con la fase mobile; le sostanze da separare si solubilizzano nelle due
fasi, distribuendosi in base alla diversa affinità per l’una o l’altra.

Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice(silanoli)

vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria.

3. SCAMBIO IONICO

fase stazionaria = è costituita da un polimero inerte (resine sintetiche) contenente siti

attivi ionizzati o ionizzabili (gruppi funzionali acidi o basici), i cui contro-ioni possono
essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno.

Durante l’eluizione gli ioni della miscela da separare vengono separati gli uni dagli altri in
base alla diversa affinità di ciascuno per i siti della fase stazionaria.

4. ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC)

Molecole separate in base al peso molecolare e ingombro sterico.

Fase stazionaria = solido poroso (gel):

le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori del gel in base
alla loro dimensione e vi rimangono per un certo tempo, mentre le molecole troppo
grandi vengono escluse dai pori e quindi usciranno prima.

5. AFFINITà

fase stazionaria = solido in polvere. SITI ATTIVI SPECIFICI per le molecole da separare
(si sfruttano reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche). Le molecole
rimangono così bloccate fino a quando, con un eluente opportuno, non si rompono
SELETTIVAMENTE i legami tra le molecole e la fase stazionaria.

Classificazione tecniche cromatografiche

Tre criteri generali di classificazione:
 secondo la fase mobile

- gas
- fluido supercritico
- liquido
  secondo la fase stazionaria  come quelli sopra, ma con riferimento alla tecnica
(adsorbimento o ripartizione); collocazione della fase stazionaria:
- in colonna (Cromatografia in colonna)
- su una superficie planare(Cromatografia Planare)

 secondo la coppia fase mobile/fase stazionaria (polare-apolare)

- fase normale
- fase inversa

Area sottesa alla curva nel cromatogramma (o l’altezza del picco, a seconda della tecnica
cromatografica) è proporzionale alla concentrazione (o quantità) di sostanza separata.
Tempo di ritenzione (tR) = tempo impiegato da ciascuna sostanza per scorrere lungo la
colonna, misurato da t0 all’istante in cui si registra il massimo del picco. In alternativa si misura
il Volume di ritenzione (VR).
Tempo morto (tM) = tempo di ritenzione di una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria.
Volume morto (VM =) volume della colonna non occupato dalla fase stazionaria, quindi a
disposizione della fase mobile.

Analisi quantitativa
1) Altezza del picco
Metodo semplice e rapido. Valido quando ci sono picchi molto stretti. L’altezza del picco è
direttamente proporzionale alla concentrazione della sostanza.
2) Area del picco
La concentrazione dell’analita C è direttamente proporzionale all’area del picco A.
C = fA
dove f è chiamato fattore di risposta.

Per capire se una separazione cromatografica è ottimale, sono necessari parametri oggettivi,
che riusciamo a calcolare proprio a partire dal cromatogramma:
1. Fattore di ritenzione (k): misura in quale proporzione una certa sostanza viene ritardata dalla
fase stazionaria.

2. Selettività (α): La capacità del sistema di eluire specie chimiche differenti a velocità differenti.

3. Efficienza (N): La capacità del sistema di mantenere le bande ristrette, fornendo picchi
appuntiti.

4. Risoluzione (Rs): Il grado di separazione reale tra due picchi cromatografici adiacenti.
5. Capacità della colonna e difetti del picco: Viene affrontato il problema del sovraccarico
(overloading) del campione, spiegando i fenomeni di asimmetria del picco come lo
scodamento (tailing) e il fronting.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA
La cromatografia liquida su colonna permette di separare i componenti di una miscela
distribuendoli tra una fase stazionaria (contenuta in una colonna) e una fase mobile liquida
(eluente) che vi scorre attraverso. In base alla pressione di lavoro, si classifica in LPLC (bassa
pressione), MPLC (media pressione) e HPLC (alta pressione), che è lo standard di riferimento
attuale.

1. Differenze tra LC Classica e HPLC

L'HPLC (High Performance Liquid Chromatography) offre una risoluzione e una velocità
nettamente superiori rispetto alla cromatografia classica. Questo miglioramento è dovuto
principalmente a due fattori:
 Dimensioni delle colonne: Molto più corte e strette (lunghezza 100-250 mm contro
500-2000 mm).
 Dimensioni delle particelle: La fase stazionaria ha diametri estremamente ridotti (3-10
micrometri contro i 150 della LC classica). Particelle più piccole aumentano l'area di
scambio, ma oppongono una grande resistenza al flusso, rendendo necessarie pompe in
grado di lavorare a pressioni elevatissime (fino a oltre 1000 atmosfere).
2. Componenti del Sistema HPLC
Un cromatografo HPLC è composto da una serie di moduli in linea che portano l'eluente dai
serbatoi fino allo scarico.
 Eluenti (Fase Mobile): I solventi devono essere ultrapuri. Devono essere
obbligatoriamente sottoposti a filtrazione (per rimuovere particelle solide che
intaserebbero la colonna) e a degasaggio (tramite elio o vuoto, per eliminare i gas
disciolti che creerebbero bolle nella pompa o nel rivelatore).
 Le Pompe: Devono garantire un flusso di solvente rigorosamente costante e privo di
pulsazioni. Vengono usate pompe "alternative reciprocanti", dotate di due pistoni che
lavorano in modo alternato per compensare le cadute di pressione e inviare un flusso
fluido.
 Sistema di Iniezione: Portare un campione a pressione atmosferica dentro un sistema
che si trova a 1000 atmosfere è complesso. Si usano perciò speciali valvole di iniezione
(es. Valvola Rheodyne) dotate di un capillare esterno detto "loop" di volume fisso e noto.
Il campione viene caricato nel loop senza interrompere il flusso e, girando la valvola,
l'eluente in pressione spazza via il campione dal loop verso la colonna.
 Le Colonne: Generalmente in acciaio, sono sigillate alle estremità da filtri porosi ("frit")
per trattenere la fase stazionaria. È fondamentale utilizzare una "precolonna" di
 protezione per bloccare eventuali inquinanti prima che rovinino la colonna analitica vera
e propria.
3. Ottimizzazione della Separazione
Per migliorare una separazione, l'operatore può agire su tre parametri fondamentali:
composizione della fase mobile, pH e temperatura.
 Eluizione Isocratica vs Gradiente: Nell'eluizione isocratica, la composizione
dell'eluente rimane identica per tutta l'analisi. Nell'eluizione a gradiente, la forza del
solvente viene modificata in tempo reale (ad esempio aumentando progressivamente la
percentuale del solvente più "forte"). Il gradiente migliora la risoluzione per le miscele
complesse e abbrevia moltissimo i tempi di analisi dei composti trattenuti troppo a lungo
in colonna.
 Variazione del pH: Modifica lo stato di ionizzazione degli analiti, cambiandone
l'idrofobicità e quindi l'ordine in cui escono dalla colonna.
 Temperatura: Alzare la temperatura (tramite appositi forni per colonne) riduce la
viscosità dell'eluente e aumenta la velocità degli scambi di massa, riducendo la
pressione necessaria e migliorando l'efficienza complessiva (picchi più stretti).
4. I Rivelatori (Detectors)
Posti all'uscita della colonna, traducono il passaggio degli analiti in un segnale elettrico. Si
dividono in rivelatori di proprietà globali (misurano una differenza fisica tra l'eluente puro e
quello con il campione) e rivelatori di soluto (misurano una proprietà specifica solo della
molecola separata).
 Indice di Rifrazione (RID): Rivelatore di proprietà globale. È universale (ogni sostanza
varia l'indice di rifrazione), ma ha bassa sensibilità ed è assolutamente incompatibile con
l'eluizione a gradiente.
 Assorbimento UV-Visibile (UVD): Il più usato in assoluto. Misura l'assorbanza della
luce. Può essere a singola lunghezza d'onda, a lunghezza d'onda variabile, o a serie di
diodi (Diode Array). Il Diode Array è formidabile perché registra lo spettro di
assorbimento completo in continuo per ogni sostanza che esce, aiutando anche a
identificarla. Compatibile con il gradiente.
 A Fluorescenza: Sfrutta le molecole che, se eccitate con un raggio luminoso, emettono
luce a lunghezze d'onda diverse. È ultra-sensibile e ultra-selettivo, ma funziona solo per
molecole naturalmente fluorescenti (come gli idrocarburi policiclici aromatici) o
preventivamente derivatizzate.
 Elettrochimico (Conduttimetrico/Amperometrico): Eccellente per gli ioni e le molecole
facilmente ossidabili/riducibili. Ha limiti di rilevabilità bassissimi ma non sopporta il
gradiente di concentrazione.
 Evaporative Light Scattering (ELS): La fase mobile viene nebulizzata ed evaporata in
un tubo riscaldato. Le molecole del campione rimangono sotto forma di aerosol solido e
diffondono la luce di un raggio laser. È un rivelatore universale molto comodo.
 Spettrometro di Massa (MS): Fornisce dati qualitativi (massa della molecola) e
quantitativi. Richiede sofisticate interfacce per far evaporare il solvente liquido e
trasformare l'analita in fase gas sotto forma di ioni.
5. Fast e Ultra-Fast LC (UPLC / UHPLC)
Oggi la vera frontiera è ridurre i tempi di analisi portandoli da decine di minuti a pochi secondi,
risparmiando tempo e solvente.
Per fare questo senza perdere la risoluzione si usano colonne molto corte combinate a
particelle ancora più piccole (minori di 2 micrometri, ad esempio 1.8 µm) e flussi di solvente
più veloci. Questa accoppiata genera però contropressioni formidabili all'interno del sistema; il
problema si bypassa scaldando la colonna a temperature maggiori (che riducono di molto la
viscosità e la pressione). Questa tecnologia richiede macchinari appositi, dotati di pompe in
grado di reggere lo sforzo, autocampionatori fulminei nell'iniezione, rivelatori ultra-rapidi nella
scansione e con volumi morti ridotti al minimo assoluto.

GASCROMATOGRAFIA
 La fase mobile è un gas (azoto, elio o idrogeno) che ha esclusivamente la funzione di
trasportare gli analiti lungo la colonna.
 I meccanismi di separazione sono determinati interamente dall'interazione dei composti
con la fase stazionaria.
 La condizione fondamentale per usare la GC è che il campione deve poter essere
vaporizzato senza subire decomposizione termica.
 La tecnica è indicata per molecole con peso molecolare fino a 500 uma e con punti di
ebollizione inferiori a 250°C.
 Per i composti altobollenti (es. zuccheri, acidi grassi, amminoacidi) si effettua la
derivatizzazione, una reazione che li trasforma in derivati più stabili e volatili, come ad
esempio la trasformazione di acidi in metilesteri.
2. Le Colonne e l'Efficienza (Equazione di Van Deemter)
 Le colonne impaccate sono riempite con un supporto solido e poroso ricoperto dalla fase
stazionaria, e possiedono diametri interni larghi (0.75-4 mm).
 Le colonne capillari (come WCOT, SCOT, PLOT) hanno la fase stazionaria depositata
solo sulle pareti interne sotto forma di film sottilissimo, lasciando un unico grande canale
centrale libero per il flusso del gas.
 Le colonne capillari offrono un'efficienza nettamente superiore (fino a 200.000 piatti
teorici contro i 10.000 delle impaccate) perché permettono di usare lunghezze molto
maggiori (fino a 100 metri) grazie alla bassissima resistenza al flusso del gas.
 Considerando l'equazione di Van Deemter ($H = A + B/u + Cu$), nelle colonne capillari il
termine A (diffusione vorticosa dovuta ai percorsi multipli tra le particelle) si azzera.
 Le colonne capillari permettono inoltre di lavorare a velocità lineari del gas molto elevate
senza perdere efficienza (la curva si appiattisce nel termine C), accorciando
enormemente i tempi di analisi.

3. La Fase Mobile (Gas di Trasporto o Carrier)

  Il gas deve possedere un'elevata inerzia chimica ed essere totalmente privo di umidità,
ossigeno e altre impurezze per non distruggere la fase stazionaria o alterare i rivelatori.
 L'azoto fornisce la migliore efficienza assoluta (altezza del piatto minima), ma solo a
basse velocità di flusso, dilatando i tempi di analisi.
 Elio e idrogeno sono spesso preferiti perché, pur avendo un minimo di altezza del piatto
leggermente superiore, consentono di aumentare parecchio la velocità del flusso senza
che l'efficienza crolli.
4. Controllo della Temperatura
 La temperatura regola l'equilibrio termodinamico gas-liquido: un aumento di temperatura
innalza la tensione di vapore dei composti, che passano più tempo nella fase mobile,
abbassando i tempi di ritenzione.
 L'analisi può avvenire in isoterma (temperatura costante) o sfruttando un gradiente di
temperatura (rampe termiche programmate).
 Il gradiente di temperatura è essenziale per risolvere miscele complesse, eludendo i
composti leggeri a basse temperature per separarli bene, e accelerando poi l'uscita dei
composti altobollenti.
 Il limite superiore di temperatura è dettato dalla stabilità del campione e della fase
stazionaria; oltrepassarlo causa lo "spurgo" (bleeding), ovvero la fuoriuscita della fase
liquida dalla colonna che ottura e rovina i rivelatori.
5. Sistemi di Iniezione
 L'iniettore deve vaporizzare il campione in modo istantaneo e omogeneo miscelandolo
con il carrier.
 L'iniezione Split divide il flusso di gas vaporizzato: solo una minuscola percentuale (es.
1%) entra nella colonna capillare, mentre il grosso viene scaricato all'esterno. È cruciale
per non saturare la bassissima capacità delle colonne capillari.
 L'iniezione Splitless è pensata per l'analisi in tracce. La valvola di spurgo resta chiusa
inizialmente per mandare quasi tutto il campione in colonna, sfruttando la condensazione
in testa (focusing) per ricompattare la banda cromatografica; in seguito la valvola si apre
per spurgare i vapori di solvente rimasti nell'iniettore.
 L'iniezione On-column salta la fase di vaporizzazione rapida. Il liquido viene deposto
tramite un sottilissimo ago direttamente in testa alla colonna "fredda"; è la tecnica
d'elezione per non degradare molecole termolabili e per non perdere i componenti
volatili.
6. Rivelatori Sensibili
 HWD (Termoconducibilità): È il classico rivelatore "universale" basato su un ponte di
Wheatstone. Non distrugge il campione, ma ha una sensibilità modesta (limite dei ppm).
 FID (Ionizzazione di fiamma): Universale per le molecole organiche (legami C-C e C-H).
Il campione viene bruciato in una microfiamma idrogeno/aria generando ioni che
producono una corrente. È distruttivo, molto stabile e ha un range di linearità altissimo.
 AFID e FPD: Sono varianti specializzate del FID, usate per rivelare selettivamente tracce
di composti contenenti azoto, zolfo e fosforo.
  ECD (Cattura di Elettroni): Straordinariamente sensibile (rilevazione a livello di ppt) e
selettivo per molecole elettronegative (es. insetticidi e pesticidi alogenati). Sfrutta una
sorgente radioattiva di Nichel-63 e non è distruttivo.
7. Tecniche Avanzate per il Trattamento del Campione
 Spazio di Testa (HSGC): Permette di analizzare analiti volatili dispersi in matrici solide o
in grandi volumi di solventi complessi. Il campione è termostatato in un vial chiuso finché
i composti volatili si mettono in equilibrio col gas sovrastante, che viene poi prelevato e
iniettato.
 SPME (Microestrazione in fase solida): Sfrutta una siringa dotata di una minuscola fibra
retrattile ricoperta di polimero (es. PDMS). La fibra assorbe selettivamente gli analiti
volatili direttamente o nello spazio di testa; successivamente l'ago viene inserito
nell'iniettore caldo della GC per desorbire le molecole termicamente.
 Purge and Trap: Viene flussato gas inerte direttamente nel campione per estrarre
("strippare") a fondo gli analiti volatili; questi passano attraverso una trappola adsorbente
(es. Tenax o carbone attivo) che li pre-concentra, per poi venire scaldati di colpo ed eluiti
verso la colonna cromatografica.