TOSSICOLOGIA

PRINCIPI DI FARMACOLOGIA GENERALE

Circa l’80% della popolazione mondiale si affida ai sistemi della medicina tradizionale a base di erbe (fonte
OMS 2000).
Una stima dell’OMS indica che da 35.000 a 75.000 specie di piante vengono utilizzate, e per solo 5.000 di
queste è stata valutata l’efficacia scientifica.

Droghe vegetali
• 4000-500 a.C.: prime conoscenze sulle azioni benefiche di alcune piante
• 1493-1541 Paracelso: merito di aver dimostrato che i medicamenti vegetali non sono entità
terapeutiche inscindibili, ma il principio attivo che ne determina l’attività benefica può essere
estratto ed usato come e meglio dei medicamenti vegetali stessi.
• Inizi 1800: validazione scientifica delle intuizioni di Paracelso, si scoprirono e si isolarono i
costituenti attivi delle piante medicinali. Nel 1803 venne isolata la morfina, nel 1820 la chinina e la
caffeina….
• 1889: si ottiene per sintesi il primo alcaloide: la coniina
• Susseguirsi di tentativi per ottenere farmaci di sintesi
• Sviluppo dell’industria farmaceutica i cui prodotti sempre più numerosi vanno a sostituirsi alle
droghe vegetali.
• Per le piante medicinali inizia così un periodo da un lato di declino, ma dall’altro anche di verifica e
apprendimento della loro valenza terapeutica.
• Si studiano la funzione farmacologica, il meccanismo d’azione e la tossicità degli estratti vegetali
standardizzati e dei principi attivi più importanti.

Il declino…
Dalla metà del XX secolo: sviluppo su scala industriale di una quantità enorme di specialità medicinali.
Vantaggio: una volta ottenuti allo stato puro e in forma stabile, i principi attivi delle piante hanno,
rispetto alle droghe vegetali, una maggior costanza d’azione e offrono la possibilità di stabilire un più
esatto rapporto tra dose e attività desiderata.
Inoltre, l’industria farmaceutica ha sviluppato la sintesi chimica, che ha permesso di avere a
disposizione nuove e sempre più attive molecole di interesse terapeutico.
Responsabilità da parte del medico: i medici imparano facilmente a prescrivere le specialità medicinali
piuttosto che a prescrivere preparazioni galeniche più o meno elaborate con indicazioni precise per il
preparatore e per il paziente.
Il paziente preferisce il farmaco di sintesi molto più attivo e dall’effetto più immediato.

Il ritorno…
ERBORISTA: pregio di aver potenziato e sviluppato il ruolo delle droghe vegetali.
✔Bisogno di realizzare terapie che diano beneficio terapeutico limitando gli effetti indesiderati.
✔Farmacofobia: si preferisce rivolgersi a farmaci naturali, meno costanti negli effetti medicamentosi,
ma meglio tollerati e comunque potenzialmente utili.
✔È stato evidenziato che l’azione farmacologica del principio attivo non sempre si identifica con quella
della pianta di partenza.
✔Questo ritorno è anche facilitato dalla possibilità: - di conservare meglio le piante medicinali e i loro
prodotti d’estrazione; - di utilizzare un prodotto vegetale con un contenuto costante di principi attivi.

Farmaco: ogni sostanza capace di provocare in un organismo modificazioni funzionali mediante

un’azione chimica o fisica.

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Droghe in erboristeria
Le droghe vegetali, a seconda delle sostanze che contengono e per le quali vengono utilizzate, si possono
classificare nelle seguenti categorie:
a) Droghe che contengono sostanze attive sul SNC (es. oppio, uso voluttuario piuttosto che terapeutico)
b) Droghe di uso quotidiano (es. tè, caffè)
c) Droghe che contengono sostanze attive ma anche molto tossiche (es. digitale, NO erboristeria).
d) Droghe utilizzate per le loro specifiche proprietà farmacologiche (es. aglio)
e) Droghe utilizzate per la loro attività coadiuvante (es. rosa canina per carenza di vit. C)
f) Droghe utilizzate per correggere il gusto di preparazioni farmaceutiche e/o preparare soluzioni ad
attività disinfettante (es. arancio amaro come aromatizzante)
g) Droghe utilizzate per abbellire le preparazioni estrattive

Ovviamente nessuna delle droghe della categoria a si può ritrovare in erboristeria, mentre delle droghe b il
tè, il matè e il carcadè possono essere presenti. Le droghe della categoria c sono recuperabili solo in
farmacia.
Molte delle droghe delle categorie e, f, g sono presenti anche in erboristeria e consigliate dall’erborista per
risolvere problemi estetici (prodotti di uso topico), alimentari (integratori alimentari contenenti droghe
vegetali ricche di vitamine, elementi etc.) ed in alcuni casi salutistici (prodotti utili in caso di affaticamento,
stomatite, dispepsia).
L’erborista con conoscenze botaniche, fitochimiche, di farmacognosia e fitofarmacologia dispensa anche
droghe vegetali della categoria d.

Dalla pianta al medicamento

La pianta in genere viene utilizzata come medicinale solo dopo una serie di interventi che servono
sostanzialmente ad estrarne le sostanze idonee per una certa attività farmacologica.

Fattori intrinseci:
✓ Specie botanica (dal punto di vista scientifico sempre nome botanico, in alcuni casi sotto un nome
comune possono essere ricondotte piante diverse non solo per specie, ma anche per genere).
Es. Anice: anice stellato cinese (Illicium stellatum) è morfologicamente simile all’anice stellato
giapponese (Illicium religiosum). Illicium stellatum: tradizionalmente usato come aromatizzante e
antidispeptico. Illicium religiosum: conosciuto per la sua neurotossicità: contiene olio essenziale
responsabile di crisi convulsive e alterazioni dello stato di coscienza.

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 ✓ Chemiotipo (nell’ambito della stessa specie botanica esiste la possibilità di avere una produzione di
metaboliti secondari differenziati, dando così origine a diversi chemiotipi).
✓ Mutazione genetiche spontanee (possono variare la concentrazione di PA).
✓ Selezione genetica (è possibile scegliere e far riprodurre solo piante che spontaneamente
presentano certe caratteristiche produttive, per avere caratteristiche migliori).
✓ Parte della pianta utilizzata -droga- (a seconda della parte di pianta utilizzata avrò proprietà diverse).
✓ Periodo di raccolta (periodo balsamico: periodo migliore per la raccolta, sia per quanto riguarda la
quantità sia per la qualità de PA, che però non sempre coincide. Es. Olio essenziale di Santoreggia:
quantitativamente scarso in ottobre e abbondante a maggio, ma in ottobre è ricco di p-cimene e in
maggio di carvacrolo).
Fattori estrinseci:
✓ Fattori ambientali (luce, temperatura, latitudine, altitudine, umidità).
✓ Mutazioni genetiche indotte (aumentare i PA modificando il numero di cromosomi -mutazione
genomica- o la struttura di un cromosoma -mutazione cromosomica-).
✓ Fattori biotici -allelopatia- (per allelopatia in generale si intende il condizionamento o l’interazione
di un essere vivente alla crescita e allo sviluppo di un altro essere vivente mediante la secrezione di
sostanze organiche).
✓ Terreno (tessitura, pH ed elementi nutritivi).
Una pianta se al di fuori del suo habitat può completamente perdere la capacità di sintetizzare
determinati principi attivi e quindi la droga potrebbe risultare inattiva.
Es. L’aconito e la cicuta, molto tossiche nei paesi mediterranei, sono praticamente innocue o poco
tossiche se cresciute in paesi freddi. Perciò, al di là delle sue caratteristiche intrinseche, per
continuare a produrre principi attivi la pianta deve crescere in un ambiente favorevole per clima e
natura del terreno.
✓ Post raccolta (dopo la raccolta nella pianta continuano alcune modificazioni quali-quantitative tra i
suoi costituenti e metaboliti secondari. Una cattiva conservazione delle droghe può essere anche
responsabile di fenomeni di contaminazione batterica o fungina e portare alla produzione di tossine
o composti diversi da quelli presenti nella pianta).

FARMACOCINETICA (introduzione generale)

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Le vie di somministrazione più importanti per i prodotti erboristici sono: la via orale e la via topica.
Nella fase biofarmaceutica in cui si ha la disgregazione e la dissoluzione del prodotto, e il PA passa in
soluzione.
Per quanto riguarda la fase farmacocinetica, che descrive il percorso del PA dal momento della sua
dissoluzione fino al raggiungimento della biofase (bersaglio).
Essa si divide in:
• Assorbimento: passaggio del PA dalla sede di applicazione al sangue, attraverso le membrane
biologiche.
• Distribuzione: distribuzione del PA dal sangue ai diversi compartimenti dell’organismo.
• Metabolismo: modificazioni chimiche che il PA subisce nell’organismo.
• Eliminazione: escrezione del PA.

I meccanismi di trasporto di un PA sono:

• Diffusione passiva (passaggio di molecole o ioni attraverso la membrana che utilizza esclusivamente
il gradiente di concentrazione)
• Diffusione facilitata (passaggio di molecole o ioni attraverso la membrana che utilizza proteine
trasportatrici, ma che funziona esclusivamente secondo il gradiente di concentrazione e non
richiede energia)
• Endocitosi (anche mediata da recettore)
• Trasporto attivo (passaggio di molecole o ioni attraverso la membrana che richiede l’attività di
specifiche proteine e il consumo di energia).
L’energia necessaria deriva dall’idrolisi di metaboliti energetici, come l’ATP, e le molecole con questa
funzione vengono chiamate POMPE.
Se come energia si sfrutta quella elettrochimica generata da un contro-ione le relative proteine
vengono chiamate SCAMBIATORI O TRASPORTATORI.

COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE: è una misura del grado di lipofilia di un composto, è relativo a come la
sostanza si distribuisce in un volume contenente olio e acqua.

Nella maggior parte dei casi il trasporto avviene per diffusione passiva: i farmaci con un adeguato
coefficiente di ripartizione possono diffondere attraverso le membrane cellulari. La diffusione tra due
compartimenti separati da una membrana è governata dalla legge di Fick:
(C1 − C2) × D × A
𝑉=
d
Flusso molare (V): velocità (moli per secondo) del passaggio di un soluto dal compartimento 1 al
compartimento 2; c1 e c2 sono le concentrazioni del composto nei due compartimenti; D: coefficiente di
diffusione che dipende dalle caratteristiche chimico fisiche di solvente e soluto ed è correlato al coefficiente
di ripartizione; A: l’area della membrana; d: spessore della membrana.
Quindi:

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 ✓ l flusso netto di farmaco attraverso una membrana biologica è tanto maggiore quanto maggiore è la
differenza di concentrazione del farmaco nei due compartimenti. Il flusso quindi si riduce nel tempo
a mano a mano che le concentrazioni si equilibrano;
✓ farmaci diversi hanno diversa capacità di attraversare le membrane a seconda del loro coefficiente
di diffusione/ripartizione;
✓ Il passaggio è tanto più efficiente quanto è più sottile la barriera da superare;
✓ Ciò che influenza la diffusione passiva sono la lipofilia e l’ingombro sterico;
✓ È più facile assorbire nell’intestino piuttosto che nello stomaco;
Le barriere attraversate durante la diffusione passiva:
• ENDOTELIO CAPILLARE
Costituisce una barriera cellulare molto labile in quanto caratterizzata da spessore limitato, alta
attività di endo-esocitosi e presenza di pori di membrana (sottile e fenestrato).
Per molecole idrofiliche e polarizzate il passaggio avviene tramite pori e il fattore determinante è
quindi la dimensione molecolare del farmaco.
Il più permeabile è quello dei globuli renali e del fegato, mentre il meno permeabile è quello dei
capillari cerebrali.

• BARRIERA EMATOENCEFALICA
I capillari encefalici sono caratterizzati dall’assenza di pori di grande diametro e presentano un
rivestimento quasi continuo di cellule gliali.
Solo farmaci ad elevata liposolubilità e a basso PM sono in grado di oltrepassarla, mentre i farmaci
idrofili non riescono ad oltrepassarla a meno che non vi sia una compromissione funzionale della
barriera (es. stati infiammatori e meningiti).
La penetrazione del farmaco nel SNC è influenzata da:
▪ Legame con le proteine plasmatiche (solo la parte di PA non legata può entrare nel torrente
circolatorio e arrivare al bersaglio)
▪ Grado di ionizzazione (la forma NON ionizzata -neutra- in linea generale attraversa meglio le
membrane biologiche per diffusione passiva)
▪ Coefficiente di ripartizione
A livello di tale barriera esistono anche meccanismi di trasporto attivo che consentono la
penetrazione nel SNC di aminoacidi, glucosio e piccoli peptidi.

FARMACOCINETICA
Branca della farmacologia che identifica e descrive gli eventi a cui è sottoposto un farma (principi attivo)
quando viene a contatto con un organismo.
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Fasi: assorbimento, distribuzione, metabolismo, eliminazione.
Parametri: biodisponibilità, volume di distribuzione, emivita plasmatica di eliminazione (Tmezzi), clearance
plasmatica.

1. Assorbimento
Insieme dei processi attivi e passivi che consentono il passaggio di un farmaco dal suo sito di
somministrazione alla circolazione sistemica.

Variabili che influenzano la velocità di assorbimento dei farmaci:

• Variabili dipendenti dal farmaco o dalla preparazione farmaceutica:
✓ Coefficiente di ripartizione
✓ Dissolubilità
• Variabili dipendenti dalla superficie assorbente:
✓ Estensione
✓ Permeabilità
✓ Vascolarizzazione

✓ Dissolubilità
Capacità della forma farmaceutica di dissolversi completamente nell’ambiente da cui deve essere assorbita.
La velocità di dissoluzione di una preparazione è correlata alla sua superficie, alla sua solubilità, al pH, agli
eccipienti e alla presenza di rivestimenti protettivi.

✓ Estensione della superficie assorbente

Maggiore è la superficie assorbente, più rapido è l’assorbimento del farmaco.
(es. poiché l’estensione della superficie dell’intestino è maggiore di quella gastrica, in genere i farmaci
somministrati per os vengono prevalentemente assorbiti a livello del piccolo intestino).

✓ Permeabilità della superficie assorbente

È fondamentalmente dipendente dallo spessore dell’eventuale corneificazione.
(es. l’assorbimento attraverso l’epitelio intestinale, monostratificato, è più rapido rispetto a quanto avviene
a livello cutaneo, epitelio stratificato corneificato)
Situazioni patologiche possono modificare la permeabilità di un epitelio: farmaci applicati su abrasioni o
ferite possono passare rapidamente in circolo.

✓ Vascolarizzazione
Maggiori sono la vascolarizzazione e il flusso ematico nella zona della somministrazione, maggiore è la
velocità di assorbimento.
(es. un farmaco per via intramuscolare raggiunge il circolo più velocemente rispetto alla via sottocutanea,
poiché il tessuto muscolare è più vascolarizzato)
Aumenti del flusso ematico per richieste funzionali (attività fisica) possono aumentare la velocità di
assorbimento.

Biodisponibilità
Frazione della dose somministrata che raggiunge la circolazione sistemica
non modificata (espressione %).
È rappresentata dall’area sotto la curva concentrazione plasmatica/tempo
(AUC).
Nella via di somministrazione endovenosa la biodisponibilità= 100%.

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Biodisponibilità per via orale
Per essere assorbito un farmaco somministrato per via orale deve:
✓ Dissolversi nel lume del tubo digerente;
✓ Attraversare la mucosa gastrointestinale;
✓ Superare il fegato (nel fegato il PA può subire il metabolismo di I passaggio, ovvero quelle
trasformazioni chimiche e metaboliche che avvengono prima che il PA arrivi nella circolazione
sistemica);

Assorbimento gastrico vs intestinale

Maggior assorbimento nel piccolo intestino: enorme superficie assorbente (200 m2 vs 1 m2 stomaco), flusso
ematico alto (1 l/min vs 0,15 l/min stomaco), mucosa permeabile a sostanze di piccole dimensioni anche se
con coefficiente di ripartizione piuttosto basso.

Dal punto di vista farmacocinetico lo stomaco deve quindi essere considerato non tanto come superficie
assorbente, quanto come organo di deposito che rilascia il farmaco assunto per os all’organo assorbente, il
piccolo intestino.
È quindi importante ricordare quali sono i fattori che controllano la velocità dello svuotamento dello
stomaco perché essi avranno un ruolo importante nel determinare la rapidità di assorbimento e quindi
l’insorgenza dell’effetto del principio attivo:
• A digiuno: lo svuotamento gastrico di liquidi, inclusi i principi attivi in essi disciolti, è relativamente
rapido. In questa fase lo stomaco presenta periodi di contrazione e rilassamento di durata variabile
che culminano in un’intensa contrazione espulsiva ogni 30 min circa. Il tempo necessario perché il
farmaco venga espulso dallo stomaco dipenderà quindi dall’intervallo intercorrente tra la
somministrazione e la successiva onda espulsiva.
• A stomaco pieno: In questo caso vi sono delle contrazioni regolari e discrete che provvedono a
mescolare e triturate il contenuto gastrico. Attraverso il piloro (regione terminale dello stomaco, che
regola il passaggio del contenuto gastrico nel duodeno-tratto iniziale dell’intestino tenue-)passano
solo particelle di dimensioni inferiori ai 2 mm. il tempo di svuotamento dello stomaco è in questo
caso molto allungato e di conseguenza il passaggio dei principi attivi al piccolo intestino è ritardato
Il tempo di transito nell’intero apparato digerente è di circa 1-2 giorni, ma il transito nella stazione
principale di assorbimento è di circa 3 ore.
Alterazioni della peristalsi vanno a modificare l’assorbimento.

Assorbimento per via transcutanea

In questo caso i PA applicati non devono essere assorbiti e avere effetti sistemici.
A livello cutaneo esistono 3 potenziali siti d’accesso con caratteristiche di permeabilità molto diverse:
• strato corneo;
• le ghiandole sudoripare;
• follicoli piliferi (in termini temporali sono la prima via di accesso);

Diversi fattori possono influenzare la velocità di assorbimento per questa via:

• Abrasioni, lesioni, ustioni e altre alterazioni possono causare una discontinuità dello strato corneo
attraverso cui i farmaci possono rapidamente diffondere nel tessuto connettivale e quindi
raggiungere poi la circolazione sistemica.
• Il grado di vascolarizzazione della cute può influenzare l’entità di assorbimento: flogosi e aumento
temperatura corporea possono aumentare l’assorbimento. Al contrario freddo o presenza di
vasocostrizione determinano riduzione dell’assorbimento.
• L’età del soggetto può influenzare l’assorbimento in quanto la cute dell’infante è molto più sottile,
così come regioni diverse della superficie corporea presentano spessori differenti, in ordine di
permeabilità crescente troviamo: plantare < avambraccio < cuoio capelluto < faccia posteriore del

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 padiglione auricolare. Mentre le mucose, che non prevedono lo strato corneo possono dar luogo ad
effetti sistemici.

[Link]
Fase farmacocinetica caratterizzata dal passaggio del farmaco dal torrente circolatorio ai tessuti.
I fattori che regolano la distribuzione sono:
• Coeff. di ripartizione del farmaco
• Peso molecolare del farmaco
• Caratteristiche anatomiche e grado di vascolarizzazione dei vari distretti
• Legame con le proteine plasmatiche
La maggior parte dei farmaci si legano alle proteine plasmatiche (principalmente albumina). L’entità della
quota legata è molto importante da un punto di vista farmacologico, perché solo la quota libera del
farmaco è biologicamente attiva.
Per farmaci con elevato legame proteico c’è la possibilità che si verifichi un incremento di attività dovuto a
fenomeni di spiazzamento (dal legame proteico) in caso di terapia combinata con altri farmaci fortemente
legati alle proteine.

Volume di distribuzione (Vd)

Parametro farmacocinetico (unità di misura in litri) che dà informazioni sulla capacità di diffusione e
penetrazione dei farmaci nei vari organi e tessuti dell’organismo.
Si definisce volume “apparente” di distribuzione poiché non sempre corrisponde al reale valore di fluidi
presenti nell’organismo.

Compartimenti (es individuo di 70Kg, circa il 60% del peso è costituito da acqua: 42 l):
• Plasma (circa 3 l)
• Fluidi extracellulari (circa 10-13 l)
• Fluidi intracellulari (25-28 l)
Quindi…
• Farmaci confinati al plasma avranno un Vd< 3 l
• Farmaci confinati al plasma e ai fluidi extracellulari Vd= 13-16 l
• Farmaci che penetrano all’interno delle cellule Vd> 16 l (e tanto maggiore quanto più grande sarà la
loro tendenza ad accumularsi all’interno delle cellule)

Fattori che modificano il Vd:

• Cambiamento del volume extracellulare o del pH
• Condizioni cliniche (neonati/anziani, emoconcentrazione e disidratazione, edema, variazione del
tessuto di proteine, modificazione dell’equilibrio acido-base)

Nel processo di distribuzione tra i diversi distretti dell’organismo, la concentrazione del farmaco tende a
diminuire progressivamente per effetto dell’escrezione, dell’inattivazione metabolica e dell’accumulo in siti
di deposito, quali ad es. i grassi e le proteine plasmatiche.
E in generale le sostanze hanno un tropismo selettivo per un organo piuttosto che per un altro.

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[Link]
Processo di biotrasformazione che ha lo scopo di trasformare le sostanze estranee presenti nell’organismo
in composti più polari e più idrosolubili, aumentandone l’escrezione e riducendo il volume di distribuzione.

Metabolismo di primo passaggio

Quelle trasformazioni chimiche e metaboliche che avvengono prima che il PA arrivi nella circolazione
sistemica, avviene nel fegato e parzialmente nell’intestino e va ridurre la biodisponibilità del PA.
In alcuni casi il passaggio attraverso il fegato determina una marcata riduzione della quota disponibile:
effetto di primo passaggio.
Per alcuni farmaci quest’effetto può essere così intenso da abolire quasi completamente l’effetto della dose
somministrata per via orale. Possibilità: cambiare via di somministrazione o cambiare farmaco.

Metabolismo
Obbiettivo: trasformare chimicamente PA o xenobiotici in derivati idrosolubili per facilitarne l’eliminazione.
• Diminuzione dell’attività e della tossicità
• Soppressione dell’attività e della tossicità
• Attivazione delle molecole originali (profarmaco o prodrug)
• Intermedi altamente reattivi (elettrofili) che inducono meccanismi tossici

Le reazioni metaboliche avvengono:

➢ Nel fegato (effetto di primo passaggio)
➢ Nei reni
➢ Nei polmoni
➢ Nel plasma
➢ Nella mucosa intestinale

Le reazioni coinvolte nel metabolismo sono:

➢ Reazioni della I fase: reazioni di funzionalizzazione (cambiano i g.f. del PA, che saranno poi usati
nelle reazioni di cnoiugazione)
➢ Reazioni della II fase: reazioni di coniugazione con componenti endogeni

Reazioni di fase I: funzionalizzazione

Introduzione o trasformazione di funzioni preesistenti in gruppi polari (enzimi “ossigenasi”) per le
successive reazioni di coniugazione.
❖ Ossidazioni
❖ Riduzioni
❖ Idrolisi
❖ Idratazione

Per quanto riguarda l’ossidazione il più importante sistema enzimatico ossidativo è rappresentato
dalle attività ossidasiche a funzione mista. Questi enzimi sono localizzati nel reticolo endoplasmatico
delle cellule del fegato, del rene, del polmone e dell’intestino.
Il più importante è il citocromo (CYP) P450.
È costituito da 2 strutture:
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 • Eme-proteina(protoporfirina di tipo ferrico; sito catalitico)
• Flavoproteina (NADPH-CYP450 reduttasi; trasportatori di e-)
E utilizzano come substrato ossidante l’O2. Le reazioni controllate da questo sistema sono molteplici,
ma tutte riconducibili ad un processo di idrossilazione del substrato conseguente alla diretta
incorporazione di una molecola di ossigeno.

Le reazioni di ossidazione richiedono la presenza di ossigeno molecolare (substrato), NADPH e del

sistema ossidativo rappresentato da due enzimi accoppiati: la NADPH citocromo reduttasi e il
citocromo P450. L’insieme di questi enzimi è contenuto nella matrice fosfolipidica del reticolo
endoplasmatico.

Figura 1 ciclo catalitico del citocromo P450

Il substrato (RH) si lega alla forma ossidata del citocromo P450 (Fe3+) per formare un complesso
enzima-substrato. Il citocromo viene quindi ridotto allo stato di Fe2+ per acquisizione di un
elettrone (e- ) messo a disposizione dalla NADPH citocromo P450 reduttasi. Il complesso substrato-
citocromo ridotto incorpora una molecola di ossigeno (02) cui fa seguito l’acquisizione di un altro
elettrone. L’inserimento degli elettroni fa passare l’ossigeno molecolare allo stato di ossigeno attivo
(02-). Questo complesso acquisisce 2 ioni H+ liberando così una molecola di H2 0, il substrato
idrossilato (ROH) e la forma ossidata del citocromo P450, che è quindi pronto ad iniziare un nuovo
ciclo.
Le reazioni ossidative mediate dal citocromo P450 sono tante (lei non pretende che ce le ricordiamo).

Reazioni di fase II: coniugazione

Composto endogeno viene legato ai metaboliti prodotti nella fase 1 o al PA tal quale (enzima: transferasi).
È attraverso la fase 2 che la molecola assume le caratteristiche di idrosolubilità e di possibile significativa
ionizzazione al pH fisiologico dell’organismo, utili per accelerarne l’eliminazione.

Esempio di reazioni: coniugazione con l’acido glucuronico, coniugazione con il gruppo solfato, acetilazione,
coniugazione con AA, coniugazione con glutatione…

Fattori che influenzano il metabolismo

Età (es. anziano riduzione della capacità metabolica)/ sesso/ stato di nutrizione/ patologie/ specie/ razza
(farmacogenetica)/ esposizione agli agenti inquinanti/ interazione fra farmaci.

Induzione farmaco-metabolica
Un’ importante caratteristica degli enzimi biotrasformativi (soprattutto del Cyt) è rappresentata dal fatto che
la loro attività può aumentare in seguito a trattamento con sostanze di natura ed origine diversa come
farmaci, pesticidi, prodotti di origine naturale destinati all’alimentazione.
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L’induzione farmaco-metabolica porta all’aumento della sintesi di enzimi biotrasformativi (che può portare
alla diminuzione della concentrazione plasmatica del substrato, con conseguente rischio di insuccesso
terapeutico; viceversa avviene con gli inibitori che come rischio possono portare ad un aumento così
elevato della sua efficacia da provocare una reazione avversa).
L’intensità e la durata di questo fenomeno variano a seconda della dose somministrata, della durata
dell’esposizione e dalle caratteristiche del soggetto (es. razza).

Si ha un’accelerazione del metabolismo se insiemi al substrato somministro gli induttori degli isoenzimi (es.
alcol, fumo, iperico, succo di pompelmo), mentre gli inibitori degli isoenzimi svolgono l’effetto inverso (succo
di pompelmo).

[Link]
È il processo attraverso il quale il PA e i suoi metaboliti vengono eliminati dall’organismo.
Le vie di eliminazione sono:
• Renale (urina)
• Biliare (feci) principali
• Polmonare (aria respirata)
• Orale (saliva)
• Cute (sudore)
• Latte materno occasionali

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Escrezione renale
Il principio di funzionamento del rene è la filtrazione glomerulare
di grossi volumi di plasma, seguita dal riassorbimento di circa il
99% dell’acqua filtrata e di una parte dei relativi soluti e dalla
secrezione attiva tubulare di acidi e basi del plasma.
Il nefrone è l’unità funzionale ed è costituita da: capsula di
Bowman (che racchiude un intreccio di capillari chiamato
glomerulo), tubolo contorto prossimale, ansa di Henle, tubolo
distale e dotto collettore.

Eliminazione renale dei farmaci:

1. Filtrazione glomerulare
2. Riassorbimento tubolare
3. Secrezione tubolare attiva

Il rene riceve un importante flusso ematico(1,3 litri/min, circa il

25% della gittata cardiaca). Il 20% della componente acquosa (flusso plasmatico 650 ml/min) viene filtrato a
livello glomerulare, determinando un tasso di filtrazione glomerulare che si aggira sui 130 ml/min – più di
150 l al giorno).
I capillari glomerulari sono caratterizzati da una permeabilità elevata. Non vengono filtrate le proteine
plasmatiche e quindi i farmaci ad esse legati rimangono in circolo.

[Link] glomerulare e clearance renale

Tutto il nostro sangue viene filtrato e tutte le sostanze passano nel filtrato ad eccezione delle grandi
proteine plasmatiche. Quindi, un farmaco che non viene assorbito né secreto a livello tubulare, non legato
alle proteine plasmatiche, ha una clearance di 130 ml/min.
Per stimare questo fenomeno si può usare l’inulina, un carboidrato polimerico, filtrato a livello glomerulare
e non più assorbito.
Quindi, volume di plasma “ripulito” dal contenuto di inulina = volume filtrato dal glomerulo ogni minuto.

La clearance di un farmaco corrisponde al volume di plasma che viene depurato dal farmaco nell’unità di
tempo (ml/min oppure l/h).

CLR = 650 ml/min, farmaco eliminato esclusivamente per via renale: clearance massima pari al flusso
plasmatico renale, quando è eliminato contemporaneamente per filtrazione glomerulare e secrezione
tubulare attiva.
CLR = 130 ml/min corrisponde al volume di filtrato glomerulare non associato a processi di secrezione
tubulare attiva e/o riassorbimento tubulare.
CLR < 130 ml/min, il farmaco dopo essere stato filtrato a livello glomerulare è stato parzialmente riassorbito
a livello tubulare.
CLR = 0 ml/min, il farmaco non viene eliminato per via renale perché, dopo essere stato filtrato a livello
glomerulare, è stato completamente riassorbito per diffusione passiva a livello tubulare.
CLT > 650 ml/min, all’eliminazione concorre in maniera considerevole il fegato (flusso plasmatico epatico =
1500ml/min).
Questi valori sono stati definiti grazie a sostanze, come l’inulina, che vengono utilizzate per misurare la
clearance perché essa viene filtrata a livello glomerulare e non viene più riassorbita né secreta a livello
tubulare, quindi, dà una misura della clearance renale, legata alla filtrazione glomerulare: infatti la CL
dell’inulina è circa 130 ml/min, così come il tasso di filtrazione glomerulare.

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Emivita plasmatica di eliminazione (T1/2)
È un parametro farmacocinetico, legato alla fase di eliminazione, che indica il tempo necessario affinché la
concentrazione plasmatica di un farmaco si dimezzi.
Generalmente si considera che dopo una singola somministrazione di farmaco, il tempo necessario alla sua
completa eliminazione dall’organismo sia pari a 4-5 volte il suo T1/2.

Bassi valori di CL fanno sì che il farmaco rimanga più a lungo nel sangue.
Mentre è direttamente proporzionale al Vd: se un farmaco è molto distribuito, Vd alto, vorrà dire che ci
vorrà tempo affinché il farmaco venga eliminato e il T1/2 sarà alto.
Assieme, questi parametri, sono indice di quanto frequente deve essere la somministrazione del farmaco.

Lungo il nefrone si ha il 99% dell’assorbimento dell’acqua filtrata:

• la maggior parte viene riassorbita nel tubulo contorto prossimale (circa il 90%). I farmaci filtrati a
livello glomerulare vengono a trovarsi concentrati nel tubulo prossimale, a causa del massivo
assorbimento di acqua, e se sono sufficientemente lipofili si ridistribuiranno in modo tale che solo il
10% della quantità di farmaco filtrata proseguirà nel percorso tubulare.
• Nell’ansa di Henle l’epitelio è scarsamente permeabile all’acqua e quindi non si verifica
assorbimento di acqua e farmaci a questo livello. Però a questo livello sono molto attivi i
trasportatori ionici: avviene un processo di estrusione attiva degli elettroliti che rappresenta il
principale meccanismo di costituzione del gradiente osmotico, ovvero il principale meccanismo
responsabile della concentrazione dell’urina nel suo passaggio finale attraverso i tubuli e dotti
collettori.
l gradiente osmotico renale rende possibile il riassorbimento di ancora 90% dell’acqua che ha
superato il tubulo contorto prossimale (portando il riassorbimento totale a circa il 99% del filtrato
glomerulare).
Quindi, un’azione farmacologica sui meccanismi di trasporto dell’ansa può drammaticamente
aumentare i volumi di urina prodotta.

• Nel tubulo contorto distale si ha un ulteriore intenso assorbimento del sodio, quindi un’ulteriore
tendenza dell’acqua ad essere riassorbita.

• L’assorbimento dei farmaci liposolubili si completa nei tubuli e dotti collettori.

Effetto del pH sull’eliminazione dei PA

Il pH urinario è qualche unità più basso rispetto al plasma.
L’acidificazione dell’urina favorisce l’eliminazione di composti basici (basi deboli).
L’alcalinizzazione dell’urina, ad esempio a seguito della somministrazione di bicarbonato, favorisce
l’eliminazione di farmaci acidi che tenderanno maggiormente a dissociarsi (perché, se il PA è in forma
indissociata, non polare-non ionica, esso verrà riassorbito nel tubulo).
Sfruttando questo principio è possibile accelerare l’eliminazione e ridurre gli effetti di farmaci assunti in
dose tossica.

Fattori che influenzano la CL renale:

• Assenza di legame con le proteine plasmatiche
• Elevata idrofilia (se idrofilo viene eliminato, se lipofilo viene riassorbito)
• Grado di ionizzazione (se ionizzato viene eliminato, se NON ionizzato viene riassorbito)
• Presenza di sistemi di trasporto attivo a livello tubulare

13
Alterazioni del flusso renale o glomerulare e patologie che limitano la permeabilità glomerulare o la
funzionalità tubulare determinano una riduzione della clearance renale dei farmaci.

La clearance renale di un farmaco viene stimata sulla base della clearance della creatinina che costituisce
un buon indice complessivo della funzionalità renale: valori troppo alti di creatinemia indicano una ridotta
funzionalità del rene e lasciano presumere una ridotta clearance.

Escrezione epatica
Il fegato è il principale organo deputato al metabolismo dei farmaci. L’ endotelio presente nel fegato è
discontinuo, poroso e fenestrato, permeabile anche a composti legati all’albumina (proteina plasmatica).
Il metabolismo e l’eliminazione sono processi strettamente collegati: il metabolismo operato dagli epatociti
consiste nella coniugazione di farmaci con gruppi polari allo scopo di accrescere il loro peso molecolare e la
loro idrofilia per renderli più suscettibili all’escrezione.

L’escrezione dei farmaci attraverso l bile è influenzata principalmente da due fattori:

• Polarità (presenza di gruppi polari aumentano l’escrezione)
• Peso molecolare (con la bile vengono attivamente escreti solo composti con PM elevato >300-500)
• Età (aumentano i problemi epatici e diminuisce la funzionalità del fegato)

Problemino: una volta presente nella bile il farmaco può non essere facilmente eliminato, ma essere
riassorbito a livello intestinale: circolo entero-epatico. Questo fenomeno può trattenere il farmaco fino ad
una sua completa metabolizzazione o ad una sua eliminazione per via renale.
Questo circolo è fondamentale per evitare la deplezione continua di alcune sostanze endogene come
vitamine D e B, acidi biliari. (senza dimenticare l’effetto di primo passaggio per i farmaci assunti per os)

Uva ursina
La droga è costituita dalle foglie essiccate di Arctostaphylos uva-ursi. È stata ampiamente utilizzata per le
infezioni del tratto urinario.
Le sue proprietà medicinali sono attribuite ai glicosidi fenolici, come l’arbutina. Essa viene idrolizzata nel
lume intestinale in un composto che si ossida immediatamente ad idrochinone. Una volta assorbito,
l’idrochinone è coniugato e raggiunge l’urina come glucuronide e solfato. Se le urine sono alcaline, i
composti coniugati idrolizzano parzialmente dando di nuovo l’idrochinone che, a determinate
concentrazioni, esercita un’azione antisettica ed astringente della mucosa delle vie urinarie.

14
FARMACODINAMICA
Riguarda la fase in cui il PA interagisce con il recettore (o bersaglio) al fine di ottenere una risposta biologica.
Obiettivo: induzione dell’effetto terapeutico.

La maggior parte dei farmaci per generare il loro effetto biologico deve interagire con macromolecole
specifiche, e per lo più di natura proteica, presenti sulla superficie o all’interno della cellula, definite con il
termine di “recettore” e dotate di propria funzione.

Recettore: macromolecole o proteine direttamente o specificatamente deputate alla trasmissione di un

segnale chimico fra e all’interno delle cellule.

Metodi per lo studio dell’interazione farmaco-recettore:

1. Studi di binding
2. Studio delle curve dove/risposta
3. Biologia molecolare
I principali parametri che caratterizzano l’interazione di un farmaco con i suoi siti di legami sono
generalmente determinati attraverso gli studi di binding e sono:
➢ Costante di dissociazione;
➢ Densità dei siti recettoriali ([Link] di recettori presenti);

Figura 2 L=ligando

La costanze di dissociazione (Kd) è una concentrazione che descrive l’affinità del PA (ligando) per il suo
recettore.
Essa viene studiata attraverso l’isoterma di Langmuir (concentrazione di ligando sulle ascisse, complesso
ligando-recettore sulle ordinate).

Figura 3 isoterma di Langmuir

RT: quantità massima di complesso che si può formare, corrisponde al valore dell’asintoto a cui tende la
curva (nel primo grafico iperbole equilatera).
Kd: corrisponde alla concentrazione di farmaco necessaria per saturare il 50% dei recettori presenti.

15
MA graficamente non è facile da capire, quindi si usa una sigmoide (secondo grafico), che ci dà un prospetto
più chiaro.

Il concetto di affinità è estremamente utile soprattutto quando si vuole paragonare la capacità di farmaci
diversi nel legare lo stesso recettore.
Più la Kd è bassa più il PA sarà affine per il recettore e ci vorrà meno PA per legare il 50% dei recettore
presenti.
<Kd >affinità (il farmaco sarà ben legato e il complesso L-R stabile).

È possibile capire se un PA può reagire con un certo recettore? Sì, è possibile attraverso degli studi di
binding.

Studi di binding
Esperimento di saturazione:

Periodo di incubazione→ parte del ligando interagisce con il recettore formando il complesso RL.
Termine dell’incubazione→ si separa il ligando rimasto libero dal complesso RL (generalmente tramite
filtrazione). A questo punto si misura la radioattività del complesso (radioattività associata al filtro: permette
di calcolare (RL) per ogni concentrazione di L utilizzata).

Nella realtà ci sono dei siti di legami aspecifici che trattengono il ligando e non lo rendono saturabile.
Bisogna trovare i siti aspecifici (non saturabili)- perché voglio eliminarlo-: si misura valutando il legame
residuo di ogni concentrazione di ligando radioattivo in presenza di un forte eccesso di ligando non marcato,
in modo tale da saturare tutti i siti di recettori specifici (almeno 1000 volte rispetto al ligando marcato). Poi
aggiungo un ligando marcato, che non troverà più recettori disponibili, si legherà solamente ai siti di legami
aspecifici, così posso determinare il legame aspecifico, la cui curva tende all’asintoto perché sono siti non
saturabili.
Per differenza tra la curva del legame totale e quella del legame aspecifico si ottiene la curva relativa al
legame specifico (che posso usare per determinare la Kd). -non si parla di efficacia, ma di occupazione
recettoriale, che può essere sia da parte di un agonista, che di un antagonista, non ci è dato saperlo-

16
Studio delle curve dose/risposta -vivo- o concentrazione/risposta -vitro-
Queste metodologie, proprie della farmacologia classica, erano le uniche ampiamente disponibili fino agli
inizi degli anni ‘70 e sono tuttora insostituibili.
Curva dose/risposta: relazione tra la dose di farmaco somministrata (espressa in peso di farmaco per peso
corporeo) e la relativa risposta.
Curva concentrazione/risposta: relazione tra la concentrazione (espressa in molarità o in peso per volume di
soluzione, es. mg/ml) di un farmaco e il grado di risposta ottenuta.

L’analisi di queste curve evidenzia alcuni fenomeni fondamentali della farmacologia, quali l’esistenza di
farmaci dotati di attività qualitativamente uguali, ma quantitativamente diverse (in POTENZA ed EFFICACIA).

Sulle ascisse: dose del ligando;

sulle ordinate: la risposta/effetto %

La pendenza della retta è indice

della maneggevolezza del farmaco
(più la curva è ripida più piccole
dose di farmaco si avranno grandi
variazioni)

Come visto prima per praticità si utilizza la sigmoide in quanto più maneggevole soprattutto per evidenziare
piccole variazioni di effetto (forma di una sigmoide simmetrica attorno al valore di EC50-concnetrazione
efficace 50-).

EC50: dose di PA utile ad arrivare ad avere il 50% dell’effetto massimo. (il parametro fondamentale
precedentemente era la Kd).
Il PA più potente è sempre quello con la curva più a sx, cioè con l’EC50 minore (poco PA, vuol dire che mi
serve meno PA per arrivare al 50% dell’effetto).
Potenza→ quanto PA devo avere per raggiungere il 50% dell’effetto (la curva più potente è quella più a sx).
Efficacia→ c’entra con l’altezza che la curva raggiunge (la curva più alta è la più efficace).

Teoria dell’occupazione
Teoria proposta da Clark nel 1933.
Ipotesi: l’effetto di un farmaco è direttamente proporzionale al grado di occupazione del recettore e quindi
alla concentrazione del complesso farmaco-recettore.
Effetto max= tutti i recettori sono occupati. Ma non è vero perché non si tiene conto che i recettori possono
essere occupati anche da antagonisti!

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 (non chiede questa equazione)

Questa equazione coincide con quella che regola l’interazione farmaco-recettore, ma questo è possibile solo
se sussistono alcune condizioni:
▪ L’interazione farmaco recettore è reversibile;
▪ È stato raggiunto l’equilibrio;
▪ I recettori sono tutti omogenei;
▪ L’interazione è stechiometrica: una molecola di farmaco si lega con una molecola di recettore;
▪ I recettori sono indipendenti l’uno dall’altro.
Quando è valida questa ipotesi la curva dose-risposta coincide perfettamente con quella relativa
all’interazione farmaco-recettore costruita con esperimenti di binding: in questo caso Kd=EC50.

MA ci si rese conto che l’ipotesi dell’occupazione nella sua forma più semplice non rende conto di alcuni
fenomeni (limiti di questa ipotesi):
- spesso la curva dose-risposta e l’interazione farmaco-recettore non coincidono
- esistono farmaci che, pur occupando un determinato recettore, non producono alcuna risposta

Agonista: un farmaco che si lega ad un recettore in modo tale da generare una risposta biologica di per sé,
generalmente un agonista mima gli effetti di composti endogeni.

Antagonista: un farmaco che si lega ad un recettore in modo tale da generare una risposta biologica di per
sé, generalmente un agonista mima gli effetti di composti endogeni.
Nello specifico esso può essere:
• Competitivo: curva sx-detto anche sormontabile-
l’antagonista compete con l’agonista per l’occupazione di un sito comune. Pertanto, la presenza
dell’antagonista aumenta l’EC50 dell’agonista senza modificarne l’effetto massimo (ha l’ effetto di
spostare la curva dose-risposta dell’agonista verso destra= diminuisce la potenza ma non viene
alterata l’efficacia).
Aumentando la concentrazione di agonista, si può infatti generare lo stesso effetto massimo
ottenuto in assenza dell’antagonista.

• Non competitivo: curva dx-detto anche insormontabile

l’antagonista sposta la curva dell’agonista verso destra in modo non parallelo, deprimendo l’effetto
massimo ottenibile anche con concentrazioni elevate di agonista. L’EC50 non viene modificata (è
uguale per tutte le curve) in quanto essa si riferisce all’effetto massimo ottenibile in presenza di
entrambi i farmaci. Diminuisce l’efficacia, in quanto ho meno recettori disponibili, in quanto sono
stati occupati e resi indisponibili perennemente dall’antagonista non competitivo, mentre la
potenza è la stessa.
Un antagonismo insormontabile può verificarsi o perché l’antagonista interagisce in modo
irreversibile con lo stesso sito dell’agonista (antagonista competitivo irreversibile) o perché si lega
ad un sito recettoriale diverso da quello occupato dall’agonista (antagonista allosterico non
competitivo).

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 Figura 4 agonista sormontabile a sx e agonista insormontabile a dx

Teoria dell’attività intrinseca

L’esistenza degli antagonisti, che, pur legandosi al recettore non determinano alcun effetto, contraddice la
teoria dell’occupazione, perché indica che l’effetto non dipende solo dall’occupazione del recettore.

Ariens and Stephenson proposero per i farmaci l’esistenza di 2 proprietà distinte:

✓ Affinità per il recettore: misura della potenza di un farmaco;
✓ Efficacia o attività intrinseca: intesa come la capacità del farmaco di dar origine alla risposta
biologica, una volta che esso è legato al recettore.

L’attività intrinseca è rappresentata come α e può assumere valori che vanno da 0 ad 1:

• =1 per un agonista
• =0 per un antagonista
• =0< α <1 per un AGONISTA PARZIALE

L’agonista parziale è un agonista che, se interagisce con un recettore, dà un effetto che però non è pieno
come nel caso di un agonista normale. Se l’agonista pieno dà un effetto del 100% un agonista parziale dà un
effetto del 60%.

19
Come si evince dal grafico: se l’agonista pieno si aggiunge all’agonista parziale la curva si sposta verso destra
(come con l’antagonista competitivo) e la potenza diminuisce!

Teoria dell’attivazione costitutiva

Si sono scoperti dei recettori costitutivamente attivi: recettori capaci di generare una risposta anche in
assenza del ligando.
Ipotesi di un modello recettoriale a due stati:

Figura 5 in condizioni basali l'equilibrio è spostato verso sx

Agonista: farmaco con maggior affinità per R* (favorisce la formazione del complesso R*F).
Agonista inverso: farmaco con maggior affinità per R (favorisce la formazione del complesso RF,
destabilizzando la conformazione biologicamente attiva del recettore). Ha azione opposta a quella dell’
agonista. SONO GLI UNICI FARMACI IN GRADO DI DIMINUIRE L’ATTIVITÀ BASALE DEL SISTEMA.
Antagonista: ha la stessa affinità per R e R* e quindi non influenza l’equilibrio tra le due conformazioni.
Inibisce sia l’azione degli agonisti che quella degli agonisti inversi, ma non è in grado di inibire l’effetto
basale.

Figura 6 esempio di curva concentrazione-effetto per un agonista che deprime l'attività basale di un tessuto legata alla presenza di
recettori costitutivamente attivati

[Link] MOLECOLARE (terza metodica)

Permette di ottenere informazioni dettagliate su PM, struttura primaria, composizione e identificazione
delle funzioni specifiche delle varie regioni del recettore.

20
Vengono fatti dei pezzetti che contengono il campione e la banda che si crea indica la presenza del recettore
(identifica il recettore nelle cellule).

Per riassumere…

Stimolo recettori
La capacità della cellula di rispondere a stimoli esterni è caratterizzata dal fatto che le risposte recettoriali
sono controllate in termini quantitativi e temporali.

L’ assenza di segnale induce la cellula ad aumentare il numero di recettori superficiali in modo da

aumentare le probabilità di interazione con il trasmettitore e quindi di “sentire” il segnale; al contrario,
l’eccesso di stimolazione viene tamponato attraverso una riduzione della capacità di risposta.

La modulazione recettoriale è bidirezionale:

• La riduzione delle risposte recettoriali dovuta a trattamento con agonisti viene detta
DESENSITIZZAZIONE.
In linea teorica, la desensitizzazione può avvenire a più livelli: riduzione dell’affinità, incapacità di
trasdurre il segnale o riduzione del numero di molecole recettoriali. Quest’ultimo meccanismo
viene comunemente detto down-regulation.
• L’ aumento delle risposte recettoriali indotte da trattamento cronico con antagonisti è definito con il
temine di UP REGULATION.

Capsaicina
(esempio di modulazione recettoriale bidirezionale)
La capsaicina, principale principio attivo del peperoncino, agisce sui recettori per i vanilloidi.

L’effetto è bifasico: attivazione seguita da desensitizzazione:

21
 la capsaicina inizialmente attiva i recettori dei vanilloidi determinando il rilascio di neuropeptidi
algogeni, come la sostanza P; mentre successivamente determina una ridotta attività delle fibre che
diventano insensibili agli stimoli nocicettivi. La desensitizzazione determina una ridotta percezione
del dolore.

L’esposizione alla capsaicina porta prima una sensazione di bruciore e in seguito un periodo di analgesia, in
cui il neurone non riesce a rispondere a stimoli nocicettivi di diversa natura.

RECETTORI
I recettore lega e riconosce un certo PA e attraverso una modifica della sua struttura è in grado di generare
una risposta cellulare.
• Di membrana: si trovano sulla membrana, trasducono il segnale portato da mediatori idrofili che
difficilmente passerebbero la membrana cellulare. Causano una cascata di reazioni.
• Intracellulari: si trovano nel citosol e poi entrano nel nucleo, trasducono il segnale portato da
mediatori piccoli e lipofili che facilmente attraversano la membrana cellulare. Sono fattori di
trascrizione genica: interagendo con specifiche sequenze di DNA (inducono modificazioni
dell’espressione genica-sintesi proteica).

Recettori accoppiati alle proteine G

Famiglia di recettori più numerosa, circa l’80% di ormoni, neurotrasmettitori si legano a questo tipo di
recettori.
Recettori legati alle proteine G: famiglia di proteine eterotrimeriche (alfa, beta, gamma) che legano GTP
(guanosintrifosfato) e possiedono attività GTPasica intrinseca (sono quindi in grado di idrolizzare il GTP).
Struttura:
singola catena polipeptidica che attraversa 7 volte la membrana plasmatica (7 domini transmembrana) e il
3° dominio lega le proteine G, estremità aminoterminale extracellulare e carbossiterminale intracellulare.
Il sito di legame per il neurotrasmettitore si trova nella porzione transmembrana o extracellulare della
molecola.

Le proteine G sono eterotrimeri costituiti da 3 subunità: α, β, γ. Le subunità β e γ rimangono sempre

strettamente associate tra loro. Le subunità α sono in grado di legare i nucleotidi guanilici, in particolare
GTP e successivamente idrolizzarlo grazie ad un’attività GTPasica intrinseca, da qui il loro nome: proteine G
o GTPasi.

Funzionamento:
Le proteine G accoppiano i recettori a effettori specifici (mediano la cascata di segnale che darà la risposta
biologica) attraverso un ciclo di attivazione-deattivazione governato dal legame e dall’idrolisi del GTP.

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Ciclo:
a) Se il recettore non è attivo, la subunità α della proteina G è legata al GDP ed è strettamente
associata alle subunità β e γ formando un eterotrimero inattivo.

b) In seguito al legame con l’agonista (cioè, se il recettore interagisce con il ligando), il recettore
interagisce con la proteina G e promuove la dissociazione di α dal GDP che viene sostituito dal GTP.
Questo determina una modificazione conformazionale della subunità a che determina la
separazione delle proteine G dal recettore e la divisione della stessa α dal dimero β-γ.
A questo punto α-GTP interagisce con gli effettori (innesca la loro attività) regolandone l’attività e
quindi dando origine alla trasduzione del segnale.

c) Ma la subunità α della proteina G non rimane attiva: il segnale viene spento quando l’attività
GTPasica di alfa idrolizza il GTP a GDP e la subunità alfa si dissocia dal GDP per legarsi nuovamente
al dimero dando quindi inizio ad un nuovo ciclo.

Abbiamo il recettore R accoppiato alla

proteina G. allo stato inattivo α è legato
al GDP, ma se si lega un agonista al
recettore R si ha un cambio
conformazionale: la subunità α lascia il
GDP e si lega al GTP e determina anche il
distacco delle subunità β,γ.
A questo punto l’α è legata al GTP e si
trova nella sua forma attiva, cioè, può
andare ad interagire con degli effettori
(E), innescando la loro reazione . L’azione
non è infinita, ma le proteine G hanno la
capacità intrinseca di idrolizzare il GTP
(attività GTP-asica), andando a perdere
un P, la subunità α si troverà nuovamente legata al GDP e può ritornare a legarsi al dimero β-γ, pronta per
un nuovo ciclo. A spegnersi è solo il ciclo della proteina G, ma l’effettore è stato innescato e lil suo segnale
continuerà fino ad arrivare alla risposta biologica!

α dà attivazione e spegnimento del segnale, ce ne sono diversi tipi: αs e αi agiscono sul sistema effettore
adenilato-ciclasi (il primo stimolatorio -dell’attività dell’effettore-, il secondo inibitore), αq agisce sul sistema
effettore fosfolipasi C.

Effettori
L’attivazione di effettori specifici traduce il segnale generato dall’interazione tra il ligando e il recettore in un
messaggio cellulare.
Gli effettori enzimatici delle proteine G regolano la concentrazione intracellulare di sostanze biologicamente
attive che agiscono come secondi messaggeri.
Gli effettori ricevono il segnale dalla sub α e propaga il segnale.
Come agiscono? Sono enzimi che regolano un secondo messaggero, ovvero sostanze o ioni la cui
concentrazione varia drasticamente in risposta all’attivazione dell’effettore e che sono in grad di legarsi a
substrati specifici modificandone la funzione.
L’attivazione di un GPCR (recettore legato alle proteine G) comporta quindi una reazione di eventi che
procede a cascata amplificandosi in termini quantitativi.

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La durata degli effetti indotti dall’attivazione di questa classe di recettori può estendersi nel tempo
indipendentemente dalla durata dell’interazione agonista-recettore (che interagisce e poi si stacca) ed
essere anche dell’ordine di alcuni minuti. La durata dipende principalmente dall’efficienza di meccanismi
cellulari specifici preposti alla riduzione della concentrazione del secondo messaggero e all’abolizione delle
modificazioni post-traduzionali da esso indotte.

(i recettori accoppiati alle proteine G sono metabotropici).

Sistemi effettori
I due sistemi effettori delle proteine G meglio caratterizzati sono l’adenilato ciclasi, che produce cAMP, e la
fosfolipasi C che genera i secondi messaggeri inositolo 1,3,5 trifosfato (IP3 ) e diacilglicerolo (DAG).

• Adenilato ciclasi
È un enzima ubiquitario che converte l’ATP in AMP ciclico (cAMP), che sarà il secondo messaggero, ha il
compito di propagare il segnale attivando la proteina chinasi A che attiva i vari substrati.
La sua attività è regolata da numerosi neurotrasmettitori od ormoni che agiscono attraverso recettori
accoppiati a proteine G, i recettori accoppiati a proteine G della classe Gs stimolano l’adenilato ciclasi,
mentre quelli accoppiati alle Gi lo inibiscono.
l cAMP regola diverse proteine cellulari e in particolare un gruppo di
protein chinasi A dette PKA (mediano le reazioni di fosforilazione).

Attivazione della PKA: la proteinchinasi cAMP-dipendente (PKA) è

formata da 2 subunità localizzate su polipeptidi distinti. In condizioni
di riposo (A), la subunità catalitica (C) è presente in complesso con
la subunità regolatoria (R), che la mantiene in uno stato di
inibizione. Quando la concentrazione di cAMP nella cellula sale (B),
il cAMP si lega alla subunità regolatoria, determinandone il distacco
dalla subunità catalitica. L’inibizione viene rimossa e la subunità
catalitica può cos’ fosforilare i substrati (R).

L’ATP viene quindi trasformato dall’adenilato ciclasi in AMP ciclico, ma questa trasformazione non è
infinita: il cAMP viene idrolizzato dalle fosfodiesterasi (PDE), Il cAMP prodotto viene rapidamente
distrutto dalla cellula grazie all’azione di una famiglia di enzimi, le fosfodiesterasi, che lo idrolizzano
a 5’-AMP, cioè un AMP lineare, che non è più in grado di attivare la cascata di segnale.
24
 Caffeine, teobromina, teofillina (metilxantine) inibiscono la fosfodiesterasi→ fanno sì che il cAMP si
accumuli, potenziando il segnale e la cascata di segnale si propaga.

Teofillina
Le metilxantine: teofillina, caffeina e teobromina, sono alcaloidi presenti in numerose specie
vegetali ampiamente diffuse in natura, come tè o caffè.
La teofillina, nonostante la relativa frequenza di reazioni avverse e la sua bassa efficacia, rimane un
farmaco comunemente usato nell’asma in numerosi Paesi per il suo basso costo (utilizzata come
broncodilatatore).
A livello della muscolatura liscia bronchiale il cAMP induce broncodilatazione, quindi, l’inibizione
delle fosfodiesterasi da parte della teofillina determina un effetto broncodilatatore.
La teofillina è anche in agonista del recettore dell’adenosina.

Il farmaco ha una stretta finestra terapeutica: anche per piccole concentrazioni rischio di effetto
tossico, con possibile insorgenza di fenomeni tossici da sovradosaggio a carico del cuore (aritmie),
del Sistema Nervoso Centrale (agitazione, convulsioni) e dell’apparato gastroenterico (nausea,
vomito, dolori addominali). I sintomi più comuni e precoci sono cefalea, nausea e vomito.

Definizione finestra terapeutica: intervallo di concentrazione plasmatica (Cp) compreso tra l minima
concentrazione efficace (MEC) e la minima concentrazione tossica (MTC).

Biancospino e digitalici
Ruolo del recettore β1-adrenergico nella modulazione della funzione cardiaca: l’attivazione dei
recettori β1 presenti sulle cellule miocardiche porta a un aumento della formazione di cAMP; la
subunità catalitica della proteinchinasi A (cPKA) fosforila canali al calcio e canali al potassio
voltaggio-dipendenti con conseguente aumento dell’influsso di Ca2+ . L’aumento della [Ca2+ ]i che
ne consegue è responsabile dell’effetto inotropo positivo (aumenta la forza di contrazione del cuore)
delle catecolamine.

Ad avere questo effetto ionotropo positivo è proprio il biancospino, il quale inibisce le

fosfodiesterasi che vanno a degradare l’cAMP e lo trasformano in un metabolita inattivo, inibendole
questo non avviene e ciò porta all’aumento della contrattilità cardiaca (effetto ionotropo positivo).
Si ricava dalle foglie e dalle sommità fiorite di Crataegus laevigata o C. monogyna. Sono piccoli
arbusti o piccoli alberi spinosi con foglie verde brillante e fiori bianchi un po’ rosati e profumati. La
droga deve contenere non meno dell’1,5 % di flavonoidi calcolati sulla droga secca. In genere gli
effetti cardiovascolari sono attribuiti alla frazione flavonoidica, in particolare alla componente
procianidinica. Proprietà: effetto ionotropo positivo e antiaritmico.
Lo stesso effetto ionotropo positivo è associabile ai PA della Digitale (la più importante Digitalis
purpurea), ma…

• Fosfolipasi C
L’attivazione della fosfolipasi C, altro effettore, induce l’idrolisi di uno specifico fosfolipide di
membrana, il fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato (PIP2) dando origine a due secondi messaggeri: l’IP3

25
 (inositolo 3 fosfato) e il DAG (diacilglicerolo). Queste due vie di segnale sono di importanza
fondamentale in quanto regolano un gran numero di processi cellulari.
La localizzazione dell’enzima è citoplasmatica, la sua attivazione ne induce il trasferimento alla
membrana.

Diacilglicerolo: Il DAG rimane confinato nella membrana cellulare dove attiva le proteinchinasi C
(PKC), che a loro volta sono in grado di fosforilare in serina e treonina numerosi substrati. Il legame
con DAG aumenta l’affinità della PKC per il calcio rendendo l’enzima attivo in presenza di
concentrazioni nanomolari dello ione Ca.

Inositolo 1,3,5 trifosfato: essendo idrofilo diffonde nel citoplasma dove si lega a specifici recettori
posti sul reticolo endoplasmatico. Il recettore per l’IP3 è un canale che una volta aperto lascia fluire
nel citoplasma il calcio contenuto negli organuli cellulari. In questo modo la produzione di IP3 è
associata ad un transitorio aumento della [Ca ++].
L’IP3 prodotto è transitorio in quanto viene
rapidamente metabolizzato nel citoplasma
attraverso enzimi che portano alla produzione finale
di inositolo libero che chiude il ciclo andando a
risintetizzare i fosfolipidi precursori.

Droghe che interagiscono con i recettori accoppiati alle

proteine G
Efedra
Decongestionante e stimola il metabolismo.
La droga è costituita dalle parti aeree di Ephedra sinica (Fam. Ephedraceae), pianta largamente diffusa in
Cina, India, Europa ed America. Contiene alcaloidi ad attività simpaticomimetica (circa l’1%, di cui il 60-80%
è costituito da efedrina ed il 20-34% da pseudoefedrina).
È una agonista adrenergico ad azione mista (agisce sui recettori α e su quelli β):
• sui recettori α1 adrenergici provoca vasocostrizione producendo decongestione nasale
• sui recettori β2 adrenergici provoca broncodilatazione (doping)
L’efedra dovrebbe essere assunta solo per brevi periodi, a causa dell’istaurarsi del fenomeno di tachifilassi,
nonché per il pericolo di dipendenza.
Tachifilassi: tolleranza che si istaura rapidamente.
Tolleranza: nel tempo per avere lo stesso effetto devo aumentare la dose.
Dipendenza: uso del farmaco in maniera compulsiva, se sospeso in maniera brusca può dare sintomi di
astinenza ed effetto rebound.

Serenoa
La droga è costituita dai frutti maturi ed essiccati di Serenoa repens, una palma nana originaria dell’ovest
dell’India e del sud degli Stati Uniti. I fitosteroli e gli acidi grassi in essa contenuti sono ritenuti i responsabili
dell’azione farmacologica.
È utile in caso di iperplasia prostatica benigna, ci sono studi clinici che dimostrano un’efficacia paragonabile
ai farmaci.
Azione spasmolitica sui muscoli delle vie urinarie, che si esercita attraverso un blocco dei canali del calcio ed
un’azione antagonista sui recettori alfa-adrenergici: gli alfa-adrenergici danno vasocostrizione ma se li
blocchiamo avremo vasodilatazione, con riduzione della resistenza al flusso delle urine.
26
Estratto di polline
Si prepara principalmente dal polline di segale (Secale cereale L., fam Graminaceae), pianta erbacea annua,
originaria dall’Asia sud-occidentale.
Anch’esso utile nei confronti dell’iperplasia prostatica benigna:
➢ attività antinfiammatoria (inibizione produzione citochine)
➢ inibizione della 5-alfa reduttasi (riduzione dimensioni prostata)
➢ blocco dei recettori alfa adrenergici (riduzione della resistenza al flusso)

Anche i recettori oppioidi sono accoppiati alle proteine G.

Recettori canale (recettori di membrana)

Sono canali ionici la cui apertura è modulata dall’interazione con specifici trasmettitori endogeni.
Come conseguenza del legame con il ligando, il recettore cambia transitoriamente conformazione aprendo
in tal modo un canale trasmembranario intrinseco nella sua struttura. Gli ioni, spinti dal gradiente
elettrochimico, passano attraverso il canale e determinano una variazione del potenziale elettrico: ha così
inizio la risposta cellulare all’attivazione del recettore.

A questa famiglia appartengono alcuni dei recettori per neurotrasmettitori ad ampia diffusone nel SNC e
periferico, come l’acetilcolina, il GABA (neurotrasmettitore inibitorio).

Possono essere classificati in 4 classi:

• recettori appartenenti alla superfamiglia dei recettori nicotinici
• recettori ionotropici del glutammato (neurotrasmettitore eccitatorio)
• recettori aperti da nucleotidi ciclici
• recettori ionotropici dell’ATP P2X.

Il canale permeabile a cationi e anioni presenterà cariche + o – per attrare anioni o cationi:
es. recettori permeabili a cationi→ nicotinici
recettori permeabili ad anioni→ GABAergico (ioni Cl)

27
Il sito di legame per il ligando endogeno è localizzato nella porzione extracellulare dei recettori
appartenenti alla superfamiglia dei recettori nicotinici, dell’ATP e del glutammato, mentre è localizzato
intracellularmente per i recettori attivati da nucleotidi ciclici.

Recettore nicotinico
Studi di microscopia elettronica ad alta risoluzione ci hanno reso possibile sapere com’è fatto il recettore:
le 5 subunità si affiancano tra loro a cerchio in modo da formare il poro ionico in un ordine ben preciso (α1 ,
γ, α1 , δ, β1 ).
Sono necessarie due molecole di acetilcolina per attivare il
recettore nicotinico.
Il recettore presenta una parte extracellulare a forma di imbuto
che ha la funzione di concentrare gli ioni destinati a passare
attraverso il canale, parte transmembrana in cui il recettore si
stringe e si forma la funzione critica per il funzionamento (in
questa regione aa acidi carichi negativamente formano degli anelli
orientati verso l’interno del canale delimitando così il poro
selettivo ai cationi); la funzione di questi anelli sembra essere
quella di selezionare e concentrare i cationi e respingere, per
effetto della repulsione di carica, gli anioni: questi anelli hanno
quindi circa negativa e il canale è permeabile ai cationi (es.
recettore nicotinico) o viceversa hanno carica positiva se il canale è permeabile agli anicioni (es. recettore
GABA A).
Parte intracellulare -citoplasmatica- , subito dopo il passaggio attraverso la membrana il recettore si allarga.
Quando si lega il ligando il canale si apre e passano gli ioni (Na+ e K+).
I recettore-canale non possiedono un’elevata capacità di selezione tra le varie specie ioniche aventi la stessa
carica: attraverso il canale dell’Ach possono fluire sia ioni monovalenti come Na+ e K+ che ioni bivalenti,
come Ca++.

Cosa regola l’attività dei recettori canale

L’ entità della risposta cellulare indotta dai recettori-canale in seguito all’interazione con l’agonista è
modulabile da almeno 2 variabili:
➢ La differenza di potenziale transmembrana
Es. Il canale del recettore nicotinico è ugualmente permeabile a Na+ e K+.
Al potenziale di riposo (-90mV) si ha l’ingresso di Na+ (fase depolarizzante) il potenziale sale e
aumenta l’uscita di K+. Al potenziale di membrana di 0 mV in ogni singolo canale la corrente
entrante di Na+ è bilanciata da una pari corrente uscente di K+ e quindi la corrente risultante è 0.
➢ La durata della stimolazione recettoriale
Es. Il trattamento con agonisti o con farmaci che bloccano la degradazione dell’agonista (es. per
l’acetilcolina, gli inibitori dell’ acetilcolinesterasi) comporta una stimolazione continua del recettore.
In queste condizioni il recettore fluttua rapidamente tra uno stato conduttivo ed uno non conduttivo
28
 finché entra in uno stato non-conduttivo in cui non risponde più all’agonista: fenomeno di
desensitizzazione. Ora, anche se aumento la quantità di recettore non si avrà più una risposta.

I curari provocano paralisi muscolare (l’Ach è l’unico neurotrasmettitore della placca neuro-muscolare,
quindi tutti gli antagonisti provocano paralisi, che può portare alla morte).

Quindi, l’acetilcolina è un neurotrasmettitore che può agire su due recettori diversi, ma non è l’unico, anche
il GABA può farlo.
In generale i recettori canale danno una risposta più immediata (eventi rapidi e a breve durata) rispetto ai
recettori accoppiati alle proteine G (risposta più lenta e di maggior durata), perché basta che si apra il
canale.

Kava
La Kava (o Kava-Kava) è data dai rizomi e dalle radici di Piper methysticum (Fam Piperaceae), un arbusto
perenne che cresce nelle isole della Polinesia occidentale e Tahiti.
Gli estratti di Kava possiedono proprietà sedative, anticonvulsivanti, anestetico locali e miorilassanti.
Facilita la trasmissione GABAergica e inibisce i canali del Na voltaggio dipendenti.
È stata ritirata dal commercio per problemi di epatotossicità, veniva usato come ansiolitico.

29
Valeriana
La droga ufficiale è data dalla V. officinalis, una pianta erbacea perenne comune nei boschi umidi, la cui
droga consiste nel rizoma secco e nelle radici.
Si usa per i suoi effetti rilassanti/ipnotici. Effetti simili alla Kava ma con diversa potenza (valeriana meno).
Gli estratti di valeriana hanno affinità per il recettore GABA A, stimolano la sintesi e il rilascio del GABA e ne
inibiscono il re-uptake ed il catabolismo.
Agisce con 4 meccanismi:
- attiva enzimi coinvolti nella sintesi del GABA nei neuroni presinaptici
- inibisce ricaptazione del GABA
- inibisce l’enzima GABA-transaminasi, coinvolto nel catabolismo del GABA
- attiva i recettori GABA A (per renderli più disponibili all’interazione con il neurotrasmettitore)
Tutti questi effetti si traducono in un potenziamento della trasmissione GABAergica: usata per il trattamento
dell’insonnia e del nervosismo.

Recettori per i fattori di crescita (ad attività tirosin-chinasica)

Fattori di crescita: polipeptidi che vengono liberati nell’ambiente extracellulare e sono capaci di stimolare
proliferazione. La loro attività biologica è mediata da recettori ad elevata affinità localizzati nella membrana
plasmatica.
La maggioranza di questi recettori esplica un’attività enzimatica tirosin-chinasica: catalizza il trasferimento
di gruppi fosfato dall’ ATP a substrati proteici fosforilando residui di tirosina.

L’attivazione enzimatica è strettamente regolata:

- in condizioni di riposo è nulla
- il legame del fattore alla parte extracellulare del recettore rimuove questa inibizione
- la sua attività chinasica innesca una cascata di reazioni biochimiche all’interno della cellula che si
traducono in risposte funzionali immediate e transitorie, oppure ritardate e durevoli.
Le fasi precoci del processo di conversione del segnale extracellulare in risposta intracellulare vengono
definite come TRASDUZIONE DEL SEGNALE.

Ci sono tanti recettori per i fattori di crescita, quello che si nota è che cambia la porzione extracellulare: il
dominio extracellulare è importante perché è quello che presenta il sito di legame.
In generale ci sono 5 domini funzionali:
• dominio extracellulare: comprende il sito di legame ad elevata affinità per il fattore di crescita;
• domini trasmembrana: circa 25 residui idrofobici che attraversano il doppio strato lipidico;
• dominio iuxta-membrana: si trova nel citoplasma è sede di importanti funzioni regolatorie;
• dominio catalitico: responsabile dell’attività chinasica;
• coda C-terminale: ha lunghezza e funzione variabile tra i vari recettori: è il segmento che, nel
recettore attivato, lega i trasduttori intracellulari del segnale.
Il dominio catalitico è il dominio chiave: due lobi delimitanti una cavità, nella quale ha luogo il trasferimento
del gruppo fosfato o dal complesso ATP-Mg++ al substrato proteico. Modificazioni possono causare tumori
(scatenando l’attività chinasica anche in assenza di ligando).

I recettori a tirosin chinasi condividono tra loro una notevole omologia nelle regioni del dominio
transmembrana e del dominio catalitico. I domini extracellulari sono invece molto variabili e presentano
diverse combinazione di motivi strutturali.

Ad una sottofamiglia di recettori corrisponde spesso una famiglia di fattori, di regola ciascun recettore lega
con elevata affinità un singolo fattore, ma sono note eccezioni.

30
La regione transmembrana funge d connessione tra il dominio extra e quello intracellulare, sembra che
abbia solo un ruolo strutturale, ma è stato dimostrato che una singola mutazione puntiforme (piccole
mutazioni) nel segmento idrofobico transmembrana è sufficiente ad alterare l’attività tirosin chinasica.

La regione iuxtamembrana, cioè la sequenza di aa che separa il dominio transmembrana da quello

catalitico è coinvolta nella modulazione della trasduzione del segnale da parte di stimoli estrinseci al
recettore: un processo di transmodulazione.
Es. per il recettore dell’EFG la fosforilazione di questa zona spegne l’attività catalitica dell’adiacente dominio
chinasico.

Attivazione e trasduzione del segnale

Il legame del recettore con il fattore di crescita induce l‘attivazione della tirosin chinasi citoplasmatica
attraverso un meccanismo basato sulla dimerizzazione. Le molecole recettoriali possono infatti muoversi
liberamente nel doppio strato lipidico della membrana e quindi possono formare dimeri e oligomeri
reversibili.

Il legame con il recettore induce un cambiamento conformazionale del dominio extracellulare che stabilizza
le interazioni recettore-recettore e sposta l’equilibrio a favore di strutture oligomeriche.

La dimerizzazione stabilizza lo stato attivo della chinasi e porta in sua prossimità il suo substrato preferito: il
dominio intracellulare di un altro recettore. In questo modo si verifica la transfosforilazione dei recettori a
livello di residui di tirosina situati sia all’interno che all’esterno del dominio catalitico. Questo evento, la
transfosforilazione, fa sì che si attivi la propagazione del segnale all’interno della cellula.

Modello dell’attivazione dei recettori tirosin-chinasici:

✓ Il legame reversibile del ligando al dominio extracellulare induce la dimerizzazione dei recettori e
modificazioni allosteriche responsabili dell’attivazione enzimatica.
✓ Si verifica la reciproca fosforilazione in tirosina (transfosforilazione) tra i recettori dimerizzati.
Ne consegue che i trasduttori del segnale vengono attivati e trasmettono il segnale all’interno della cellula.

La trans-autofosforilazione può verificarsi anche esternamente al dominio catalitico. La fosforilazione di

questi residui forma siti di ancoraggio che vengono riconosciuti con alta affinità dai trasduttori
citoplasmatici del segnale contenenti specifici domini.
L’attivazione della tirosin-chinasi, in assenza di trans/autofosforilazione non è sufficiente ad indurre un
effetto biologico.

Il meccanismo della dimerizzazione e dell’attivazione può essere alterato in numerose situazioni

patologiche. La presenza di un numero eccessivo di molecole recettoriali incrementa la probabilità di
interazioni casuali e quindi la formazione di dimeri anche in assenza di ligandi.

31
Negli ultimi anni è stata studiata la correlazione tra tumori e l’attività tirosin-chinasica. È diventata quindi
bersaglio di numerosi farmaci antineoplastici. Hanno ricevuto particolare attenzione i recettori VEGF
(Vascular Endothelial Growth Factor), protagonisti della neo-angiogenesi tumorale, cioè del processo di
vascolarizzazione indotta dal tumore, indispensabile per la crescita e la diffusione sistemica (metastasi) del
tumore stesso.
Strategie:
▪ inibitori dell ’attività catalitica tirosin-chinasica;
▪ anticorpi anti-recettore: causano il blocco dell’interazione ligando-recettore;
▪ inibitori della trasduzione del segnale: ci sono delle vie di trasduzione costitutivamente attive in
seguito a iperespressione o mutazione dei recettori per fattori di crescita;

Angiogenesi:
Sviluppo di nuovi vasi a partite da vasi preesistenti che si verifica sia nell’embrione, sia nella vita post natale
in condizioni fisiologiche, di difesa-riparazione (infiammazione, cicatrizzazione…) e patologiche (neoplasie,
alterazioni della vascolarizzazione retinica nei diabetici etc..).
Richiede la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali e la loro organizzazione in capillari. Il VEGF
tramite i recettori presenti nell’endotelio ne induce proliferazione e organizzazione in strutture tubulari.
Tramite questo fenomeno le cellule tumorali sono capaci di indurre la formazione dei vasi indispensabili per
il rifornimento di ossigeno e metaboliti.

Soia
Semi di Glycine max, Fam. Fabaceae, pianta erbacea annuale di 50-70 cm.
La soia rappresenta uno degli alimenti più ricchi in isoflavoni.
Studiata per il suo effetto antitumorale, andando ad arrestare la crescita del tumore MA gli studi sono
ancora molto contrastanti.

Ginkgo
La droga è costituita dalle foglie del Ginkgo biloba (Fam Ginkgoaceae), albero originario della Cina, ma
coltivato da noi in giardini o parchi in quanto molto resistente all’ inquinamento delle grandi città.
Le foglie contengono flavonoidi, lattoni terpenici (ginkgolide A, B, C, J e M) sesquiterpeni (bilobalide),
aminoacidi, proantocianidine.
Utilizzato per migliorare il microcircolo e va a favorire la memoria e l’apprendimento (microcircolo
cerebrale).
Svolge questi effetti per una riduzione dell’effetto ossidativo (scavanger) e per lo stimolo del recettore per
l’NFG (fattore di crescita neuronale, scoperto da Rita Levi Montalcini). Potrebbe inibire l’azione del PAF, che
induce apoptosi (attenzione ai soggetti che utilizzano anticoagulanti e antiaggreganti perché ne potenzia
l’effetto!)

Pigeo africano
La droga è data dalla corteccia di Pygeum africanum.
Si usa per ridurre i sintomi dell’iperplasia prostatica benigna (come la serenoa) e inibizione die fattori di
crescita.

Ortica
la droga è data dalle radici di Urtica dioica e/o U. urens.
Stesso utilizzo del pigeo e della serenoa.

Recettori intracellulari (o di membrana)

(sono proteine nucleari o citoplasmatiche (solo i recettori dei glucocorticoidi, dei mineralcorticoidi e del
progesterone) che in seguito all’interazione con i rispettivi ligandi sono in grado di controllare
32
l’espressione genica. I ligandi devono attraversare la membrana cellulare per entrare nel citoplasma,
perciò, devono essere molecole lipofiliche o avere un carrier specifico).
Recettori che stanno all’interno della cellula e avranno dei ligandi che sono sufficientemente lipofili per
entrare nella membrana e raggiungere i bersagli.

Gli ormoni steroidei, tiroidei e alcune vitamine, grazie alla loro struttura altamente lipofila che li caratterizza
e ne permette la diffusione attraverso la membrana citoplasmatica, agiscono tramite recettori che si trovano
all’interno delle cellule.
Tale peculiare localizzazione cellulare permette che queste proteine svolgano la loro funzione nel nucleo
della cellula bersaglio, modificando la trascrizione genica e quindi la sintesi proteica (penetrano nel nucleo
e si legano al DNA). L’effetto finale dei recettori intracellulari è la sintesi di proteine.
I recettori intracellulari giocano un ruolo fondamentale nella regolazione della crescita, del
differenziamento e dell’omeostasi cellulare.

Due caratteristiche differenziano i recettori intracellulari da quelli di membrana:

- Il meccanismo di attivazione, che non sempre richiede un ligando specifico;
- L’attività intracellulare: non è mediata da secondi messaggeri, perché questi recettori hanno la
capacità di legare direttamente il DNA per regolare la trascrizione di geni specifici.

I recettori intracellulari hanno tutti un’organizzazione strutturale simile, in cui si distinguono 5 domini
funzionali denominati come A/B, C, D, E, F :
• Il dominio C: è deputato al legame con il DNA. E’ costituito da aa basici che, per mezzo del legame
con 2 molecole di zinco, conferiscono alla proteina recettoriale una conformazione spaziale detta a
“dita di zinco” che permette l’inserimento del recettore all’interno del solco maggiore del DNA.
• Il dominio E : è responsabile del legame ad alta affinità con il ligando.
• Il dominio F: presente solo in alcuni recettori, la sua funzione non è ancora ben conosciuta.
• Il dominio A/B: ha un ruolo fondamentale per la regolazione della trascrizione genica. La sequenza
di questo dominio è poco conservata tra i vari recettori e si pensa che la sua variabilità strutturale
sia un elemento molto importante per conferire la specificità d’azione di ciascun recettore.

Meccanismo d’azione dei recettori intracellulari

Allo stato inattivo il recettore presente nel citoplasma è allo stato inattivo. Una volta che R interagisce con il
ligando migra nel nucleo e dimerizza. La dimerizzazione può avvenire con recettori dello stesso tipo
(omodimeri) oppure con recettori diversi (eterodimeri). Una volta che dimerizza può andare ad interagire
con il DNA (come l’ha spiegato la prof).

33
Il modello classico di attivazione ligando-dipendente dei recettori intracellulari prevede che, in seguito
all’interazione con il ligando (L), il recettore venga rilasciato dal complesso con proteine inibitorie e attivato
ad interagire con le specifiche sequenze regolatorie poste nel promotore dei geni bersaglio e con altre
proteine nucleari, regolando quindi la trascrizione di geni specifici (come scritto sulle slides).

Il recettore nel citoplasma è allo stato inattivo perché associato a delle proteine inibitorie. Una volta che
arriva il ligando le proteine inibitorie vengono rilasciate, il recettore cambia conformazione, migra nel
nucleo e dimerizza legandosi ad elementi responsivi specifici del DNA, modulando la trascrizione genica
interagendo sui geni bersaglio.

Generalmente i recettori in assenza del ligando non possono attivare la trascrizione genica perché associati
a proteine inibitorie che ne legano i domini deputati alla dimerizzazione e al legame con il DNA.

L’entrata del ligando nella cavità lipofila del dominio E determina modificazioni della struttura tali da
bloccare la fuoriuscita del ligando. Inoltre, il legame con il ligando causa il distacco delle proteine inibitorie.
Il recettore è quindi libero di dimerizzare con molecole recettoriali identiche, formando omodimeri, o con
recettori diversi formano eterodimeri.
Il recettore così attivato è in grado di interagire con il DNA a livello di sequenze nucleotidiche caratteristiche
e specifiche per ogni recettore denominate elementi responsivi.

Il legame del recettore con il DNA determina l’inizio di interazioni con proteine nucleari che permettono di
regolare l’attività trascrizionale di geni bersaglio.
In particolare, al complesso recettore–ligando si legano una serie di proteine dette co-regolatori la cui
funzione consiste nel facilitare (co-attivatori) o bloccare (co-repressori) il legame con il DNA che dà inizio alla
trascrizione.

34
Attivazione in assenza di ligando
Alcuni recettori possono essere attivati anche in assenza del ligando endogeno, in seguito all’attivazione di
recettori di membrana, come quello per l’EGF e l’insulina.

Le proteinchinasi fosforilano il recettore, ne modificano la

conformazione strutturale, come avverrebbe in seguito
all’interazione con l’omone.
Il modello di attivazione ligando-indipendente dei recettori
intracellulari postula l’attivazione iniziale di proteinchinasi che,
fosforilando il recettore, ne modificano la conformazione
strutturale similmente a quanto avviene in seguito all’interazione
con l’ormone; tali fosforilazioni favoriscono la dimerizzazione e il
legame ad alta affinità con il DNA.
(Non si ha un ligando ma un segnale che porta sempre
all’attivazione del recettore).

Specificità d’aione dei recettori intracellulari

È dovuta a diversi fattori:
1. Presenza dei recettori nei vari tessuti (specificità tissutale): i ligandi non hanno effetti se non c’è
recettore
2. Presenza di diverse concentrazioni delle proteine regolatorie nei vari tessuti: perché questi recettori
attivano la trascrizione interagendo con altre proteine nucleari, la presenza di diverse
concentrazioni di queste proteine potrebbe determinare una specificità d’azione.
3. Metabolismo degli ormoni tessuto-specifico: poiché gli ormoni possono essere metabolizzati in
modo differente nei diversi tessuti, possono essere trasformati in metaboliti con diversa efficacia
per il recettore.
Questo spiega perché uno stesso PA può avere effetti diversi in base al tessuto.

La concentrazione dei recettori può andare incontro a regolazione, così come avveniva per i recettori di
membrana:
• Regolazione autologa: il recettore attivato induce la sintesi di se stesso.
• Regolazione eterologa: il recettore attivato induce la sintesi di un altro recettore intracellulare; es.
l’attivazione del recettore per gli estrogeni nell’utero determina l’aumento dell’attività del
promotore del gene codificante per il recettore del progesterone, aumentando significativamente
la concentrazione intracellulare di quest’ultimo.

Modulazione dei recettori intracellulari

Possiamo agire:
➢ sul ligando (sintesi, immagazzinamento o secrezione)
➢ sulla sintesi del recettore (dipenderà dalla sensibilità del tessuto)
➢ sulla funzionalità del recettore impiegando agonisti e antagonisti
Gli agonisti vengono usati in caso di carenza alimentari (lega con co-attivatori nel nucleo).
Gli antagonisti si legano al recettore intracellulare, dando origine a una cascata di eventi, ma questo
complesso non è in grado di attivare la trascrizione perché il sito di legame con le proteine
attivatorie risulta coperto, mente rimane libero quello che riconosce i co-oppressori.

Generalmente il controllo avviene mediante agonisti/antagonisti.

Uso dell’agonista: es. con vitamine per sopperire a carenze di origine alimentare.

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Gli antagonisti agiscono legandosi al recettore e dando origine alla stessa cascata di eventi, ma questo
complesso non è in grado di attivare la trascrizione, perché risulta coperto il sito di legame con le proteine
attivatorie, mentre è libero quello che riconosce i co-repressori.

Esempi di droghe che possono interagire con questi recettori

Fitoestrogeni
Sono delle sostanze vegetali con attività ormonosimile: possono legarsi al recettore per gli estrogeni
nonostante la loro potenza risulti essere 1000 volte inferiore a quella degli estrogeni endogeni.

In base alla loro struttura chimica i fitoestrogeni si dividono in: isoflavoni, lignani e cumestani. I cumestani si
trovano nei germogli dei fagioli, nei cavoli di Bruxelles, nel trifoglio e nei semi di girasole. I lignani sono
abbondanti nei cereali, frutta, vegetali e olio di oliva. Gli isoflavoni sono i fitoestrogeni con attività
estrogenica maggiore e sono contenuti nei legumi, soia e derivati. I principali isoflavoni sono la daidzeina e
la genisteina, (la genisteina ha un’attività estrogenica 7 volte superiore a quella della daidzeina).

L’assunzione dietetica varia molto a seconda dell’area geografica. Ad esempio, il loro contenuto nella dieta
sembra essere 30 volte maggiore in Asia e zone orientali, rispetto ad Europa e nord America.
I fitoestrogeni possono trovarsi in natura allo stato libero o sotto forma di glicosidi, questi ultimi necessitano
di essere idrolizzati dalla flora batterica intestinale per poter essere assorbiti. L’assorbimento può quindi
essere soggetto ad alterazioni e variare da soggetto a soggetto ma anche nella stessa persona a seconda
della presenza di condizioni particolari, quali uso di antibiotici, o altre alterazioni della flora batterica
intestinale.

Essi possono avere effetti sia estrogenici che NON-estrogenici anche in relazione ai livelli di estrogeni
endogeni: hanno attività da agonista parziale
- se l’estrogeno endogeno è basso, il fitoestrogeno ha effetto da agonista, perché va a legarsi al
recettore;
- se l’estrogeno endogeno è altro, il fitoestrogeno ha effetto da antagonista, quindi andrà a
competere per il recettore.

Sebbene esista un considerevole interesse sull’uso dei fitoestrogeni come alternativa alla terapia ormonale
sostitutiva, non esistono attualmente chiari dati a sostegno della loro efficacia.
Si può però andare a consigliare alimenti ricchi di fitoestrogeni (es. derivati della soia) quando quelli
endogeni risultano bassi (ad es. durante la menopausa).

Le principali droghe vegetali contenenti fitoestrogeni sono il trifoglio rosso e la soia:

Trifoglio rosso
È dato dai fiori di Trifolium pratense (Fam Fabaceae), pianta erbacea perenne. Contiene un olio volatile,
flavonoidi, derivati della cumarina e glicosidi. Il trifoglio è spesso considerato una fonte di estrogeni
equivalente alla soia. Su 4 studi, in due è risultato efficace e in altri due no. Non sono stati osservati effetti
collaterali in seguito alla sua somministrazione a dosi consigliate. Tuttavia, è da considerare la presenta di
cumarine, a potenziale azione anticoagulante.
36
Soia
È data dai semi di Glycine max, Fam. Fabaceae, pianta erbacea annuale di 50- 70 cm. La soia rappresenta
uno degli alimenti più ricchi in isoflavoni (circa il 2%), costituiti prevalentemente da genisteina (70%) e
daidzeina (25%) ed altri come la gliciteina. L’efficacia clinica nel ridurre i sintomi della menopausa non è
stata ancora dimostrata. Su 10 studi clinici, in 4 i fitoestrogeni sono risultati efficaci, negli altri 6 no.

La trascrizione genica si concretizza con la sintesi della proteina.

Principi attivi che agiscono senza recettori

I principi attivi che non esplicano il loro effetto mediante recettori agiscono a concentrazioni nettamente
più alte di quelli che agiscono tramite un recettore specifico.

Esempi di principi attivi che non agiscono tramite recettori:

➢ diuretici osmotici
➢ lassativi formanti massa

Diuretici osmotici
➢ Gramigna
La droga (Graminis rhizoma) si ottiene dal rizoma intero o tagliato, lavato ed essiccato, dopo
rimozione delle radici avventizie. Gli zuccheri osmotici presenti vengono filtrati nel glomerulo senza
essere particolarmente assorbiti; una volta nel filtrato gli zuccheri, per effetto osmotico, richiamano
acqua e quindi aumentano la produzione di urina.
• Zuccheri osmotici: Gli zuccheri osmotici presenti nella gramigna vengono filtrati dal glomerulo
senza subire apprezzabile riassorbimento tubulare; gli zuccheri nel filtrato, per effetto osmotico,
richiamano acqua e quindi aumentano la produzione di urina.

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Meccanismo: gli zuccheri osmotici presenti nella gramigna, vengono filtrati dal glomerulo senza subire
apprezzabile riassorbimento tubulare; una volta nel filtrato gli zuccheri provocano, per effetto osmotico,
richiamo d’acqua e quindi aumentano la produzione di urina.

Lassativi formanti massa

Numerose sono le sostanze di origine vegetale che nel lume del colon assorbono acqua e si rigonfiano;
questo comporta un aumento della massa fecale con conseguente effetto lassativo, anche se blando.
Droghe: psillio, gomma guar, crusca, agar e fibra alimentare

Crusca
residuo della macinatura del grano (Triticum aestivum); rappresenta l’involucro esterno del cereale e si
presenta, allontanata la farina, sottoforma di scagliette più o meno larghe e ben distinte.
Può anche derivare da altre piante, quali l’avena (Avena sativa), l’orzo (Hordeum vulgare) o il riso (Oryza
sativa).
L’effetto lassativo è tanto maggiore quanto maggiore è la parte insolubile della crusca.

Utilizzata nel modo corretto (bere 300-400 ml di acqua per volta) la crusca ammorbidisce le feci e previene
la difficoltà di defecazione.

Nella stipsi la crusca aumenta la massa fecale ed accelera il transito intestinale. In alcuni pazienti può
determinare gonfiore per aumento della produzione del gas intestinale in seguito alla degradazione

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batterica dei suoi componenti. Questi sintomi in genere scompaiono con il tempo, ma fanno si che alcuni
pazienti non la tollerino.

Gomma guar
si ottiene dal seme di Cyamopsis tetragonolobus, Fam Fabaceae, pianta erbacea coltivata a lungo in India.
Contiene galattomannano (70-80%), acqua (10-13%), fibre grezze (1,5-2%), proteine, cere e grassi. Come
tutti gli agenti formanti massa, aumenta il volume delle feci e le idrata rendendo più agevole l’evacuazione
in caso di stipsi. Azione graduale. Può causare flatulenza, crampi e dolori addominali.

Fibra alimentare
parte commestibile degli alimenti vegetali che non viene digerita dagli enzimi digestivi.
Un uso quotidiano potrebbe ridurre il rischio di disturbi a carico del sistema digerente (stipsi etc). Potrebbe
anche ridurre l’assorbimento di colesterolo e glucosio.
Gli effetti benefici dipendono dal fatto che per la sua blanda azione lassativa riduce il tempo di permanenza
dei nutrienti, acidi grassi, fosfolipidi, zuccheri e tossine nel lume intestinale e quindi il loro assorbimento.
Comunque, la stipsi può essere più facilmente prevenuta che curata con la fibra alimentare. Flatulenza e
crampi addominali sono tra i più importanti effetti indesiderati, anche se in genere tendono a diminuire con
il tempo.

Agar
si ottiene da diverse specie di alghe e contiene circa il 90% di polissaccaridi tra cui agarosio e agaropectina.
Si prepara trattando le alghe con acqua bollente, l’estratto si filtra, si concentra e si essicca. L’agar si rigonfia
nel lume del colon determinando un effetto lassativo.
Azione graduale.

Psillio
è costituito di semi di Plantago psyllium e di P. indica, Fam Plantaginaceae. Sono piante erbacee annuali con
frutti in capsule che a maturità rilasciano semi giallo-brunastri.
I semi presentano un rivestimento mucillaginoso che a contatto con l’acqua bollente si espande a causa
dell’elevato contenuto di mucillagine (10-30%). L’effetto rigonfiante che ne deriva rende morbide le feci e
aumenta la peristalsi.
Una caratteristica dello psillio è quella di migliorare il peso e la consistenza della massa fecale, sia nella stipsi
che nella diarrea.
Inoltre, allunga il tempo di transito quando questo è breve (nella diarrea) e lo accorcia quando è lungo
(nella costipazione) contribuendo ulteriormente a normalizzare il transito intestinale della massa fecale.
Se usato a lungo e a dosi superiori a quelle consigliate può provocare flatulenza e sensazione di gonfiore
addominale. È controindicato in pazienti con diabete difficile da controllare, in trattamento con
ipocolesterolemizzanti o nei casi di ostruzione intestinale.

DROGHE VEGETALI PER LE DISLIPEDEMIE

La più grande patologia: colesterolo → se troppo alto causa placche aterosclerotiche con ictus, non ha
sintomi, quindi, bisogna controllarne la quantità nel sangue.
HDL: High Density Lipoproteins, è il colesterolo buono, rimuove il colesterolo in eccesso dai tessuti periferici
per portarlo di nuovo al fegato.
39
LDL: Low Density Lipoproteins, è il colesterolo cattivo e una sua elevata concentrazione plasmatica è
strettamente correlata al rischio di malattia cardiovascolare aterosclerotica.

I° consiglio → dieta equilibrata e vita sana (attività fisica fa aumentare l’HDL).

II° consiglio → integrazione con droghe vegetali per dislipidemie.

Via di sintesi del colesterolo: parte dall’acetil-CoA.

La maggior parte delle droghe vanno ad inibire un enzima: 3-
idrossi-metil-glutarilCoA, responsabile della sintesi del
mevalonato. Se si inibisce non si arriva alla sintesi di
colesterolo.

Riso rosso fermentato

Viene prodotto lasciando fermentare per nove giorni il riso cotto (Oryza sativa) con il micete Monascus
purpureus. È un alimento comune in Cina ed è costituito soprattutto da amido (73%), ma i composti
rilevanti dal punto di vista biologico sono le monacoline.
Nello specifico va a ridurre la produzione di colesterolo endogeno (prodotto dal nostro organismo, non
introdotto dalla nostra dieta).
In particolare, il riso rosso contiene monacolina K, che inibisce l’enzima 3-idrossi metil glutaril coenzima A
(HMG-CoA) reduttasi (enzima che converte l’HMG-CoA in mevalonato, tappa limitante per la sintesi del
colesterolo) e quindi la biosintesi del colesterolo.
Da un punto di vista chimico la monacolina k è identica alla lovastatina, una statina ampiamente utilizzata in
clinica. La sua bassa concentrazione nella droga però ha messo in dubbio il suo contributo all’azione
ipolipidemica; altre sostanze, incluse altre monacoline, ne prendono quindi probabilmente parte.

Efficacia dimostrata in studi clinici. Incidenza di

eventi avversi bassa rispetto alle statine, ma è
bene considerare tutti gli eventi avversi della
lovastatina come possibili per il riso rosso
fermentato (come ad esempio dolori
muscolari).

Non chiede la cascata di reazioni, ma solo il

target della monacolina K.

40
 Un altro meccanismo con cui agiscono le statine
è quello di aumentare l’espressione dei recettori
per le LDL: si captano le LDL che non rimango più
in circolo, con conseguente diminuzione del
colesterolo nel circolo plasmatico (che è quello
che ci interessa).

Fieno greco
È dato dai semi di Trigonella foenum graecum (Fam Fabaceae).
L’attività ipocolesterolemizzante è stata attribuita alla presenza di mucillaggini e saponine. La mucillagine
probabilmente determina un ispessimento del muco che riveste il tratto intestinale e quindi può inibire
l’assorbimento di sostanze nutritive, con conseguente riduzione della glicemia e dei tassi di colesterolo.
Inoltre, il fieno greco aumenta l’escrezione di acidi biliari (probabilmente grazie alle saponine) con
diminuzione della riserva di colesterolo nel fegato (la perdita netta di acidi biliari determina una maggior
richiesta di colesterolo dal fegato, con conseguente riduzione dei livelli di LDL circolanti- il colesterolo è un
precursore degli acidi biliari-).
Effetti collaterali gastrointestinali lievi, che non richiedono l’interruzione del trattamento. Potrebbe ritardare
l’assorbimento di alcuni farmaci. Controindicato in gravidanza.

Gomma guggul
È una oleoresina giallina che si ricava da Commiphora mukul.
Da essa per estrazioni successive si ricava il guggulipide. I principali costituenti chimici del guggulipide sono
composti steroidei denominati guggulsteroni.
L’ esatto meccanismo non è ancora chiaro. Il guggul potrebbe interferire con il metabolismo lipidico in
diversi modi:
• riducendo i livelli plasmatici di colesterolo e trigliceridi, aumentando la captazione delle
lipoproteine nel fegato;
• inibendo la biosintesi epatica del colesterolo (riduzione dell’incorporazione di acetato);

41
 • aumento dell’ escrezione biliare di colesterolo;
• aumento dei livelli di HDL nel sangue.
Non chiara l’efficacia clinica, con effetti avversi lievi. Può ridurre assorbimento intestinale di farmaci assunti
contemporaneamente.
Aglio
L’ aglio è costituito dal bulbo di Allium sativum (Fam. Liliaceae), pianta erbacea perenne, originaria dell’ Asia
centrale.
Il principale componente dell’aglio è l’allina.
Principali effetti dell’aglio:
• Effetti ipolipidemizzanti (inibisce enzima 3-HMG-Co; aumenta degradazione trigliceridi per aumento
attività lipasi; riduce LDL e aumenta HDL; inibisce l’ossidazione delle LDL, effetto importante per la
prevenzione dell’aterosclerosi)
• Effetti sulla pressione arteriosa
• Effetti ipoglicemizzanti
• Effetti antiossidanti
• Proprietà antimicrobiche
• Attività antipiastrinica
• Attività fibrinolitica

Carciofo
È dato dalle foglie di Cynara scolymus (Fam. Asteraceae/Compositae).
I principali componenti attivi del carciofo sono divisi in tre classi di sostanze: composti dicaffeilchinici (es.
cinarina), lattoni sesquiterpenici e flavonoidi.
La sua azione ipocolesterolemizzante si svolge su più fronti:
• inibizione dell’ossidazione delle LDL
• favorisce l’escrezione del colesterolo
• inibizione della sintesi del colesterolo (inibizione dell’enzima HMG-CoA)
Inoltre, il carciofo ha proprietà antiossidanti ed epatoprotettive.
Dati clinici non definitivi, ma incoraggianti. Non indicato in soggetti con ostruzione dotto biliare, calcoli alla
colecisti o allergici alle piante della famiglia delle Asteraceae.
Fitosteroli
Ad essere utili in caso di dislipidemie sono anche i fitosteroli, molecole di origine vegetale con struttura
molto simile a quella del colesterolo. Determinano la riduzione dell’assorbimento intestinale del colesterolo,
favorendone l’eliminazione.
Ne sono esempi: la serenoa, il pigeo africano, l’ortica, la zucca, l’estratto di polline di segale… (anche efficaci
nel ridurre i sintomi dell’iperplasia prostatica benigna).

MECCANISMI DI TRASPORTO (ultimi tipi di target per i PA)

Siti d’azione per i principi attivi
Gli effetti terapeutici e tossici dei farmaci traggono origine dalle loro interazioni con macromolecole presenti
nell’organismo.
Si definisce sito d’azione o bersaglio molecolare di un farmaco il componente di una cellula che interagisce
con un farmaco dando inizio a una catena di eventi biochimici che portano agli effetti farmacologici
osservati.
Possono essere siti d’azione:
• recettori per i neurotrasmettitori e gli ormoni
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 • enzimi
• canali ionici
• trasportatori
• acidi nucleici

Meccanismi di trasporto (recap)

Diffusione passiva: passaggio di molecole o ioni (piccole e lipofile) attraverso la membrana che utilizza
esclusivamente il gradiente di concentrazione.
Diffusione facilitata: passaggio di molecole o ioni attraverso la membrana che utilizza proteine
trasportatrici, ma che funziona esclusivamente secondo il gradiente di concentrazione e non richiede
energia.
Trasporto attivo: passaggio di molecole o ioni attraverso la membrana che richiede l’ attività di specifiche
proteine e il consumo di energia.
L’energia necessaria deriva dall’idrolisi di metaboliti energetici, come l’ATP, le molecole con questa funzione
vengono chiamate pompe. Se come energia si sfrutta quella elettrochimica generata da una contro-ione, le
relative proteine vengono chiamate scambiatori o trasportatori.

Canali ionici (target di PA)

Rappresentano insieme alle pompe e ai trasportatori, una classe di proteine che, partecipando in misura
determinante alla regolazione delle specie ioniche ai due lati della membrana cellulare, rende possibile il
corretto svolgimento di funzioni di fondamentale importanza, quali la regolazione del volume e della
motilità cellulare.
Il 5% dei farmaci attualmente disponibili ha come bersaglio un canale ionico. I recettori e gli enzimi
rappresentano il 70% di tutti i bersagli farmacologici ora disponibili. Quindi, intervengono in misura minore
ma sono comunque possibili target di principi attivi.
Il canale ionico è una proteina che attraversa il doppio strato fosfolipidico della membrana cellulare, con
strutture ultraspecializzate in possesso di filtri per specificità ionica e meccanismi di apertura e chiusura
finemente regolati.

Possono essere classificati sulla base di due criteri funzionali:

• A seconda del meccanismo d’azione
▪ Canali attivati da ligando: recettori canale
▪ Canali voltaggio-dipendenti: il meccanismo di innesco del flusso ionico è una variazione del
voltaggio transmembrana (VM).
L’attivazione non dipende dolo da VM ma anche da altre variabili come la concentrazione
43
 citoplasmatica di cAMP, e di altri secondi messaggeri…
• A seconda della loro selettività ionica
▪ Canali del Na+
▪ Canali del K+
▪ Canai del Ca++
▪ Canali del Cl-

Subunità alfa → polimero proteico lungo, componente principale del canale, dopo lo stimolo si apre.
Nel caso del canale del Na+ e del Ca++ questa struttura consiste in una sola catena
polipeptidica, nel caso dei canali del K+ essa consiste in 4 polipeptidi più piccoli a formare
un tetramero.

A differenza dei canali attivanti da ligando, nei quali l’apertura del poro ionico è stimolata da un agonista
extracellulare, nel caso dei canali voltaggio dipendenti lo stimolo per l’apertura del poro è, per definizione,
rappresentato da una variazione del voltaggio ai lati della membrana plasmatica.
Il canale voltaggio dipendente deve quindi possedere una struttura membranaria in grado di “sentire” il
campo elettrico e sue eventuali variazioni.
Questa struttura prende il nome di “sensore del voltaggio” e rappresenterebbe il “cancello” di attivazione
del canale.
In tutti i canali ionici voltaggio-dipendenti la transizione dallo stato chiuso a quello aperto viene definita
attivazione, viceversa, il processo mediante il quale il canale riassume la configurazione dello stato di
chiusura, con conseguente disattivazione del flusso ionico, viene definito deattivazione.
In alcuni canali esiste anche uno stato “inattivato”, che viene raggiunto tramite un processo di
“inattivazione”.
Nello stato inattivato, come in quello chiuso, non si ha flusso ionico attraverso il poro del canale, ma a
differenza dello stato chiuso, in questo caso il canale non può venire immediatamente attivato in seguito a
depolarizzazione, ma è necessario che il canale ritorni prima nello stato chiuso, dal quale soltanto potrà
essere riaperto.
Il processo di riattivazione richiede che la cellula si ripolarizzi, ossia che il suo potenziale torni a valori più
negativi.

Pompe e trasportatori (target di PA)

Pompe:
Nelle cellule animali la principale ATP-asi è la pompa sodio/potassio: enzima di membrana che consente di
utilizzare energia accoppiando la scissione dell’ATP al trasporto di Na e K attraverso la membrana.
Questa pompa consuma in media il 30% dell’energia prodotta dalla cellula. La sua distribuzione ubiquitaria
assicura il mantenimento dei gradienti di Na e K attraverso la membrana in tutte le cellule, muovendo il Na
verso l’esterno e il K verso l’interno.

Trasportatori:
Meccanismo di trasporto che utilizza energia, ma non ricavata da ATP.
Il movimento dei soluti può coinvolgere una o più sostanze: si parla quindi di uniporto o cotrasporto. Il
cotrasporto può essere ulteriormente suddiviso in simporto (entrambe le specie molecolari sono
trasportate nella stessa direzione) o antiporto (quando le due sostanze sono trasportate in direzioni
opposte).

44
Tra i trasportatori il principale scambiatore è quello Na+/Ca++:
catalizza il controtrasporto del Na+ e del Ca++ in entrambe le direzioni (particolarità di questo trasportatore)
attraverso la membrana plasmatica. L’entità e la direzione del trasporto dipendono dai gradienti di Na+ e
Ca++ e dai potenziali di membrana.
Lo scambio avviene con una stechiometria di 3Na+ : 1Ca++.
Lo scambiatore entra in funzione solo quando la [Ca++] aumenta in modo consistente, ed è uno
scambiatore bidirezionale.

La pompa sodio-potassio ATPasi

È un antiporto che accoppia l’idrolisi di 1 molecola di ATP al trasporto di 3 ioni Na+ verso l’esterno (escono
dalla cellula) e 2 ioni K+ verso l’interno (entrano nella cellula), producendo quindi una corrente di cariche
positive in uscita e generando uno squilibrio trasmembrana delle concentrazioni di Na+ e K+.
Il trasporto può avvenire se lo ione Na+ e l’ATP sono presenti sulla superficie intracellulare della pompa e il
K+ su quella extracellulare.

Sotto il piano siamo nella parte

intracellulare, sopra il piano siamo nella
parte extracellulare.

1 ATP e 3 Na+ che si legano all’interno

della cellula, grazia all’ATP si ha la
fosforilazione della pompa che cambia
conformazione e si chiude, per riaprirsi nel
lato extracellulare dove rilascerà 3 Na+
(presi dalla cellula) e li sostituirà con 2 K+
(presi dalla parte extracellulare).
La pompa viene nuovamente defosforilata,
cambia conformazione (si richiude) e si
riapre all’interno della cellula dove
rilascerà i 2K+.

Questa pompa può essere un bersaglio d’azione di principi attivi importanti: i glicosidi cardioattivi.

Glicosidi Cardioattivi
I glicosidi sono composti costituiti da una porzione zuccherina, glicone, unita ad una porzione non
zuccherina definita aglicone o genina. La natura dell’aglicone determina le funzioni farmacologiche dei
glicosidi, mentre la parte zuccherina è responsabile della farmacocinetica di queste molecole.
Tipologia d’azione: cardiotonica. Non si possono trovare in erboristeria.

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Digitale
Droga contenuta nella foglia essiccata di Digitalis purpurea o D. lanata, contiene glicosidi cardenoldi,
espressi come digitossina (PM=765).
Il termine digitale deriva dalla forma a ditale dei fiori e purpurea per il colore rosso dei fiori, mentre lanata
per il rivestimento di aspetto lanoso sempre del fiore.
In particolare, le foglie di D. purpurea presentano dei glicosidi (purpurea glicosidi A e B e la glucogitalossina)
che durante l’essiccamento si degradano andando a formare prevalentemente digitossina (dal purp.A),
gitossina (dal purp.B) e gitalossina (dal glucogita.).
Mentre, la D. lanata presenta come glicosidi i lanatosidi A,B, C. Dai lanatosidi A e B si ricavano la digitossina
e gitossina, mentre da quello C si origina la digossina, tipica della lanata.
Attualmente si impiega maggiormente la digossina.

Altre droghe che presentano cardenolidi sono: strophanthus (g-strofantina), oleandro, convallaria, scilla.

I glicosidi cardioattivi hanno come target d’azione/agiscono sulla pompa Na+/Ka+ - ATPasi inibendola
reversibilmente: il K non entra più e il Na non esce più, questo causa un aumento della concentrazione del
sodio intracellulare, quindi, lo scambiatore che è bidirezionale, porta fuori il Na e lo scambia con l’entrata
del calcio. Il risultato è un aumento del calcio intracellulare che causa un aumento della forza della
contrazione sistolica (delle miofibrille).
I glicosidi cardioattivi si legano alla pompa dalla parte del potassio (extracellulare), quindi compete con il K
per il legame sulla pompa, questo sta a significare che il funzionamento dei cardenolidi può essere
influenzato dalla concentrazione di K (se tanto potassio il glicoside cardioattivo avrà un effetto minore).

Effetti dei glicosidi cardioattivi:

• Inotropo positivo, aumento della forza di contrazione cardiaca, quindi è indicata per l’insufficienza
cardiaca.
• Cronotropo e dromotropo (modifica della velocità di conduzione dell’impulso elettrico del cuore)
negativo: la digitale determina una riduzione della frequenza cardiaca.
Per questo la digitale viene impiegata anche come antiaritmico.
Intossicazioni da digitalici:
• Manifestazioni extracardiache: effetti a carico dell’apparato digerente (nausea, vomito, raramente
diarrea) ed effetti neurologici (affaticamento e debolezza, alterazione nella percezione dei colori,
visione giallo-verde).
• Manifestazioni cardiache: aritmie (tachicardia atriale con blocco atrio ventricolare).
I digitalici sono quindi farmaci difficili da maneggiare, sono stati soppiantati da farmaci più sicuri.
46
Prezzemolo come diuretico (curiosità)
Altra droga che ha come target la pompa Na/K ATPasi.
Principali costituenti dell’olio essenziale sono miristicina e apiolo. È stato dimostrato in studi in vivo (nel
ratto) che gli estratti di prezzemolo aumentano la produzione di urina, aumentando l’escrezione del potassio
attraverso l’inibizione della Na/K ATPasi.

Glicoproteina P (è una pompa)

È un membro delle ATP-binding cassette: ATPasi responsabili del trasporto di varie sostanze, non è specifica
per un substrato, attraverso le membrane cellulari. Questi trasportatori pompano i substrati presenti dentro
la cellula al di fuori della cellula (eliminazione).
• L’espressione della P-glicoproteina può condizionare l’assorbimento di farmaci o il loro accesso ai
tessuti bersaglio, oppure incrementarne l’eliminazione epatica o renale (resistenza
multifarmacologica).
• Inducono la resistenza farmacologica delle cellule tumorali (dopo un iniziale successo terapeutico si
assiste alla comparsa di resistenza).
La glicoproteina P è espressa in zone canonicamente adibite all’eliminazione di xenobiotici come la
membrana biliare negli epatociti, l’orletto a spazzola del tubulo prossimale del nefrone e la superficie
dell’ileo e del digiuno.
Il trasportatore è in grado sia di ridurre l’influsso dei farmaci nel citoplasma che di aumentare l’efflusso con
un meccanismo dipendente dall’ATP.
▪ I farmaci possono essere individuati ed espulsi nel momento in cui entrano a livello della membrana
plasmatica. In tal modo la =-glicoproteina funziona come meccanismo di espulsione o di pulizia di
sostanze idrofobiche.
▪ Il trasporto avviene attraverso un singolo canale formato dalla P-glicoproteina.
L’attività del trasportatore richiede l’utilizzo di due molecole di ATP per svolgere la sua funzione.

L’espressione della glicoproteina P può condizionare l’assorbimento dei farmaci o il loro accesso ai tessuti
bersaglio, oppure incrementare l’eliminazione epatica o renale.
Es. digossina: substrato della glicoproteina P.
Farmaci che inducono la glicoproteina P determineranno un ridotto assorbimento di digossina (che avrà
meno effetto), viceversa farmaci che la inibiscono aumenteranno l’assorbimento.

Interazioni con la glicoproteina P sono state dimostrate anche con alimenti, quali il succo di pompelmo,
arancia e mala e con prodotti erboristici come cardo mariano o iperico e in generale, con quelli che
contengono flavonoidi e furanocumarine.
In generale le sostanze che inducono o inibiscono il Cyt450 hanno lo stesso effetto sulla glicoproteina P.

È interessante notare che alcuni composi tossici sono in grado di stimolare essi stesi l’attività ATPasica
favorendo indirettamente la loro espulsione.

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Iperico
È costituito dalle foglie e dalle sommità fiorite essiccate di Hypericum perforatum.
Il nome anglosassone della Pianta (Erba di San Giovanni) è dovuto al fatto che la pianta fiorisce in
corrispondenza della festività di San Giovanni.
La droga contiene derivati naftodiantronici (ipericina, pseudoipericina), flavonoidi e derivati floroglucinolici.

Meccanismo d’azione: i derivati floroglucinolici, in particolare l’iperforina sono in grado di inibire la

ricaptazione di numerosi neurotrasmettitori a livello centrale, come la serotonina, la noradrenalina, la
dopamina, il glutammato e il GABA (in altre parole, inibisce il reuptake delle catecolamine).
L’iperico è utilizzato per il trattamento della depressione. La sua efficacia è stata dimostrata in studi clinici
(depressione lieve e moderata).

Effetti avversi: gastrointestinali, vertigini e stanchezza, mal di testa, secchezza delle fauci,
fotosensibilizzazione (raro, ma possibili a dosi elevate).
Interazioni farmacologiche: anticoncezionali e tutti gli altri farmaci che sono metabolizzati dal citocromo
p450 e che sono substrato della glicoproteina P.

Cardo mariano
È dato dai frutti maturi di Silybum marianum, una pianta erbacea bienne.
La droga contiene un complesso di flavonolignani denominato silimarina.
Ha diverse proprietà farmacologiche: antiossidante, epatoprotettive, nefroprotettive, antitumorali,
antinfiammatorie e antiulcera.
Infatti, la silimarina:
- aumenta la sintesi proteica negli epatociti, stimolando la rigenerazione epatica
- reagisce con i radicali liberi trasformandoli in composti più stabili e meno reattivi
- azione antinfiammatoria, inibisce la sintesi di mediatori dell’infiammazione
- inibisce la P-glicopriteina e quindi può aumentare l’assorbimento di altri principi attivi
L’efficacia del cardo mariano non è stata dimostrata in studi clinici.
A dosi giornaliere elevate, la silimarina può determinare aumento di produzione di bile con conseguente
possibile effetto lassativo.

Le altre pompe (in giallo) non le chiede yeeeeeeeeeee.

48
49
Endocitosi
È un processo tramite cui le cellule internalizzano macromolecole, sostanze particolate e addirittura altre
cellule.
Il materiale che deve essere internalizzato viene progressivamente racchiuso all’interno di una porzione di
membrana plasmatica che si invagina e quindi si distacca dalla superficie cellulare, formando una vescicola
intracellulare con le sostanze ingerite. I processi di endocitosi sono anche alla base della down regulation
dei recettori di membrana.

Endocitosi mediata da recettore

Viene utilizzata dalle cellule per internalizzare specifiche molecole presenti nell’ambiente extracellulare
senza che ciò comporti l’internalizzazione di ingenti quantità di fluido extracellulare.
Una volta internalizzata, la vescicola con il suo contenuto può fondersi con il sistema endosomiale che è
caratterizzato da un basso pH (il passaggio attraverso l’ambiente acido può avere un notevole significato
funzionale e comportare la dissociazione del ligando dal suo recettore).

FINE DEI POSSIBILI TARGET DEI PA

Fattori che possono influenzare l’effetto di un PA introdotto nell’organismo

✓ età
✓ presenza di fattori patologici
✓ dieta
✓ fumo
✓ fattori ambientali
✓ gravidanza/allattamento
✓ sesso
✓ fatto genetici (farmacocinetica)

Età
Metabolizziamo le sostanze in maniera diversa a seconda dell’età: raggiunge i max livelli enzimatici in età
adulta e poi tenderà a diminuire con l’avanzamento dell’età.
In particolare:
• Età pediatrica: nei neonati l’attività degli enzimi deputati al metabolismo dei farmaci è ridotta, la
barriera ematoencefalica non completamente sviluppata e i sistemi escretori immaturi; fino
all’età puberale i bambini sono > soggetti agli effetti tossici ed indesiderati dei farmaci.
Inoltre, anche le droghe vegetali possono essere dannose.
• Età geriatrica: metabolizzano meno e l’altro aspetto importante è che tendono ad avere una
compresenza di più patologie.

Fattori patologici
Le disfunzioni epatiche sono quelle a cui prestare maggiore attenzione, perché non permettono la completa
eliminazione del p.a. Pertanto, anche il ricorso ad un prodotto erboristico richiede un’attenta valutazione,
soprattutto se sono presenti piante ritenute tossiche per il rene.
Altra particolare attenzione va fatta nel caso di medicinali anticoagulanti/antiaggreganti.

Dieta
Importante fattore di modulazione delle biotrasformazioni.
Si è visto che la deficienza di minerali (calcio, rame, ferro, magnesio e zinco) diminuisce le ox catalizzate dal
CytP450 e anche le reazioni di riduzione. La deficienza di vitamine (C, E e complesso B) riduce la velocità
delle trasformazioni degli xenobiotici.
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Inoltre, per quanto riguarda la carruba e i cavoli di Bruxelles hanno un effetto inducente, cioè > il
metabolismo di un PA (ad es. questi citati aumentano il metabolismo della caffeina).

Fumo
Il fumo di tabacco contiene numerosi composti chimici, alcuni dei quali sono induttori dell’attività farmaco–
metabolica, altri invece sono dotati di attività inibitoria (monossido di carbonio).

Fattori ambientali
Il posto in cui si vive o in cui si lavora può modulare il nostro metabolismo: ciò succede nelle industrie in cui
si lavora a contatto con i metalli pesanti (piombo e mercurio) o numerosi inquinanti, solventi, insetticidi
(residui negli alimenti)etc.

Gravidanza
È da almeno gli anni ’60, in seguito alla teratogenicità della talidomide (usato come antinausea dalle donne
incinta, si scoprì poi la teratogenicità di uno dei suoi enantiomeri) che si raccomanda di evitare l’uso dei
farmaci in gravidanza. In particolare, nella prima fase della gravidanza, fino al terzo mese.
Evitare in particolar modo i farmaci che possono interagire con lo sviluppo del feto.

Allattamento
In genere, le sostanze sconsigliate durante la gravidanza lo sono anche durante l’allattamento. Il bambino
potrebbe infatti andare incontro ad inconvenienti correlati alle proprietà della sostanza assunta dalla madre
ed aggravati dall’immaturità dei suoi meccanismi di eliminazione.

Sesso
Le prime osservazioni sulle differenze nell’azione di un farmaco legate al sesso risalgono al 1932 quando
Nicolas e Barron riportarono come l’induzione del sonno nel ratto femmina richiedesse soltanto la metà
della dose di barbiturici necessaria per il ratto maschio. Successivi studi indicarono che questo diverso
effetto era dovuto prevalentemente ad una ridotta capacità della femmina di metabolizzare i barbiturici.
Da questi studi è nata la “farmacologia di genere”.
Ciò nonostante, attualmente, gli studi vengono effettuati sugli uomini intorno ai 35 anni di età, ma
paradossalmente sono le donne ad usarne di più.

Farmacologia di genere
La Medicina di Genere è una branca recente delle scienze biomediche che ha l’obiettivo di riconoscere e
analizzare le differenze derivanti dal genere di appartenenza sotto molteplici aspetti: a livello anatomico e
fisiologico, dal punto di vista biologico, funzionale, psicologico, sociale e culturale e nell’ambito della
risposta alle cure farmacologiche.
La finalità di questa innovativa disciplina è arrivare a garantire a ciascuno, uomo o donna che sia, il miglior
trattamento possibile sulla base delle evidenze scientifiche.

Come detto prima, però, i medici hanno preso come modello di riferimento il corpo maschile – di età media
(35 anni), peso nella norma (70 chili circa) e di origine caucasica – e su di esso hanno costruito l’identikit
delle malattie. Questo anche perché l’organismo femminile è molto più complesso, dal punto di vista
fisiologico rispetto quello maschile (ormoni durante il ciclo, gravidanza, ecc…).
Questo è paradossale, in quanto i farmaci risultano meno studiati nel genere che più li usa: le donne.

Il concetto di genere
Il “genere” rappresenta una costruzione sociale, la rappresentazione, definizione e incentivazione che può
far variare il concetto di uomo/donna in base ai contesti socioculturali di riferimento.
Il “sesso” invece, costituisce un corredo genetico, un insieme di caratteri biologici, fisici e anatomici che
producono una dicotomia maschio/femmina.

51
Sesso e genere non costituiscono due dimensioni contrapposte ma interdipendenti: sui caratteri biologici si
innesta il processo di produzione delle identità di genere.

Ciò che c’è anche di differente è l’incidenza di patologie tra uomo e donna: ad es. le donne sono molto più
soggette alla depressione, allo sviluppo dell’Alzheimer e tumore al polmone, mentre gli uomini sono più
soggetti a sviluppare il Parkinson.

Ma anche i sintomi stessi della malattia possono svilupparsi in maniera differente tra uomo e donna: ad es.
nel caso dell’infarto (angina pectoris) nelle donne i sintomi sono dolore irradiato alle spalle, al dorso, al
collo, mancanza di fiato, nausea persistente, sudori freddi; mentre negli uomini si tratta di un dolore
toracico a livello dello sterno che può irradiarsi al braccio sinistro.
In primis gli operatori devono essere consapevoli di queste differenze, per intervenire correttamente.

Alcune differenze di genere dei parametri farmacocinetici

• Biodisponibilità orale: nelle donne, prendendo in considerazione il paramento fisiologico del tempo di
svuotamento, esso è maggiore perché dipende anche dalla fase del ciclo mestruale ed è aumentato in
gravidanza.
• Volume di distribuzione: bisogna tener conto che l’uomo ha un peso maggiore (nelle donne è di circa il
30% minore) e che c’è una diversa composizione corporea, come la maggior quantità di tessuto adiposo
nelle donne del 25% (il Vd sarà > nelle donne se si tratta di farmaci lipofili- cioè, solubili nei grassi-, > per
gli uomini se si tratta di farmaci idrofili).
• Enzimi: quelli coinvolti nel metabolismo dei farmaci possono presentare una maggiore o minore attività
a seconda del sesso.
• Clearance renale: filtrazione glomerulare ridotta nelle donne, mediamente più alta negli uomini.
• Succo gastrico: quello della donna ha un una minore acidità

Anche per quanto riguarda l’alcol è presente una differenza: le donne sono maggiormente vulnerabili agli
effetti tossici dell’etanolo, perché hanno una minore capacità di metabolizzare le bevande alcoliche.
In particolare, l’etanolo deve essere idrolizzato in acetaldeide tramite l’enzima alcol deidrogenasi;
quest’ultimo enzima è meno presente nelle donne e quindi, a parità di dose, i livelli ematici di etanolo nelle
donna sono maggiori.

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Farmacogenetica
È la disciplina che studia come l’assetto genetico degli individui influenzi l’azione dei farmaci ad essi
somministrati, con l’obiettivo di predire e quindi prevenire reazioni avverse e fallimenti terapeutici, ma
anche di favorire l’identificazione del farmaco giusto e del suo corretto dosaggio per ogni singolo paziente.
L’EMA (Agenzia europea per i medicinali) definisce la farmacogenetica come: ”lo studio delle variazioni
interindividuali nella sequenza del DNA in relazione alla risposta ai farmaci”.

Si ritiene che circa l’80% dei geni nell’uomo contenga variazioni di sequenza tra individui.
Quando una variazione nella sequenza del DNA è presente almeno nell’1% della popolazione si parla di
polimorfismo, mentre al di sotto dello 0,1% si parla di mutazione. Esistono diversi tipi di polimorfismi, ma i
più numerosi sono gli SNP (polimorfismi a singolo nucleotide).
SNP: in una medesima posizione nel genoma, due individui presentano variazioni di sequenza a livello di un
singolo nucleotide.

Gli SNP sono i principali responsabili dell’esistenza di forme diverse dello stesso gene, ossia di varianti
alleliche (indicate con il simbolo *). Si parla di varianti alleliche se la particolare forma del gene è presente
in almeno l’1% della popolazione, riservando la definizione di allele mutato per gli altri casi.

I polimorfismi possono riguardare un solo allele (eterozigosi) o entrambi (omozigosi). Nel caso degli enzimi
metabolici, rispetto ai soggetti con entrambi gli alleli attivi, la presenza di una variante inattiva determina la
produzione del 50% dell’enzima nei soggetti eterozigoti e l’assenza totale dello stesso negli omozigoti.

I DIFETTI FARMACOMETABOLICI SU BASE GENETICA PIÙ FREQUENTI SONO:

• Polimorfismo genetico nell’ossidazione
Tra i diversi polimorfismi del sistema metabolico dei farmaci il sistema enzimatico del citocromo
P450 svolge un ruolo centrale nel metabolismo ossidativo dei farmaci. Il polimorfismo del CYP2D6 è
quello con le più importanti implicazioni cliniche.
La determinazione dello stato metabolico di un soggetto può essere effettuata mediante procedure
di fenotipizzazione basate sulla somministrazione di un marker dell'enzima e successiva misurazione
del farmaco e del metabolita nelle urine o con genotipizzazione con tecniche di biologia molecolare.
Le variazione vengono rappresentate con * e un numero. Questo può comportare diversi effetti.

53
 A oggi sono state descritte oltre settanta varianti alleliche di CYP2D6, tra le quali almeno quindici
codificano per un enzima non funzionale.
Portatori di due alleli a ridotta funzionalità o con perdita di funzionalità sono definiti
rispettivamente metabolizzatori intermedi (10-15% della popolazione) e lenti (5-10%); questi si
contrappongono a individui omozigoti ed eterozigoti per enzimi wild-type o a normale attività (75-
85%), ossia i metabolizzatori rapidi. L’1-10% della popolazione è invece rappresentato dai
metabolizzatori ultrarapidi (caso studio del paziente che prende la codeina e va in coma).

• Polimorfismo dell’acetilazione
Il primo e più conosciuto esempio di metabolismo geneticamente controllato di un farmaco è dato
dalla differente capacità di acetilazione di alcuni composti di impiego clinico quali isoniazide dall’N-
acetiltransferasi.
In base alla capacità di acetilazione gli individui possono essere distinti in acetilatori rapidi e lenti.
L'attività dell'enzima è controllata monogenicamente e l'acetilazione lenta viene ereditata come
carattere autosomico recessivo. La frequenza di acetilatori rapidi e lenti varia in relazione al gruppo
etnico: nelle popolazioni europee i due fenotipi sono ugualmente distribuiti, mentre tra i giapponesi
e gli esquimesi gli acetilatori lenti non superano il 10%.

L’area in cui oggi la farmacogenetica gioca un ruolo chiave nella scelta del farmaco è quella oncologica: la
stratificazione dei pazienti sulla base della genetica del tumore permette di aumentare la percentuale di
risposta a diversi farmaci (target therapy).

Ora abbiamo tutte le basi per capire cose succede a un PA quando lo assumiamo.

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APPROCCIO SPERIMENTALE PER LO STUDIO DI UNA DROGA VEGETALE
Importanza della ricerca scientifica
✓ Migliorare l’impiego di droghe vegetali già note
✓ Caratterizzare attività terapeutiche nuove
✓ Scoprire proprietà farmacologiche di piante mai utilizzate in medicina
✓ Stabilirne la tossicità
✓ Definire nuove metodologie di studio

Finalità: studiare la droga nella sua interezza in quanto tra le sostanze in essa presenti si stabiliscono
sinergismi utili agli effetti benefici.
Questo è diverso se studiamo la droga per intero (estratto contiene molti PA diversi) o una parte (PA puro).

Primo problema: scelta del materiale di base da esaminare, con relativi problemi di riconoscimento e
differenze del materiale per via della provenienza, periodo di raccolta e conservazione. Nonché necessità di
conoscenze molto diverse tra di loro (etnobotanica, chimica e farmacologia).
Secondo problema: trattamenti, cioè trasformazione del vegetale da trattare in estratti facili da
somministrare.

Lo studio di efficacia di una droga è sempre più complicato rispetto al farmaco:

• il farmaco di sintesi è ben caratterizzato chimicamente e può essere facilmente somministrato ad
una dose definita
• la droga, invece, presenta numerose sostanze oltre al PA che potrebbe interessare, che possono
anche essere inerti o agire su siti diversi rispetto a quello del PA. Questo può portare anche ad avere
effetti collaterali o addirittura tossici es. tasso (contiene tassolo, sostanza impiegata nel carcinoma
ovarico e mammario, assieme a numerosi alcaloidi tossici, quali tossina A e tossina B, che possono
causare morte). Es. saponine che, grazie al loro potere tensioattivo, modificano i processi di
assorbimento dei principi attivi, così come mucillagini e sostanze peptiche e che sono in genere
sostanze inattive farmacologicamente, ma che in un estratto hanno la loro attività.

In molti casi si è accertato che più del principio attivo di una droga è efficace il “pool” di sostanze
farmacologicamente attive presenti nella droga in quanto tra esso e gli altri componenti si stabiliscono
sinergismi utili verso gli effetti medicamentosi e/o antagonismi verso gli effetti collaterali, siano essi dannosi
o semplicemente indesiderati.
Es. Il “seme santo”, Artemisia cina, risulta più attivo del principio attivo, la santonina, come antielmintico.
Riveste infatti un ruolo importante l’olio essenziale presente nella droga: questo facilita la penetrazione
della santonina nel verme ed esercita direttamente un’azione antielmintica.

In una droga possono anche essere presenti sostanze con azioni opposte a quella del componente
principale (nel rabarbaro, ad esempio, sono presenti sennosidi ad azione lassativa e tannini ad azione
astringente) o sostanze che agiscono su tessuti o organi diversi da quelli sui quali va ad agire il principio
attivo (ad. es. la China, Chinchona spp, contiene la chinina, alcaloide con proprietà antimalariche, ma anche
l’alcaloide chinidina che si comporta come deprimente cardiaco e l’acido cincotannico che provoca stipsi).

Belladonna: azione più blanda di quella degli alcaloidi tropanici puri.

Rabarbaro: grazie alla presenza di tannini causa un’azione lassativa più blanda e priva di effetti spiacevoli
tipici di altre droghe antrachinoniche.
Eucalipto: attivo come ipoglicemizzante, mentre non lo sono i principi attivi purificati.
Ipecacuana: la presenza di tannini riduce l’assorbimento degli alcaloidi emetina e cefelina, con conseguente
diminuita attività e tossicità della droga

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Analisi dell’attività biologica
Per ogni attività farmacologica esistono test specifici e selettivi.

Sperimentazione clinica: sperimentazione fatta sull’uomo.

Sperimentazione pre-clinica: o in vitro (su culture cellulari) o in vivo (sugli animali)

Sperimentazione in vitro
Si utilizzano colture cellulari di diverso tipo:
• colture primarie
• colture ottenute da banche cellulari
la banca cellulare è nata per raccolta, controllo di qualità, espansione, conservazione e distribuzione di linee
cellulari umane e animali, con l'obiettivo di fornire ai ricercatori e alla comunità scientifica prodotti di
qualità certificata, a garanzia dell'affidabilità e riproducibilità dei risultati della ricerca.

Una linea cellulare isolata di fresco da un tessuto viene chiamata “coltura primaria”(hanno vita breve). Da
questa, per subcoltivazione, si possono ottenere sottocolture o linee cellulari (non vanno in contro a
morte).
Così si ottengono notevoli quantità di materiale con caratteristiche relativamente omogenee e simili alla
coltura primaria, quanto minore è il numero di passaggi.

Sorgenti di materia cellulare:

• tessuti embrionali (elevata capacità proliferativa, ma relativa diversità rispetto alle cellule
dell’animale adulto)
• tessuti adulti (replicazione più lenta, differenziate a seconda del tessuto, NO coltivazione in vitro?)
➢ le cellule più comunemente utilizzate in coltura sono non interamente differenziate, con alte
capacità proliferative.
+ la proliferazione in vitro si accompagna alla perdita dei caratteri di differenziazione.

La differenziazione viene tuttavia mantenuta per un certo numero di passaggi in vitro. Ad esempio, le cellule
endoteliali conservano le caratteristiche di differenziazione per 5-10 passaggi. Dopodiché perdono dei
caratteri di differenziazione.
I fattori che facilitano la proliferazione sono:
✓ la bassa densità cellulare
✓ la bassa concentrazione di calcio
✓ presenza di fattori di crescita

Mentre, favoriscono la differenziazione:

✓ la presenza di ormoni
✓ l’alto livello di calcio
✓ l’alta densità cellulare
✓ la presenza di fattori di differenziamento specifico
✓ la presenza di solventi

Dopo un certo numero di passaggi una linea cellulare si “trasforma” dando origine ad una linea cellulare
“immortale”. Il fenomeno di immortalizzazione, però, non è stato definito con precisione.
Una linea cellulare immortale è riconosciuta da alcuni caratteri:
✓ diminuzione delle dimensioni cellulari
✓ dalla dipendenza da siero
✓ diminuzione della dipendenza dall’ancoraggio (cioè, maggior capacità di crescere in sospensione).
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Queste linee cellulari sono più facili da coltivare anche se possono a volte perdere alcune delle
caratteristiche delle cellule da cui sono originate.

Altra possibilità è l’utilizzo di linee cellulari neoplastiche: esse hanno un’elevata capacità di riprodursi in
vitro con le caratteristiche delle cellule immortali, ma riescono a conservare parte dei caratteri di
differenziazione delle cellule da cui derivano.

Mezzi di coltura:
I mezzi di coltura più comuni sono i medium con aggiunta di siero, il siero può contenere: albumina
(trasporto molecole biologiche), fibronectina (adesione cellulare), transferrina (trasporto di ferro), alfa-2-
macroglobulina (inibizione della tripsina), ormoni (controllo di funzioni metaboliche).
Il medium più adatto viene scelto su indicazione da letteratura.

Oltre al siero, il medium contiene fattori di crescita, lipidi e acidi grassi, minerali, metaboliti, polipeptidi.
Esistono in commercio numerosi tipi di siero, il più utilizzato è il siero bovino fetale.

A seconda delle loro caratteristiche le cellule possono crescere in sospensione o aderire alla superficie.

La coltura primaria viene preparata da un tessuto, prelevato sterilmente dall’animale o dall’uomo e in

seguito fatto aderire al recipiente di coltura. Quando trasferite in una fiasca, le cellule, dopo una fase di
latenza di circa 24 ore, vanno incontro ad una serie di moltiplicazioni. Ogni 2 o 3 giorni è necessario un
cambio di medium e l’amplificazione quando raggiungono un numero tale che le induce a staccarsi.

Contaminazione → può essere di natura batterica, virale o da micoplasma. La contaminazione batterica si

riconosce per la torbidità del medium (infatti si lavora sotto cappa sterile). Contaminazione
da micoplasma molto comune.
Conservazione → le linee cellulari si possono conservare in azoto liquido, per evitare che si formino lesioni
irreversibili e formazione di cristalli il congelamento deve essere lento e deve avvenire in
presenza di criopreservanti, come il DMSO, che producendo microfori sulla membrana
cellulare permette il passaggio di acqua impedendo la formazione di cristalli.

Controllo della vitalità cellulare:

il metodo più classico è l’uso dei coloranti detti “vitali”. Sono macromolecole che in condizioni normali non
penetrano nella cellula, vitale ,quindi, perché non riescono a colorare le cellule vive. Le cellule alterate
(morte) perdono la permeabilità selettiva ed appaiono colorate.
Il colorante vitale più comune è il trypan blu 1%. Il risultato si esprime come % di cellule colorate rispetto al
totale.

Test per valutare la vitalità cellulare: SAGGIO MTT

Il saggio MTT è un saggio colorimetrico per la misurazione dell'attività degli enzimi (contenuti nei
mitocondri) che convertono (riducono) l'MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolio) in
FORMAZANO.

Il saggio utilizza sali di tetrazolio di colore giallo solubili in acqua che vengono convertiti in formazano
insolubile e di colore blu-violaceo, colore che deriva dallo sfaldamento riduttivo degli anelli di tetrazolio,
qualora le cellule abbiano un'attività metabolica. Se invece le cellule sono morte, non presentano più
attività metabolica e di conseguenza i sali non vengono convertiti e la sostanza rimane di colore giallo.

L'attività di riduzione del tetrazolio avviene principalmente nei mitocondri dove l'enzima succinato
deidrogenasi è attivo solamente nelle cellule vive. L'attività metabolica è valutata attraverso la spettroscopia
a determinate lunghezze d'onda.

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Può essere utilizzato per determinare la citotossicità di farmaci o altri tipi di sostanze chimicamente attive e
potenzialmente tossiche.

Sperimentazione animale
Normativa:
- L’8 settembre 2010 il Parlamento Europeo ha definitivamente approvato a larghissima maggioranza
la nuova direttiva sulla protezione degli animali usati per scopo scientifico (Direttiva 2010/63/CEE).
Ed è stato recepito in IT nel 2014.
- Art. 4 principio della sostituzione, della riduzione e del perfezionamento.
- Regola delle 3R, proposta nel 1959 per ridurre l’impatto della sperimentazione animale:
▪ Rimpiazzamento, sostituzione con metodi alternativi
▪ Riduzione, riduzione del numero di animali
▪ Raffinamento, miglioramento delle condizioni animali
- Art. 5 finalità delle procedure: si può fare sperimentazione esclusivamente per:
a) La ricerca di base
b) La ricerca applicata o traslazionale che persegue uno dei seguenti scopi (cura malattie ecc…)
c) Per realizzare uno degli scopi di cui alla lettera b) nell’ambito dello sviluppo, della produzione o delle
prove di qualità, di efficacia e di innocuità dei farmaci, dei prodotti alimentari, dei mangimi e di altre
sostanze o prodotti
d) Protezione ambientale e animale
e) Ricerca finalizzata alla conservazione della specie
f) L’insegnamento e la formazione al fine del mantenimento o miglioramento delle competenze
professionali
g) Indagini medico-legali

Condizioni in cui tenere gli animali:

✓ Alloggiamento→ gli animali, ad eccezione di quelli per natura solitari, sono alloggiati in gruppi
stabili di individui compatibili.
✓ Alimentazione→ ogni animale deve poter accedere agli alimenti e avere spazio sufficiente per
mangiare in modo da limitare la concorrenza tra animali, con alimenti adeguati alle esigenze
nutrizionali
✓ Abbeveraggio→ tutti gli animali dispongono in permanenza di acqua potabile non infetta.
✓ Illuminazione→ nei locali in cui la luce naturale non garantisce un adeguato ciclo luce/buio, occorre
fornire un’illuminazione artificiale controllata, sia per rispettare le esigenze biologiche degli animali,
sia per fornire un soddisfacente ambiente di lavoro.
✓ Rumore→ il livello dei rumori, compresi gli ultrasuoni, non deve nuocere al benessere degli animali
✓ Ambiente e relativo controllo→ ventilazione e temperatura
a) L’isolamento, il riscaldamento e la ventilazione del locale di permanenza devono garantire
che la circolazione dell’aria, i livelli di polvere e la concentrazione di gas siano mantenuti
entro limiti non nocivi per gli animali ospitati.
b) La temperatura e l’umidità relativa nei locali di permanenza sono adattate alle specie e
alle fasce d’età ospitate. La temperatura è misurata e registrata ogni giorno.
c) Gli animali non devono essere confinati in zone all’aria aperta in condizioni climatiche che
possono causare loro angoscia.

È consentito l'utilizzo degli animali ai fini scientifici o educativi soltanto quando, per ottenere il risultato
ricercato, non sia possibile utilizzare altro metodo o una strategia di sperimentazione scientificamente
valida, ragionevolmente e praticamente applicabile che non implichi l'impiego di animali vivi. (d.L. 4 marzo
2014, attuazione della direttiva EU 2010 sulla protezione degli animali ai fini scientifici).

Inoltre, per poter eseguire una sperimentazione animale è necessario ottenere l’approvazione ministeriale
e del comitato etico locale.
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Le specie più utilizzate nella sperimentazione animale sono:
➢ Topo
Il topo di laboratorio deriva dal topo domestico (Mus musculus).
Non hanno una vista particolarmente acuta, prediligono spazi chiusi e buii, si affidano soprattutto
all’odorato e marcano l’ambiente in cui vivono con l’urina. Hanno anche un udito molto acuto e
sono sensibili agli ultrasuoni. Le varie razze presentano notevoli differenze nell’espressione e
nell’intensità dei comportamenti.
È l’animale più comune perché:
• Estrema prolificità
• Piccole dimensioni (gestione ambiente)
• Resistenza agli stress
• Abbondanza della specie
• Intelligenza
• Arco di vita relativamente breve (1-2 anni)
• Animali transgenici e knock-out (è un ratto geneticamente modificato con un singolo gene
disattivato attraverso una mutazione mirata, imitando malattie umane; nel knock-in invece
si inserisce un gene).
➢ Ratto
È un animale più grande e docile rispetto al topo. Deriva dal ratto bruno (Rattus norvegicus).
Gli animali giovani sono esploratori e spesso si dedicano a giochi (arricchimento).
La vista diurna è in genere scarsa, ma in alcune varietà pigmentate è buona in condizioni di scarsa
luminosità. Sono più attivi nelle ore notturne.

➢ Porcellino d’india (cavia domestica)

Sono roditori socievoli, hanno bisogno di stare in compagnia. I maschi possono essere aggressivi tra
loro. Sono estremamente sensibili agli spostamenti e vanno facilmente incontro a stress. Sono
inclini ad andare incontro a fenomeni allergici e cardiaci, vengono studiati per queste patologie.

➢ Coniglio
Il coniglio (Oryctolagus cuniculus) è, per natura, una specie gregaria. Deve avere a disposizione uno
spazio sufficiente e un ambiente arricchito; in caso contrario ci può essere una perdita della
normale attività locomotoria e anomalie a livello di scheletro.
Se non è possibile raggruppare i conigli, è opportuno sistemarli a stretto contatto visivo.
Hanno una aspettativa media di vita di 7 anni: inadatti a studi di tossicità cronica, come quelli di
cancerogenesi che rendono necessaria l’osservazione per tutta la vita. Sono pacifici e inoffensivi, ma
i maschi possono diventare aggressivi tra loro.
o Vantaggio: grande massa corporea
o Svantaggio: molto emotivi, si stressano con facilità, vanno spesso incontro a fratture
Sono stati gli animali di scelta per la determinazione dei pirogeni, ora si ricorre a metodi alternativi.

Ministero della salute

Linee di indirizzo sugli studi condotti per valutare la sicurezza e le proprietà di prodotti alimentari
1. Premessa
In campo alimentare è possibile effettuare sperimentazioni in vitro, in vivo su modelli animali e
sull’uomo, aventi ad oggetto alimenti come di seguito definiti (l’uomo deve firmare un foglio di
consenso informativo e può ritirarsi quando vuole).
Tali sperimentazioni devono essere condotte ispirandosi ai principi generali della buona pratica clinica.
2. Introduzione
L’evoluzione della legislazione alimentare in campo europeo ha portato ad un aumento nel numero di
studi effettuati sugli alimenti, con diverse finalità.
Possono essere condotti studi (elenco non esaustivo) di:
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 - Sicurezza, per valutare la sicurezza d’uso nel caso di nuovi prodotti o nuovi ingredienti alimentari
(novel food) o per confermare la sicurezza d’uso nel caso di prodotti con aggiunta di vitamine,
minerali e altre sostanza agli alimenti.
- Efficacia, per dimostrare gli effetti sulla salute o sulla riduzione di un fattore di rischio di malattia e
per confermare la validità dell’indicazione d’uso.

Per poter effettivamente testare effetti benefici sulla salute rivendicabili dai prodotti alimentari, ai sensi
della normativa vigente, bisogna che: il prodotto oggetto di studio sia effettivamente un alimento e che lo
studio sia eseguito su un soggetto sano, infatti, gli alimenti non possono rivendicare un’attività terapeutica
(recupero di condizioni patologiche), ma soltanto contribuire a mantenere un equilibrio “omeostatico” di
una determinata funzione dell’organismo, e qualora volesse essere così lo studio rientrerebbe nella
sperimentazione clinica dei medicinali.

Studi di sicurezza
Prodotti o ingredienti presenti sul mercato che hanno fatto registrare un consumo significativo, tale da
deporre a favore della sicurezza, possono essere liberamente immessi in commercio come prodotti o
ingredienti alimentari ai sensi del Regolamento (EU) 2015/2283.
In caso non avessero registrato un consumo significativo, per poter essere commercializzati come
alimenti, devono essere autorizzati con una procedura per accertarne la sicurezza.

Per dimostrare la sicurezza di un alimento vanno condotti studi in viro e in vivo su modello animale
prima di procedere a studi effettuati sull’uomo.

Studi di efficacia
Gli studi di efficacia hanno l’obiettivo di stabilire l’efficacia dell’alimento per l’indicazione sulla salute
(health claim) di cui si intende richiedere l’autorizzazione.
Indicazione definita in modo da esprimere un reale beneficio per una specifica funzione dell’organismo,
comprensibile dal consumatore medio, e che le prove vengano condotte con un livello di assunzione
prestabilito dall’alimento in studio.

Per dimostrare l’efficacia di un alimento è necessario fornire dati derivati da studi condotti sull’uomo.
Mentre, gli studi su animali o in vitro possono fornire prove a supporto.
Gli studi sugli effetti sulla salute di un alimento devono essere svolti conformemente alle diverse inee
guida messe a punto dall’EFSA.

3. Tipologie di studi
Studi in vitro e in vivo su modelli animali.
Queste tipologie di studi possono essere effettuate:
1. Per supportare l’efficacia di un alimento, documentando ad esempio meccanismi biochimici ad
essa correlabili;
2. Per supportare la sicurezza di un alimento dimostrandone l’assenza di tossicità alle normali
condizioni di esposizione;
Per quanto riguarda in particolare gli studi di efficacia, ferma restano che devono essere effettuati
sull’uomo, per giustificare un claim potrebbero bastare studi in vitro a supporto del maccanismo d’azione
alla base dell’effetto rivendicato, senza ricorrere a studi sugli animali.

Test di tossicità (è necessario farlo sugli animali)

1. Studi del metabolismo e tossico-cinetica
Sono utili per fornire dati sull'assorbimento, sulla distribuzione, sul metabolismo ed eliminazione
(ADME) dell’alimento. La progettazione di questi studi deve essere adattata alla sostanza in esame.
2. Genotossicità
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 Per valutare il potere mutageno e cancerogeno (alterazione del codice genetico).
3 test possibili:
- Test di induzione di mutazioni genetiche nei batteri (si inizia sempre dagli organismi meno
complessi)
- Test di induzione di mutazioni geniche in cellule di mammifero in vitro
- Un test di induzione di aberrazioni cromosomiche in cellule di mammifero in vitro (cellule figlie
non si divideranno come dovrebbero e si originano micronuclei).
Eventuali risultati positivi in uno qualsiasi di questi test in vitro in genere richiedono ulteriori
valutazioni della genotossicità in vivo.
3. Studi di tossicità subacuta/subcronica/cronica
- tossicità subacuta (per 14-28 giorni)
- tossicità subcronica (fino a 90 giorni)
- tossicità cronica (fino a 18-24 mesi)
-non c’è tossicità acuta negli alimenti-
Tali studi si effettuano in due specie di animali da laboratorio (di norma roditore e non roditore)
somministrando in genere l’alimento con la dieta.
Gli studi di durata più breve (studi di tossicità sub-acuta, condotti per 14 o 28 giorni) servono inoltre
a fornire indicazioni relative agli organi da valutare e a selezionare le dosi adeguate per effettuare
poi lo studio a 90 gg. Gli studi brevi non sono, in genere, sufficienti per la valutazione del potenziale
di tossicità sub-cronica.
4. Studi di tossicità della riproduzione e dello sviluppo
Uno studio della riproduzione multi-generazione, dovrebbe essere condotto in una specie di
laboratorio, di norma ratto, e comprendere almeno due generazioni e una nidiata per generazione.
L’alimento deve essere somministrato di solito con la dieta.
Studi di tossicità dello sviluppo dovrebbero essere condotti in due specie di laboratorio, di norma un
roditore e un non-roditore, come il ratto o il topo insieme al coniglio. La somministrazione dell’alimento
deve essere fatta di norma con la dieta o mediante sonda gastrica e coprire non solo il periodo
dell'embriogenesi ma continuare fino alla fine della gestazione.
5. Cancerogenesi
Studi per escludere rischi nell’uomo, importanti soprattutto quando è previsto il trattamento per lunghi
periodi.
Tali studi si effettuano in due specie di animali da laboratorio (di norma su ratto e topo),
somministrando in genere l’alimento con la dieta, per un periodo che copre la maggior parte della
durata della vita degli animali, di norma 24 mesi nel ratto e 18 o 24 mesi nel topo.
6. Tossicità speciali
Studi che si rendono necessari su principi attivi che hanno rischi di particolari tossicità oppure per
molecole su cui esistono dubbi nati durante altre prove di tossicità.

Gli studi devono riguardare specificatamente l’alimento da testare a quantità di assunzione prestabilite,
che devono poter ragionevolmente far parte di una dieta varia ed equilibrata.
La sicurezza non può essere trascurata, quindi anche per gli alimenti bisogna fare studi sia in vitro che in
vivo (riassunto estremo).

61
Valutazione dei principali effetti farmacologici
Infiammazione
L’ infiammazione è una normale reazione protettiva (di difesa) ad una lesione del tessuto causata da un
trauma fisico, da prodotti chimici nocivi oppure da agenti microbiologici (stimolo).
Il processo infiammatorio può essere innescato da numerosi stimoli (per es. agenti infettivi, ischemia o altri
stimoli termici o meccanici). L’infiammazione rappresenta lo sforzo compiuto dal corpo per inattivare o
sopprimere i MO invasori, per eliminare le sostanze irritanti e per creare le condizioni di recupero del
tessuto.
L’infiammazione è provocata dal rilascio di mediatori chimici da parte del tessuto lesionato e delle cellule
infiammatorie.
Se la risposta è esagerata può diventare un problema.

Caratteristiche della risposta infiammatoria sono:

- Rubor (rossore)
- Dolor
- Calor
- Tumor (gonfiore)

Coinvolge diversi mediatori chimici, da parte delle cellule danneggiate e da cellule infiammatorie:
- Amine (istamina e 5-HT), che sono dei mediatori performati e quindi immediatamente rilasciati dai
granuli citoplasmatici-
- Lipidi (prostaglandine, leucotrieni e PAF), che si possono formare in pochi minuti a seguito di uno
stimolo nocivo
- Mediatori proteici (citochine), la cui sintesi richiede più di 30 min.

Metodi in vivo per lo studio degli antinfiammatori

L’attività dei farmaci antinfiammatori viene validata in vivo:
- Inducendo l’infiammazione nell’animale in maniera artificiale
- Misurando il grado di diminuzione dell’infiammazione
In particolare, l’attività antinfiammatoria dei principi attivi può essere studiata nell’ animale misurando il
grado di riduzione dell’eritema, dell’ ipertermia cutanea e dell’edema (classici segni che accompagnano a
livello macroscopico la risposta infiammatoria).

Modelli di infiammazione acuta:

Eritema da raggi UV
Indotta mediante lampade a vapori di mercurio che emettono raggi UV nella regione dello spettro tra 250-
300 nm.
Per misurare la capacità di farmaci antinfiammatori nel ridurre l’eritema si opera in questo modo:
62
 - roditori depilati dorsalmente il giorno prima dell’esperimento
- somministrazione del farmaco
- un’ora dopo il farmaco l’animale viene sottoposto ai raggi ultravioletti per tempi variabili (si usa un
guanto in cui sono stati praticati 3 fori di uguale dimensione in modo da esporre ai raggi solo delle
parti delimitate).
L’intensità della reazione eritematosa viene valutata attribuendo un punteggio pari a: - 0=non è visibile
arrossamento; - 1= rossori, reazione uguale agli animali irradiati ma non trattato con il farmaco (controlli) -
0, 5=per situazioni intermedie, la droga funziona.
È importante avere un controllo positivo e negativo per verificare che non sia stato casuale:

Edema da carragenina (mucopolisaccaride solforato estratto dall’alga marina Chondrus crispus)

L’edema viene indotto iniettando in una delle zampe posteriori del ratto, 50-100 ul di una sospensione di
carragenina all’1% in soluzione fisiologica.
Si ottiene una reazione infiammatoria locale con conseguente aumento del volume della zampa, si gonfia,
che raggiunge un massimo circa 3 ore dopo l‘iniezione.
Confronto con e senza la somministrazione del farmaco in gruppi di ratti.
È presente un test sull’effetto antinfiammatorio di 3 estratti di erbe del genere Sussurea sull’edema indotto
sulle zampe del ratto mediante carragenina (eccolo qui sotto)

I valori delle 3
piante vengono
paragonati
all’effetto di un
farmaco
antinfiammatorio
riconosciuto, in
questo caso
l’indometacina.

I° gruppo → controllo positivo: gruppo che non ha ricevuto il trattamento ma è stato sottoposto all’edema
da carragenina

63
II° gruppo → SI a dose crescenti: gruppo trattato con la prima droga (all’inizio poco effetto, dopo 4 ore a
dose massima si ha un effetto inibitorio del 40%)
III° gruppo → SL a dose crescenti: gruppo trattato con la seconda droga (nella dosa minima l’effetto è già del
30%, fino ad arrivare al 55% dopo 3h)
IV° gruppo → SM a dose crescenti: gruppo trattato con la terza droga (effetto di molto inferiore alle altre 2)
V° gruppo → Indometacina: valori fino al 75% dopo 3 ore
(l’asterisco indica che il dato è statisticamente significativo) FINE STUDIO

LPS come stimolatore infiammatorio

A= si valuta la produzione % di
nitrossido, mediatore che vasodilata;
all’aumentare della concertazione
dell’estratto diminuisce la % di NO

B= PEG2 prostaglandine
Si somministra LPS e droga, l’effetto anti-
infiammatorio della droga risulta
evidente (si abbassa i livello di
prostaglandine)
- controllo negativo
- + controllo positivo
* dato buono e significativo

C= sull’asse delle y
Figura 7 produzione delle prostaglandine, nelle cellule di controllo negativo (non tratte), non ci sono
prostaglandine. Poi controllo positivo: cellule sottoposte allo stimolo infiammatorio, numerosissime
vitalità, per
prostaglandine. LPS (lipopolisaccaridi)e droga: grossa riduzione delle prostaglandine, effetto
antinfiammatorio.
valutare la
sicurezza degli estratti: la vitalità rimane alta in entrambi i casi, l’estratto è sicuro su entrambe le tipologie
cellulari analizzate.

Quindi, Il controllo positivo è un trattamento sperimentale che viene eseguito con un fattore conosciuto per
ottenere l'effetto desiderato del trattamento. Il controllo negativo è un trattamento sperimentale in cui non
aggiungo la sostanza di cui voglio valutare ’effetto che non provoca l'esito desiderato dell'esperimento (sito
web).

Modelli di infiammazione cronica:

Artrite da adiuvante di Freund
L’artrite può essere indotta nel ratto mediante l’iniezione di una sospensione di micobatteri in olio minerale
(adiuvante di Freund).
L’adiuvante viene iniettato nel cuscinetto plantare di una delle zampe posteriori del ratto e induce una
reazione infiammatoria acuta che dura circa 7 giorni e comporta l’aumento di volume della zampa del 70-
80%. La reazione artritica risulta visibile dal settimo giorno dall’iniezione e raggiunge un massimo al 30°, si
manifesta con un ulteriore aumento del volume della zampa iniettata e anche di quella controlaterale.

Questo modello è adatto a riprodurre un modello di infiammazione sperimentale di tipo autoimmune con
un ruolo preponderante per i linfociti T. Dal 7° al 17° giorno dall’iniezione vengono somministrati i farmaci
antinfiammatori. I risultati si ricavano comparando il volume delle zampe posteriori degli animali trattati con
il gruppo non trattato (controllo positivo: si paragonano gli animali che hanno ricevuto il farmaco con quelli
che hanno ricevuto il fattore scatenante, ma non hanno ricevuto la sostanza antinfiammatoria).

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Misura dell’attività ulcerogena (derivante dalla somministrazione a stomaco vuoto degli antinfiammatori)
A ratti digiuni da 24 ore sono somministrate per os, in dose unica, le sostanze da testare sospese in
carbossimetil cellulosa.
Per la valutazione delle lesioni gastriche, dopo sacrificio dell’animale, lo stomaco viene prelevato e
posizionato in modo da esternarne la mucosa. Questa viene analizzata al microscopio per il rilevamento dei
siti emorragici e delle eventuali erosioni superficiali.
L’effetto del farmaco viene misurato sia in base al numero di animali che hanno riportato lesioni sia
attribuendo ad ogni animale un indice di ulcera calcolato con una scala arbitraria; la valutazione più essere
effettuata 2 ore dopo la somministrazione del farmaco.

Metodi per lo studio di analgesici

I punti da prendere in considerazione quando si sceglie un test di screening per un ipotetico analgesico
sono:
- validità del test (deve poter dare informazioni)
- affidabilità del test (risultati riproducibili)
- semplicità del test
- sensibilità del test (deve essere possibile discriminare dosi differenti di una stessa sostanza).

Metodi meccanici:
• Pinzettamento
pinzettando l’orecchio di un ratto o cavia, la coda di un topo…etc si provoca un risposta che verrà
valutata (es. squittio, atto del divincolarsi, tentativo di liberarsi etc.). Il metodo è qualitativo, ma non
facilmente quantificabile. Generalmente non si usa.
Metodi termici:
• Hot-plate (test della piastra calda)
prevede l’uso di un contenitore in acciaio immerso in un bagno maria a 52,5°C. L’animale viene
posizionato sulla piastra calda, dalla quale viene rimosso non appena manifesta di aver avvertito lo
stimolo doloroso, e comunque per non più di 45 s per evitare danni ai tessuti. L’andamento
dell’analgesia si segue ripetendo il test ad intervalli di 15 min circa.
• Test del colpo di coda (tail-flick)
Il raggio colpisce la coda dell’animale e quando il ratto avverte dolore allontana la coda con uno
scatto (da qui il nome del test). Il raggio quindi, non essendo più impedito dalla coda, colpisce la
fotocellula e in questo modo determina lo spegnimento della sorgente di calore. Il tempo massimo
di esposizione è 30 s, nel tempo ogni 15 min.
• Tail immersion
prevede l’immersione della coda in un bagno d’acqua a 58°C. Si valuta il tempo che intercorre
dall’immersione al momento in cui l’animale, avvertendo dolore, toglie repentinamente la coda
dall’acqua. Durata max 6 sec.

Sono le 3 droghe che prima avevamo studiato per

quanto riguarda l’azione antinfiammatoria.
Avranno un effetto analgesico?
La prima e la terza no (tra l’altro, se i dati non
hanno l’ * vuol dire che è un risultato casuale).
La seconda roga ha un effetto significativo a
livello analgesico, così come lo era per l’effetto
antinfiammatorio.

65
Metodi chimici:
• Writhing test
consiste nell’iniettare sostanze chimiche irritanti nel peritoneo dell’animale (solitamente acido
acetico 0.5%) che, in risposta, va incontro a degli stiramenti addominali. L’operatore conta il
numero di stiramenti nell’unità di tempo.
L’iniezione viene fatta 5 minuti prima di iniziare il conteggio degli stiramenti che vengono poi seguiti
per 10 min.

Cascata dell’acido arachidonico:

l’acido arachidonico è un fosfolipide di membrana che viene rilasciato a seguito di stimoli infiammatori e dà
origine alla cascata di mediatori che portano all’infiammazione (5-lipossigenasi e ciclossigenasi).
La fosfolipasi A2, che viene attivata in seguito a stimoli nocivi, è in grado di liberare acido arachidonico dai
fosfolipidi di membrana.
L’acido arachidonico è il substrato di due enzimi, la
ciclossigenasi (responsabile della produzione di
prostaglandine) e la lipossigenasi (responsabile della
produzione di leucotrieni).
Le prostaglandine ed i leucotrieni sono molecole
proinfiammatorie e pertanto possono indurre
infiammazione, dolore e febbre.
L’inibizione dei metaboliti dell’acido arachidonico porta ad
un effetto antiinfiammatorio.

Droghe con effetti antinfiammatori

Artiglio del diavolo
Harpagophytum procumbens, usata nella medicina tradizionale sudafricana, che è anche il suo luogo di
origine, come bevanda amaro-tonica e per la cura di vari disturbi, tra cui febbre, dolori e malattie
reumatiche. Consigliato ora per persone che soffrono di artrite.
I principali costituenti sono gli iridoidi (procumbide, arpagoside e arpagide), i carboidrati e alcuni fenoli (es
acetoside). La droga non dovrebbe contenere meno dell’1,2% di arpagoside.
Manifesta proprietà antinfiammatorie e analgesiche nei roditori: l’effetto analgesico sembra essere di tipo
periferico piuttosto che centrale, visto che la droga inibisce gli stiramenti addominali indotti dall’acido
acetico (writhing test), mentre risulta meno efficace nel test della piastra calda (hot plate test) un modello
sperimentale di analgesia specifico per i farmaci analgesici ad azione centrale.
Studi di farmacologia preclinica hanno fornito evidenze che indicano come l’azione antiinfiammatoria
dell’artiglio del diavolo dipenda dall’inibizione della lipossigenasi.
Non sono stati riportati effetti collaterali specifici, ma è controindicato in caso di ulcere gastriche e
duodenali. Gli effetti collaterali più comuni sono stati rappresentati da stimoli gastrointestinali: flatulenza,
diarrea.

Salice
La droga è costituita dalla corteccia del salice.
Contiene tannini condensati, flavonoidi, glicosidi fenolici (salicilina 0,1-2% etc..) che per idrolisi liberano
acido salicilico.
Le proprietà antinfiammatorie sono dovute non solo alla salicina (che tuttavia è il componente più attivo),
ma anche agli altri glicosidi fenolici (salicortina, tremulina, tremulacina).
Inibisce la formazione delle prostaglandine ma con un meccanismo non del tutto chiaro.
Effetti avversi nel tratto gastrico.

66
Tanaceto
La droga consiste nelle foglie secche di Tanacetum parthenium.
Il Tanaceto contiene lattoni sesquiterpenici (partenolide), un olio essenziale e altri componenti come
flavonoidi, tannini e piretrina. La FU IV dice che non deve contenere meno di 0,2% di partenolide, calcolato
su droga essiccata.
Proprietà farmacologiche:
- inibisce il rilascio di istamina dai mastociti (- reazioni allergiche)
- riduce la biosintesi degli eicosanoidi mediante inibizione della fosfolipasi A2;
- inibisce il rilascio di serotonina dalle piastrine;
- efficacia in modelli in vivo di writhing test e dell’edema da carragenina.
Non si conosce quali siano i componenti responsabili di queste attività, anche se sicuramente un ruolo
rilevante ce l’ha il partenolide:
- riduce attività di fattori di trascrizione proinfiammatori (nf-kb);
- inibisce molecole di adesione;
- inibisce sintesi di NO (mediatore dell’infiammazione);
- effetti analgesici e antinfiammatori.
È utilizzato in alcuni casi nel trattamento dell’emicrania, anche se i dati clinici non supportano questo
utilizzo.
Gli effetti collaterali sono in genere lievi e transitori. Sono in genere: ulcerazione della bocca (solo se contato
diretto con il tanaceto) e disturbi gastrointestinali.
Un’improvvisa interruzione del tanaceto può scatenare una sindrome “post tanaceto” caratterizzata dal mal
di testa, nervosismo, dolore alle articolazioni e stanchezza.
Il tanaceto sembra avere proprietà antiaggreganti, quindi controindicato in soggetti con problemi di
coagulazione.

Ortica
La droga è costituita dalle parti aeree di varie specie di Urtica.
Presenta proprietà antinfiammatorie che possono essere esercitate attraverso diversi meccanismi:
• Inibizione enzimi ciclossigenasi e lipossigenasi;
• Inibizione produzione di citochine proinfiammatorie.
Può essere usata come terapia adiuvante dei disturbi reumatici, negli stati infiammatori delle vie urinarie e
per i calcoli renali.
Le evidenze cliniche sulla sua efficacia negli stati infiammatori sono incoraggianti, anche se poche.

67
Determinazione in vitro dell’attività antimicrobica
Metodi di diluizioni:
un inoculo standard del microrganismo da saggiare è esposto a diverse concentrazioni dell’antimicrobico
(convenzionalmente ad una serie di diluizioni a raddoppio riferite a 1 mg/L).
Al termine dell’incubazione si verifica la presenza o l’assenza di sviluppo microbico e la MIC (minima
concentrazione inibente) del composto, definita come la più bassa concentrazione che inibisce una crescita
visibile.
MCB (minima concentrazione battericida) corrisponde alla più bassa concentrazione di principio attivo in
grado di inibire la crescita batterica di almeno il 99,9% rispetto alla popolazione iniziale.

Disco diffusione (altro metodo):

Risulta affidabile per le prove su patogeni a crescita rapida e per alcuni
patogeni esigenti.
La superficie della piastra di agar è inoculata con una quantità standardizzata
del microrganismo. I dischi di carta contengono un’appropriata quantità di
agente antimicrobico e sono posti sulla superficie della piastra.
La sostanza diffonde nel terreno e realizza un gradiente di concentrazione
con valori maggiori in prossimità del disco e che si riducono allontanandosi
dallo stesso.
Al termine dell’incubazione si forma un’area di inibizione di crescita ed i
diametri di questa area sono interpretati nell’ambito delle categorie di
sensibilità.

Studi preclinici sull’attività antifungina dell’olio essenziale di Melaleuca alternifolia (tea tree oil) e del suo
principale componente terpinen-4-olo
Tale sostanza possiede proprietà antibatteriche, antifungine, antivirali, antinfiammatorie ed
immunomodulanti.
Scopo di questo studio è stato quello di valutare la possibile attività antibatterica in vitro dell’olio essenziale
di Melaleuca alternifolia Cheel (TTO) e dei suoi principali componenti terpinene-4-olo e 1,8- cineolo, in
particolare sull’effetto nei confronti del MO Candida albicans.

68
 ➢ TTO, terpinene-4-olo e 1,8 cineolo sono stati attivi in vitro sia nei confronti di ceppi di C. albicans
sensibili, sia nei confronti di ceppi resistenti a due farmaci antifungini quali il fluconazolo (FCZ) e
l’itraconazolo (ITR).

Questi dati sperimentali hanno dato un sostanziale supporto a precedenti evidenze empiriche e scientifiche
sull’efficacia del trattamento della candidosi con TTO, soprattutto quando l’infezione è causata da specie di
C. albicans farmaco-resistenti (serve una dose minore di TTO rispetto a fungicidi di sintesi per esplicare
l’attività). Ed è stato confermato che il terpinene-4olo è il prodotto attivo della mistura.

Possibilità di utilizzare frazione polifenoliche de Sida urens L. contro i batteri delle carie dentarie
I risultati hanno validato l’uso, tradizionalmente compiuto da una zona del Burkina Faso, della Sida urens
come potente agente antibatterico nei confronti della carie dentali.

Ocimum basilicum e metabolismo lipidico

Oltre ad essere una pianta aromatica utilizzata in cucina, in molti paesi è una pianta medicinale con
proprietà terapeutiche riconosciute (antinfiammatorie, antibatteriche e insetticide); contiene molti
composti antiossidanti e possiede un forte potere antiossidante.

Nella zona orientale del Marocco la pianta essiccata di Ocimum basilicum viene anche utilizzata in
erboristeria come agente ipolipidemizzante e distribuita ad un elevato numero di soggetti iperlipidemici.
Tali pratiche di medicina tradizionale non sono, però, validate da studi atti a comprendere le reali proprietà
ipolipidemiche, sia quelli volti a valutare l’assenza di effetti nocivi determinati dall’uso dei derivati
erboristici.

Ruolo dell’Ocimum basilicum sul metabolismo del colesterolo nel macrofago

Scopo: Valutazione del potenziale anti-aterogenico dell’Ocimum basilicum sul processo di accumulo di
colesterolo in macrofagi umani.
L’ipercolesterolemia è il principale fattore di rischio delle malattie cardiovascolari. Il suo aumento si associa
ad un incremento delle LDL, lipoproteine aterogene che possono indurre accumulo lipidico nelle cellule
vasali. L’accumulo di colesterolo indotto da LDL modificate nei macrofagi con conseguente loro
trasformazione in foam cell, rappresenta un evento precoce nel processo della formazione della lesione
aterosclerotica.
Primo obiettivo: effetti del trattamento per 24 ore con 0, 20, 40, 60 o 100 μg/mL di estratto etanolico di
Ocimun basilicum sulla vitalità, morfologia e integrità cellulare, valutati rispettivamente con il test del Tripan
blu, osservazione microscopica e quantità di lattato-deidrogenasi citoplasmatica rilasciata nel mezzo di
coltura cellulare.
Risultato: nessuna alterazione.

L'enzima LATTATO DEIDROGENASI (LDH) è un enzima normalmente presente nel citoplasma delle cellule che
catalizzano la reazione di trasformazione del lattato in piruvato. In seguito ad un danno alla membrana
cellulare l'enzima LDH dal citoplasma si riversa nel mezzo di coltura.

69
Questo enzima viene perciò impiegato nel saggio per valutare l’integrità cellulare.

Risultato: in assenza dell’estratto, la percentuale di induzione delle foam cells (macrofagi il cui citoplasma
era infarcito per almeno 1/3 da lipidi) da parte delle acLDL (acetilate) è circa raddoppiata rispetto alle nLDL
(native).
Il trattamento con 20 µg/mL Ocimum basilicum non altera tale risultato.
Alla concentrazione di 60 µg/mL, l’estratto etanolico di Ocimum basilicum riduce significativamente la
proporzione di foam cells, portando la percentuale di foam cells indotte dalle acLDL simile a quella ottenuta
con le nLDL. È quindi in grado di ridurre il danno provocato dalle LDLacetilate e, quindi, è in grado di ridurre
ridurre l’accumulo di lipidi: effetto ipolipemizzante.
LDL acetilate, modificate, per condurre questo studio in vitro e simulare l’accumulo di lipidi nel macrofago
(formazione di placca aterosclerica).

Effetto dell’estratto acquoso di Ocimum basilicum su un modello di ipercolesterolemia acuta

Effettuato nei ratti (studio in vivo)
Il Triton WR-1339 (utilizzato per il controllo positivo) agisce in vivo bloccando la clearance delle lipoproteine
ricche in trigliceridi ed è stato osservato che i valori plasmatici massimi di colesterolo totale e trigliceridi
vengono raggiunti dopo 20 ore dalla somministrazione di Triton WR-1339 per poi tornare gradualmente a
valori normali.
Per la preparazione dell’estratto acquoso le parti aeree della pianta sono state lasciate in infusione per 30
min in acqua distillata a 100°C. come farmaco ipolipidemico di controllo è stato usato il fenofibrato.

Gli animali sono stati divisi in 4 gruppi:

Al primo gruppo – gruppo iperlipidemico (HG) – è stata praticata un’iniezione intraperitoneale di Triton WR-
1339 (per indurre l’iperlipidemia) alla dose di 200 mg/kg in fisiologica.
Nel secondo gruppo – ratti iperlipidemici trattati con estratto di Ocimum basilicum (HG+OB) – l’iniezione di
Triton WR-1339 è stata seguita da somministrazione intragastrica di estratto di Ocimum basilicum (0,5
g/100 g).
Nel terzo gruppo – ratti iperlipidemici trattati con fenofibrato (HG+FF) – l’iniezione di Triton WR-1339 è
stata seguita da somministrazione intragastrica di fenofibrato (65 mg/kg).
Al quarto gruppo – gruppo di controllo (CT) – è stata somministrata una soluzione fisiologica, no Triton-non
sono iperlipidemici.
Dopo 7 e 24 ore dal trattamento, agli animali è stato effettuato un prelievo di sangue per l’analisi lipidica.

Il basilico, in questo test, è stato più efficiente del farmaco di sintesi.

70
Esempio di studio che ha valutato l’effetto antitumorale di una droga
Emodina come possibile droga ad attività anticancerogena nelle cellule del cancro del prostata (sia in vitro,
che in vivo).

La crescita delle cellule tumorali è sempre

più ridotta con l’emodina.

Nel B il tumore manifesta recettori per gli

androgeni.
Con l’emodina, in quel caso, la crescita del tumore è
pari a zero.

71
Studio dei farmaci antidepressivi: modelli animali di depressione
La depressione, così come altri disordini mentali, è attualmente diagnosticata su base clinica, senza far
riferimento ad una particolare eziologia o a marker biologici diagnostici. Questo è dovuto ad una ancora non
completa conoscenza dei meccanismi patofisiologici alla base del disordine.
Generalmente i modelli animali tentano di imitare la condizione umana, inclusa la psicopatologia.

La validità di un modello animale di depressione è caratterizzata da tre differenti aspetti:

➢ Il modello deve indurre nell’animale alcuni dei sintomi della depressione osservati negli adulti (“face
validity”)
➢ I sintomi negli animali dovrebbero essere mediati dagli “stessi” meccanismi neurobiologi che si
verificano nell’uomo (“construct validity”)
➢ L’uso di trattamenti farmacologici o non per la malattia dovrebbe indurre variazioni
comportamentali negli animali (“predictive validity”)

Per poter essere usato come modello preclinico un modello animale deve essere inoltre:
✓ facile da effettuare,
✓ indurre un fenotipo e un comportamento nell’animale stabile nel tempo
✓ riproducibile (inteso come il livello di comparabilità tra dati ottenuti con lo stesso modello
sperimentale nello stesso laboratorio in momenti diversi o in laboratori differenti)
I modelli di depressione sviluppati fino ad ora sono stati originariamente disegnati per determinare in modo
più specifico e sensibile i responsi comportamentali ai farmaci antidepressivi.

Test di porsolt o del nuoto forzato

Modello di depressione in ratti o topi che sono costretti a nuotare in uno spazio ristretto da cui non è
possibile sfuggire. Dopo un periodo di iperattività, adottano una posizione immobile caratteristica e non
tentano più di scappare. Questa posizione indica uno stato di disperazione/depressione.
Procedura: I ratti vengono tuffati individualmente in un cilindro di plexiglass con 15-25 cm d’acqua a 25°C.
Durante i 15 minuti della prova il ratto rimane immobile per un lungo periodo, con la testa appena sopra il
livello dell’acqua. 24 h dopo o anche 2 settimane dopo l’esperimento si ripete, questa volta con una durata
di 5 minuti. I ratti si immobilizzano quasi subito e rimangono in tale posizione per il 75% del tempo.

La durata totale dell’immobilità durante i 5 minuti della seconda sessione rappresenta il termine di
riferimento per valutare l’effetto degli antidepressivi.
La maggior parte dei farmaci antidepressivi è in grado di modulare il tempo di immobilità, mentre gli
ansiolitici e i farmaci antipsicotici non hanno questo effetto (quindi effetto antidepressivo specifico).
Questo test è stato originariamente sviluppato nei ratti, che sono noti essere dei buoni nuotatori, a
differenza dei topi; il test su questi ultimi potrebbe essere molto più stressogeno.

Effetto antidepressivo-simile dell’estratto alcolico di Zuojiin Pill, contenente due droghe vegetali di rizoma
Coptidis e frutti di Evodiae, è spiegato modulando il neurotrasmettitore monoaminergico nei topi
Interessante perché a quantità inferiori fa più effetto.

72
Tail-suspension
Topo sospeso per la coda ad una barra per 6 min, valutazione del tempo di immobilità.
Una volta appeso per la coda, in un primo momento il topo inizia a cercare di scappare intraprendendo
vigorosi movimenti, ma dopo pochi minuti diventa immobile.
Viene valutato il tempo speso nell’immobilità.
Il test è usato sia per ratti che per topi ed è risultato sensibile a tutte le maggiori classi di farmaci
antidepressivi.
L’imipramina, principio attico della classe degli antidepressivi triciclici, riduce il tempo di immobilità.

Negli ultimi tempi questi due test sono stati molto discussi quali test comportamentali per la depressione,
nello specifico perché entrambi i test rappresentano una situazione acuta, senza mimare le altre
caratteristiche temporali della depressione clinica (inizio, persistenza, effetto terapeutico).

Chronic mild stress – modello di stress cronico moderato

Questo modello è dotato di buona “face “ and “construct validity” ed è stato usato con successo per
l’identificazione di farmaci antidepressivi dimostrando anche quindi una buona “predictive validity”.
Poiché lo stress cronico può indurre depressione in alcuni esseri umani vulnerabili, alcuni autori hanno
suggerito che questo potrebbe essere un modello di depressione. Il modello è stato proposto per mimare
l’effetto che possono avere alcuni fattori ambientali che contribuiscono all’induzione dei disordini depressivi
nell’uomo.
In questi modelli gli animali sono soggetti ad uno stress cronico generato da una successione di stimoli
stressogeni moderati e imprevedibili in ordine casuale nell’arco di alcune settimane.
In seguito a questo stress i ratti dimostrano un minor consumo di saccarosio, rispetto agli animali di
controllo: alterazione tipica del comportamento riconducibile allo stato di anedonia (perdita di interesse per
le attività o ridotta capacità di trovare piacere in esperienze normalmente piacevoli).

In queste condizioni lo stato di anedonia è mantenuto per alcune settimane riproducendo un aspetto
cronico della malattia umana.(con gli altri studi si valutava, invece, l’aspetto acuto della depressione).
Esempi di stimoli stressogeni: affollamento, isolamento, sottrazione cibo, inclinazione e scuotimento della
gabbia, lettiera umida, illuminazione intermittente, inversione del ciclo luce/buio.
Gli antidepressivi ripristinano il decremento di consumo di saccarosio indotto dal CMS.

Il topo depresso,come conseguenza, ha deficit cognitivi (senso di impotenza acquisito): dopo l’esposizione a
stimoli imprevedibili e non controllati l’animale non impara a scappare dalla situazione stressogena, si
rassegna.

Criticità: solo una piccola percentuale di animali sottoposti a questi trattamenti sviluppano sintomi
depressivi, inoltre alcune specie di topo presentano questi comportamenti già come caratteristica della
specie, indipendentemente dall’induzione con stimoli stressogeni.

73
Modelli animali di ansia
L’ansia può essere considerata come una risposta emotiva fisiologica e una reazione adattativa che si
sviluppa in risposta a situazioni pericolose e/o stress acuto che minacciano l’integrità dell’individuo.
Uno stato d’ansia transitorio e proporzionale alla situazione che lo provoca è considerato una difesa
dell’organismo volto ad anticipare la percezione del pericolo prima che questo sia chiaramente
identificato.
È dunque un sistema di allarme fisiologico utile alla sopravvivenza.
L’ansia eccessiva può generare uno stato di malattia, infatti induce uno stato di attesa apprensiva.

Negli animali l’ansia induce un’inibizione comportamentale che si evidenzia in una minore motilità
accompagnata da uno stato di continua attenzione, ma soprattutto in una marcata inattività esplorativa e
quindi un disinteresse verso tutto ciò che non rassicura l’animale nella nuova situazione in cui si viene a
trovare.
I più importanti modelli d’ansia si basano su procedimenti nei quali i farmaci ansiolitici disinibiscono un
comportamento che si presume sia soppresso dalla paura delle sue conseguenze.

I test ansiometrici possono essere suddivisi in 3 gruppi:

• Test in cui l’ansia viene indotta provocando uno stato conflittuale, come col test di Vogel
Prima dell’esecuzione gli animali sono stati privati dell’acqua, poi sono posti in gabbie dove per
dissetarsi devono leccare un beccuccio metallico che eroga scosse elettriche di 1 s ogni 4 leccate. Il
ratto quindi si ritira in una posizione immobile di attesa, combattuto tra la sete e il timore della
scossa.
Il PA da testare viene somministrato prima di iniziare e se risulta efficace si assiste ad una riduzione
del periodo di stato conflittuale, in modo tale che l’animale può riprendere a bere (Test di Geller-
Seifter con il cibo).
• Test in cui l’ansia viene indotta da condizioni ambientali inusuali ed ostili
Un esempio è quello di metter coppie di ratti in gabbie fortemente illuminate, la forte illuminazione
provoca disagio e un blocco delle loro attività sociale.
• Test in cui l’ansia è indotta farmacologicamente, mediante la somministrazione di sostanze ansiogene

Risposte non condizionante (innate)

• OPEN FIELD, consiste nel valutare l’attività motoria spontanea dell’animale che si trova per la prima
volta in un posto nuovo: si ritiene che gli ansiolitici aumentino questa attività, anche se molti fattori
possono influenzare questa attività.
• TAVOLA A BUCHI, 16 buchi e libertà di esplorazione: latenza ad andare al centro e ficcano il naso; il
diazepam incrementa il n. di head dips (mettono la testa dentro il buco)

• LIGHT/DARK EXPLORATION
Animale posto nel compartimento nero → valutazione del tempo trascorso nel bianco entro 5 min.
Consiste nel misurare gli attraversamenti dalla zona illuminata a quella buia in una camera a due
compartimenti: gli attraversamenti sono aumentati dagli ansiolitici.
Limite: i farmaci che alterano l’attività locomotori potrebbero inficiare i risultati derivati da questo
tipo di saggio.

74
 • ELEVATED PLUS-MAZE, Si basa sul conflitto provato dagli animali tra la curiosità di esplorare un
ambiente nuovo e la riluttanza all’esplorazione a causa delle sue caratteristiche.
Il test si svolge in un labirinto formato da due corridoi incrociati e sollevati da terra che formano 2
bracci chiusi (lo spazio buio e chiuso è più consono a quello dei topi) e due bracci esposti (aperti,
suscitano curiosità).
Il tempo trascorso nei bracci aperti è aumentato dagli ansiolitici (es. diazepam), ma non da
stimolanti, neurolettici e antidepressivi, dimostrando la validità di questo modello.

Comportamento animale
Il comportamento animale nei suoi vari aspetti lo si può quantificare in laboratorio con strumenti e tecniche
che registrino i dati dell’attività motoria, della reattività a stimoli esterni, della variazione nella raccolta di
cibo, nonché di risposte condizionate di vario tipo.

ATTIVITÀ MOTORIA GENERALE: si parla di attività spontanea generale quando l’animale viene lasciato nella
sua gabbia o nel suo ambiente.
RETTIVITÀ GENERALE: si intende il comportamento che l’animale esibisce quando viene posto in ambienti
che non gli sono abituali.

Quasi tutti gli animali quando vengono posti in ambienti nuovi o diversi da quelli di allevamento, hanno una
reazione che può essere di inibizione parziale o totale dell’attività o viceversa di eccessiva reattività.
Per evitare che questi comportamenti interferiscano con quelli da rilevare, l’animale viene lasciato
ambientarsi (periodo di adattamento) nell’ambiente o nello strumento usato per la rilevazione dei dati
comportamentali.

Attività motoria generale

Può essere misurata tramite il tamburo rotante: lo strumento è formato da un cilindro di 15 cm di altezza,
chiuso da ambo le parti con pareti trasparenti di plexigass e montato su un perno centrale ruotante e
collegato ad un contatore numerico.
Il contatore misura il numero di giri che il tamburo fa quando è percorso all’interno dal ratto.
Il numero riportato dal contatore dà indicazione dell’attività motoria dell’animale.

Attività motoria spontanea

È un comportamento naturale comune ad ogni essere vivente; essa risponde a delle motivazioni che sono
diverse da specie a specie.
L’animale si sposta da una parte all’altra della gabbia e gli spostamenti vengono registrati: essi sono
indicatori della curiosità che ha l’animale di esplorare l’ambiente circostante. Nel ratto da laboratorio
vengono parzialmente a mancare le motivazioni primarie, ma permangono i caratteri specie-specifici del
comportamento esplorativo. Questi caratteri possono essere registrati usando la tavola a buchi.

75
Memoria
La memoria ha 2 componenti: una a breve termine e una a lungo termine.
La memoria a breve termine permette di ricordare per periodi di tempo limitati una quantità di
informazioni limitate.
La memoria a lungo termine permette di ricordare quantità maggiori di informazioni per periodi di tempo
molto lunghi.

CONDIZIONAMENTO
Apprendimento associativo
Emissione di risposte comportamentali attraverso l’associazione a stimoli originariamente neutri.
Condizionamento classico: esperimento cane Pavlov.
Il cane produce saliva ogni volta che vede una bistecca (risposta incondizionata), nella fase di
condizionamento ogni volta che si fa vedere al cane la carne e inizia a salivare si aggiunge il suono di una
campanella, questa è la fase più lunga. Fino ad arrivare ad una salivazione associata soltanto al suono della
campanella (risposta incondizionata che diventa condizionata).

Evitamento attivo (con il test della shuttle-box) -ci dà un indice dell’apprendimento-

Si tratta di una gabbia ripartita col pavimento basculante, costituito da una griglia metallica e collegata ad
un generatore di shock temporizzato.
L’arrivo della leggera scossa elettrica (1,5mA) al pavimento è preceduto di 5 secondi da uno stimolo
luminoso e/o acustico. L’accensione della luce o lo stimolo acustico rappresentano lo stimolo condizionato e
la scossa elettrica lo stimolo incondizionato.
Il ratto dopo aver ricevuto lo stimolo condizionato e, subito dopo, quello incondizionato fugge dalla parte
opposta della gabbia interrompendo così lo shock elettrico. Dopo alcune sedute giornaliere il ratto impara a
fuggire nella parte opposta della gabbia immediatamente dopo lo stimolo luminoso o acustico evitando lo
shock elettrico, capendo che subito dopo lo stimolo acustico/luminoso sarebbe arrivato lo shock elettrico.
Si verifica quindi un vero e proprio apprendimento per associazione esibendo un comportamento motorio
di evitamento. Questo test è chiamato di evitamento attivo proprio perché l’animale deve dare la risposta
motoria di evitamento.

76
Evitamento passivo
L’apparecchio è composto da una parte trasparente che comunica con una scatola dipinta di nero. Una
lampada da 100W a luce fredda è posta sopra la scatola trasparente. Il pavimento è formato da una griglia
metallica ed è collegato ad uno stimolatore elettrico.
All’inizio dell’esperimento il ratto è posto nella parte trasparente e illuminata, luogo sgradito ai ratti. La sua
naturale inclinazione lo poterà a rifugiarsi nella parte buia; il tempo impiegato ad entrare nella seconda
scatola viene registrato come primo tempo di latenza, che è mediamente di 30 secondi.
Quando il ratto è completamente entrato nel luogo buio la porta viene abbassata e una leggera scossa
elttrica (1,5 mA) percorre il pavimento. L’animale viene tolto e rimesso nella gabbia.
Dopo un certo periodo di tempo (generalmente 30 min o 24 ore) viene messo nuovamente nella scatola
trasparente, se il ratto ricorda la scossa ricevuta, non rientra nella scatola buia, mentre se ha dimenticato la
punizione ricevuta, rientrerà con tempi di latenza molto bevi simili al 1° tempo di latenza.
Il test è chiamato dell’evitamento passivo perché l’animale, ricordando lo shock ricevuto non esibisce la
risposta motoria di attraversamento. Questo test è molto usato per le prove di memoria recente poiché
viene eseguito una sola volta sul singolo ratto e ciò permette di seguire le variazioni della traccia
mnemonica nel tempo.

Un risultato sperimentale significativo, ottenuto con rigore scientifico, non è sempre indice di efficacia
della droga sull’uomo.
Per averne la certezza è necessaria l’indagine clinica, con studi terapeutici sull’uomo.

77
SPERIMENTAZIONE CLINICA
Definizione: qualsiasi studio sull’essere umano finalizzato a scoprire o verificare gli effetti clinici,
farmacologici o altri effetti farmacodinamici di uno o più medicinali sperimentali o a individuare qualsiasi
reazione avversa ad uno o più medicinali sperimentali o a studiarne l’assorbimento, la distribuzione, il
metabolismo, l’eliminazione, con l’obiettivo di accertarne la sicurezza o l’efficacia, nonché altri elementi di
carattere scientifico e non, effettuata in un unico centro o in più centri (es. ambulatori) in Italia o anche in
altri stati membri dell’Unione Europea o in Paesi terzi.
• Decreto legislativo 6 novembre 2007, n 200 Attuazione della Direttiva 2005/28/CE
Oggi sperimentazione multicentrica: nazionale e internazionale.

Nel 1964 è stata promulgata la dichiarazione di Helsinki: documento fondamentale nella ricerca biomedica
che definisce i principi etici della sperimentazione e la necessità del consenso da parte dei soggetti che
partecipano allo studio.
Nello stesso anno la Food and Drug Administration (FDA) ha introdotto protocolli di ricerca clinica
controllata, prevedendo l’uso del placebo (sostanza farmacologicamente inerte da impiegare in un gruppo
di pazienti in confronto al nuovo farmaco in studio, somministrato ad un secondo gruppo di pazienti): un
passo fondamentale verso una metodologia scientifica rigorosa per raggiungere conclusioni certe
sull’efficacia e sicurezza dei farmaci.

Convenzione di Oviedo (consiglio d’Europa-1997)

Convenzione per la protezione dei diritti dell’uomo e la dignità dell’essere umano riguardo alle applicazioni
della biologia e della medicina
Art.1 Oggetto e finalità: garantire ad ogni persona, senza discriminazione, il rispetto della sua integrità e dei
suoi altri diretti e libertà fondamentali riguardo alle applicazioni della biologia e della medicina.
Art.2 Primato dell’essere umano: l’interesse e il bene dell’essere umano debbano prevalere sul solo
interesse della società o della scienza.
Art.5 Regola generale: un intervento nel campo della salute non può essere effettuato se non dopo che la
persona interessata abbia dato il consenso libero e informato. La persona interessata può liberamente,
ritirare il proprio consenso.
Art.6 Protezione delle persone che non hanno a capacità di dare consenso (tutore legale)

Linee di indirizzo sugli studi condotti per valutare la sicurezza e le proprietà dei prodotti alimentari
(Ministero della Salute -revisione novembre 2018-)
3.2 STUDI CONDOTTI SULL’UOMO
Il parere preventivo e vincolante del Comitato etico di riferimento è da considerarsi un requisito
necessario per l’effettuazione dello studio.

Comitato etico
Il Comitato Etico (C.E.) è un organismo indipendente, composto da personale sanitario e non, che ha la
responsabilità di garantire la tutela dei diritti e del benessere dei soggetti in sperimentazione e di fornire
pubblica garanzia di tale tutela esprimendo, ad esempio, un parere sul protocollo in sperimentazione,
sull’idoneità degli sperimentatori, sulla adeguatezza delle strutture e sui metodi e documenti che verranno
impiegati per ottenere il consenso informato; che svolga i compiti di cui al decreto legislativo 24 giugno
2003, n 211, alle norme di buona pratica clinica e a decreto del Ministro della Salute in data 12 maggio
2006.
I comitati etici devono comprendere:
a) Due clinici
b) Un medico di medicina generale territoriale e/o un pediatra di libera scelta
c) Un biostatistico
d) Un farmacologo
e) Un farmacista
f) Il direttore sanitario
78
 g) Un esperto in materia giuridica o un medico legale
h) Un esperto in bioetica
i) Un rappresentante del settore infermieristico
j) Un rappresentate del volontariato e/o associazionismo di tutela dei pazienti
(oggi il mondo dei comitati etici è in evoluzione)

Art3. Indipendenza dei comitati etici

Il comitato etico deve garantire la sua indipendenza, e deve essere garantita almeno:
a) Dalla mancanza di subordinazione gerarchica del comitato etico nei confronti della struttura ove
esso opera
b) Dalla presenza di personale non dipendente dalla struttura ove opera il comitato etico
c) Dalla estraneità e dalla mancanza di conflitti di interesse dei votanti rispetto alla sperimentazione
proposta
d) Della mancanza di cointeressenze di tipo economico tra i membri del comitato e le azione del
settore farmaceutico

Art.5 Funzionamento del comitato etico

Deve seguire le norme di buona pratica clinica.
I diritti, la sicurezza e il benessere dei singoli soggetti coinvolti nello studio costituiscono le considerazioni
più importanti e devono prevalere sugli interessi della scienza e della società.
Il comitato etico, nell’esprimere le proprie valutazioni, tiene conto:
a) Che in linea di principio i pazienti del gruppo di controllo non possono essere trattati con placebo,
se sono disponibili trattamento efficaci noti, oppure se l’uso di placebo comporta sofferenza,
prolungamento di malattia o rischio es. no pazienti con tumore trattai con placebo (non è etico);
b) Che l’acquisizione del consenso informato non è una garanzia sufficiente né di scientificità, né di
eticità di protocollo di studio, e pertanto, non esime il comitato dalla necessità di una valutazione
globale del rapporto rischio/beneficio del trattamento sperimentale;
c) Che nel protocollo della sperimentazione deve essere garantito il diritto alla diffusione e
d) pubblicazione dei risultati da parte degli sperimentatori che hanno condotto lo studio, nel rispetto
delle disposizioni vigenti;
e) I componenti del comitato etico sono vincolati al segreto d’ufficio.

Ritornando al punto 3.2 studi condotti sull’uomo

• “promotore”: una persona, società, istituzione oppure un organismo che si assume la responsabilità
di avviare e gestire lo studio, curandone altresì il relativo finanziamento;
• “sperimentatore”: una persona responsabile della conduzione di uno studio presso un dato sito;
• “sperimentatore principale”: uno sperimentatore che guida, in qualità di responsabile, un gruppo di
sperimentatori incaricato di condurre uno studio in un determinato sito;

79
 • “protocollo”: un documento in cui sono descritti gli obiettivi, il disegno, la metodologia, gli aspetti
statistici e l’organizzazione di uno studio. Il termine “protocollo” comprende le versioni successive e
le modifiche del protocollo stesso;
• “consenso informato”: l’espressione libera e informata di un soggetto della propria disponibilità a
partecipare a un determinato studio, dopo essere stato informato di tutti gli aspetti rilevanti per la
decisione di partecipare, oppure, nel caso dei minori e dei soggetti incapaci, l’autorizzazione o
l’accordo dei rispettivi rappresentanti legalmente designati a includerli nello studio;

Studi a supporto della sicurezza

Inoltre, solo se si dispone di dati significati derivanti da studi in vitro e in vivo o da altre tipologie di studio
pertinenti che dimostrano l plausibile sicurezza per il consumo umano dell’alimento, possono essere svolti
studi sull’uomo per supportare la sicurezza di un alimento.
Tali studi vengono classificati abitualmente in 2 tipologie:
a) Studi di assorbimento, metabolismo ed eliminazione
b) Studi di tollerabilità
Il protocollo deve prevedere delle modalità per rilevare eventuali effetti/reazioni indesiderate nonché delle
procedure cui ricorrere, se necessario, per la revisione/modifica/interruzione dello studio, che in ogni caso
deve essere conforme alle norme etiche e legali.

Studi a supporto dell’efficacia

Gli studi volti a testare effetti sulla salute devono essere progettati tenendo conto delle seguenti indicazioni:
a) L’alimento da usare nello studio deve essere quello oggetto del “claim”
b) Il “design” e la qualità dello studio devono essere tali da fornire prove valide per supportare la
fondatezza scientifica dell’indicazione
c) Devono essere effettuati su un campione rappresentativo del gruppo di popolazione cui è diretta
l’indicazione, scelto in modo che i risultai possano essere estrapolati alla popolazione target.

Studi sperimentali
Anche detti interventistici perché presuppongono un intervento attivo da parte dello sperimentatore:
1. Studi non controllati
2. Studi controllati non randomizzati
3. Studi controllati e randomizzati (RCT)

[Link] non controllate

Il trattamento in questione viene assegnato a tutti i pazienti eleggibili consecutivamente osservati.
Non c’è un confronto diretto con un gruppo di pazienti trattati in altro modo (non c’è un gruppo di
controllo). Gli effetti del trattamento sono valutati in base al confronto con il decorso della malattia trattata
con terapia standard, che si ritiene ben noto.
In assenza del gruppo di controllo l’efficacia del trattamento sperimentale viene riportata come beneficio
assoluto.
LIMITE: assenza di un gruppo trattato con una terapia standard diversa da quella sperimentale che serva
come termine di confronto per valutare l’efficacia di quest’ultima.
+ le malattie hanno una variabilità pronostica e di decorso: in ragione di tale variabilità, i parametri scelti per
valutare l’efficacia del trattamento possono migliorare spontaneamente, anche se in coincidenza
cronologica con il trattamento.

[Link] controllate, non randomizzate

✔Il trattamento da testare è assegnato ad una parte dei pazienti eleggibili consecutivamente osservati.
✔C’è un gruppo di pazienti trattato in altro modo, arruolati con procedure diverse che serve come controllo.
✔Rimane incerta la comparabilità tra i pazienti che ricevono il trattamento sperimentale e i controlli:
80
 a) Con controlli paralleli
La popolazione dello studio viene divisa in due gruppi: uno viene trattato con il farmaco da saggiare
mentre l’altro funge da controllo.
I risultati sono valutati comparativamente.
LIMITE: L’assegnazione non è random e segue altri criteri (es: giorni di ricovero pari o dispari). Se un
gruppo ha un’età media di 30 anni e l’altro di 80, non sono gruppi comparabili.

b) Con controlli storici

Tutti i pazienti eleggibili ricevono il trattamento sperimentale.
Servono come controlli pazienti osservati in precedenza e trattati con terapia tradizionale.
I dati dei controlli sono retrospettivi, di solito ricavati dalla cartelle cliniche.
LIMITE: bias versus risultati falsi positivi→ i pazienti che ricevono il trattamento sperimentale si
avvantaggiano di progressi diagnostici e terapeutici successivi al periodo di osservazione dei
controlli.
Limiti di completezza e attendibilità delle cartelle cliniche.

c) Con controlli da banche dati

Tutti i pazienti eleggibili ricevono il trattamento sperimentale.
Servono come controlli dati ricavati da banche dati computerizzate

3. Sperimentazione controllata randomizzata: RCT (Randomized Clinical Trial)

Random= a caso, cecità, non influenza, studi in cieco
Gold–standard della ricerca clinica per valutare l’efficacia di un trattamento: attualmente l’RCT costituisce
il modello di riferimento per la sperimentazione di nuovi trattamenti.
Gold standard= è il metodo migliore.
Il trattamento sperimentale viene assegnato ad una parte dei pazienti eleggibili, consecutivamente osservati
(di solito attorno al 50 %). Gli altri vengono trattati in altro modo e fungono da controllo (gruppo parallelo
che subisce le stesse cose del gruppo trattato col farmaco da sperimentare, ma senza aver assunto il
farmaco).

L’assegnazione dei trattamenti è fatta mediante un sistema di sorteggio che favorisce la comparabilità tra i
gruppi (randomizzazione centralizzata o tramite buste chiuse).

Randomizzazione
I pazienti vengono assegnati al trattamento da sperimentare o a quello di controllo mediante
randomizzazione: cioè, in modo casuale

Ogni paziente ammesso al trial ha eguali probabilità di essere assegnato al trattamento sperimentale o a
quello di controllo.
Questo permette di ottenere gruppi comparabili nei quali, almeno in via teorica, sono egualmente
distribuite caratteristiche prognostiche note e non.
La sola variabile che può quindi influenzare un diverso esito di malattia nei gruppi a confronto rimane
perciò la differenza del trattamento assegnato: sperimentale o controllo.
Presupposto etico: ipotesi che i due trattamenti a confronto abbiano probabilità approssimativamente
equivalenti di efficacia in quella categoria di pazienti a cui si rivolge la sperimentazione.

1. Randomizzazione semplice
✔Metodi semplici che però presentano problemi pratici di validazione e riproducibilità.
✔Generalmente la randomizzazione semplice avviene tramite specifici software.

81
 2. Randomizzazione con restrizioni
Prevede tecniche di randomizzazione specifiche al fine di migliorare il bilanciamento tra i due
gruppi, sia per quanto riguarda il numero di pazienti progressivamente arruolati che, per quanto
riguarda i fattori prognostici.
I. Randomizzazione a blocchi
viene utilizzata per bilanciare l’asimmetria quantitativa (n. di soggetti) tra i gruppi
sia durante che al termine dell’arruolamento. Il blocco è una sequenza della lista
che contiene lo stesso numero di pazienti da assegnare ai trattati e ai controlli.
Viene garantito un numero analogo di pazienti nei due gruppi, anche se lo studio è
interrotto precocemente (il numero dei blocchi deve essere un multiplo dei bracci
del trial). Sono da evitare sia gruppi troppo piccoli che troppo grossi. La dimensione
non deve mai essere resa nota agli sperimentatori coinvolti nell’arruolamento.

Ad esempio, un blocco di 4 genera 6 diverse sequenze: ciascuna delle quali assegna

due soggetti al gruppo A e due al gruppo B: AABB, ABAB, BBAA, BABA, ABBA, BAAB.

II. Randomizzazione stratificata

Si attiva quando ha fattori prognostici es. fumo, età.
Questa tecnica aumenta la complessità.
Per effetto del caso i due gruppi, soprattutto quando il numero di pazienti è limitato,
possono non essere bilanciati rispetto ad uno o più fattori prognostici.
Ha lo scopo di migliorare il bilanciamento tra i gruppi rispetto a specifici fattori: es.
fumatori e non fumatori, i pazienti vengono suddivisi in base alla loro abitudine
riguardo al fumo e vengono così creati due “strati”, ci sarà una lista di
randomizzazione per ognuno (li suddivido al loro interno).

Poche applicazioni pratiche:

- il numero elevato di fattori implica la necessità di creare troppe liste di
randomizzazione;
- la probabilità di sbilanciamento dei fattori prognostici diminuisce
all’aumentare del numero di pazienti arruolati;
- eventuali sbilanciamenti possono essere “aggiustati” in fase di analisi
statistica (in caso in cui i due gruppi non sono completamente comparabili
per un fattore).
La randomizzazione è indispensabile nei trial multicentrici, dove ogni centro
diventa uno “strato” e deve arruolare lo stesso numero di pazienti per ogni
intervento.

Metodi dinamici di randomizzazione: non esiste alcuna lista. Il primo paziente viene distribuito in maniera
casuale e gli altri in relazione alla distribuzione dei principali fattori prognostici in modo da minimizzare ogni
tipo di sbilanciamento tra i gruppi.
Questa metodologia viene utilizzata principalmente nei piccoli trial perché mantiene i gruppi omogenei
durante tutta la fase di arruolamento.

Metodi inappropriati: sono metodi prevedibili che non permettono l’occultamento della lista: distribuzione
alternata, secondo il numero di cartella clinica, secondo la data di nascita. In questo caso la prevedibilità di
assegnazione favorisce il “sovvertimento” della lista.

82
È necessario mantenere una traccia permanente dei metodi usati per la randomizzazione e definire le
responsabilità operative: chi ha generato la lista, quali metodi ha utilizzato, con quali strumenti e’ stato
ottenuto e mantenuto l’occultamento. Per documentare il successo della randomizzazione è documentato
l’uso di tabelle riportanti i principali fattori prognostici (demografiche, cliniche e sociali), relative ai due
gruppi di pazienti.

Punti fondamentali:
✓ generazione della lista di randomizzazione
✓ occultamento della lista (nessuna influenza psicologica)
✓ attuazione della lista

Cecità
La randomizzazione consente inoltre il disegno in doppio cieco: sia gli sperimentatori che i pazienti non
conoscono il tipo di trattamento (sperimentale o controllo) a cui sono stati assegnati.

Questo tipo di disegno è necessario quando gli obiettivi del trattamento sono influenzabili da componenti di
valutazioni soggettive (dolore ed impotenza funzionale dell’artrite reumatoide, sintomi della dispepsia…).
Inoltre, in questo modo viene evitato un fattore di disparità tra i gruppi a confronto, dovuto all’eventuale
maggiore interesse con cui gli sperimentatori possono seguire i pazienti del gruppo di trattamento
sperimentale, rispetto ai controlli.

Confronto
✔La valutazione clinica sottintende in confronto
✔Il confronto deve essere simultaneo, deve perciò avere luogo all’interno dello stesso studio
✔Il confronto è indispensabile perché il ricercatore deve stabilire il valore relativo della terapia

Placebo

L’uso del placebo è eticamente giustificato se non è disponibile per il gruppo di controllo alcuna terapia di
efficacia consolidata.
Se esiste una terapia di consolidata efficacia l’uso del placebo è non solo NON ETICO, ma anche illogico: in
questo caso un medico è infatti interessato a sapere se il nuovo trattamento è migliore di quello già noto.
La ragione principale dell’uso del placebo improprio consiste nella maggior facilità di dimostrare l’efficacia di
un nuovo trattamento rispetto ad un placebo inefficace; il confronto tra due trattamenti efficaci richiede
infatti che il numero di pazienti inclusi nella sperimentazione sia nettamente maggiore.

Definire gli obiettivi principali e secondari

Definire esattamente le misure di efficacia e sicurezza scelte per valutare il raggiungimento degli obiettivi (o
out-come, end-point: sono gli esiti).

Per end-point si intende un esito o un evento chiaramente definito, il cui comportamento indica l’effetto del
trattamento in sperimentazione. Gli end-point intrinsecamente validi sono quelli clinicamente rilevanti, di
immediato e percepibile interesse per il paziente (sopravvivenza più lunga…).

83
 esempio di studio sull’efficacia e sulla sicurezza di
un supplemento dietetico, puriam110, su adulti in
uno stato di pre-diabete e con diabete mellito:
protocollo per uno studio randomizzato, doppio-
cieco, controllato con placebo, multicentrico

Abstract:
Recent studies suggests that bitter oranges and mulberry leaves have antidiabetic effects. PURIAM110, a
compound made from orange fruits and mulberry leaves (patent application no. 10-2006-0020040), is
expected to prevent the progress to the early stage of diabetes mellitus, safely.

Diagramma di flusso con fasi dello studio:

7 gg prima si fa lo screening per soggetti elegibili

Quelli elegibili saranno randomizzati: destinati al gruppo

placebo o al gruppo che riceverà l’integratore

Stesse dosi di integratore e placebo per mantenere la

cecità

Sesta settimana: Visite

Ottava settimana: Periodo di osservazione (no

somministrazione)

Obiettivo primario

Obiettivo secondario

criteri di inclusione per questo trial

le persone con questi criteri sono elegibili per lo studio

84
 non sono in terapia ma con glicemia alta

criteri di esclusione
anche uno solo di questi criteri può escludere una
persona dalla studio
- altri trattamenti (es. altri studi clinici)
- allergie (es. asma)
- malattie acute o gravi e disfunzioni renali/epatiche
- consumo di alcol o fumo
- donne in gravidanza o in allattamento
- donatori di sangue
- diagnosticato diabete di tipo 1 o 2

-queste slides sono tutti esempi per capire come viene

condotto uno studio-

End point primario: sono i parametri biochimici

End point secondario: sono i sintomi del diabete tra cui

molta fame, molta sete e frequente urinazione

End-point possono essere:

clinici: mortalità, eventi morbosi, misure fisiologiche-metaboliche (facilmente rilevabili, perché oggettivi)
economici: costi diretti (ospedalizzazioni, visite ambulatoriali) o costi indiretti (giornate lavorative perse)
umanistiche: qualità della vita ecc…
85
Si definiscono surrogati gli end-point che si presumono essere patogeneticamente correlati agli end-point
veri/clinici, che si modificano nello stesso senso di questi e che sono di più facile osservazione.
Di solito sono parametri biochimici.
Es. end point vero: ictus
End point surrogato, cioè, correlato: ipertensione, è più facile da misurare e tempo di osservazione e costi
ridotti.

End-point clinicamente rilevanti: comprendono, oltre alla mortalità, tutti gli stati morbosi che possono
essere rilevati durante il decorso naturale o post-trattamento della malattia.
End-point surrogati: sono variabili anatomico-fisiologicometaboliche misurate con test di
laboratorio/strumentali. Vengono utilizzati con la speranza di dimostrare l’efficacia di un trattamento su un
end-point clinicamente rilevante senza valutarlo direttamente.

La validità di molti end-point surrogati è stata smentita da evidenze cliniche, ma il loro uso continua ad
esserci perché indubbiamente dimostrano numerosi vantaggi:
- riduzione del follow-up
- riduzione della dimensione del campione
- riduzione dei costi

Un end-point surrogato può essere considerato un reale sostituto dell’end-point vero solo se è in grado di
predire in modo inequivocabile l’evento maggiore e se è possibile dimostrare che l’intervento sull’end-
point surrogato modifica sempre anche l’incidenza dell’evento maggiore.

Invece, un end-point surrogato può non essere un valido sostituto quando:

- non è coinvolto direttamente nel meccanismo patogenetico della malattia
- l’end-point surrogato ha un ruolo patogenetico, ma il modificarlo non determina alcun
cambiamento sull’evento finale, in quanto un altro meccanismo fisiopatologico è essenziale per lo
sviluppo della malattia

End-point composito o combinato (somma di più end-point, con diversi vantaggi):

End-point costituiti da una serie di end-point singoli.
Es. insieme del numero di decessi + numero di infarti + numero di stroke.

Fuorviante se sono evidenziati solo i risultati complessivi: ogni end-point deve essere esplicato.
ATTENZIONE:
➢ l’end point composito deve essere stabilito prima di iniziare lo studio
➢ end point importanti dal punto di vista clinico possono essere combinati con end point surrogati
es. infarto + livelli di proteina C reattiva + livelli di LDL
➢ devono essere anche riportati anche i risultati relativi agli end point singoli

Se si trova una riduzione dell’end-point combinato e contemporaneamente una

riduzione dei singoli end-point allora i risultato è attendibile, se invece non c’è
corrispondenza tra l’end-point composito e i singoli, allora è difficile
interpretare correttamente i risultati.

86
In alcuni casi l’uso di alcuni end-point compositi crea dei paradossi:
✓ Numero di Fratture + numero pazienti che dimostrano un decremento della densità ossea
✓ Il farmaco riduce l’end-point combinato

Quando ci sono end point combinati uno studio ben fatto deve riportare il risultato dei singoli end point,
soprattutto quando ci sono end point surrogati e clinici.

Esempio di studio:

✓ L’uso degli end-point combinati è molto comune;

✓ Almeno un terzo degli articoli non riporta l’effetto del trattamento sui singoli end-point che
costituiscono l’end-point combinato;
✓ Esiti di minor importanza si verificano con maggior frequenza e fanno registrare effetti del
trattamento più ampi
✓ Gli esiti di mortalità contribuiscono in misura minore e ad essi sono correlati gli effetti più scarsi del
trattamento
RISCHIO: attribuire riduzioni della mortalità ad interventi che di fatto non riducono le percentuali di decessi
(a volte gli studi dicono cose opposte ma uno potrebbe essere più valido di un altro).

Un ricercatore deve decidere a priori quali criteri decide di valutare per stabilire se il trattamento
sperimentato è efficace (quali sono gli end point).
Non è corretto procedere ad analisi su sottogruppi di una casistica per corroborare ipotesi formulate a
posteriori: in questo caso si partirebbe da un risultato trovato forse casualmente, significativo su un
campione dimensionato per saggiare un’altra ipotesi e si conclude affermando la correttezza di un’ipotesi
non prevista dall’esperimento.
Non significa che l’ipotesi sia errata, ma che tutta via questa dovrà essere testata con un esperimento ad
hoc che si ponga come obiettivo la nuova ipotesi.

È opportuno che l’end-point primario sia unico e ben definito in quanto è quello in base al quale si
determina la dimensione del campione e si stabilirà se l’ipotesi è stata verificata.

Campione
Affinché i risultati ottenuti nel campione in studio siano generalizzabili all’intera popolazione di provenienza
sarebbe necessario che esso riproducesse, in scala ridotta, tutte le caratteristiche della popolazione di
provenienza.

87
MISURE DI EFFICACIA
Valutiamo l’efficacia del principio attivo A nel prevenire gli eventi per cause cardiovascolari rispetto al
trattamento di confronto (controllo, gruppo B).

Rischio relativo negli RCT

Il rischio relativo (RR) è il rapporto tra la probabilità che si verifichi un evento in un gruppo esposto (ad un
trattamento, ad un fattore di rischio, ad un fattore protettivo), e la probabilità che si verifichi lo stesso
evento in un gruppo di non esposti (allo stesso trattamento, fattore di rischio, fattore protettivo).

RR = (RISCHIO NEGLI ESPOSTI)/(RISCHIO NEI NON ESPOSTI)

Il RR indica la forza dell'associazione fra l'esposizione (o trattamento) e l'esito ed è sempre un numero

positivo.

Se RR>1 significa che c’è una correlazione positiva,

perché c’è un aumento del numero degli eventi nel
gruppi dei trattati. Se questa è una cosa buona o
cattiva dipende dall’evento che stiamo andando a
studiare.

Se RR<1 significa che il rischio che si verifichi un evento

nel gruppo dei trattati è inferiore rispetto al gruppo di
controllo. Anche in questi caso, se è una cosa positiva o
negativa dipende dal tipo di studio che siamo
conducendo.

Un discostamento dall’unità (cioè 1) indica la forza

dell’associazione tra l’esposizione e l’esito.

esempio di calcolo dell’RR

88
 In questo esperimento si è andato ad utilizzare
una droga tradizionale giapponese per andare
a valutare l’effetto sulla neurotossicità da
oxaliplatino (un chemioterapico).

Figura 8 Flow chart

Chi è stato esposto alla terapia con rimedio erboristico è andato incontro meno alla neuropatia, in quanto il
rischio relativo RR è <1, visto che l’evento che stiamo valutando è la neurotossicità.
Esposizione determina il decremento del n° di eventi. Dopo vedremo che per l’intervallo di confidenza
questi valori NON sono statisticamente significativi. (FINE STUDIO)

Altro trial eseguito in Cina in cui hanno cercato di applicare l’agopuntura con un rimedio erboristico nelle
donne incinta che avevano la posizione del bambino in maniera podalica, osservando se l bambino con
questo rimedio erboristico si girasse.
moxibution: bruciare erbe per stimolare i punti di agopuntura.
Punto terapeutico BL 67 usato (aumenta l’attività fetale) per correggere la posizione podalica.
Obiettivo: valutare sicurezza ed efficacia della maxibution (> attività fetale e correggere posizione podalica).
Progetto: in aperto, inutile fare in cieco
Risultati: il 98 di 130 feti nel gruppo di intervento erano cefalici vs gli 81 su 130 del gruppo di controllo (RR,
1,21: abbiamo un maggior rischio nel gruppo di trattamento con rimedio erboristico di andare incontro
all’evento, cioè la presentazione cefalica, il bambino si gira in maniera naturale evitando il cesareo).
Conclusione: la droga è risultata efficace, RR>1 evento si presenta negli esposti, effetto positivo. (FINE
STUDIO)

89
 Efficacia del finocchio e del
contraccettivo orale combinato
sull’amenorrea indotta da
MEDROSSIPROGESTERONE
ACETATO (contraccettivo che
induce amenorrea) – studio
randomizzato, controllato con
placebo. A 3 bracci: 1 gruppo di
donne è stato tratto con il
finocchio, 1 gruppo con la
terapia di contraccezione
combinata, 1 gruppo con il
placebo (controllo).

Obiettivo: determinare l’efficacia nell’indurre il sanguinamento mestruale e nella continuazione del metodo
nelle donne che utilizzano questo contraccettivo e che non hanno avuto sanguinamento nei precedenti
45/140 gg.
Tutti i partecipanti ricevano 2 capsule di
finocchio o 2 capsule di placebo e 1
pastiglia di ormoni o 1 pastiglia di
placebo (per mantenere la cecità-double
blind-), per 21 gg.

No follow-up: vuol dire che tutti i

soggetti arruolati per lo studio sono
rimasti fino al termine dello studio.

Conclusioni: sia le donne trattate con

finocchio (73%) sia le donne trattate con
la terapia combinata (81%) avevano
avuto delle perdite di sangue, risolvendo
così l’amenorrea indotta da DMPA e
aumentare il tasso di continuazione di questo metodo contraccettivo.
RR 3.1 per finocchio, RR 4.2 per la terapia combinata, efficacia elevata. (FINE STUDIO)

Hazard Ratio (HR) -altra misura di efficacia-

Rapporto tra rischio di un evento in un gruppo di soggetti trattati rispetto ad un altro gruppo di confronto.
È la stessa cosa dell’RR ma questa misura si utilizza soprattutto nelle analisi di sopravvivenza (curve di
Kaplan-Meier) e nelle metanalisi.

Con queste curve si parte sempre da una sopravvivenza del 100%,

man mano che il tempo passa la curva si abbassa (ogni qualvolta
che un individuo muore in questo caso).

ad es. in questo grafico il trattamento fa sì che la sopravvivenza sia

più elevata rispetto al placebo.

90
 Esempio di caso studio: effetto terapeutico di una
soluzione orale in una malattia mani-bocca-piedi
(rimedio cinese a base di rabarbaro e Scutellaria
baicalensis).

Curve Kaplan-Meier
A pazienti con ulcere orali e
vescicole; si parte dal 100%, tutti
i bambini all’inizio dello studio
hanno questi problemi. ci
aspettiamo di scendere ogni
volta che abbiamo una
guarigione. Con il trattamento si
ha una riduzione più veloce
delle problematiche, rispetto al
placebo.
B si parte dalla condizione che il
100% dei bambini hanno la
febbre. Anche in questa curva di
sopravvivenza si ha una
riduzione della febbre più veloce
con il trattamento con placebo.

La differenza tra i trattamenti che si evidenzia nello studio rispetto ad uno specifico endpoint è
significativa o è dovuta al caso??

Bisogna respingere l’ipotesi zero, per convenzione si accetta l’errore alfa. Se il valore di P è inferiore al 5% il
risultato è statisticamente significativo (non dovuto al caso ma al trattamento).

IPOTESI ZERO: la differenza tra i due trattamenti è soltanto casuale.

L’ipotesi zero viene data per vera e deve essere respinta, tramite un’analisi statistica. Bisogna farlo ogni volta
che otteniamo un risultato.
La probabilità di sbagliare nel respingerla è chiamata errore alfa.
Errore alfa: affermare che un risultato casuale sia statisticamente significativo.
Per convenzione viene accettato una probabilità di questo tipo di errore < 5%
P<0,05= il rigetto dell’ipotesi è ragionevole e il risultato è STATISTICAMENTE SIGNIFICATIVO (altrimenti il
risultato ottenuto è dovuto al caso).

L’RR, e le altre misure di efficacia in generale, non può essere un valore unitario. Immaginando di ripetere la
misura per 100 volte si troveranno 100 risultati differenti, il 95% dei quali sarà compreso all’interno di un
intervallo definito intervallo di confidenza.

91
L’intervallo di confidenza esprime il range entro il quale può trovarsi l’RR con una probabilità del 95%.
Maggiore è l’intervallo di confidenza, minore sarà la riproducibilità del dato.

Figura 9 P<0,05 riproducibile valore affidabile; qui i risultati

sono o sempre a favore della droga o sempre a favore del
controllo (100%)

In questo caso il segmento dell’intervallo di confidenza

oltrepassa l’unità: ciò vuol dire che non abbiamo un risultato
univoco.
P>0,05 valore non statisticamente significativo, non
riproducibile. Risultati a volte a favore della droga, a volte a
favore del controllo.

Negli studi clinici i risultati si trovano scritti come:

✓ Valore della misura di efficacia (RR o HR)
✓ Intervallo di confidenza al 95% (da cui possiamo già capire se i risultati sono statisticamente
significativi- non devono raggiungere l’unità-)
✓ Valore di p (che ci dice se il risultato è dovuto al caso oppure no, se <0,05 il risultato è
statisticamente significativo, più è piccolo meglio è)
Es. RR 0,6; IC 95% 0,45-0,80, p<0,05.

Esempio di come
vengono scritti i
risultati negli
studi

92
Gli RCT non sono però infallibili: spesso RCT su uno stesso trattamento e simili tra loro possono raggiungere
risultati differenti, non sempre spiegabili con differenze casistiche o con una diversa applicazione dei
trattamenti.
Fattori critici possono essere:
▪ Numerosità del campione (influenza la significabilità)
▪ Fase della malattia (deve essere la stessa in tutti i campioni)
▪ Maggiore o minore abilità degli sperimentatori (es. chirurghi)
Quando si legge un RCT è necessario essere in grado di valutarne la validità metodologica e la plausibilità
generale e di interpretarne la possibile eterogeneità tra l’uno e l’altro.

In più, molti fattori possono aumentare la variabilità della risposta e vanno quindi tenuti sotto controllo:
✓ La gravità dello stato morboso: pazienti meno gravi potranno rispondere in maniera più
soddisfacente rispetto a pazienti più gravi. Introducendo pazienti di ogni gravità si rischia quindi di
rendere meno sensibile l’esperimento e di non cogliere l’effetto di un farmaco o di non ravvisare
differenze tra i farmaci.
✓ Età: Pazienti più giovani possono rispondere meglio, grazie a difese organiche più efficienti.
✓ Sesso: Fattori ormonali possono influire sull’esito di un trattamento.
✓ Le terapie concomitanti: Possono influire sul risultato perché la loro efficacia può oscurare quella
della nuova terapia per il verificarsi di interazioni
✓ L’osservatore: per quanto si cerchi di uniformare i criteri di diagnosi, di valutazione, di esecuzione di
test, rimane sempre una marcata quota di variabilità nella risposta, attribuibile alla diversità tra
osservatori
✓ Le condizioni ambientali: Una buona assistenza infermieristica, la disponibilità di trattamenti
accessori di qualità, un ambiente ospedaliero confortevole, possono marcatamente contribuire ad
un’evoluzione positiva di un quadro morboso anche grave e non solo sotto il profilo asintomatico.
✓ Le abitudini alimentari e di vita: marcate differenze di introito calorico, di tipo di dieta, di consumo
di tabacco/alcol, possono modificare sia il comportamento cinetico dei farmaci sia l’andamento
dell’affezione morbosa.

Analisi critica di un RCT

1. Lo studio è valido? (l’end point deve essere chiarissimo)
▪ È stato definito con chiarezza il quesito della ricerca (l’endpoint)?
▪ La sperimentazione è controllata?
▪L’assegnazione del soggetti ai trattamenti è avvenuta in modo randomizzato?
▪ La randomizzazione ha prodotto gruppi paragonabili all’avvio della sperimentazione?
▪ La sperimentazione è stata condotta in cieco o, meglio, in doppio cieco?
▪ I gruppi sono stati trattati in modo uguale in tutto e per tutto?
▪ È stato reso conto di tutti i soggetti alla conclusione dello studio?
(quanti sono i soggetti “persi” al follow-up? Il loro numero può mettere in dubbio i risultati ottenuti?
SE IL NUMERO DI PAZIENTI “PERSI” AL FOLLOW UP è > 10%, I RISULTATI DELLO STUDIO PERDONO DI
ATTENDIBILITÀ.

2. I risultati sono importanti?

▪ Quanto è ampio l’effetto del trattamento?
Valutazione delle misure di efficacia (RR), intervallo di confidenza (CI), NNT
▪ Il risultato è statisticamente significativo (p<0,05)?

Revisione sistematica (Systematic Review):

Articolo in cui gli autori hanno cercato, valutato e riassunto tutta la letteratura medica su un argomento
specifico.
3 caratteristiche chiave:
- recupero di tutti i resoconti originali sull’argomento di interesse;
93
 - valutazione critica dei resoconti;
- conclusioni basate su una sintesi degli studi che soddisfano criteri prestabiliti di qualità.
I risultati sono espressi come semplice conta del numero degli studi con risultati a sostegno dell’intervento e
di quelli con risultati contro.

METANALISI
È una tecnica clinico-statistica di assemblaggio di sperimentazioni multiple di uno stesso trattamento (quasi
sempre di RCT) che consente una valutazione quantitativa cumulativa dei loro risultati.
= Revisione sistematica che usa metodi quantitativi per sintetizzare i risultati.
Analizza i risultati degli studi dando una valutazione complessiva.

Perché sono importanti?

1) Sono molto utili. L’efficacia di molti trattamenti viene valutata da più trial (spesso parecchie decine), cosa
che rende indispensabile un resoconto sintetico (resoconto di tutta la letteratura fino a quel momento).
2) Sono molto diffuse. Il numero di meta-analisi che vengono pubblicate è crescente in tutti i campi della
patologia.
3) Sono tra le evidenze più attendibili. Secondo la medicina basata sull’evidenza le meta-analisi di trial
randomizzati, sono, insieme ai trial ben disegnati, le prove più valide dell’efficacia (o della non efficacia) dei
trattamenti. Costituiscono pertanto le basi più affidabili per raccomandazioni terapeutiche.

Sequenza di operazioni di una meta-analisi

1. Definizione di un obiettivo
2. Definizione di criteri di inclusione ed esclusione dei trial (per esempio, si possono escludere trial
che non valutano un end point che rientra nell’obiettivo della meta-analisi).
3. Ricerca dei trial di interesse, il più possibile esaustiva.
4. Analisi critica dei trial che sono stati inclusi nella meta-analisi (caratteristiche dei pazienti,
modalità di somministrazione del trattamento, end point, follow up, qualità metodologica). Di
particolare interesse è la ricerca di una eventuale eterogeneità qualitativa inter-trial, cioè con trial
che dimostrano un vantaggio terapeutico del trattamento sperimentale e altri che dimostrano un
vantaggio terapeutico del trattamento di controllo.
5. Combinazione dei risultati dei trial (pooling), spesso presentata anche in forma grafica.
6. Interpretazione:
⮚trial sufficientemente simili tra loro: si ottiene una misura globale di efficacia del trattamento, più
precisa e riproducibile di quella di ognuno dei trial analizzati;
⮚trial troppo eterogenei: sarebbe arbitrario giungere ad una conclusione combinata dei loro
risultati.

94
Cochrane Collaboration: è un mega-network internazionale non-profit costituito da numerosi gruppi
collaborativi che producono e diffondono meta-analisi di trattamenti relativi a specifici
problemi sanitari.
Le meta-analisi della Cochrane Collaboration raccolte nella Cochrane Library e
disponibili su Internet sono parecchie centinaia.
Sono elaborate con criteri metodologici rigorosi: ognuna di esse deve essere preceduta
dall’approvazione, ad opera di esperti, del protocollo di ricerca (peer review).

esempio di metanalisi: il quadrato indica

il risultato dello studio, la linea indica l’intervallo di
confidenza, cioè la riproducibilità (più è piccolo più è
riproducibile), la grandezza del quadrato indica la numerosità
del campione.

Il rombo indica il risultato finale.

altro esempio di metanalisi: alcuni risultati sono a

favore dei controlli, ma non si può considerare efficace,
in quanto molti sono vicino all’unità e altri ancora a
favore dei controlli: ci sono risultati che arrivano a una
conclusione opposta (non valido scientificamente).

(ulteriore metanalisi sulle slide sull’ansia non ci sono

abbastanza studi per validarne l’suo scientificamente,
sul sonno funziona- RCT è il trial)
FINE STUDI SPERIMENTALI

All’inizio avevamo visto che gli

studi clinici si dividono in 2
grosse categorie:
• studi sperimentali (o
interventistici), lo sperimentare
ha un ruolo attivo, ad es.
somministra medicina; sono tutti
gli studi visti finora
• studi osservazionali, in
questo caso lo sperimentatore
osserva un gruppo di persone a
cui non è stato lui a decidere
cosa somministrare (no ruolo
attivo)

95
STUDI OSSERVAZIONALI
Studio epidemiologico nel quale il ricercatore non determina l’assegnazione dei soggetti a ciascun gruppo,
ma si limita a registrare (osservare) quello che avviene nella realtà.
Lo sperimentatore osserva e basta i soggetti, valutandoli. È più difficile da effettuare.
Si possono dividere in 2 categorie:

• studi osservazionali analitici:

Uno studio analitico (eziologico) si sviluppa quando si conoscono dati sufficienti sulla malattia prima
della ricerca, in modo che esistono già ipotesi stabilite a priori e che queste possono essere
comprovate nello studio. Gli obiettivi generalmente sono: identificare fattori di rischio per la
malattia, stimare l’effetto della esposizione sulla malattia e dedurre quindi le possibili strategie
d’intervento.
Sottotipi: studi di coorte, studi caso e controllo e studi trasversali.

• studi osservazionali descrittivi: Trasversali, Case report e serie clinica

Si realizza quando si hanno poche informazioni sulla comparsa, storia naturale o determinanti di
una malattia.
Tra i soggetti si deve determinare la frequenza di una malattia o di una caratteristica, la tendenza
temporale in una particolare popolazione ed elaborare/generare ipotesi eziologiche più specifiche.

Studi osservazionali analitici

In questi studi i ricercatori non si limitano ad osservare e descrivere, ma analizzano i dati delle
osservazioni.
Si caratterizzano quindi per l’impiego di analisi statistiche.
✔Studi di coorte
✔Studi caso-controllo
✔Studi trasversali
▪ Studiano l’associazione tra malattie e fattori di rischio
▪ Viene quantificata la forza di tali associazioni
▪ Le informazioni sulla malattia e sull’esposizione a fattori di rischio sono raccolte a livello individuale

Studi di coorte (prima tipologia di studi osservazionali analitici)

Si basano sull’osservazione di un gruppo di soggetti per un certo periodo di tempo al fine di valutare
l’incidenza del fenomeno di interesse.
Coorte: gruppo di persone che condividono una o più caratteristiche (età, assunzione del farmaco) e che
possono essere osservate nel corso del tempo.
La lunghezza del follow-up dipende dall’evento da valutare.
Con coorte parallela: si identificano due gruppi di soggetti (coorti), uno esposto al farmaco in studio e l’altro
no (funge da controllo). I gruppi vengono seguiti nel tempo misurando l’incidenza dell’evento in studio.
Molto simile a un trial randomizzato controllato (RCT), ciò che è diverso è la randomizzazione di base, in
quanto lo sperimentatore non decide a chi somministrare il farmaco.

Lo studio di coorte è uno studio longitudinale (che si svolge nel tempo in quanto il soggetto viene “valutato”
sul momento e poi “rivalutato” dopo del tempo) dove l’esposizione precede sempre l’esito.

Esempio: ci interessa studiare l’associazione tra ipertensione (esposizione) ed ictus (esito). Quindi i soggetti
vengono valutati al basale per la presenza di ipertensione, dopo un determinato periodo di tempo (follow-
up) si osserva quanti tra i soggetti con ipertensione hanno avuto ictus.

96
 Inizialmente si ha il gruppo degli esposti e il gruppo dei non
esposti, per un certo periodo di tempo.
Al termine del follow-up si andrà vedere qual è la % che ha
manifestato la malattia negli esposti e qual è la % che l’ha
sviluppata nei non esposti. Quindi, l’esposizione precede
sempre l’esito.

Visto che, dopo un certo periodo di tempo, possiamo capire quanti sono numericamente gli eventi che si
sono manifestati nelle due coorte, possiamo andare a calcolare il rischio relativo:
RR=1 nessuna associazione, RR>1 associazione positiva è maggiore il numero di eventi che si manifesta nei
soggetti trattati, RR<1 associazione negativa è minore rischio nei soggetti trattati-esposti di andare incontro
all’evento. Inoltre, quanto più RR è lontano da 1, tanto più forte è l’associazione (refresh dell’RR).

Nel caso dell’esempio: 3,5 associazione positiva, chi è stato esposto a fattore rischio, è andato incontro
all’evento cardiovascolare.

Aspetti principali dello studio:

Definizione: della coorte (criteri di inclusione precisi),
del gruppo di confronto,
dell’esposizione,
dell’evento in studio

Studio di coorte: caratteristiche

• Le coorti sono definite in base alla variabile di esposizione
• Alla fine del follow-up, l’incidenza della malattia viene confrontata tra le coorti
• Si possono calcolare il rischio o il tasso di incidenza
• Si possono misurare una varietà di esiti (outcome)
• Possono essere prospettici o retrospettivi

Una coorte può essere formata a partire da: (gruppo di persone affini per determinate caratteristiche)
- la popolazione generale di una determinata area geografica
- un gruppo ben definito da un punto di vista sociale o professionale (la coorte dei medici inglesi, la coorte
delle infermiere americane)
- un gruppo di soggetti accumunati da una esposizione specifica, rara nella popolazione generale
(popolazioni esposte ad un evento specifico: sopravvissuti alle esplosioni atomiche di Hiroshima, soggetti
che hanno effettuato determinate terapie mediche)
97
Modalità e durata follow-up
- Ogni soggetto in studio deve essere osservato per tutto il tempo in cui è a rischio di sviluppare
l'evento
- Questo periodo dipende dall'esposizione e dalla malattia considerata
- Nel fissare la durata del follow-up si deve tener conto delle conoscenze sui meccanismi biologici alla
base dell'evento studiato (Induzione-Latenza)

Vantaggi:
✓ è il tipo di studio dotato della massima validità intrinseca, dopo i trial randomizzati, ai quali
assomiglia in tutto, tranne che per la mancanza di randomizzazione.
✓ Poter calcolare l’incidenza nella coorte esposta e in quella non esposta e di conseguenza il rischio
relativo;
✓ L’esposizione è rilevata prima dell’esito e questo è importante ai fini del nesso di causalità (relazione
temporale);
✓ Poter studiare più malattie. Sulla base dell’esposizione o meno, seguo nel tempo questa coorte e
decido io quale malattie rilevare;
✓ Poter valutare esposizioni rare in quanto si va a selezionare i partecipanti proprio in base
all’esposizione;
✓ Possibilità di osservare in modo completo tutto ciò che succede in seguito all’esposizione.

Svantaggi:
✓ sono studi laboriosi e richiedono molti partecipanti (servono tante persone perché dall’esposizione
devo rilevare l’esito).
✓ sono studi organizzativamente impegnativi e costosi (le persone devono essere seguite, talvolta
sono richieste esami di laboratorio, lastre, ecc, possono essere necessari contatti telefonici; ma
anche solo un questionario è una macchinazione non indifferente).
✓ Richiede un lungo follow-up.
✓ Lo stadio di esposizione può variare nel corso dello studio.
✓ Non si possono verificare ipotesi eziologiche emerse successivamente all’inizio dello studio.
✓ Possono cambiare nel tempo i criteri diagnostici.
✓ Non è adatto a valutare malattie rare: esiti rari o troppo dilazionati nel tempo, richiederebbero
grandi quantità di soggetti arruolati e/o di anni di osservazione, con relativo aumento spropositato
dei costi.

Studi caso-controllo (seconda tipologia di studi analitici osservazionali)

L’esito anticipa l’esposizione, siamo nel caso opposto rispetto a quello precedente.

Negli studi caso controllo si parte dalla malattia per ricercare nel passato l’esposizione ai fattori di rischio
presunti responsabili della patologia. Ricapitolando: negli studi di coorte si partiva da soggetti ipertesi e si
monitoravano nel tempo per vedere se sviluppavano l’ictus. Qui partiamo da soggetti con l’ictus e si va a
ritroso per capire se prima erano ipertesi.

98
Identificazione dei CASI e dei CONTROLLI e mediante interviste con appositi questionari e l’esame dei dati
clinici disponibili, viene esaminata la frequenza di esposizione ad un determinato fattore dei due gruppi nel
passato.

Es.) Ci interessa studiare l’associazione tra ipertensione (esposizione) ed ictus (esito). Quindi i soggetti
vengono valutati al basale per la presenza di ictus e si cerca di scoprire se sono o no ipertesi.

Si parte dalla selezione del gruppo caso e

controllo. In questo caso la freccia va a ritroso: si
va indietro al momento prima della malattia e si
osserva se erano esposti a fattori di rischio per la
malattia che ci interessa.

Figura 10 stima della distribuzione dell'esposizione nella popolazione

I casi vengono appaiati ai controlli (simili in tutto e per tutto ai casi, ma senza aver sviluppato la malattia).
1 o più controlli per ogni caso.

Per la scelta dei controlli si utilizza sovente la tecnica dell’appaiamento (matching): per ogni malato si
seleziona una persona che abbia le stesse caratteristiche ritenute importanti per lo studio (età, sesso, ecc.)
purché non sia malato o portatore di condizioni correlate con la malattia stessa.

L’attendibilità e l’affidabilità dello studio dipendono dalla corretta selezione dei casi e dei controlli
(importantissimo che vengano selezionati nella maniera corretta)!!!

Campioni di popolazione: nel caso che la patologia si sviluppi in una determinata popolazione di una
circoscritta area geografica, il miglior gruppo di controllo sono soggetti sani della stessa popolazione
(population-based control).
Controlli ospedalieri: nel caso di casi ospedalieri è difficile identificare la zona di provenienza quindi i
controlli, per semplicità e per approssimazione di popolazione possono essere scelti nella stessa struttura,
ma che non hanno manifestato quell’evento.

A differenza dello studio di coorte non è possibile conoscere l’incidenza della malattia, quindi, non è
possibile calcolare il RR e il RA:
Si calcola quindi una misura surrogata del rischio ovvero l’ODDS RATIO;
Tale misura è una stima del rischio relativo e ci dà la misura di quanto l’esposizione sia più frequente tra i
malati che tra i non malati, e quindi la forza dell’associazione tra fattore ed evento.

L’analisi statistica verte sulla ricerca se, in passato, i casi sono stati esposti in modo differente rispetto ai
controlli ad uno o più fattori di rischio. Il confronto può essere quantitativo (numero di sigarette fumate ogni
giorno) o qualitativo (fattore presente o assente).

99
ODDS RATIO (OR)
L’ODDS RATIO altro non è che il rapporto tra due ODDS:
- L’ODDS di esposizione dei casi: ovvero il rapporto tra la probabilità che i casi siano stati esposti al
fattore e la probabilità che non siano stati esposti.
- L’ODDS di esposizione dei controlli: ovvero il rapporto tra la probabilità che i controlli siano stati
esposti al fattore e la probabilità che non siano stati esposti.

Interpretazione dell’OR:
OR>1 l’esposizione è associata positivamente all’esito. Se l’esposizione è un fattore di rischio e l’esito una
malattia, vuol dire che l’esposizione a quel fattore è associato allo sviluppo per una determinata patologia
perché nel gruppo degli esposti ho un numero maggiore di malati.
OR=1 nessuna associazione: : i due ODDS sono uguali. Non c’è legame tra l’esposizione e l’esito.
OR<1 l’esposizione è associata negativamente all’esito.
Quanto più OR è lontano da 1, tanto più forte è l’associazione (in un senso o in un altro).

Vantaggi:
✔ Organizzazione semplice, rapida e poco costosa;
✔ Idonei a studiare malattie con lunga incubazione;
✔ Idonei a studiare malattie rare (perché posso selezionare i malati, andando a selezionare solo i malati
rari);
✔ Raccomandato nel caso di malattie croniche;
✔ Consentono lo studio di più fattori di rischio contemporaneamente;
✔ Relativamente brevi ed economici rispetto allo studio di coorte.

Svantaggi:
✔Non adatti allo studio di fattori di rischio rari
✔Non consentono il calcolo diretto dell’incidenza e quindi non posso valutare il rischio relativo
✔Difficile selezione del gruppo di controllo
✔La relazione temporale tra esposizione ed evento può essere difficile da stabilire.- per questo è inferiore
per livelli di evidenza agli studi di coorte
✔Mancano dati oggettivi sull’intensità di esposizione pregressa.

100
 Taiwan ha la più alta incidenza di
malattia renale allo stadio terminale
nel mondo.
STUDIO CASO-CONTROLLO
Malattia renale allo stadio terminale

Valutare il rischio di ESRD associato a

una serie di presunti fattori di rischio:
- 200 pazienti con ESRD
- 200 parenti dei pazienti controllo

Questionario: fattori socioeconomici,

storia di malattie, screening di sangue
e urine, stile di vita, esposizione
ambientale, integratori e farmaci

Risultati fattori di rischio

significativi: - basso status
socioeconomico; - storia di ipertensione e diabete; - uso regolare di erbe cinesi.
Diminuzione del rischio: in caso di assunzione di multivitaminico.

Fumo

Alcol

Esposizione a benzina
Vernice

Chi assume vitamine è protetto OR<1 (in

verde)

Rimedi popolari (in rosso)

Nello studio di coorte l’esposizione anticipa l’esito.

Nello studio caso-controllo l’esito anticipa l’esposizione.

Entrambi sono degli studi longitudinali, perché abbiamo un fattore

tempo importante tra esposizione ed esito.

Questo differenzia questi 2 studi da quelli trasversali, i “cross-

sectional study”. Esposizione ed esito sono determinati nello stesso
momento.

101
Studi longitudinali e trasversali
È possibile studiare i fenomeni con l'utilizzo di studi longitudinali e trasversali. I primi prevedono lo studio
dei suddetti fattori, nel corso del tempo, in uno stesso soggetto; i secondi prevedono, invece, lo studio delle
variazioni di un fattore, in diversi soggetti o contesti, in un momento preciso. Quindi, in quelli trasversali si
ha l’osservazione di più soggetti, ma una singola volta.

Es. di studio longitudinale ripetute osservazioni dello stesso soggetto o soggetti in un periodo di tempo: es.
osservare l'insorgenza di sintomi ansiosi in soggetti iperattivi per 5 anni dall'età di 5 ai 10 anni. Es. studi di
coorte o caso-controllo.
Es. di studio trasversale diverse osservazioni in un momento preciso su diversi soggetti: es. osservare la
presenza di sintomi ansiosi in gruppi di soggetti iperattivi di una certa età.

Gli studi longitudinali sono più dispendiosi in termini di tempo e di costi, ma permettono di studiare un
fenomeno nella sua evoluzione nello stesso soggetto, permettendo di determinare un nesso causale.

Studi trasversali (terza tipologia di studi clinici)

→ ESPOSIZIONE ed ESITO sono rilevati contemporaneamente nella popolazione.
→ Singolo momento di osservazione: “fotografia” di una determinata popolazione in un determinato
momento.
→ Permette di descrivere la diffusione della malattia nell’ambito di una certa popolazione in funzione ,ad
esempio, delle caratteristiche della popolazione (Es. le caratteristiche demografiche):
- etnia
- gruppo sanguigno
- caratteristiche genetiche.
→ L’ obiettivo non è individuare i fattori di rischio.

Il valore che si ricava da questi studi, non è un’incidenza, ma è una prevalenza:

Es. Si vuole andare a vedere quanti sono i soggetti che si sono ammalati di una certa patologia in una
popolazione.
Per farlo rilevo quante persone hanno contratto la malattia e divido questo numero per quello dei soggetti
che ho esaminato: ho fatto uno studio di prevalenza.
È uso distinguere la prevalenza per il sesso, per esempio: prevalenza di 2% per gli uomini 5% per le donne,
oppure in funzione dell’età.

Rilevazione istantanea da una “popolazione definita” dei dati sui fattori di rischio, gli atteggiamenti dei
soggetti, le loro malattie, i loro disturbi.

Sono utili per generare ipotesi sull’eziologia ed i fattori di rischio delle malattie

Si può stabilire la presenza di un’associazione fra due variabili ma è impossibile fare affermazioni valide
relative alla relazione causale.
Utili per valutazioni di politica sanitaria (conoscere lo stato di salute della popolazione per pianificare
l’allocazione delle risorse).
FINE studio osservazionale analitico.

102
Studi descrittivi
Case report e case series
Si tratta di studi prevalentemente clinici.
Case report è l’esperienza che lo sperimentatore fa relativamente ad un singolo caso clinico.
La serie clinica è l’esperienza relativa ad un gruppo più o meno ampio di pazienti.
Può per esempio riferirsi ad una malattia molto rara o con uno strano tipo di rappresentazione clinica: un
qualcosa che rende questo caso unico nel suo genere e che secondo chi lo ha osservato merita una
segnalazione.
In linea di massima un Case report è più facile che venga scritto dal medico più che dal ricercatore.

Vantaggi:
✓ Può condurre alla formulazione di nuove ipotesi (senza verificarle, perché sono semplici
descrizioni).
✓ Legame tra la pratica clinica e la ricerca.
Limiti:
✓ Non può essere usato per vagliare ipotesi.
Trattamento del cancro al seno
trattato con erbe medicinali cinesi
(decotto di Fei).

Case report, può essere utile ad

altri medici e ricercatori per avere
spunti di riflessione nel caso in cui
dovessero fare studi nelle stesse
condizioni.

Dopo 2 mesi di assunzione del

decotto:
- È diminuito il marker del
tumore
- Sono diminuite le
dimensioni delle metastasi

altro case report, che abbiamo già visto nella

farmacocinetica.
Caso del soggetto che è andato in coma da
oppioide a seguito dell’assunzione di codeina
per curare la polmonite.

È stato un case report.

FINE STUDI CASI DESCRITTIVI.

103
Effetto placebo (placebo: sostanza farmacologicamente inerte, l’effetto riscontrabile è psicologico)
Gli effetti di ogni trattamento medico (farmacologico o meno) hanno due componenti, una correlata agli
effetti specifici del trattamento e l’altra alla percezione di aver ricevuto una terapia: effetto placebo.

Primi risultati sul placebo ottenuti in una metanalisi del 1955.

35% dei pazienti ha risposto positivamente alla somministrazione del placebo nel trattamento

I progressi nella comprensione dei meccanismi neurobiologici e psicologici degli effetti del placebo hanno
non solo spostato la questione dal concetto di contenuto inerte a quello di interventi placebo (trattamenti
simulati e contesto clinico), ma hanno anche permesso di sfatare le numerose credenze sui placebo e sui
loro effetti.

Effetto placebo: effetto osservato nel gruppo placebo di uno studio clinico, prodotto da un fenomeno
biologico placebo in aggiunta ad altri fattori che contribuiscono al miglioramento dei sintomi quali ad
esempio il decorso naturale della malattia.

Gli effetti placebo sono da intendere come reali eventi psicobiologici causati dal contesto terapeutico nel
suo complesso.

Da un punto di vista psicologico molti meccanismi possono contribuire agli effetti placebo. La suggestione
verbale di un miglioramento che tipicamente accompagna la somministrazione di un farmaco crea
un’aspettativa.

Meccanismi psicobiologici dell’effetto placebo

• Aspettative: incrementata dalla suggestione verbale (se qualcuno mi dice che funziona io sono
tenuto a crederci, soprattutto se è un medico)
• Apprendimento: diviso in rafforzamento delle aspettative, condizionamento (es. cane Pavlov),
apprendimento sociale (apprendiamo da quello che vediamo dalle altre persone)

104
Primo studio valutato per l’effetto placebo:

Il soggetto trattato con una sostanza, senza sapere quando

riceve il farmaco. Con la somministrazione in aperto il dolore
scala, con la somministrazione in cieco, quindi quando il paziente non sa che è trattato con il farmaco,
l’intensità del dolore è più alta: latenza di effetto dovuta all’effetto placebo (grafico).

105
 Nel condizionamento prolungato, anche in questo
caso, l’intensità del dolore veniva percepita come
maggiore a seguito della luce rossa, nono stante
fosse uguale con tutte e 3 le luci.

FINE SPERIMENTAZIONE CLINICA

106
LIMITAZIONE DEGLI STUDI CLINICI
• Breve durata della sperimentazione clinica
• Popolazione selezionata
• Indicazione ristretta
• Ambiente della sperimentazione (non sarà mai paragonabile a quello che succede nella realtà)
• Numero ristretto di pazienti

Differenza tra studi clinici controllati RCTs e normale pratica clinica

Durante i trial clinici si cerca di rilevare anche le reazioni avverse. Spesso si riescono, però, a rilevare solo
quelle più comuni, perché sono quelle che si manifestano con maggiore frequenza, ma quelle rare e molto
rare è difficile rilevarle durante gli studi clinici, proprio per i limiti visti prima (durata limitata, soggetti
limitati).

Fattori che incrementano il rischio di ADR (reazione avversa) per prodotti di origine naturale:
➢ Attuale tendenza a ricorrere a medicina “naturale” o alternativa
➢ Le ADR da fitoterapici hanno minor probabilità di venir denunciate rispetto a quelle dei farmaci
convenzionali (non si pensa che gli integratori possano fare male)
➢ Gli integratori alimentari on devono sottostare a dimostrazioni di efficacia, sicurezza e qualità come
i farmaci convenzionali
➢ Usati spesso in contemporanea con farmaci tradizionali
➢ La vendita via internet può vanificare qualsiasi iniziativa legislativa rivolta alla tutela della salute del
paziente
➢ Presenza di contaminanti e adulteranti del prodotto

Infatti, le reazioni avverse da erbe medicinali possono essere dovute:

➢ All’effetto di uno dei costituenti del rimedio erboristico
➢ Alla contaminazione o sostituzione con erbe note per la loro tossicità

107
 ➢ Alla presenza di metalli pesanti
➢ All’inserimento nel prodotto erboristico di un farmaco (es. corticosteroidi)
➢ All’interazione fra un fitoterapico ed un farmaco di sintesi, conseguente ad associazione.

Fattori che condizionano la comparsa di ADR (reazioni avverse da farmaco)

Relativi alla pianta:
• Variabilità principi attivi (botanica, coltivazione, raccolta…)
• Sostanze tossiche presenti (alcaloidi, aflatossine, etc.)
• Pesticidi, metalli, microbi
Relativi al prodotto:
• Presenza di pesticidi, metalli, microbi
• Sofisticazioni
• Tecnologia inadeguata
• Prodotti con numerose piante o irrazionali
Relativi all’attività del prodotto sul paziente:
• Allergie
• Effetti collaterali o tossici
• Interazioni farmacologiche
• Presenza di controindicazioni
• Uso durante gravidanza-allattamento

Definizioni
Effetto collaterale: qualsiasi effetto non intenzionale di un farmaco che insorga alle dosi normalmente
impiegate sull’uomo e che sia connesso alle proprietà del farmaco (es. secchezza delle fauci da
anticolinergici o sonnolenza da antistaminici anti H1). Sono reazioni di tipo A.

Reazione avversa ADR: era una risposta nociva e non intenzionale ad un farmaco che avviene a dosi
normalmente usate nell’uomo per la profilassi la diagnosi o la terapia di una malattia o per modificazione di
funzioni fisiologiche.
Ora si è data una nuova definizione: effetto nocivo e non voluto conseguente all’uso di un medicinale
- Conformemente alle indicazioni contenute nell’autorizzazione all’ammissione in commercio;
- Agli errori terapeutici
- Agli usi non conformi alle indicazioni contenute nell’autorizzazione all’ammissione in commercio,
incluso sovraddosaggio, uso improprio, abuso del medicinale
- Nonché associato all’esposizione per motivi professionali
(non è più la dose che causa reazione avversa)

ADR specifica: la reazione ha come unica causa un determinato PA e on avviene naturalmente o per altre
cause.
ADR aspecifica: la reazione oltre che provocata da uno specifico PA può avvenire naturalmente o essere
provocata da altre cause.

La quasi totalità delle ADR conosciute sono aspecifiche.

Le Reazioni Avverse si classificano:

a) Per nesso di causalità (certa, probabile, possibile, improbabile, sconosciuta o non
classificata/classificabile)
b) Per gravità
c) Per intensità (lieve, moderata, rilevante)
d) Per frequenza (molto frequente, rara...)
e) A seconda del momento di comparsa

108
f) Per tipo (Tipo A, B, C, D, E)

1. Nesso di causalità:
L’evento avverso raggruppa tutte le reazioni, mentre, la
reazione avversa si manifesta soltanto quando c’è un nesso
di causalità con il prodotto.

Evento avverso (AE)

Per evento avverso si intende qualsiasi evento medico indesiderato che si può presentare durante un
trattamento, ma che non ha necessariamente una relazione causale con esso.

L’AE rappresenta il punto di partenza per indagare l’eventuale esistenza di una relazione causa-effetto tra un
farmaco ed un evento dannoso.

Per determinare se vi sia o meno un reale rapporto causale tra il trattamento e l’evento occorrono altre
indigni. Quindi, fintanto che non sia stato chiarito se esiste oppure no questo rapporto causa effetto si usa il
termine evento avverso che dunque si riferisce ad una mera correlazione.
Le ulteriori indagini necessarie per investigare l’esistenza di un eventuale rapporto causale consistono
principalmente in studi “challange” e “re-challange” che sono in grado di stabilire anche la forza di questa
relazione causa-effetto.

Il rapporto di causalità sarà presente e ritenuto “altamente probabile” (o certo) se la sospensione del
trattamento (“dechallenge”) seguita, quando eticamente possibile, dalla risomministrazione (“re-
challenge), determina la scomparsa e la ricomparsa, rispettivamente, dell’AE. Questo non è sempre
possibile, perché non possiamo compromettere le condizioni di salute di una persona solo per capire se c’è
un nesso di causalità.

Il rapporto di causalità sarà ancora presente, ma meno forte, e denotato come “probabile”, quando si è
potuta effettuare solo la sospensione del trattamento e a questa ha fatto seguito la scomparsa dell’effetto.
Questo perché molto spesso non si può risomministrare il farmaco, ma solamente sospendere il
trattamento e vedere se l’effetto scompare.

Quali sono i dati che ci possono far pensare a un nesso di causalità?

- Precedenti casi riportati in letteratura
- Scomparsa dell’ADR alla sospensione del farmaco
- Ricomparsa dell’ADR alla nuova somministrazione del farmaco
- Possibilità di ause alternative
- Presenza di un rapporto dose-risposta (se la reazione aumenta all’aumentare della dose)
- Relazione temporale
- Concentrazioni tossiche del farmaco

109
I fattori cronologici sono importanti nell’intervallo di comparsa dell’evento avverso: è la finestra temporale
tra la dose critica (es. prima dose, ultima dose, overdose, dose inappropriata) e la prima manifestazione
dell’evento. Deve essere compatibile con la cinetica del farmaco.

Algoritmo di Naranjo
Oltre all’impiego delle procedure di dechallenge e re-challenge (che non sempre sono possibili) sono stati
proposti altri approcci più articolati per determinare in maniera accurata la “forza” del rapporto di causalità.

Uno di questi metodi, coto con il nome di algoritmo di Naranjo, si basa su una serie di 10 domande
(questionario).
Ad ogni possibile risposta viene assegnato un punteggio prefissato che poi, quando sommato, contribuisce a
generare un valore cumulativo che sarà utilizzato per stabilire qual è la “forza” del grado di causalità entro i
quattro ambiti previsti:
altamente probabile (o certo)
probabile
possibile
dubbia.

Criteri di Karch
Altra metodologia. Prende in considerazione 5 punti:
1. Reazione avversa già nota
2. Intervallo temporale ragionevole
3. Scomparsa della reazione avversa in seguito a sospensione o a riduzione di dosaggio del farmaco

110
 4. Nessuna possibile spiegazione alternativa
5. Ricomparsa dei sintomi alla risomministrazione, oppure dimostrazione di livelli tossici del farmaco o
di anomalie metaboliche farmaco-indotte

Quindi, in relazione al nesso di causalità, una reazione aversa viene classificata come:
• Certa
• Probabile
• Possibile
• Improbabile
• Sconosciuta (non classificata o non classificabile)
Se il nesso di causalità è certo o probabile allora si può parlare di reazione avversa; nel caso in cui il nesso
sia possibile, improbabile o sconosciuta si parla di evento avverso.

b) Per gravità
Definizione di gravità: qualsiasi reazione che provoca la morte di un individuo, ne mette in pericolo la vita,
ne richiede o prolunga l’ospedalizzazione, provoca disabilità o incapacità persistente o significativa,
comporta una anomalia congenita o un difetto alla nascita.

In base alla severità del danno:

➢ Lievi (fastidiose, ma non richiedono variazioni di terapia)
➢ Moderate (richiedono variazioni, trattamenti aggiuntivi o ricovero)
➢ Gravi (disabilitanti, che mettono in pericolo di vita)

c) Per intensità
Si intende il grado di manifestazione clinica di una reazione che può essere:

111
Questa quantificazione non sempre coincide con la gravità, es. un prurito rilevante può non essere una
reazione avversa grave preoccupa il medico ma non necessariamente il paziente (es. leucopenia), una
reazione di intensità rilevante preoccupa il paziente ma non necessariamente il medico (es. prurito).

d) Per frequenza

È il modo in cui si riportano le reazioni avverse negli studi clinici.

e) A seconda del momento di comparsa rispetto al trattamento:

➢ Acute (entro 60 min)
➢ Sub-acute (da 1 a 24 ore)
➢ Latenti (o tardive) dopo 2 giorni o più

f) Per tipo (Tipo A, B, C, D, E)

Tipo A (la più comune)

Prevedibili e dose-dipendenti: rappresentano un’esagerazione degli effetti terapeutici del trattamento.
▪ Relativamente frequente (1/100)
▪ Può essere di diversa gravità
▪ Può essere studiata sperimentalmente

Può essere di difficile identificazione perché:

-coincide con disturbi relativamente frequenti;
-rara a basse dosi
-può verificarsi in situazioni particolari (segnalazione spontanea)
-può essere dovuta ad interazioni

Sono individuate soprattutto tramite studi clinici. Sono la maggioranza delle ADR e sono quelle
principalmente coinvolte nell’interazione tra principi attivi.

Tipo B
Reazioni idiosincrasiche, reazioni allergiche.
▪ Poco frequente, non prevedibile
▪ Predisposizione individuale
▪ Dose-indipendente
▪ È specifica e in molti casi seria, ma reversibile
L’individuazione avviene soprattutto tramite segnalazione spontanea (non sono prevedibili).

112
 non si ha nessuna reazione al
prima contatto con l’antigene,
ce ne vogliono 1-2 e sono
riconducibili ad un elevata
produzione di istamina e hanno
una sintomatologia specifica e
definita.

Si manifesta già alla prima somministrazione e il

tipo di reazione dipende dal PA che viene
somministrato.

Sono determinate a livello genetico.

113
Esempio di idiosincrasia: favismo
3,4 diidrossi fenil alanina amminoacido contenuta nella fava (Vica faba).
Può essere fatale in soggetti portatori di un’anomalia genetica (favismo), molto diffusa nelle regioni
mediterranee.
Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (catalizza una reazione in cui si produce GSH): enzima inibito dall’AA
presente nella fava.

Nelle persone affette

da favismo è carente
l’enzima (inibito
dall’assunzione delle
fave), che catalizza la
reazione del Glu-6 P in
6-fosfato-
Gluconolattone.
Il NADPH che si
dovrebbe produrre a
seguito di questa
reazione è
fondamentale per la
riduzione del
glutatione ossidato
(GSSG) in glutatione
ridotto (2GSH).
È importante per i globuli rossi: in carenza di GSH l’emoglobina diventa suscettibile a stress ossidativi, con
conseguente ossidazione dei gruppi SH di cisteina, distacco dell’EME e precipitazione di globina, con
formazione di corpi di Heinz.

114
I corpi di Heinz rendono rigido il globulo rosso che resta intrappolato nei capillari della milza ed emolizza.
Nei casi più gravi emolisi intravascolare anche extra-splenica.
Idiosincrasia perché è una reazione inaspettata, difficile da prevedere.

Tempo di comparsa nelle razioni allergiche:

Terapia per la reazione allergica (standard):

Reazioni anafilattoidi
Sono reazioni che hanno delle caratteristiche intermedie tra la reazione allergica e quella idiosincrasica.
Riguardano alcuni farmaci.
Portano alla liberazione di istamina, ma non tramite meccanismo immunologico, non c’è coinvolgimento del
sistema immunitario.

115
La sindrome sgombroide:
è una patologia simil-allergica dovuta all’ingestione di pesce alterato (“mal di sushi”).
È il secondo tipo più frequente di intossicazione da prodotti ittici, secondo solo alla ciguatera.
Viene spesso confusa con allergia alimentare e deriva dal consumo di specie ittiche a carne rossa,
appartenenti alle famiglie Scombridae (tonno, sgombro ecc), Clupeidae (sardine, aringhe, acciughe) e specie
ittiche imparentate con queste, refrigerate o conservate in modo non adeguato dopo la pesca.
L’istidina è presenta in natura in molti prodotti di pesce e a temperature superiori ai 16°C a contatto con
l’aria viene convertita in istamina ad opera dell’istidina decarbossilasi da vari batteri.

Altri cibi ricchi di istamina: formaggio tipo Emmental, Camembert, Parmigiano, insaccati, crauti, spinaci,
melanzane, pomodoro, vino rosso, alcol, birra fermentata, champagne.

Alimenti in grado di aumentare il rilascio di istamina: papaya, fragole, agrumi, crostacei, liquirizia, spezie,
ananas, albume d’uovo, frutta secca, spinaci, cioccolato, mirtillo rosso.

Alimenti in grado di inibire l’attività della DAO- diamminossidasi, enzima che degrada l’istamina-: alcol, in
particolare il vino rosso.

Fotoallergia
È una risposta immunologica (coinvolge il sistema immunitario) che avviene quando una sostanza
fotosensibilizzante, detta fotoallergene o fotoaptene, assorbe l’energia radiante e induce una risposta
immune con produzione di anticorpi o formazioni di T linfociti sensibilizzanti.
A successivi esposizioni alla luce compare la risposta allergica, la più comune è di tipo eczematosa con
eritema, prurito ed essudazione ma vi sono altre forme cliniche come semplice vasodilatazione e edema.

Fototossicità
È una reazione NON immunologica provocata da una sostanza chimica che interagisce con l’energia della
luce di appropriata lunghezza d’onda.
La più comune reazione di fototossicità è l’accentuazione esagerata di eritema accompagnata da prurito non
correlata al tempo di esposizione. Alcune reazioni sono immediate altre possono essere ritardate di ore o di
116
giorni. Mentre le reazioni fotoallergiche possono interessare tutta la cute, ad esempio l’orticaria solare, le
reazioni fototossiche sono confinate nella sede di fotoesposizione, in alcuni casi queste reazioni persistono
per mesi o anni anche dopo la cessazione dell’esposizione alla sostanza chimica o alle radiazioni solari
(sulfamidici e tetracicline).

FINE REAZIONI DI TIPO B (reazioni allergiche e idiosincrasiche)

Tipo C
Trattamenti cronici
Sono associate a uso a lungo termine del farmaco e possono richiedere un accumulo di dose
▪ Meccanismo d’azione poco chiaro
▪ Avviene dopo trattamenti cronici
▪ Specifica e spesso grave
Difficoltà nell’individuazione perché:
▪ inaspettata,
▪ può non essere riproducibile sperimentalmente
▪ conoscenze farmacologiche inadeguate
L’individuazione avviene soprattutto tramite studi caso-controllo e studi con follow-up lunghi

Tipo D
Effetti ritardati (es. cancerogeni, teratogeni)
▪ Grave ed irreversibile
▪ Avviene dopo un periodo di induzione inaspettata, imprevedibile

Tipo E
Effetti fine trattamento
Si verificano per la sospensione del principio attivo, qualora la sospensione sia brusca e dopo un lungo
tempo di assunzione
▪ Poco frequente
▪ Può essere seria ma reversibile
▪ Dose-dipendente Inaspettata, specifica
L’individuazione avviene soprattutto tramite segnalazione spontanea

Definizione reazione avversa “inattesa”: è quella la cui natura e severità non è riportate nel foglietto
illustrativo o nella scheda tecnica del farmaco o che sia inattesa rispetto alle caratteristiche del farmaco
stesso. Le reazioni inattese rappresentano la tipologia di ADR più importanti da comunicare ai Centri di
Farmacovigilanza per l’individuazione di precoci segnali d’allarme.

117
FITOFARMACOVIGILANZA
Obiettivi:

• Individuare nuove reazioni avversa da fitoterapici

• Individuare reazioni avverse che possono manifestarsi in occasione di associazioni farmacologiche
fitoterapico/farmaco tradizionale
• Individuare reazioni avverse che possono manifestarsi per l’influenza di fattori relativi al paziente
(età, stato fisiopatologico, caratteristiche genetiche)
• Migliorare le informazione sulle reazioni avverse già note
• Valutare i vantaggi di un fitoterapico rispetto ad una terapia farmacologica convenzionale ben nota
• Facilitare la diffusione delle informazioni acquisite per rendere più corretta e sicura la pratica
terapeutica

Qualora si abbia un evento clinico indesiderato/avverso e si possa collegare ad un trattamento

farmacologico assunto ci può essere sospetto di una reazione avversa.

Se ADR è sospetta allora è necessario effettuare la segnalazione.

Elenco di ragioni che ci possono far sospettare di essere in presenza di ADR:

Monitorare per prevenire: FITOSORVEGLIANZA

Il sempre maggior numero di persone che fa uso dei prodotti di derivazione naturale e la sempre più diffusa
pubblicità (non contrapposta ad una corretta comunicazione sui potenziali rischi) pone evidentemente
l’esigenza di un attento monitoraggio del loro livello di attività nelle varie fasce di popolazione per rilevare
eventuali effetti inattesi o reazioni avverse.
Per contribuire alla conoscenza dei potenziali rischi associati all’uso dei prodotti naturali è attivo dal 2002 un
sistema di sorveglianza delle reazioni avverse a questi prodotti. Poiché, infatti, le reazioni avverse da
118
prodotti di origine naturale non possono essere inserite nel sistema nazionale di farmacovigilanza gestito
dall’Agenzia italiana del farmaco (Aifa), l’Istituto superiore di sanità (Iss) in accordo con l’Aifa e il ministero
della Salute, ha organizzato e coordina un sistema di raccolta delle segnalazioni spontanee di sospette
reazioni avverse a questi prodotti.
Non è necessario che chi segnala sia assolutamente certo che l’evento avverso sia riconducibile al prodotto
a base di piante (non deve essere un esperto a fare la segnalazione), poiché in fitosorveglianza, come in
farmacovigilanza, si lavora nell’incertezza di un rischio sulla base delle maggiori conoscenze possibili. Gli
eventi avversi vengono poi valutati da un gruppo di esperti.

La scheda, molto simile a quella utilizzata per la segnalazione spontanea delle reazioni avverse da farmaci, è
scaricabile in formato PDF.

Es. di scheda di segnalazione spontanea: iniziali del nome, informazioni di base; data di insorgenza della
reazione, descrizione della reazione e un’eventuale diagnosi se presenti. La reazione è migliorata con la
sospensione? Prima cosa da fare è sospendere la terapia. Eventuali esami di laboratorio, esito, commento
del soggetto: non è tenuto a dire una cosa certa. Informazioni del prodotto sospetto.

Chi segnala, segnala un ADR ma non è suo compito determinare se è presente un nesso di causalità o meno.

119
Segnalazione spontanea
Vantaggi:
• È un sistema semplice, rapido ed economico
• Può riguardare tutti i farmaci in commercio
• Può coinvolgere tutti i pazienti
• Non interferisce con la pratica prescrittiva
• Fornisce allarme precoce su reazioni non note

Limiti:
• È difficile stabilire una relazione causale tra farmaci ed evento
• È difficile individuare reazioni ritardate
• Non fornisce direttamente dati di incidenza
• Determina una sottostima delle reazioni a causa della sottosegnalazione

Dall’inizio della sorveglianza numerosi sono stati i casi di epatopatie, alcuni i casi di crisi asmatiche, reazioni
allergiche e problemi gastrointestinali (dolori addominali, diarrea, ecc.).

Le segnalazioni sono ancora troppo poche e la maggior parte delle volte sono incomplete.

L’uso di questi prodotti è associato ad un rischio di reazioni avverse spesso non percepito dai pazienti, sia
per gravità sia per probabilità del rischio stesso.

Lezione 10

Tale tabella rende l’idea di

quanto sia importante la scheda
di segnalazione.

Nonostante l’importanza, l’entità delle segnalazioni è molto bassa: studio pilota presente nelle slide lo
dimostra.
Quali sono i fattori che ostacolano la segnalazione? Dobbiamo ricordarci che le segnalazioni non
necessitano di un rapporto di causalità dimostrato, non spetta a chi segnala.

120
Entriamo nel merito delle reazioni avverse più diffuse che possono derivare sia da un effetto del prodotto
sia da interazioni con farmaci assunti in contemporanea (non è un elenco esaustivo):
• danni a livello circolatorio: biancospino, favorisce l’azione dei bradicarizzanti dei β-bloccanti (farmaci),
riducendo la frequenza cardiaca favorendo così l’insorgere di disturbi di conduzione dell’impulso elettrico.
Aglio ginkgo o ginseng interferiscono con anticoagulanti orali, facilitando l’insorgenza di emorragie.
Liquirizia ha provocato diversi casi di aritmia cardiaca in seguito ad uno prolungato o di elevata quantità
(la dose fa la differenza).

• danni a livello cutaneo: pelle è uno dei più comuni target di reazioni avverse. Es. dermatite da contatto,
alterazione che avviene per contatto diretto con PA non avviene se assunto per via orale (es. pasta
cutanea che conteneva aglio fresco). Fotodermatite: eruzione cutanea che si manifesta in seguito al
contatto con sostanze fotosensibilizzanti presenti nelle piante e successiva esposizione ai raggi UV, es.
tutte le piante che presentano furanocumarine (iperico), furanocumarine sono fotosensibilizzanti.
Dermatite allergica da contatto: coinvolgimento del sistema immunitario, ha bisogno di un primo contatto
con l’antigene es. gel d’aloe, essenza di Niaouli.
È opportuno che chi effettua segnalazioni non ricorra a termini specifici che indicano una precisa diagnosi,
ma effettui una segnalazione che contenga le seguenti informazione:
⮚ Distribuzione della lesione;
⮚ Numero di lesioni;
⮚ Tipo di lesione
⮚ Presenza di secreto,
⮚ Durata delle lesioni
⮚ Sintomi/segni associati (febbre, prurito, etc.)
La segnalazione dovrebbe essere accompagnata da documentazione fotografica.

• sintomi gastrointestinali, assolutamente aspecifici. È difficile a meno che non siano eclatanti che siano
oggetto di segnalazione.

• danni al sistema nervoso: molto soggettivi, con diversi tipi di danni. . I fitoterapici che potenzialmente
possono indurre queste reazioni avverse in genere contengono ginseng, eucalipto, passiflora, liquirizia,
121
 iperico. Queste reazioni possono manifestarsi, oltre che per i componenti chimici del prodotto anche per
la scarsa qualità, ad esempio per la contaminazione con metalli pesanti, adulteranti (presenza di farmaci
convenzionali) e sostituzioni arbitrarie di vegetali con altro.

• danni a livello epatico: essendo l’organo deputato al metabolismo, il danno epatico è una complicazione
che può interessare qualsiasi farmaco, naturale o di sintesi. Es. kava, non si comprende se tutto è
riconducibile al PA della kava o ad un errato uso.
Disturbi epatici rilevati anche con la senna: lassativo antrachinonico con azione drastica, per periodi
brevi, se assenti alterazioni del tratto gastrointestinale. Nella maggior parte dei casi uso improprio del
PA.

Esempio studio che descrive tre casi di ginecomastia in maschi in età prebuberale (4, 7 e 10 anni) che
usavano saponi, shampoo e lozioni alla lavanda e a base di tea tree oil.

Ginecomastia: ingrossamento delle ghiandole del seno in 3 bambini con meno di 10 anni. Molto strano per
l’età e per il sesso. Si è subito escluso uno squilibrio ormonale mediante analisi del sangue. Quindi era
imputabile ad una causa esterna, che aveva determinato la crescita delle ghiandole mammarie.
Questi bambini facevano uso di saponi shampoo e lozioni a base di olio di lavanda e tea tree oil. Sono loro i
responsabili?

Prendo in considerazione la crescita - incremento medio rispetto al controllo.

Si lavora su cellule di ghiandola mammaria (studio in vitro) quindi cellule tumorali e vengono usati come
controllo positivo estrogeni (perché il cancro alla mammella è positivo agli estrogeni); in effetti l’estradiolo
ha determinato una crescita rispetto al controllo. Per essere sicuri che sia un meccanismo recettore
dipendente viene usato un antagonista dell’estradiolo (quadratino vuoto). L’antagonista lo inibisce
totalmente.
Dopodiché si è andato ad aggiungere in concentrazioni crescenti l’olio di lavanda e il tea tree oil. Otteniamo
i pallini scuri. A determinate condizioni, la lavanda e il tea tree oil presentano effetto estrogenico, cioè sono
in grado di andare a stimolare il recettore per gli estrogeni; hanno un effetto agonista.
Si è verificato anche se avessero un effetto antiandrogenico.

122
Esempio Studio di meta analisi per valutare gli effetti collaterali dei fitoestrogeni (estrogeni utilizzati per
la terapia ormonale sostitutiva, per rimpiazzare estrogeni endogeni) che vengono messi a confronto con
un placebo o con nessun trattamento in trial controllati e randomizzati.

Lo studio ha evidenziato il fatto che gli integratori fitoestrogeni hanno un profilo di sicurezza con tassi
moderatamente elevati di effetti collaterali gastrointestinali. Negli studi analizzati i tassi di emorragia
vaginale, iperplasia endometriale, cancro all’endometrio e al seno non erano significativamente aumentati
tra gli utilizzatori.

Rischi di epatotossiticità da Kava e FDA (altro studio)

Nel 2002 l’FDA ha allertato i consumatori sul rischio di grave epatotossicità associata agli integratori
contenenti Kava-kava.
L’uso di Kava-kava era stato associato allo sviluppo di epatotossicità in rari casi. Esistono comunque solide
evidenze che tale reazione avversa possa essere provocata sia dalla bevanda tradizionale che dai prodotti
presenti sul mercato occidentale contenenti flavokavaina B, un componente della pianta.
Uno studio sui fattori patogenetici nell’epatotossicità da Kava-kava ha rivelato un uso inappropriato delle
parti della piante e delle sa varietà. I prodotti con Kava-kava sono stati banditi dal mercato di diversi stati
inclusi alcuni Paesi europei.

Freddo Baby e emorragia gastrica

Caso di un bambino di 4 anni con raffreddore e febbre. Il pediatra gli prescrive uno sciroppo con varie erbe.
Dopo una serie di assunzioni il bambino presenta melena ovvero presenza di sangue nelle feci, ma la
mamma attribuisce il colore scuro delle feci al colore dello sciroppo.
Il bambino sta male, inizia a vomitare sangue —> erosioni multiple a livello dell’esofago e del duodeno.
Tramite analisi di laboratorio si arriva alla conclusione che lo sciroppo gli ha fatto male. Perché? Presenza di
salice e spirea da cui si estrae la salicina, molto gastrolesiva che ha peggiorato una situazione pre-esistente
di esofagite da reflusso gastrico, che non era stata diagnosticata prima in quanto il bambino era
asintomatico.

Serie di slide in cui sono state rese note delle segnalazioni spontanee di reazioni avverse emerse in seguito
ad assunzione di droghe vegetali.
• ginkgo: antiaggregante piastrinico reazioni avverse con antiaggreganti e anticoagulanti, ma sono molo
più comuni le reazioni allergiche o i casi di intolleranza; base allergica (predisposizione individuale).
Problemi quando estratti non sono depurati, quindi impurezze
• lassativi antrachinoni (senna, aloe, cascara, frangula, rabarbaro): azione drastica sulla parete
gastrointestinale; casi di dolori addominali etc. —> uso improprio, da usare per periodi brevi non in
maniera cronica
• arancio amaro: caso di tachicardia e ipertensione. Ci stupisce? No, perché è presente sinefrina, amina
simpaticomimetica (problemi con i prodotti dimagranti, in quanto hanno un alto contenuto di sinefrina).
• propoli: potere allergizzante noto, attenzione a somministrare a popolazione pediatrica (soggetti a
allergie)
• preparati a base di iperico/passiflora/melissa assunto dalla mamma: il lattante ha avuto una crisi
convulsiva —> sospetto, non individuato ancora il nesso di causalità
• gomma guggul: rabdomiolisi, reazione importante a livello muscolare legato di solito a statine;
evidenziato con la gomma guggul
123
• liquirizia: rabdomiolisi, reazione non immediatamente riconducibile alla liquirizia.
• silimarina: componente del cardo mariano usato per rigenerare cell. del fegato; episodio di ipertensione
arteriosa

Esempio Studio che valuta le reazioni avverse (mialgia, rabdomiolisi, reazioni gastrointestinali, danni al
fegato...) dei preparati a base di riso rosso fermentato:
• riportati casi in Italia
• profilo di rischio simile a quello delle statine.
Diffusione di case report per sensibilizzare l’opinione pubblica.

PRINCIPI DI TOSSICOLOGIA

Ogni sostanza in quantità eccessiva è tossica.

La dose è la base della tossicologia.
Nulla è così buona che in eccesso non possa nuocere (Ovidio)
Solo la giusta dose differenzia il veleno dal rimedio (Paracelso)

La Tossicologia è una scienza multidisciplinare che studia gli effetti nocivi provocati da sostanze
somministrate incidentalmente o volutamente ad un organismo vivente.
Multidisciplinare perché la figura del tossicologo è complessa, deve conoscere molti aspetti. Di fatto è un
insieme di scienze (fisiologia, statistica, chimica, epidemiologia, genetica, fisica, biologia, immunologia,
farmacologia).
Ci sono diversi tipi di tossicologia, tutti riferibili ad un aspetto specifico in cui ha un ruolo (bellica,
ambientale, alimentare, sperimentale, clinica, forense, da abuso).

Aree della tossicologia che principalmente concorrono alla

valutazione del rischio
• tossicologia descrittiva
• tossicologia dei meccanismi
• tossicologia normativa

124
Valutazione del rischio: ogni volta che siamo di fronte ad una sostanza possibilmente tossica bisogna fare
una valutazione in merito al rischio. Cosa permette di fare tale valutazione?
L’integrazione fra t. dei meccanismi, t. descrittiva e t. normativa.
 Tossicologia descrittiva: analizza in vitro e in vivo i possibili effetti tossici con test appostiti

 Tossicologia dei meccanismi: azione in vitro e vivo per studiare invece i meccanismi molecolari con
cui l’effetto tossico può manifestarsi. Insieme di reazioni biochimiche e fisiologiche

 Tossicologia normativa: si basa sulle norme vigenti in ambito tossicologico

Quali sono gli agenti tossici?

Per antropogenica si definisce ogni effetto, processo, oggetto o materiale derivato dalle attività umane in
opposizione a quelle che accadono in ambiente naturale senza influenza umana. Questo termine è molto
spesso utilizzato nel contesto ambientale per indicare la fonte dei residui chimici o biologici che si
producono come sottoprodotti delle attività umane.

Un altro modo per classificare la tossicologia è analizzarla su 3 livelli:

• I: CLINICA implica una esposizione ad una dose elevata di agente tossico ma per breve tempo, potrebbe
essere su base volontaria o involontaria
• II: INDUSTRIALE esposizione media (per via del proprio impiego professionale)
• III: SPERIMENTALE, dose bassa ma per lunghissimo tempo (cronica)

Differenti classi di agenti chimici cui siamo sottoposti come esseri umani (sono tantissimi):

125
LA TOSSICITÀ
La TOSSICITÀ è in funzione della dose/concentrazione.

Ci sono dei casi in cui non è vero: ci sono delle sostanze che sono così tossiche che in misura minima
possono dare tossicità.
Da cosa è generato un effetto tossico?
 sostanza tossica all’origine o che può diventarlo
La tossicità dipende dalla tossicocinetica e dalla tossicodinamica (interazione con recettori, enzimi, target
per gli agenti tossici).

Tossicocinetica
ADME, reazioni a cui viene esposta la sostanza tossica dopo che l’abbiamo assunta. Ciò significa che può
essere che assorbiamo una sostanza tossica ma la eliminiamo così in fretta che non esplica il suo effetto
tossico.

Via inalatoria: noi respiriamo delle particelle, anche possibili tossiche, che si andranno a depositare in varie
zone dell’apparato respiratorio, in funzione delle dimensioni che hanno (le più piccole arrivano fino agli
alveoli, sono pericolose non solo perché penetrano più in profondità ma perché più sono piccole più
aumenta la loro quantità per ml di aria).

Dopo l’assorbimento e la distribuzione andrà incontro alla metabolizzazione che potrà generare dei
composti inattivi o dare origine a dei prodotti attivi o anche tossici, che arriveranno al bersaglio.

126
Tossicodinamica

Tossicità è in funzione della concentrazione,

del numero dei bersagli e dell’affinità
recettoriale.

Il bersaglio può essere di qualsiasi tipo ma di solito sono gli acidi nucleici oppure i gruppi -SH delle proteine
degli enzimi (non credo sia davvero così).
Tossicità di A e di C sono uguali o diverse?

▪ tossicità massima è uguale tra A e C perché raggiungono lo stesso livello ma C è più potente perché
richiede una dose minore.
▪ tra C e D: inizialmente più tossico C poi però diventa più tossico D. E’ più pericoloso C o D? D in
quanto più ripido.

Proporzionalità diretta tra la dose che

assumo e la dose che raggiunge il bersaglio.

127
La risposta all’agente tossico può essere influenzata da:

Sostanze con attività tossica importante sia dal punto di vista sistemico, sia del semplice contatto:
• acidi forti (es. cloridrico, fluoridrico, nitrico, solforico ): necrosi coagulativa per disidratazione a
livello cutaneo

• basi forti (ammoniaca, idrossido di sodio, etc.): necrosi coagulativa per saponificazione dei grassi
• agenti ossidanti (perossidi, ipocloriti, permanganato di potassio )

Parlando dell’ HCl e NaOH:

Bioaccumulo

È più tossico agente lipofilo o idrofilo? Lipofilo perché si accumula sui tessuti adiposi.
Se assumo un agente tossico lipofilo cosa succede?
Ogni agente tossico viene assorbito, aumenterà concentrazione
plasmatica e poi scenderà.
Se il tossico è altamente lipofilo e le somministrazioni sono vicine, come
in questo caso, posso avere accumulo. Frequenza tale per cui non posso
eliminare l’agente. Se potessi limarlo tutto prima della seconda
somministrazione non avrei tossicità. Ma in questo caso ho un fenomeno
di accumulo.

128
 Sono le 3 vie principali, le vie
parenterali sono possibili ma
è più difficile.

L’esito dell’esposizione è
condizionata da due fattori:
• durata: tipologie in cui
diversificato l’effetto tossico.
• frequenza: esprime
intervallo temporale tra una
somministrazione e l’altra.

Caratterizzare l’effetto tossico

L’effetto tossico può essere caratterizzato come:
Locale (rimane confinato all’area di contatto) o sistemico (se riguarda tutto l’organismo; le manifestazioni
possono riguardare diverse aree). La maggior parte delle sostanze tossiche —> effetto sistemico, riguarderà
principalmente alcuni organi (cd bersaglio). L’organo in cui manifesto la tossicità non è detto che sia quello
in cui il tossico ha raggiunto la maggiore concentrazione.

Reversibile e irreversibile. Da cosa dipende la reversibilità? Dipende dalla rigenerazione tissutale, quanto
le cellule colpite sono in grado di rigenerarsi. Un danno al fegato sarà uguale o diversa al SNC? Diversa. A
livello del fegato abbiamo una capacità di rigenerazione elevata, mentre a livello del SNC l’effetto tossico
sarà irreversibile.

Selettivo, mirata (es. antibiotici: li assumiamo affinché siano tossici nei confronti dei batteri. Tossicità in
funzione della specie; sarebbe il grande desiderio degli antitumorali; pesticidi: tossicità selettiva nei
confronti degli insetti anche se pure per l’uomo non sono un toccasana) e non selettivo.

Tossicità e tempo di esposizione

Tossicità —> effetti definiti in relazione al tempo di esposizione (tempo-dipendenza)
• Effetto acuto: si manifesta subito.
• Effetto cronico: duraturo, irreversibile, frequenza di esposizione è alta.
• Effetto ritardato: es cancerogeni, estremamente tossici ma la tossicità non insorge
immediatamente, può insorgere dopo decine di anni.

Quali sono i sintomi di una tossicità acuta?

129
Variabilità della risposta
Variabilità nella risposta ad un agente tossico:

Ci sono fattori diversi che danno effetti tossici che agiscono su fattori del metabolismo o farmacodinamici.
Es. specie: differenze tra uomo e ratto (peso, superficie, consumo di cibo)

CURVE DOSE-RISPOSTA QUANTALI

Abbiamo la possibilità di valutare un effetto tossico in relazione alla sua distribuzione nella popolazione.
Mettono in relazioni la frequenza con cui si manifesta l’evento e la dose —> curva gaussiana (ha il compito
di rappresentare andamento di una popolazione generale).

In questo caso andiamo a rappresentare le reazioni tossiche di una popolazioni che assumono dose
crescenti: gli individui che manifestano reazioni tossiche a basse dosi sono individui sensibili; gli individui
che manifestano reazioni tossiche solo ad alte dosi sono individui resistenti.

Possiamo anche scegliere di rappresentare la popolazione generale analizzando il numero di individui e

l’evento tossico in relazione ad un’unica dose. Anche in questo caso la distribuzione sarà sempre gaussiana,
la maggior parte sarà nella parte centrale ma alla stessa dose avremo una risposta piccola/lieve negli
individui resistenti o più forte/estrema negli individui sensibili (guardare grafico sotto).

130
 Esistono differenze di suscettibilità tra individui sottoposti
alla medesima sostanza.
Qui si parla di risposta alla stessa unica dose.

Concetto della DOSE-SOGLIA: un effetto tossico si scatenerà solo quando l’agente tossico arriverà al
bersaglio ad una determinata concentrazione, che deve essere adeguata e il tempo deve essere sufficiente.

Al di sotto di questa dose non avremo l’evento tossico. Dose minima a cui avremo l’effetto tossico.
Permette di poter calcolare le dosi di ciascuna sostanza per cui avremo un effetto tossico.

Eccezioni: la dose soglia non c’è per tutte le sostante, ad esempio non c’è per i cancerogeni, basta una
singola molecola per avere l’effetto tossico.

Indipendentemente dal tipo di risposta tossica che si sta valutando la relazione che lega il grado della
risposta avversa alla quantità di sostanza somministrata assume un andamento grafico riproducibile che
rappresenta uno dei concetti fondamentali della tossicologia: LA RELAZIONE DOSE-RISPOSTA.

Si ha la dose sull’asse delle ascisse e la % di risposta

sull’asse delle ordinate. Per risposta si intende
tossicità.
Dose dell’agente tossica e la % di risposta. Curva a
sigmoide. Che informazioni mi dà?
• dose soglia, dose al di sopra della quale si
scatena l’evento tossico (al di sotto no).
• Sostanza usata fino a 10 mg non mi dà
tossicità
Questa dose-soglia è propria di praticamente tutte le
sostanze, deriva dalla relazione dose-risposta.

Ci sono, però, delle sostanze per cui dire che all’aumentata concentrazione aumenta l’effetto tossico non è
esaustivo. Prima maggiore era la dose maggiore era la tossicità, ci sono sostanze per cui vale il contrario: i
nutrienti essenziali.

131
NUTRIENTI ESSENZIALI (vitamine e Sali minerali)
Per le sostanze necessarie per le normali funzioni fisiologiche e per la sopravvivenza (vitamine o elementi
essenziali in tracce) la forma della dose-risposta assume una tipica forma ad U.

Vitamine, sali minerali, in elevate quantità possono essere tossici, ma non hanno un grafico come quello
sopra. Perché?

Sono sostanze essenziali —> pertanto la tossicità è molto elevata se vi è una carenza. Nel caso precedente
se ho carenza è quasi meglio, non ho effetto tossico.
La curva assume la forma di una campana al contrario.
Evento tossico se sono in carenza rispetto allo stato fisiologico normale, se la dose aumenta si ridurrà
l’evento tossico fino a raggiungere il punto di equilibrio fisiologico (omeostasi). Ma se la dose aumenta
ancora avrò tossicità.

La curva è sigmoide per la maggior parte delle sostanze ma si differenzia se sono di fronte a nutrienti
essenziali.
La curva assume una forma diversa anche per altre sostanze, es. alcol etilico.

Ormesi (stimolazione)
Caratteristica di sostanze che a basse dosi possono dare effetti benefici mentre ad alte dosi reazioni avverse.
Questa particolare relazione dose-risposta è denominata ormesi (U tronca) che significa: stimolare, per
sottolineare la peculiare capacità stimolatoria che tali sostanze hanno a basse concentrazioni (es. alcol
etilico).

Partiamo dall’evento tossico che si manifesta dalla retta

in su, per dosi basse la sostanza fa bene. Sono sostanze
che in piccole quantità hanno effetti benefici.
es. alcol etilico (etanolo)
l’alcol viene idrolizzato a livello metabolico dall’alcol
deidrogenasi, che lo trasforma in acetaldeide.

Può portare addirittura alla morte ad alte dosi.

Il picco alcolemico si ha dopo 30-45 min
dall’assunzione. Dopo 4-6 ore l’alcolemia non è più
rilevabile.
A dose 0,1-0,2 g/l l’alcol, oltre a produrre arrossamento
cutaneo e dispersione di calore, ha un effetto positivo
sul profilo lipidico: va a diminuire le LDL andando ad aumentare le HDL (diminuzione del rischio di malattia
cardiaca coronarica). A questa dose abbiamo anche una riduzione del senso di affaticamento. Sopra questo
livello abbiamo solo effetti negativi, senza considerate i danni epatici (intossicazione cronica porta a cirrosi
epatica, malattia fatale). Oltre alla sua teratogenicità, effetto inibitorio dell’etanolo e dell’acetaldeide sulla
132
proliferazione cellulare embrionale che porta a un ritardi della crescita fetale, disfunzioni centrali,
microcefalia, anomalie morfologiche.

CARATTERIZZAZIONE DEGLI EFFETTI TOSSICI CON SOGLIA

Dose letale 50, dl50 (parametro che definisce la tossicità di una sostanza)
Quella dose nell’arco delle 24h provoca la morte del 50% degli animali sottoposti al trattamento. Si usa
come parametro per misurare la tossicità di una sostanza.
La sostanza sarà tanto più tossica quanto più bassa sarà la dose letale.
Prima avevamo visto la dose efficace 50, ovvero la dose necessaria per arrivare l 50% dell’effetto.

Come si fa a definire il valore della dl50?

Tramite studi di tossicità acuta.

Tossicità acuta
Test di tossicità acuta servono a capire non solo la DL50 ma anche ad identificare l’organo bersaglio e altre
manifestazioni cliniche di tossicità acuta e a stabilire la reversibilità della reazione tossica e fornire e
indicazioni sulle dosi da usare negli studi successivi.
Quindi oltre alla determinazione della DL50, le informazioni più importanti ricavabili da questi test
riguardano l’osservazione clinica e l’esame post-mortem effettuato sugli animali.

Per determinare con precisione la DL50 sono necessarie 3 dosi di somministrazione:

133
Risposte quantali (di popolazione)
Grafico con gaussiana e sigmoide con rettangoli, prende il nome di curva quantale e mette in relazione la
frequenza di distribuzione in maniera quantitativa, cumulativa.
Sigmoide, indica una
distribuzione cumulativa (fino
alla morte del 100% degli
animali).
Con la gaussiana, invece, si va ad indicare
la frequenza di distribuzione (per ogni
dose abbiamo la quantità di animali che
incontrano la morte), con l’individuazione
di una sottopopolazione, con individui
ipersensibili che muoiono a bassissime
dose e individui resistenti.
La sigmoide e la gaussiana danno
un’indicazione differente a uno stesso
fenomeno.
La DL50 è sempre rapportata su mg/kg di peso corporeo.

Viene anche mostrato come la DL50 varia in base

alla via di somministrazione (oltre che per il sesso
e ovviamente per il peso dell’animale).

INDICE TERAPEUTICO
Ogni sostanza usata per scopo terapeutico è identificata con un indice terapeutico.
Questo rapporto mette in relazione tra loro due parametri fondamentali: quello della dose efficace 50 e
quello della dose letale 50, per andare a stabilire un indice di sicurezza per l’assunzione di una sostanza da
parte dell’uomo.

Fornisce una misura della reale sicurezza del farmaco. Un IT alto è più sicuro di un IT basso?

134
Più è alto più il farmaco è sicuro, in quanto le due dosi sono molto diverse. Se è basso, significa che il
farmaco è difficile da maneggiare, per piccole variazioni di dosaggio otteniamo risposte importanti. Anche
usato alla DE50 basta poco affinché la dose efficace si trasformi in dose tossica.
Valutando l’indice terapeutico, però, rischiamo di esporre le code della gaussiana (individui ipersensibili e
individui resistenti) a dei rischi elevati o a una mancanza di efficacia.

Quindi si è deciso di sostituire l’IT con:

MARGINE DI SICUREZZA

DL1 sarà minore della DL50, mentre la DE99 sarà più grande della DE50.
Considero anche i soggetti più resistenti al farmaco ma anche i soggetti più sensibili alla tossicità del
farmaco, rispetto al 50%.
Intervallo di cui parliamo è sicuramente minore rispetto all’IT. Il margine di sicurezza sarà maggiore rispetto
a quello fornito dall’indice terapeutico.

Grafico di risposta alla dose:

mette in relazione la curva sigmoide dovuta
all’effetto terapeutico, e la curva sigmoide dovuta
all’effetto tossico.
Ho entrambe le curve/sigmoidi, per prima quella
dell’effetto terapeutico che è quello che si
raggiunge a concentrazioni inferiori, più avanti
quella dell’effetto tossico, con concentrazioni
maggiori.
Il margine di sicurezza ci fornisce un
fattore di sicurezza maggiore perché
non sottopongo individui sensibili a
tossicità elevata e individui resistenti
ad una mancanza di effetto (lo chiede
spesso agli esami).

TOSSICITÀ SUBCRONICA
Altri test vengono condotti sulla tossicità subcronica.
Studi importanti perché ci permettono di captare un altro parametro: NOAEL, cioè il più alto livello di dose
al quale non si osservano effetti avversi (importante ricordare che è la dose più alta).
135
Studi di tossicità subcronica sono studi a medio termine, eseguiti impiegando una vasta gamma di dosi
somministrate per almeno 1/3 della vita media dell’animale e generalmente questi studi vengono condotti
su animali di almeno 2 specie diverse.
Gli animali vengono osservati più volte al giorno e tutti i decessi devono essere registrati. Il livello di dose
più alto che non produce effetti avversi corrisponde al NOAEL.

Questi valori sono utilizzati per derivare la dose di riferimento giornaliera e la dose giornaliera accettabile
(ADI).

Curva dose-risposta “graduale” e costruzione sigmoide: descrive la

risposta di un individuo a diverse concentrazioni di una sostanza.
Abbiamo una soglia oltre la quale c’è un effetto tossico. Le dosi da A
a B non danno effetto tossico, la risposta tossica parte da B.
Il NOAEL è la più alta dose che non dà effetto tossico, quindi, è
appena prima di B. Importante ricordare che è la più alta.

Perché è rilevante?

CI permette di capire qual è questa concentrazione e quindi

ottenere l’ADI: dose giornaliera che un individuo può assumere
durante tutta la vita senza avere un evento tossico.
Per ottenere l’ADI, il NOAEL viene diviso per un fattore di sicurezza,
che in genere è 100, e quindi ottengo l’ADI che trasferisce all’uomo
le condizioni del NOAEL presenti sull’animale.

TOSSICITÀ CRONICA
Si tratta di studi effettuati con la stessa modalità degli studi subcronici con la differenza che i trattamenti si
estendono per un periodo di 6-24 mesi.
Questi studi vengono effettuati sia per valutare la tossicità cumulativa che il potenziale cancerogeno di una
sostanza.

Effetti non soglia

Nel caso della soglia abbiamo una sigmoide, per cui fino ad una certa dose non notiamo un effetto tossico.
Ci sono sostanze che non hanno effetto soglia.
Quali sono? I cancerogeni genotossici, cioè sostanze estremamente pericolose. Non si parla quindi di curva
sigmoide ma di una retta: infatti all’aumentare della dose ho un aumento della probabilità che l’evento si
verifichi, non un aumento della gravità.

136
Excursus sull’ormesi: alcol etilico (TUTTO Già VISTO MA RIPORTATO IN MANIERA APPROFONDITA)
ETANOLO: viene metabolizzato una volta assunto dal nostro organismo secondo 3 diverse vie:
1) alcol deidrogenasi: differenze tra uomo e donna, la donna ne contiene in qualità inferiore. Trasforma
l’etanolo in acetaldeide. Assimilato nel torrente
circolatorio e espulso per vie diverse 2) citocromo p
3) catalasi

Nel citoplasma degli epatociti

trasformazione dell’etanolo in acido acetico,
questo per individui che non presentano tossicità nei
confronti dell’alcol. In un individuo che assume dosi
elevate di alcol, microcosmi (CYP) e perossisomi
(catalasi) coinvolti. es. Un intossicazione da 80,90 mg
su 100 ml può aumentare la probabilità di scatenare
un incidente di 4 volte.

Qual è la sintomatologia di un’intossicazione alcolica acuta?

euforia, agitazione, etc.
sopore, coma, depressione respiratoria.
A livello cardiovascolare: inotropismo negativo, aritmie, vasodilatazione. L’ alcol ha quindi un azione
deprimente, agisce in maniera negativa sul potenziale d’azione.

Grafico che mette in relazione la concentrazione di alcol e il grado di diluizione: blu= alcol puro, verde= alcol
diluito, rossa e rosa= alcol assunto durante un pasto . Differenza quindi della concentrazione ematica in base
al fatto che io sia a stomaco vuoto o a stomaco pieno, a stomaco pieno l’effetto è ridotto.

Effetti farmacologici dell’etanolo

A livello cardio vascolare —> effetto di ormesi: a basse concentrazioni (0,1, 0,2 g/l ) riduzione della
pressione arteriosa, incremento dell’HDL ( colesterolo buono) , effetto positivo sul rischio cardio vascolare.
Sintomi: arrossamento cutaneo. Se invece la dose aumenta fino ad arrivare a 1, 1,5 g/l subentrano effetti
pericolosi: depressione cardiovascolare, fino ad arrivare al coma alcolico.

A livello muscolare nel sistema scheletrico: per basse concentrazioni —> riduzione del senso di
affaticamento; a alte concentrazioni —> dolori ai muscoli, riduzione della quantità del lavoro muscolare,
alterazioni elettromiografi che

137
A livello gastrointestinale: erosivo sulla mucosa gastrica ( effetto di irritazione gastrica )

Dispersione di calore, aumentata sudorazione che determinano una riduzione della temperatura corporea.

In un individuo in dipendenza da alcol: pancreatite, stipsi, diarrea

Fegato: (meccanismi informativi, non da sapere, che emergono quando la quantità di alcol assunta è
eccessiva), epatomegalia: ingrossamento del fegato in quanto accumulo di lipidi, con aumento di enzimi
epatici (transaminasi); Epatite alcolica acuta: fenomeno grave perché può portare a cirrosi epatica con esito
fatale.

Reni: assunzione cronica —> diuresi profusa, inibizione dell’ormone antidiuretico

Sistema nervoso centrale: per dosi basse è di nuovo un esempio di ormesi, mentre per dosi alte pericolo
fino ad arrivare a deficit cognitivi e coma etilico.

Teratogenicità dell’alcol: ritardo della crescita fetale, disfunzioni, microcefalia, anomalie morfologiche;
ipoglicemia della mamma che assume alcol

Criteri adottati per identificare una persona affetta da dipendenza da alcol: la persona assume una quantità
di alcol per avere effetti che lui ritiene benefici, ma se si priva della sostanza accusa sintomi negativi ( solo
informativi )
Terapie per trattamento della dipendenza ( solo informativo ) —> disulfiram: inibisce l’aldeide deidrogenasi
che metabolizza alcol in acetaldeide.

Perché si usa un farmaco che inibisce il metabolismo dell’alcol?

Meccanimo ad azione punitiva: il paziente che lo assume sa che se farà uso di alcol accuserà tutti i sintomi
tipici di un’assunzione elevata di alcol —> funge quindi da deterrente. Persona deve essere consapevole e
intenzionata a smettere altrimenti non prenderà il disulfiram.

138
VALUTAZIONE DEL RISCHIO

RISCHIO TOSSICOLOGICO

Parlando di sostanze tossiche parliamo di rischio tossico riferito a quelle sostanze.

Molte sostanze le conosciamo bene e sappiamo definire la tossicità ma nella maggior parte dei casi non
abbiamo informazioni sufficienti e ragioniamo quindi per rischio tossicologico.

Tabella: rischi reali e percepiti di effetti tossici connessi all’alimentazione

Il rischio spesso non è oggettivo (lo diventerà quando viene valutato da organismo competente ) ma
ciascuno di noi può percepire il rischio, in modo personale.
Per quanto concerne gli alimenti (nostro campo di intervento): i rischi reali sono —> 1) deficienze
nutrizionali, 2) intossicazione di origine batterica, 3) tossine di origine biologica, 4) residui di farmaci, 5)
additivi alimentari. Ma questi non sono i rischi percepiti dalla popolazione, si dà più attenzione al 4) e 5) e
non ai primi 3 che in realtà sono più pericolosi.

Siamo portati a vedere più come rischio qualcosa da cui non traiamo un immediato vantaggio: fitofarmaci e
additivi alimentari non si ritiene (opinione comune) che siano necessari ma pensiamo solo che
consumeremo un cibo contaminato —> il soggetto si sente di subire una condizione imposta da altri.

139
Se il soggetto trae un vantaggio da un’azione (fumatore che fuma sigarette) non percepisce il rischio (il
vantaggio è maggiore del rischio che corre), stessa cosa per la guida dei mezzi. Visione generale per rendere
l’idea di come il rischio dai soggetti è percepito in modo estremamente soggettivo.

ALIMENTI E SICUREZZA ALIMENTARE

La sicurezza alimentare rappresenta un interesse primario della popolazione, è essenziale un'attenzione a
tutti gli aspetti della catena alimentare, che vanno visti come un unico processo → legislazione alimentare
comunitaria, che ha attribuito la diretta responsabilità agli operatori del settore alimentare che devono
garantire ciò che commercializzano ed, inoltre, ha introdotto l’impiego di uno strumento preciso che è
l’analisi del rischio.

ANALISI DEL RISCHIO:

processo costituito da 3 fasi:
• valutazione del rischio (fase che arriva a delle conclusioni)
• gestione del rischio (una volta che ho dei risultati dal punto 1) devo capire se necessario prendere
provvedimenti legislativi/normativi per contrastare, minimizzare il rischio emerso dalla fase
valutativa )
• comunicazione del rischio

Le tre componenti dell’analisi del rischio sono tra loro interconnesse e forniscono una metodologia
sistematica per definire provvedimenti, o altri interventi a tutela della salute, in modo efficace,
proporzionato e mirato.

1. VALUTAZIONE DEL RISCHIO

Per rischio si intende la probabilità che un evento avverso si verifichi. Può essere espresso come un numero
probabilistico, una percentuale.
Mentre, la valutazione del rischio è l’analisi dei dati a disposizione riguardo l’argomento in questione, deve
essere svolta in maniera indipendente e trasparente. Si basa su 4 fasi:
FASE I: INDIVIDUAZIONE DEL PERICOLO dove per pericolo si intende la proprietà intrinseca di un
agente (fisico, chimico, o biologico) che comporta un potenziale di effetti avversi o nocivi. Es. di pericolo:
tossina, additivi, batteri, contaminanti. Per identificarlo sottopongo la sostanza che costituisce il nostro
pericolo a tutte le analisi, a delle sperimentazioni tossicologiche, tramite un protocollo tossicologico
(tossiciocinetica, tossicità acuta, tossicità a breve termine, genotossicità, tossicità dello sviluppo, tossicità
della riproduzione, tossicità a lungo termine e/o cancerogenesi). Ho così in mano gli strumenti per
identificare esattamente il pericolo intrinseco della sostanza.

FASE II: CARATTERIZZAZIONE DEL PERICOLO

Quanto il pericolo può essere dannoso per la popolazione? Utilizzo il NOAEL (dose più alta a cui non
corrisponde alcuna tossicità, risalgo all’ADI, dose giornaliera ammissibile).
Per passare dal NOAEL all’ADI:
Utilizzo un fattore di sicurezza (SF): permette di estrapolare i dati ottenuti sull’animale e applicarli sull’uomo.
Posso così usare sia il NOAEL acuto che quello cronico.
Dal NOAEL cronico —> ottengo ADI
Dal NOAEL acuto —> ottengo la dose acuta di riferimento, cioè la dose assumibile in un breve periodo di
tempo senza avere effetti tossici (ARfD)
SF: variabile che valuta la differenza interspecie, coefficiente che prevede l’utilizzo di 10 come fattore per
differenza interspecie e 10 per differenza intraspecie.

140
UL: massimo livello tollerabile riferito a un nutrienti essenziale (vitamine e sali minerali); si ricava come
l’ADI, cioè, divido il NOAEL per un fattore di sicurezza. Per UL non si intende la dose da assumere
quotidianamente ma la dose massima che può essere assunta (non è quella raccomandata, attenzione a
questo dettaglio).
TMDI: massima dose tollerabile a cui possiamo essere esposti giornalmente, sempre in relazione ai kg di
massa corporea (si riferisce ad un agente chimico correlato al consumo di alimenti).

Al massimo si divide per 100 ma si può

dividere ancora per 1000, quando si
lavora con bambini o quando i
protocolli strumentali adottati hanno
tempi ridotti quindi, per sicurezza,
aggiungo un fattore 10 e si divide per
mille.
Se invece ho già dati derivanti da studi
sull’uomo non ho bisogno di aggiungere
un fattore 10 e dividere per 100.

Si parla quindi di differenza interspecie e si utilizza un fattore 10 e di differenza intraspecie in cui si aggiunge
un altro fattore 10.

Studi sugli animali

fattore interspecie: si passa dall’animale all’uomo,
dividendo per un fattore 10, se voglio informazioni
su una popolazione sensibile, ad es. bambini, ho
bisogno di un altro fattore, il fattore intraspecie,
aggiungo un altro fattore 10.
Si parla quindi di differenza interspecie e si utilizza
un fattore 10 e di differenza intraspecie in cui si
aggiunge un altro fattore 10.

141
Per ottenere dose di riferimento (RfD)—> NOAEL/100
Per ottenere dose su popolazioni specifiche (PAD) si aggiusta il risultato dividendo ancora per 10 —>
RfD/10

Il NOAEL può essere ottenuto tramite studi tossicologici a breve termine e studi tossicologici a lungo
termine:

Studi cronici, sul lungo periodo; dobbiamo identificare almeno 3 dosi -> dose più bassa, dose intermedia
(sufficientemente alta da provocare qualche effetto tossico, potrebbe essere metà di quella più alta, ma non
deve portare alla morte/ essere drastica), dose alta (provoca minima mortalità).

Come faccio a trovare la dose alta?

Ad es. per additivi alimentari: rinvenibili negli alimenti con caratteristiche simili a nutrienti endogeni non
devono essere prese in considerazioni dosi superiori del 5% di tutto l’apporto della dieta dell’individuo.

Per paragonare studi diversi presenti in letteratura:

Se c’è una differenza di qualità degli studi, va scelto lo studio di migliore qualità ma soprattutto lo studio che
ha osservato effetti tossici a dose più bassa (a meno che non ci siano dati a livello farmacocinetico o
farmacodinamico che dimostrano che una specie è più simile all’uomo rispetto ad altre, quindi, vanno presi
in considerazione i dati presenti in questi studi).

In genere questo approccio viene seguito per tutte le sostanze che determinano un effetto tossico in organi
o sistemi e/o per sostanze che causano effetti cancerogeni non genotossici, per i quali si accetta l’esistenza
di effetti legati a una soglia (cancerogeni epigenetici).
Questo metodo non si applica ai cancerogeni genotossici.

142
CANCEROGENI
Tossicità così elevata per cui una singola molecola è in grado di indurre il cancro;
Ce ne sono 2 tipologie:

 cancerogeni genotossici: sostanze che interagiscono direttamente con il DNA (provocano

mutazioni, alterazioni). Sono i più pericolosi, sostanze che intervengono nella fase di
iniziazione per cui la cellula da sana diventa cancerogena. Non siamo in grado identificare
delle dosi soglia, al di sotto delle quali non si verifichi un aumento di incidenza e di tumori
per la quasi totalità delle sostanze con potere cancerogeno (genotossiche).
 cancerogeni epigenetici: sostanze che hanno potenzialità di provocare il cancro ma non
interagiscono con il DNA, interferiscono con la normale funzionalità della cellula ( ne
aumentano la proliferazione ad es ). Agiscono su una cellula già cancerogena ma silente
e viene resa attiva.
Intervengono nella fase si promozione: la cellula neoplastica silente viene resa attiva.
Non possono agire su una cellula sana.
(hanno una dose soglia es. DDT, etanolo, androgeni, etc. ). È possibile ricavare la DOSE SOGLIA per le
sostanza promotrici (epigenetiche).
Per i cancerogeni genotossici bisogna prevedere un rischio per qualsiasi dose, anche la più bassa.

Cancerogeni genotossici
Si hanno 2 possibilità:
1) vietare l’uso della sostanza ma non è attuabile per tutte le sostanze.
2) stabilire livello di rischio, cercando di individuare un livello di rischio sufficiente piccolo
da ritenere trascurabile ( o accettabile ) l’esposizione alla sostanza.
Si è scelto di ritenere come accettabile un livello di rischio che causa l’induzione di tumore di un
soggetto su 1 milione di esposti.
Nel caso di un’esposizione professionale si fa riferimento a uno su centomila.
per i cancerogeni genotossici
non si può definire NOEL/RfD, si ragiona in
termini di livello di rischio.

Cancerogeni epigenetici (o non genotossici)

Non possiedono azione sul DNA e non danno mutazioni → formazione di neoplasia per mezzo di:
- effetti citotossici conseguenziali a danno tissutale cronico
- azioni ormono-simili
- formazione di metaboliti particolarmente reattivi
- azione promovente nei confronti di cellule neoplastiche esistenti allo stato silente.

143
Esempio del limonene

Nefropatia (organo sotto accusa è il rene)

FASE III: VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE AL PERICOLO si preoccupare dell’esposizione alla

sostanza. Misura quantitativa.
Rischio tossicologico = esposizione * tossicità
L’esposizione della popolazione generale non professionalmente esposta dipende da più fattori di cui i
principali sono:
 respirazione si aria inquinata (incendio, nube tossica...)
 ingestione di alimenti contaminati (residui di fitofarmaci, presenza di tossine)
 contatto cutaneo con superfici contaminate

La valutazione dell’esposizione comprende due elementi:

144
- quantità all’interno dell’alimento
- quantità di alimento ingerita

es. L’analisi del latte materno e del contenuto di diossina ha fornito un dato chiaro dell’esposizione della
popolazione nei confronti di questa sostanza (diossina).

Fattori che modulano l’esposizione:

Stima dell’esposizione su dati teorici

Se ci basiamo su dati teorici andiamo per approssimazione, non abbiamo dati certi. Nel caso, ad esempio, di
un additivo alimentare rimane stabile fino al consumo, tuttavia, in molti casi la quantità può cambiare prima
del consumo dell’alimento (possono degradarsi, oppure interagire con altri ingredienti).
Utilizzo la TMDI: dose massima giornaliera tollerabile per un determinato alimento; deve essere 10/15%
dell’ADI per ciascuna sostanza, in quanto possiamo venire a contatto con la stessa sostanza tossica
assumendo alimenti diversi, i cui livelli si possono sommare nella dieta.
Sarebbe interessante avere dati sull’esposizione e la tossicità riferita alla popolazione di anziani e bambini
(più sensibili, da tutelare).

Stima dell’esposizione su dati analitici

La disponibilità dei dati attendibili è indispensabile per una valutazione dell’esposizione basata sulla misura
dei livelli delle sostanze chimiche negli alimenti stessi. Mi baso su dei campioni biologici quali:
• sangue
• urina
• aria espirata

Quello più usato e più attendibile è il sangue. L’urina sarebbe importante, procedura non invasiva però
subisce molte variazioni anche a seconda del momento di raccolta. Per avere un dato preciso mi riferisco
all’urina raccolta nelle 24 ore.
Aria espirata sarebbe un dato importante ma a livello pratico è difficile da misurare —> influenzabile in
soggetti con alterazioni respiratorie.

Valori limite di esposizione ambientale

Valori limite per l’esposizione occupazionale a sostanze tossiche:
Valori limite pattuiti per soggetti che sono a contatto con le sostanze tossiche nelle ore lavorative, uso
parametri:
- TLV-TWA: valore medio riferito all’intera durata di un turno di lavoro di 8 ore.
- STEL: valore limite per esposizioni brevi. Non può essere raggiunto per più di 15 minuti
consecutivi, e per più di 4 volte su un intero turno di lavoro.

- Ceiling: livello di concentrazione ambientale che non deve essere mai, per nessun motivo,
superata.

145
FASE IV: CARATTERIZZAZIONE DEL RISCHIO: mette in relazione caratterizzazione de pericolo con
l’esposizione.
Punto finale del processo di valutazione tramite cui si riesce a definire il rischio, si descrive la natura e la
grandezza del rischio, considerando le incertezze di analisi.
Elaborazione di una stima quantitativa del rischio a cui sono soggetti i consumatori o un target di questi.

L’ADI non deve essere considerata come una soglia di tossicità ma di sicurezza in quanto deriva dal NOAEL e
il NOAEL è la dose più alta a cui non si verifica evento tossico. Piccoli sforamenti dell’ADI non dovrebbero
avvenire ma se avvengono e sono limitati nel tempo non dovrebbero allarmare in quanto riguardano una
dose che di per sé non è tossica.

In caso di cancerogeni genotossici: uso margine di esposizione, cioè, rapporto tra NOAEL su ESPOSIZIONE. Il
NOAEL in realtà è impossibile da ricavare nel caso dei c. genotossici, perché non ho una dose-soglia, ma
L’EFSA ha raccomandato l’utilizzo del BMDL10: limite inferiore dell’intervallo di confidenza della benchmark
dose associata con una incidenza di tumori indotti del 10% (dose che causa una % di tumori del 10%).
Tenendo esposizione bassa ottengo un margine di sicurezza alto.
146
Quindi:

2)GESTIONE DEL RISCHIO

Alla base vige il principio di precauzione: la minaccia non va ignorata anche se la scienza non ci permette di
avere conoscenze certe, sia che si parli di tossicologia alimentare che ambientale.
Esigenza politica —> sono le autorità competenti che se ne occupano.

Chi si occupa della valutazione del rischio?

EFSA (Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare ) —> valutatore sicurezza alimentare, valuta il rischio
esaminando le 4 fasi; non fa ricerca in prima persona ma si basa sull’analisi dei dati già presenti ( es.
pubblicazioni scientifiche e dati a disposizione ). Arriva ad una conclusione —> valutazione del rischio. A
questo punto la “palla” passa a chi si occuperà della gestione del rischio .

Chi si occupa della gestione del rischio?

Commissione europea, le autorità degli stati membri e il Parlamento europeo (politica).

147
3) COMUNICAZIONE DEL RISCHIO
Ultima componente dell’analisi del rischio, anche se talvolta l’EFSA emana documenti anche in itinere
(durante l’analisi). I cittadini sono l’obiettivo finale della valutazione del rischio. Molto spesso le informazioni
sono divulgate in maniera troppo specifica e sono difficili da comprendere. È quindi molto importante che
vengano fornite informazioni precise e soprattutto ben comprensibili, trasversali, in quanto lo scopo è
quello di assicurare che tutte le parti interessate, compresi i consumatori, siano correttamente informate.

La comunicazione del rischio rientra tra i compiti riconosciuti all’EMA e all’EFSA, ma anche gli organi polito-
decisionali responsabili per la gestione del rischio svolgono un importante ruolo nella comunicazione.

Quali sono i principi di base di una buona comunicazione del rischio?

- apertura: di pari passo con la trasparenza
- indipendenza: informazione non deve essere influenzata da interessi vari
- trasparenza
- tempestività: prontezza di reazione, essenziale per limitare gli eventi tossici

Per mettere in pratica questi principi:

Natura del pericolo:

• presente naturalmente
• aggiunto agli alimenti o creato durante la lavorazione

148
Dov’è utilizzato o riscontrato il pericolo:
• utilizzato o riscontrato in un prodotto/marchio comunemente utilizzato in casa o per la produzione
di alimenti
• utilizzato o riscontrato ampiamente in una gamma di prodotti
• non ampiamente utilizzato o riscontrato
• illegale/regolamentato ai sensi della normativa UE

Chi, che cosa è interessato?

• Consumatori in generale: uomini, donne
• Gruppi vulnerabili: neonati, bambini, donne in gravidanza, anziani o altro
• Piante
• Animali
• Ambiente

Effetti su persone/animali/piante/ambiente
Sono state individuate le seguenti categorie di tipi di rischio:
➢ Rischio sanitario acuto/immediato potenzialmente letale (ad es. intossicazione
alimentare)
➢ Potenzialmente letale senza rischi immediati (ad es. sostanze cancerogene)
➢ Rischio sanitario cronico/a lungo termine (ad es. allergie, obesità)
➢ Sconosciuto
➢ Non considerato un rischio

È possibile anche individuare diversi approcci al rischio:

Esperti
➢ Si basano sulla valutazione del rischio
➢ Sono obiettivi e generali
➢ Svolgono argomentazioni analitiche
➢ Valutano i rischi a fronte dei benefici

Pubblico
➢ Si basa di più sulla percezione del rischio (personale, non sempre è reale)
➢ Chiede: “Che cosa significa per me?”
➢ Vuole risposte alle preoccupazioni
➢ Valuta i rischi a fronte di paura e indignazione

Livelli di esposizione al pericolo/rischio

➢ Nessuna esposizione
➢ Esposizione limitata
➢ Esposizione diffusa
➢ Esposizione di gruppi particolari
➢ Esposizione sconosciuta

Capacità di controllare il rischio

Il rischio è:
✔evitabile dall’individuo

149
✔non evitabile dall’individuo
✔ può servire un’azione di gestione del rischio
✔ un’azione di gestione del rischio non può servire o non è immediatamente ovvio/disponibile un approccio
chiaro
✔un’azione di gestione del rischio non applicabile/necessaria (ad esempio un rischio percepito ma non
dimostrato scientificamente)
(pag. 193, 194: gli elenchi che ho inserito sono state solo letti e non commentati)

Strumenti e canali per comunicare il rischio

Il canale principale —> MEDIA, raggiungono nell’immediato un’ampia popolazione (tv, radio, interviste); le
informazioni devono essere chiare e di immediato impatto, fruibili.

Canali alternativi:

EFSA

L’EFSA è un ente della comunità europea finanziata dall’UE ma che opera in modo indipendente
dalla commissione europea, dal Parlamento e dagli Stati membri.
Istituita nel 2002, per vigilare sulla sicurezza alimentare. Responsabilità di valutare i rischi e di
gestirli separate.

Opera non solo sulla nutrizione umana ma anche sull’aspetto ambientale, come protezione delle
piante e salute delle piante, e sulla salute degli animali.
Da quando è stata istituita ha emanato numerosi pareri scientifici, ad es. sull’aspartame come
additivo alimentare, gli OGM, i pesticidi… che sono stati usati in seguito dagli enti di gestione del
rischio per modificare la situazione presente.

Svolge un ruolo importante anche nella raccolta e nell’analisi dei dati, in cooperazione con gli Stati
Membri dell’UE.
La comunicazione sui rischi associati alla catena alimentare è un altro settore fondamentale del
suo mandato.
Uno dei compiti dell’EFSA è dunque quello di comunicare in modo chiaro non solo con i principali partner e
le parti interessate, ma anche con il grande pubblico, onde contribuire a colmare il divario tra scienza e
consumatore.
150
Neonicotinoidi: insetticidi molto tossici per le api (sicuri invece per l’uomo)

Attività dell’EFSA a livello pratico:

Nuove valutazioni sono necessarie, con il trascorrere del tempo, perché possono essere emersi
nuovi rischi.
La prof legge i due grafici di questa pagina.

151
Slide di un esperto dell’EFSA (in realtà ISS):

B) tramite il NOAEL riesco a capire la dose

più alta alla quale non si vedono effetti
tossici
d) più sono vicini i valori dell’ADI (che
rappresenta il NOAEL) e delll’esposizione
più ci saranno effetti negativi

Ogni additivo alimentare (in generale sostanze regolamentate ) per essere messo in commercio —> dossier
con tutte le informazioni necessarie e i test tossicologici richiesti dalla normativa.
La ricerca indipendente può integrare gli studi standard presenti nel dossier.

Es. bisfenolo A (additivo nelle plastiche per biberon, alcune sue piccole particelle possono migrare in cibi e
bevande ed essere ingerito, rientra tra le sostanze chimiche chiamate “distruttori endocrini”-interferisce con
il sistema ormonale (problemi a livello della fertilità)) nuovi studi “non convenzionali” su effetti immunitari e
di promozione tumorale durante lo sviluppo hanno creato incertezze nella valutazione dell’EFSA,
relativamente tranquillizzante. L’EFSA ha condotto una nuova valutazione del rischio, esaminando 200 nuovi
studi.

Fattore di incertezza 500 molto elevato (di solito

è 100)

Conclusione della nuova analisi: nel 2011 viene vietato nei biberon, esclusi i biberon l’assunzione di
bisfneolo A si riduceva del 30% della TDI (EFSA 2015).
Azione correttiva: non usare i recipienti in policarbonato che sono usurati: il rilascio aumenta (tupperware,
piatti di plastica dura).

Caratterizzazione del pericolo

LOAEL ( oltre che NOAEL ): la dose più bassa che dà un evento tossico ma si usa generalmente il NOAEL.
Se mi confronto con una sostanza con potenzialità tossica elevata faccio riferimento agli effetti che si
riscontrano con dosi più basse, i cosiddetti effetti critici: se proteggo da questi effetti, proteggo anche dagli
altri che osservo a dosi più alte.

152
Es. Pesticidi: sono sostanze necessarie per proteggere la salute degli organismi viventi che forniscono
alimenti vegetali, in questo senso sono fitofarmaci. Sono sintetizzate per essere tossiche con gli organismi
bersaglio (insetti, funghi, erba) ma non sono totalmente innocui per l’uomo: si possono trovare residui negli
alimenti e nell’ambiente di vita delle comunità che vivono in aree agricole.
Fitofarmaci strettamente e rigidamente regolamentati: sospetto del ruolo dei fitofarmaci in insorgenza di
morbo di Parkinson e leucemia infantile (EFSA 2014).
Per prevenire i rischi da pesticidi: uso corretto e sostenibile, produzione di fitofarmaci meno tossici
(sostituzione di molecole con molecole meno tossiche). Non deve solo tutelare la salute dei cittadini, ma
anche educare il mondo agricolo.
Problema: alcuni fitofarmaci sono neurotossici anche nei mammiferi. I neonicotinoidi nello specifico hanno
una limitata tossicità, tuttavia studi di ricerca indicano che il sistema nervoso in via di sviluppo (feto,
bambino) può essere vulnerabile ma rappresentano un problema perché sono tossici per le api.
I limiti dissati in passato vanno abbassati, come conseguenza della seconda valutazione dell’EFSA.

Es. degli integratori alimentari in Svezia —> problemi epatici legati all’assunzione di un integratore
(epatopatie collegate all’utilizzo del Fortodol); dei 4 pazienti osservati, 1 è deceduto.
Livello di rischio qui era sconosciuto: non si sapeva quanti soggetti potevano aver assunto questo
integratore in quanto era prodotto in Messico con materie prime arrivate dall’India, assemblato in America
e venduto via Internet —> difficile definire l’entità dell’esposizione.
Conteneva nimesulide, pa dell’aulin —> farmaco antiinfiammatorio che ha come controindicazione
epatopatie; tale sostanza non era indicata tra gli ingredienti (adulterazione).
Critica: la mancanza di tempestività dell’autorità svedese.

Valutazione dell’EFSA sulla caffeina:

Perché?
Richiesto di intervenire da alcuni membri della comunità europea, perché avevano riscontrato problemi
sull’utilizzo della caffeina in soggetti che svolgono elevato esercizio fisico e assumevano anche bevande
energetiche.
Popolazione non considerata: pop. che presenta patologia, in dipendenza da droghe, in dipendenza da alcol
Ha analizzato inizialmente il quantitativo medio che viene consumato di caffeina?
In molti Paesi la caffeina deriva dal caffè, in paesi come Irlanda e Inghilterra deriva invece dal the.
400 mg sono 5 caffè espresso, consumata nel corso della giornata, non pone problemi di sicurezza per gli
adulti sani (tranne donne in gravidanza 200mg/die). Il consumo di altri componenti delle "bevande
energetiche" a concentrazioni normalmente presenti in tali bevande non influirebbe sulla sicurezza di dosi
singole di caffeina sino a 200 mg. Un consumo di alcol a dosi sino a circa 0,65 g/kg pc, che porta ad avere un
tenore di alcol nel sangue dello 0,08% circa (livello al quale in molti Paesi è interdetta la guida di autoveicoli)
non influirebbe sulla sicurezza di dosi singole di caffeina fino a 200 mg. Sino a tali livelli di assunzione è
improbabile che la caffeina mascheri la percezione soggettiva di ebbrezza da alcol.
(leggere il file sulla caffeina caricato su e-learning, ha solo letto la valutazione)

L’effetto della caffeina:

➢ viene rapidamente assorbita, si manifesta in 10-45 min
➢ emivita della caffeina: circa 4 ore, che in base alle variabili può arrivare fino a 8 ore.
➢ Alcune sostanze possono indurre o ridurre il metabolismo della caffeina: fumo ( induce il
metabolismo ) e crucifere ( inducono il metabolismo ); inibitori invece succo di pompelmo, alcol…
➢ emivita influenzata dall’età: nel bambini 14 ore

Agisce come la teofillina (farmaco, usato per l’asma in quanto inibisce gli enzimi che degradano
AMPciclico, agisce come broncodilatatore ); effetti della caffeina oltre che sulla muscolatura
bronchiale anche su altri distretti.

153
Effetti:
azione eccitatoria, agisce sul SNC non tutti hanno gli stessi effetti: in
alcuni aiuta a digerire, variabilità individuale.
aumenta secrezione gastrica acida
broncodilatazione
restringimento degli atti di respirazione,
diventano più brevi aumenta la diuresi rilascio
epatico di glucosio
lipolisi
apparato circolatorio: tachicardia
vasocostrizione celebrale ( se il mal di testa è dovuto a vasodilatazione il caffè può
aiutare ) aumenta la biodisponibilità di alcuni farmaci

Effetti avversi:
 irritabilità, ansia, mal di testa, insonnia
 tremori a livello muscolare
 nausea e dolore addominale
 aritmie
 sensibilità cutanea
 ronzio all’orecchio
 problemi di vista

Valutazione dell’EFSA sull’acrilamide:

L’acrilammide è una sostanza chimica che si forma naturalmente nei prodotti alimentari amidacei durante la
normale cottura ad alte temperature (frittura, cottura al forno e alla griglia e anche lavorazioni industriali a
più di 120° con scarsa umidità). Si forma per lo più a partire da zuccheri e aminoacidi (principalmente un
aminoacido chiamato asparagina) che sono naturalmente presenti in molti cibi. Il processo chimico che
causa ciò è noto come “reazione di Maillard” e conferisce al cibo quel tipico aspetto di “abbrustolito” che lo
rende più gustoso.

Se l’acrilamide causa tumore negli animali esiste una dose tollerabile? No, non c’è una dose soglia in quanto
è genotossica e cancerogena.
Per calcolare il margine di sicurezza si è utilizzato, come per tutte le sostanze genotossiche e cancerogene, il
BMLD10 (limite inferiore dell’intervallo di confidenza relativo alla dose di riferimento). Per i tumori gli
esperti hanno scelto un BMDL10 di 0,17mg/kg pc/giorno1. Per altri effetti, i mutamenti neurologici più
pertinenti al caso sono stati osservati con un BMDL10 di 0,43 mg/kg pc/giorno.
154
Margine di esposizione: è il rapporto tra il BMLD10 e l’esposizione a cui sono sottoposti i soggetti. Il
comitato scientifico dell'EFSA afferma che per sostanze genotossiche e cancerogene un MOE di 10 000 o più
è di lieve preoccupazione per la salute pubblica (sopra i 10.000 non è un rischio importante). I MOE per gli
effetti dell’acrilamide correlati al cancro variano da 425 per gli adulti medi consumatori fino ai 50 per i
bambini piccoli che ne facciano un consumo elevato. Tali intervalli indicano un allarme per la salute pubblica
(più il fattore è basso, <10.000, più il rischio è certo).
Mentre, per quanto riguarda gli effetti di danno neurologico, non sembrano esserci rischi da esposizione
all’acrilamide (per i bambini un po’ più di accortezza).

Tutto quello che viene fatto al forno, fritto o alla piastra.

L’unica soluzione per ridurre l’esposizione è cerca di evitare di abbrustolire troppo il cibo (i livelli aumentano
all’aumento della T).
L’acrilammide è presente anche nel fumo di tabacco.

LINEE GUIDE DELL’EFSA SUI BOTANICALS O PRODOTTI A BASE DEI BOTANICALS

Si valuta la sicurezza

Principio di presunta sicurezza: se è applicabile allora la sostanza non necessita di ulteriori studi. Se tale
principio non può essere applicato sono necessarie ulteriori indagini per valutare la sicurezza.

Le seguenti sezioni mirano a identificare i dati e le informazioni considerati necessari per valutare la
sicurezza degli ingredienti botanici:
 Dati tecnici (technical data)
 Esposizione (Exposure)
 Dati tossicologici (Toxicological data)

Dati tecnici:
Identità e natura del materiale:
identificazione precisa della pianta a disposizione, mediante Farmacopea europea oppure
mediante altre fonti accettate come autorevoli. Indicare nome scientifico, sinonimi, nome
comune, parti usate della pianta, zona di origine geografica, condizioni di coltivazione.
processo di fabbricazione: necessaria la descrizione dei metodi utilizzati , solventi utilizzati.
I botanicals potrebbero diventare infatti pericolosi a causa di deviazioni nel processo di
produzione (ad esempio errata classificazione).

Esposizione
Stiamo parlando di botanicals quindi abbiamo anche un’idea di come saranno assunti. Quanto prevediamo
che saranno assunti, con che frequenza, etc?

Possibilità che ci siano altre fonti concomitanti con cui assumiamo quella droga, modalità di uso e
informazione storica (se il suo uso è noto da tempo) —> importante perché se c’è un prodotto e l’uso della
droga che contiene è sicuro allora sarà sicuro anche l’uso del prodotto.

155
Livello A: si basa sui dati preesistenti che riguardano quella preparazione. Se ci consentono di dire
che quella preparazione è sicura allora non c’è preoccupazione sulla sicurezza, non svolgo altre
analisi. Se invece i dati non ci permettono di dichiarare la preparazione sicura, servono ulteriori
dati —> Livello B, valutazione dei dati relativi alla preparazione, si fanno ulteriori analisi.

Livello A:
Dati pregressi e conoscenze disponibili, mi avvalgo del principio di presunta sicurezza.
Il botanical non deve essere previsto però per un’esposizione superiore a quella pregressa. I
chemiotipi attuali devono essere gli stessi di quelli precedenti (presenti negli studi).

Se un botanicals è usato in un ampio numero di persone e per tanti anni senza che si siano manifestati degli
effetti avversi, abbiamo una conoscenza di base per rassicurare sulla sicurezza di quel botaniclas: abbiamo
incontrato i criteri del livello A e non è necessario procedere con ulteriori indagini (a parità di stessa
esposizione e chemiotipo).
Per i botanicals potenzialmente in grado di contenere sostanze tossiche, che provocano dipendenza,
sostanze psicotrope o altre sostanze potenzialmente pericolose, la presunzione di sicurezza può essere
applicata solo se vi sono prove convincenti che queste sostanze indesiderate nelle parti o nei preparati
specifici della pianta sono assenti nel materiale originale, o significativamente ridotte se non escluse, o
inattivate durante l’elaborazione.

Livello B:
Se non posso applicare il principio di presunta sicurezza.
Si ricorre al livello B quando:
• Se esposizione futura su quel botanicals sarà superiore a quella del passato
• Se il livello nei dati storici non è presente, non è valutabile

Allora attuo una valutazione tossicologica, riguarda tossicocinetica del pa, deve fornire tutti i dati necessari.
Devono essere portati dati tra le interazioni dei costituenti del botanicals o delle interazioni con altri
prodotti medicinali.

156
Studi di genotossicità: per stabilire se la sostanza contiene o meno un mutageno. L’EFSA indica
quali test bisogna fare:
- test di ames su cellule procariote
- aberrazioni cromosomiche
- test nel micronucleo
- test simil ames ma su cellule di mammiferi
Una sostanza che dà un risultato positivo in un test in vitro probabilmente lo darà anche in vivo.

Per individuare una sostanza a carattere mutageno che è in grado di dare una mutazione a livello
del DNA:

1) TEST DI AMES: cellule batteriche, procariote, spesso su cellule di Salmonella Typhimurium

o Escherichia Coli. Test a mutazione inversa —> si induce una mutazione, batteri mutanti, e
li si rende impossibilitati a proliferare in un ambiente in cui manca un amminoacido che
nel caso dell’Escherichia coli è il triptofano, per Salmonella è istidina, e quindi il batterio
non riesce a proliferare se non viene fornito aa. Batterio, in questo caso Salmonella, posto
in una piastra di coltura (his-, cioè mutato per l’istidina, non può sintetizzarlo) in presenza
di un medium privo di istidina —> si aggiunge al centro un dischetto imbevuto della
sostanza da saggiare e si lascia incubare—> nel risultato positivo (+) il batterio è cresciuto.
Perché? La sostanza da testare è un mutageno quindi ha invertito la mutazione indotta, in
prima battuta, al batterio; ha reso in grado alla Salmonella di sintetizzare l’istidina.
Sull’altra piastra noterò soltanto alcune colonie, ciò vuol dire che la sostanza non è
mutagena, ma le mutazioni possono anche essere spontanee (è impossibile non avere
nessuna colonia).

Esperimento ha un limite : infatti c’è l’aggiunta dell’s9 estratto, cioè una soluzione detta attivante
metabolico perché somministrare una sostanza ad un batterio è diverso che somministrarla ad un
organismo in vivo —> l’organismo vivo (uomo) subirà delle reazioni di metabolismo che danno origine
metaboliti che possono avere potere mutageno. Se la sostanza che analizziamo non ha potere mutageno di
per sé ma un suo metabolita sì sarebbe un problema —> per questa ragione aggiungo un attivatore
metabolico.

Necessario sempre avere una piastra di controllo in cui non è presente la sostanza da saggiare
(metto in entrambi i casi l’attivatore metabolico):
157
Se si forma una colonia vuol dire che quella sostanza ha un potere mutageno. Ma per capire se l’effetto è di
per sé o dovuto alle reazioni che avvengono (metabolismo), possiamo vedere cosa succede con e senza
attivatore metabolico:

Sebbene molti composti positivi in questo test siano cancerogeni nei mammiferi, la correlazione non è
assoluta. Dipende dalla classe chimica e ci sono agenti cancerogeni che non vengono rilevati da questo test
perché agiscono attraverso altri meccanismi o meccanismi non genotossici assenti nelle cellule batteriche.

2. TEST DI ABERRAZIONI CROMOSOMICHE in cellule di mammifero: posso avere

un’alterazione di struttura o di numero dei cromosomi (hamster cinese = criceto).
L’obiettivo del test è capire se la sostanza che stiamo valutando è in grado di andare ad interagire
con il DNA, provocando delle alterazioni cromosomiche, sia per numero che per struttura.

Il test lo faccio sempre in presenza e in assenza dell’attivatore metabolico per comprendere se la sostanza è
mutagena di per sé o in seguito a metabolismo anche se questo non ridimensiona la gravità del risultato.
158
 Si definisce aberrazione cromosomica o mutazione cromosomica, un'alterazione della struttura o del
numero dei cromosomi.
Queste alterazioni normalmente sono una conseguenza di un errore durante la divisione cellulare, che
consistono nella perdita, acquisizione o riarrangiamento di una o più parti di uno o più cromosomi (le si
vedono visivamente al microscopio, test qualitativo).

3. TEST DEL MICRONUCLEO: viene evidenziato il potere mutageno di una sostanza che interferisce
con la mitosi. Al microscopio si vede che le cellule non si dividono correttamente e si forma un
nuovo addensamento ( micronucleo ) di dimensioni pari ad 1/3 del nucleo di base.
le cellule che vengono prese in considerazione sono sempre le stesse di prima.

Il test del micronucleo è un test di mutagenesi che consente di osservare eventuali errori occorsi durante la
mitosi, causati da agenti mutageni.
Consiste nel prelevare, da un organismo sottoposto all'agente mutageno, cellule durante la mitosi, e
osservarne un discreto numero (almeno un centinaio) al microscopio, dopo aver effettuato una colorazione
differenziale che evidenzi il materiale genetico: in caso di errori (provocati dal mutageno), sono visibili, oltre
al nucleo, frammenti di DNA sparsi per il citoplasma e che dunque non sono stati incorporati nel nucleo
principale durante le ultime fasi della divisione cellulare (chiamati micronuclei).
Tali alterazioni, che appaiono come dei piccoli nuclei accessori, sono morfologicamente identiche a quelli
normali; dunque perfettamente tondi, ma di dimensioni notevolmente ridotte. Infatti, per essere considerati
dei veri e propri micronuclei, generalmente non devono superare un terzo delle dimensioni del nucleo
principale.

159
Sperimentalmente: utilizzo linfociti umani, sangue prelevato viene stratificato, linfociti trattati con la
sostanza da testare, si arresta la fase di divisione, si colorano le cellule e si osserva se si sono formati
micronuclei nel vetrino.

4. TEST DI MUTAZIONE GENETICA IN CELLULE DI MAMMIFERO (corrispondente del test di ames ma su

cellule di mammifero e con mutazione in avanti)
Non è una mutazione inversa, ma si utilizzano delle cellule di mammifero che di base presentano la timidina
chinasi. In presenza di questo enzima non resistono all’azione di una sostanza TFT (trifluorotimidina),
sostanza tossica, e muoiono. Se la cellula muta viene a mancare la timidina chinasi (TK —> TK meno meno),
allora la cellula può sopravvivere anche in presenza del TFT.
Quindi, in questo caso, se la sostanza da testare indurrà una mutazione sulle cellule, rendendole prive della
timidina chinasi, proseguendo nella proliferazione.
Nella piastra in cui c’è crescita cellulare vuol dire che la sostanza saggiata è un mutageno, ha reso le cellule
immuni all’attività della TFT.
Questo metodo viene detto della mutazione in avanti, perché non si va a ripristinare una situazione
pregressa la mutazione fa sì che il batterio assuma un genotipo nuovo che gli permette di stare meglio
(supera un ostacolo e continua con la proliferazione).

Questi erano i 4 test per valutare la potenziale mutagenicità e genotossicità di una sostanza in vitro.

Nei test in vitro: se il risultato dei test è negativo posso operare in vivo per fare dei test riguardo altre
tossicità, in quanto non presentano problemi di mutagenicità.
Se invece il risultato dei test è positivo, è necessario scegliere altri test in vivo per verificare se i risultati
sono confermati. Oppure si abbandona la strada per quel botanicals.
Se i risultati sono contraddittori, necessari ulteriori test per chiarire.

Questi studi ci forniscono informazioni sulla mutagenicità: che è un danno al DNA o alla struttura
cromosomiale che verrà trasmesso alle cellule figlie. È più grave della genotossicità perché il danno viene
trasmesso, mentre il genotossico modifica il DNA (grave) ma il danno non viene trasmesso.

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 Il danno cambia a seconda se si tratta di un
danno alle cellule somatiche o alle cellule
germinali.

Evidenza aumenta con l’aumento della complessità

dell’organismo in analisi.
Partendo dai procarioti, con il test di Ames, non ci
assicura che quella sostanza analizzata sia un possibile
mutageno anche per l’uomo.
Questa possibilità diventa probabilità (incide
maggiormente) quando abbiamo un risultato positivo
anche sulle altre cellule (insetti, mammiferi).

Documento dell’EFSA che ha preso in considerazione 6 droghe vegetali: esempio per vedere come
l’EFSA realizza una valutazione:

Necessario innanzitutto identificare il botanical —> technical data. Necessario talvolta individuare anche
sottospecie, varietà, tutti i dati che identificano in maniera inequivocabile del botanical. Es. Citrus aurantium
in base alla specie contengono diversi livelli di sinefrina. Fondamentale che la pianta sia ben definita.

Informazioni devono anche considerare l’uso previsto del botanical (cibo comune, integratore, o un
prodotto medicinale), descrivere i componenti maggiori (aa., polisaccaridi, lipidi) e il livello di contaminanti
che è possibile trovare.

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Verificare anche l’esplosione che si prevede.

Esempio del Citrus Aurantium L (come estratto idroalcolico):

 non commestibile ma usato in liquori, cosmetici, etc.
 in passato veniva usato come erba medicinale, in particolare la buccia, per stimolare
l’appetito (uso storico). Uso in netto contrasto con l’uso attuale: viene usato nei prodotti
per perdere peso (perché contiene sinefrina).
Non aumenta l’appetito ma al massimo lo dovrebbe ridurre —> NETTO CONTRASTO
Dati tossicologici:
Usato come alternativa sicura all’Ephedra (pianta che non può essere più venduta come integratore, per il
contenuto di sinefrina).
Attualmente sappiamo che il suo composto principale: p-sinefrina, agonista adrenergico che può dare una
stimolazione adrenergica eccessiva. Pertanto, non possiamo darlo per sicuro. Non ci sono attualmente studi
epidemiologici sull’arancio amaro su larga scala.
Quale approccio?
Livello A: per liquori, marmellate, cosmetici ho dati di uso pregresso, pertanto, posso usare il principio di
presunta sicurezza.
Il problema è che attualmente l’arancio amaro dà problemi per i nuovi usi: pillole, compresse con arancio
amaro al 6% di sinefrina ma spesso dopo le analisi in realtà il contenuto di alcuni integratori arriva fino al
95%.
P- sinefrina: abbiamo dati per il suo uso come decongestionante nasale; tuttavia, questi studi non possono
essere ritenuti validi per l’uso come coadiuvante alla perdita di peso.
Sono quindi necessari nuovi studi a breve e lungo termine di preparazioni a base di arancio amaro al 6% di
sinefrina (si deve andare al livello B). È noto invece che la sinefrina somministrata con altri composti attivi,
es Ephedra o caffeina è tossica (problemi cardiaci-aritmie).

Esempio del Camelia sinensis kuntze

Nell’EFSA viene riportato come si prepara il tè (tè verde cinese e giapponese) e poi ci si sofferma sulle
preparazioni vegetali con prodotti differenti.
Come cibo si usa come bevanda stimolante, non stimolante nel caso di te deteinato, oppure ancora come
integrazione al cibo (preparati per la perdita di peso). Altro uso è antiossidante. L’uso farmaceutico ne
prevede l’uso come coadiuvante nei problemi gastrici, vomito e diarrea.
Negli ultimi anni c’è stata una commercializzazione elevata per quanto riguarda la perdita di peso. Molti
prodotti sono stati ritirati in quanto epatotossici.

In un infuso di tè la quantità di caffeina e catechina cambia in base a tempo di infusione, alla quantità di
acqua e alla quantità di droga utilizzata.

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L’EFSA valuta l’esposizione della sostanza a un certo soggetto, cioè quanto un soggetto può essere esposto
alla droga. Secondo un questionario in Germania secondo cui viene valutato il consumo giornaliero di te per
una persona la stima è da 362 g/persona/giorno fino a 1097 g/persona/giorno:

In base a questi dati l’EFSA ha tracciato la quantità di catechine assunte durante il giorno nel tè verde
giapponese e cinese. L’EFSA ha inoltre valutato il profilo di sicurezza nelle preparazioni.

L’EFSA (2009)ha valutato 4 tipologie di esposizioni:

• estratti acquosi di tè verde secchi per preparazioni di bevande in infusione;
• estratti acquosi per preparazione di cibo (integratori);
• altri estratti di verde secco non svolti in maniera tradizionale;
• estratti di tè verde essiccati utilizzati in prodotti consigliati in aggiunta alla perdita di peso.

Per quanto riguarda la sicurezza di prodotti per la perdita del peso si è determinata epatotossicità (per
l’epigallocatechina gallato in una determinata popolazione per tempi prolungati). L’EFSA però sostiene che
mancano le conoscenze del meccanismo di azione, coinvolgimento di altri organi ecc. Per quanto riguarda le
altre preparazioni non ci sono dati certi e l’EFSA sostiene che sia necessario un livello B (ultimi 2 punti).
Mentre il livello A è superato dalle prime due preparazioni.
Gli aggiornamenti dell’EFSA confermano che le catechine assunte sottoforma di integratori alimentari a dosi
pari o superiori a 800 mg/giorno possono rappresentare un problema per la salute. Non problemi per
l’infusione (non si raggiungono alte dosi di catechine).

Esempio del Triticum estivum

NOMI COMUNI: italiano: frumento, frumento tenero; Inglese: Breadwheat; Francese: Blé
FAMIGLIA: Graminaceae
PARTI UTILIZZATE: Crusca (strati esterni delle cariossidi)
ORIGINI GEOGRAFICHE: Coltivata in tutti i paesi con clima moderato

La crusca è consumata per il contenuto di fibre (25-30 g al giorno uso raccomandato per regolarità
intestinale). Non ci sono dati tossicologici, tranne per le popolazioni particolari es. celiaci o allergie o chi
assume farmaci. Al di là di queste categorie non ci sono dati tossicologici, per la lunga storia di utilizzo. Il
livello A pertanto è sicuro.

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