INTRODUZIONE ALLA BIOLOGIA MOLECOLARE

Questa guida di studio offre un’analisi rigorosa della biologia molecolare, esaminando in
profondità le basi biochimiche della vita, dalla struttura complessa di proteine e acidi
nucleici fino ai sofisticati meccanismi di regolazione genica. Il testo copre i pilastri
fondamentali della disciplina: l’organizzazione del genoma, la dinamica della replicazione
del DNA, la trascrizione, la maturazione dei trascritti, la riparazione dei danni genetici e le
moderne tecniche di bioingegneria (PCR, clonaggio, CRISPR/Cas9), fornendo una visione
integrata dei processi cellulari essenziali negli organismi procarioti ed eucarioti.

0. LE BASI: ESPERIMENTI STORICI E IL CODICE GENETICO

Prima di comprendere la struttura, è fondamentale sapere come il DNA è stato

identificato come portatore dell’informazione:

1. L’esperimento di Griffith (1928): Dimostrò il Principio Trasformante. Batteri

Streptococcus pneumoniae del ceppo R (rugosi, non virulenti) acquisivano letalità se
miscelati con ceppi S (lisci, virulenti) inattivati al calore.
2. L’esperimento di Avery, MacLeod e McCarty (1944): Dimostrò che il principio
trasformante di Griffith era il DNA. Trattando l’estratto del ceppo S con Proteasi,
RNasi e DNasi, solo la distruzione del DNA (con la DNasi) impediva la
trasformazione del ceppo R.
3. L’esperimento di Hershey e Chase (1952): Utilizzando il fago T2, marcarono le
proteine virali con Zolfo radioattivo (35 S ) e il DNA con Fosforo radioattivo (32 P ).
Dopo l’infezione di E. coli e la centrifugazione, dimostrarono che solo il Fosforo (
32
P , quindi il DNA) entrava nella cellula per dirigere la replicazione virale.
4. La decifrazione del Codice Genetico: Nirenberg e Matthaei (1961) sintetizzarono
un RNA artificiale composto solo da Uracile (Poli-U). In un sistema di traduzione in
vitro, questo produsse un polipeptide di sola Fenilalanina, dimostrando
definitivamente che il codone UUU codifica per l’amminoacido Phe.

1. ARCHITETTURA STRUTTURALE DELLE

MACROMOLECOLE

🧬 Struttura delle Proteine

Le proteine sono polimeri lineari formati da amminoacidi uniti da un legame peptidico
(legame covalente di condensazione tra il gruppo carbossilico −COOH di un
amminoacido e il gruppo amminico −N H2 del successivo). Si organizzano in quattro
​

livelli:

Struttura primaria: La successione lineare degli amminoacidi dall’estremità N-

terminale alla C-terminale.
Struttura secondaria: Il ripiegamento locale della catena stabilizzato da ponti
idrogeno (α-elica o foglietto β ).
Struttura terziaria: La disposizione tridimensionale globale dell’intera catena
polipeptidica.
Struttura quaternaria: L’associazione di più catene polipeptidiche (monomeri) in
un’unità funzionale.

🧬 Acidi Nucleici (DNA e RNA)

Le unità ripetitive degli acidi nucleici sono i nucleotidi, composti da: uno zucchero
pentoso (ribosio nell’RNA, desossiribosio nel DNA, che differiscono per l’assenza di un
gruppo ossidrile −OH sul carbonio 2’), una base azotata e un gruppo fosfato.

Basi Azotate: Purine (due anelli: Adenina, Guanina) e Pirimidine (un anello:
Citosina, Timina nel DNA, Uracile nell’RNA).
Reazione di Polimerizzazione: Il legame fosfodiesterico si stabilisce tra la
posizione 3’-OH di un nucleotide e il gruppo fosfato in α (posizione 5’) del
nucleotide successivo, con liberazione di pirofosfato (P Pi ). ​

Modello a Doppia Elica del DNA (Forma B)

Il DNA è una doppia elica destrorsa formata da due filamenti antiparalleli. Lo scheletro
zucchero-fosfato è esterno (idrofilo e carico negativamente), mentre le basi sono interne
(idrofobe). La stabilità è garantita da legami a idrogeno e dall’effetto idrofobico di
impilamento (stacking):

Appaiamenti: A = T (2 legami a idrogeno, meno stabili) e G ≡ C (3 legami a

idrogeno, più stabili).
Parametri geometrici della forma B (fisiologica): Diametro di 20 Å (2 nm); Passo
dell’elica di 34 Å; Distanza tra basi di 3.4 Å; circa 10.5 coppie di basi per giro.
Solchi: L’orientamento delle basi genera un solco maggiore (più largo e accessibile
alle proteine regolatrici per la lettura sequenza-specifica) e un solco minore.

Configurazioni Alternative e Strutture Particolari

 1. DNA di tipo A: Destrorso, si forma in condizioni di bassa umidità o negli ibridi
DNA-RNA.
2. DNA di tipo Z: Sinistrorso, andamento a zig-zag. Presenta basi in conformazione
SYN (anziché ANTI) esposte verso l’esterno. Si manifesta in sequenze alternate di
purine/pirimidine e alte concentrazioni cationiche.
3. Tripla elica: Si forma in tratti poli-pirimidinici o poli-purinici mediante
appaiamenti non canonici di Hoogsteen.
4. Quartetto G: Struttura planare che coinvolge 4 guanine unite da legami di
Hoogsteen, tipica dei telomeri a singolo filamento.
5. DNA cruciforme: Struttura a croce indotta da sequenze palindromiche invertite
sullo stesso filamento (ansa e stelo).

2. TOPOLOGIA DEL DNA E APPARATO NUCLEASICO

Topologia e Superavvolgimenti

Superavvolgimento negativo: Il DNA è sotto-avvolto; favorisce la denaturazione

locale dei filamenti, facilitando replicazione e trascrizione.
Superavvolgimento positivo: Il DNA è sovra-avvolto; contrasta la denaturazione
(tipico dei batteri termofili per proteggere il genoma dal calore).
Forme geometriche: Plectonemica (DNA nudo) e Toroidale (DNA avvolto attorno
agli istoni).

L’Enzima Topoisomerasi

Regolano lo stato topologico del DNA mediante un meccanismo in tre fasi catalizzato da
una tirosina nel sito attivo: Taglio (attacco nucleofilo al legame fosfodiesterico),
Manipolazione (passaggio del filamento) e Ri-legazione.

Topoisomerasi di
Caratteristica Topoisomerasi di Tipo II (es. Girasi)
Tipo I

Struttura Monomerica Dimerica / Multimerica

Meccanismo di Doppio filamento simultaneo (Segmento G

Singolo filamento
Taglio tagliato, Segmento T trasportato)

Cofattori
M g 2+ e Ca2+ Sempre ATP
richiesti
 Importanza Clinica: Le topoisomerasi sono i bersagli elettivi di farmaci
antitumorali (es. camptotechine, etoposide) e antibatterici (es. fluorochinoloni).
Bloccando la fase di ri-legazione, causano un accumulo letale di rotture
cromosomiche.

Le Nucleasi

Enzimi che scindono i legami fosfodiesterici richiedendo solitamente ioni metallici

bivalenti (M g 2+ ) per stabilizzare lo stato di transizione del fosfato.

Endonucleasi: Tagliano all’interno della catena (es. Enzimi di restrizione, Cas9,

DNasi I, Mnasi).
Esonucleasi: Rimuovono nucleotidi dalle estremità; es. attività 3′ → 5′
(proofreading) della DNA Pol III e attività 5′ → 3′ della DNA Pol I.

3. DINAMICA DELLA REPLICAZIONE DEL DNA

Il processo è semiconservativo (dimostrato dall’esperimento di Meselson e Stahl con

isotopi 15 N e 14 N in gradienti di CsCl) e tipicamente bidirezionale, operato dal
complesso macromolecolare noto come replisoma.

Direzioni del Replisoma:

Filamento Leading (Guida): 5' --------------------> 3' (Sintesi Continua)
Filamento Lagging (Lento): 3' --------------------> 5' (Frammenti di Okazaki)

Il Macchinario di Polimerizzazione

La sintesi richiede una giunzione innesco:stampo e deossinucleosidi trifosfato (

dN T P s). Avviene esclusivamente in direzione 5′ → 3′ .

La DNA Polimerasi: Struttura a “mano destra” (Palmo con sito catalitico, Dita per
l’allineamento dei dNTP, Pollice per la processività). L’accuratezza è guidata dal
cambio conformazionale dell’elica O (da “aperta” a “chiusa” solo con il corretto
appaiamento).
Frammento di Klenow: Variante della DNA Pol I batterica ottenuta per taglio
proteolitico, priva dell’attività esonucleasica 5′ → 3′ , usata in vitro per mantenere
solo polimerizzazione e proofreading.

Replicazione nei Procarioti ([Link])

 1. Inizio: Presso l’unica origine OriC. La proteina DnaA lega le ripetizioni a 9 bp
avvolgendo il DNA; DnaB (Elicasi) denatura le sequenze ricche in AT; le proteine
SSB stabilizzano il singolo filamento. La tensione topologica anteriore è risolta dalla
Girasi.
2. Terminazione: Avviene nelle sequenze ter, dove la proteina Tus blocca la forca
replicativa in modo unidirezionale. Le molecole figlie catenate vengono separate
dalla Topoisomerasi IV.
3. Regolazione: La replicazione è limitata a un ciclo grazie a SeqA, che si lega ai siti
GAT C emimetilati subito dopo il passaggio della forca, impedendo il ri-
legamento prematuro di DnaA-ATP.

Replicazione negli Eucarioti ([Link] e superiori)

Origini multiple: Siti ARS (Autonomously Replicating Sequences) ricchi in AT.

Regolazione del Ciclo Cellulare: In fase G1 (bassa attività CDK), si assembla il
complesso di pre-replicazione (pre-RC: ORC, Cdc6, Cdt1, e l’elicasi MCM).
All’ingresso nella fase S (alta attività CDK), la fosforilazione induce il rilascio di Cdt1
e Cdc6, attivando il replisoma ed evitando il re-firing delle origini.
Il problema della replicazione terminale: Risolto dai Telomeri (ripetizioni
5′ − T T AGGG − 3′ nell’uomo). La Telomerasi è una ribonucleoproteina
contenente TERT (trascrittasi inversa) e TERC (stampo a RNA). Protegge le
estremità formando strutture a T-loop o quartetti G.

4. MUTAZIONI, DANNO E RIPARAZIONE DEL DNA

I genomi sono costantemente esposti a danni fisici e chimici. Mantenere l’integrità è
vitale per prevenire l’instabilità genomica.

Tipi di Mutazioni

Puntiformi: Transizioni (purina → purina o pirimidina → pirimidina) e Trasversioni

(purina ↔ pirimidina).
Effetto codificante: Missenso (cambia l’amminoacido), Nonsenso (crea un codone
di stop prematuro), Silente (amminoacido inalterato grazie alla degenerazione del
codice).
Frameshift: Inserzioni o delezioni che sfasano l’intera cornice di lettura.
Agenti Mutageni: Analoghi delle basi (es. 5-bromouracile), deaminanti
(convertono C in U), agenti intercalanti (es. bromuro di etidio, causano
scivolamento della polimerasi) e Radiazioni UV (creano dimeri di timina).
Meccanismi di Riparazione Cellulare

1. Riparazione Diretta: Inversione enzimatica del danno senza rimozione di

nucleotidi. Esempio: la Fotoliasi (nei batteri/piante) scinde i dimeri di timina usando
l’energia della luce visibile. La Metiltransferasi rimuove i gruppi alchilici agendo
come enzima suicida.
2. Mismatch Repair (MMR): Corregge gli errori di appaiamento sfuggiti al
proofreading post-replicativo. In [Link], il complesso MutS/MutL/MutH distingue
il filamento parentale (corretto) da quello neosintetizzato (errato) perché
quest’ultimo, per un breve periodo temporale, non è metilato sulle sequenze GATC.
3. Base Excision Repair (BER): Ripara singole basi alterate chimicamente (es. Uracile
nel DNA). Una DNA Glicosilasi riconosce e taglia la base errata, lasciando un sito
abasico (AP). L’AP endonucleasi taglia lo scheletro fosfodiesterico, la Polimerasi
colma il buco e la Ligasi salda.
4. Nucleotide Excision Repair (NER): Rimuove danni ingombranti che distorcono
l’elica (es. dimeri di timina o addotti chimici voluminosi). Il complesso
UvrA/UvrB/UvrC incide il DNA a monte e a valle della lesione, rimuovendo un
frammento oligonucleotidico di 12-13 basi.
5. Riparazione Translesione (Risposta SOS nei batteri): Se un danno massivo
blocca la forca replicativa, il DNA a singolo filamento (ssDNA) accumulato attiva la
proteina RecA. RecA stimola l’autoclivaggio del repressore LexA, accendendo un
set di geni di emergenza. Vengono reclutate polimerasi specializzate (Pol IV, Pol V)
in grado di bypassare fisicamente la lesione, ma essendo prive di proofreading,
inducono un alto tasso di mutazioni (meccanismo error-prone).

5. RICOMBINAZIONE GENETICA
La riorganizzazione delle sequenze nucleotidiche è essenziale per la variabilità genetica
(crossing-over) e per la riparazione delle letali rotture a doppio filamento (DSB).

1. Ricombinazione Omologa (HR)

Avviene tra sequenze di DNA identiche o estremamente simili (cromosomi omologhi).

Segue il Modello della Giunzione di Holliday.

Iniziazione (RecBCD): Il complesso elicasico/nucleasico si lega al DSB ed elabora le

estremità, degradando il DNA fino a incontrare una specifica sequenza Chi,
generando code a singolo filamento sporgenti al 3’.
Invasione del filamento (RecA): La proteina RecA (l’omologo Rad51 negli
eucarioti) polimerizza sul ssDNA formando un filamento nucleoproteico. Questo
 complesso guida l’invasione nel duplex intatto (ricerca dell’omologia), formando
una struttura nota come D-loop.
Migrazione del chiasma (RuvAB): Il complesso proteico RuvAB spinge il punto di
incrocio (la giunzione di Holliday) lungo il DNA, scambiando i filamenti con
consumo di ATP.
Risoluzione (RuvC): Endonucleasi specializzata che taglia i filamenti incrociati della
giunzione, separando le due molecole in prodotti ricombinanti (crossing-over) o
non-ricombinanti (patch) a seconda del piano di taglio.

2. Ricombinazione Sito-Specifico

Avviene tra brevi sequenze di riconoscimento specifiche (20-30 bp) che non necessitano
di omologia estesa, ed è mediata da enzimi chiamati Ricombinasi (a tirosina o a serina).

Esempi chiave usati in laboratorio: Il sistema Cre/LoxP (derivato dal fago P1) e
FLP/FRT (dal lievito).
Funzionamento: Se i due siti LoxP inseriti nel DNA sono orientati nella stessa
direzione (ripetizioni dirette), l’enzima Cre deleterà la sequenza interposta (tecnica
fondamentale per creare topi knock-out condizionali); se i siti sono invertiti, Cre
invertirà la sequenza.

6. STRUTTURA DEL GENOMA E CROMATINA

Organizzazione Genomica e il “Paradosso del Valore C”

Non vi è correlazione lineare tra la dimensione del genoma e la complessità biologica

dell’organismo (Paradosso del valore C). Negli eucarioti, l’ampiezza del genoma riflette
l’alto tasso di sequenze non codificanti e ripetute:

Elementi Trasponibili (44% del genoma umano): Retrotrasposoni (intermedio a

RNA) e Trasposoni a DNA. Mediano il mosaicismo somatico, in particolare nel
sistema nervoso centrale.
DNA Satellite: Microsatelliti (STR) (ripetizioni di 1-10 bp, polimorfici tra individui) e
Minisatelliti (11-100 bp).

Organizzazione della Cromatina

La cromatina (DNA, istoni, proteine non istoniche e RNA) si organizza in:

 Eucromatina: Struttura aperta, trascrizionalmente attiva, replica precocemente in
fase S.
Eterocromatina: Struttura condensata, trascrizionalmente silente, replica
tardivamente. Si suddivide in Costitutiva (strutturale, es. centromeri) e Facoltativa
(regolata cellula-specifica).

Il Nucleosoma e il Codice Epigenetico

È l’unità fondamentale della cromatina: circa 147 bp di DNA avvolti per 1.65 giri attorno a
un ottamero istonico composto da due copie di ciascun istone del core (
H2A, H2B, H3, H4). Il DNA linker varia da 20 a 60 bp ed è legato dall’istone H1 per
formare la fibra da 30 nm.

Basi Biochimiche: Gli istoni sono ricchi di amminoacidi basici carichi

positivamente (Lisina, Arginina) per interagire con i fosfati del DNA.
Modificazioni Post-Traduzionali: Le code N-terminali subiscono modifiche
reversibili:

💡 Focus: Acetilazione vs Metilazione

Acetilazione (HAT): Neutralizza la carica positiva delle lisine, riduce l’affinità

istone-DNA e apre la cromatina (Eucromatina / Trascrizione attiva).
Metilazione del DNA (DNMT): Avviene sulle citosine dei dinucleotidi CpG (Isole
CpG nei promotori). La metilazione de novo (DNMT3A/3B) e il mantenimento
(DNMT1) inducono il silenziamento genico reclutando proteine con dominio
MBD, che compattano la cromatina. La demetilazione attiva è mediata dagli
enzimi TET.

Confronto Strutturale tra Istoni Canonici e Varianti

Le varianti istoniche sono espresse in modo indipendente dalla replicazione del DNA,
regolando finemente la compattazione locale della cromatina.

Varianti Istoniche (es.

Caratteristica Istoni Canonici
H2A.Z, [Link])

Dipendenza dalla No (espresse durante tutto il

Sì
fase S ciclo)

Struttura del gene Privi di introni Contengono introni

Termina con una struttura a Presenta una coda Poli(A)

mRNA
forcella (stem-loop) canonica
 1-2 copie geniche single-
Numero di Copie Geni altamente ripetuti (> 50)
locus

7. MECCANISMI DI TRASCRIZIONE GENICA

🦠 Trascrizione nei Procarioti

La trascrizione è accoppiata alla traduzione nel citoplasma. La sintesi non richiede

inneschi (primer).

L’RNA Polimerasi Core (α2 β β ′ ω ): Bassa specificità di legame.

​

Oloenzima: Si forma quando il core lega il Fattore σ , elemento essenziale per il

riconoscimento specifico delle sequenze promotrici a -10 (Pribnow box) e -35.
Fasi: Formazione del complesso chiuso → Isomerizzazione spontanea in complesso
aperto (bolla di trascrizione di ~25 bp) → Sintesi in direzione 5′ → 3′ sul filamento
stampo → Rilascio del fattore σ .
Terminazione:
Intrinseca: Formazione di una forcina strutturale ricca in G-C nell’RNA, seguita
da una coda di Poli-U che destabilizza l’ibrido DNA-RNA.
Rho-dipendente: L’esamero Rho lega la sequenza Rut sull’RNA nascente e
trasloca idrolizzando ATP fino a scalzare la polimerasi.

Modelli di Regolazione Procariotica: Gli Operoni

Gruppi di geni funzionalmente correlati coordinati da un unico promotore in un mRNA

policistronico.

1. L’Operone Lac (Controllo Catabolico del Lattosio)

Contiene i geni lacZ (β -galattosidasi tetramerica), lacY (permeasi) e lacA.

Controllo Negativo: Il repressore LacI lega l’operatore O1 ostacolando la

​

polimerasi. In presenza di lattosio, l’allolattosio funge da induttore opponendosi

al legame di LacI, che si stacca dal DNA.
Controllo Positivo: In assenza di glucosio, l’adenilato ciclasi produce cAMP. Il
complesso CAP-cAMP lega il promotore debole, stabilizzando l’RNA polimerasi per
massimizzare la trascrizione.

2. L’Operone Trp (Biosintesi del Triptofano)

 Repressione: Il triptofano in eccesso agisce come co-repressore legandosi a TrpR,
attivandolo per il blocco dell’operatore.
Attenuazione: Meccanismo basato sulla velocità del ribosoma sul trascritto leader
(composto da 4 sequenze complementari):
Basso Trp: Il ribosoma si arresta sui codoni Trp della sequenza 1; la sequenza
2 si appaia con la 3, impedendo la formazione della forcina di terminazione
3-4. La trascrizione prosegue.
Alto Trp: Il ribosoma scorre velocemente coprendo la sequenza 2; le
sequenze 3 e 4 si appaiano formando un terminatore intrinseco. La
trascrizione si interrompe.

🦠 Il Fago Lambda (λ): L’Interruttore Genetico

Il virus batterico λ infetta [Link] e deve scegliere tra due destini vitali basandosi sullo
stato nutrizionale della cellula (livelli di proteasi Hfl):

1. Ciclo Lisogeno (Dormienza): Il fago integra silente il suo genoma in quello

batterico (diventando un profago).
Il promotore PRE esprime cI (il Repressore Lambda).
​

La proteina cI dimerizza e lega con estrema affinità gli operatori destri (OR 1, ​

OR 2), bloccando fisicamente la trascrizione di tutti gli altri geni virali ma

​

stimolando positivamente il suo stesso promotore di mantenimento (PRM ). ​

2. Ciclo Litico (Moltiplicazione e Lisi): In condizioni di stress acuto (danno al DNA →

risposta SOS → accumulo di RecA), RecA cliva enzimaticamente il repressore cI.
Liberato l’operatore, la proteina virale Cro prende il sopravvento, lega
l’operatore OR 3 e spegne per sempre la sintesi di cI.
​

Si innesca l’espressione a cascata dei geni precoci intermedi e tardivi

necessari per costruire le teste virali, assemblare i virioni e lisare la cellula
batterica.

Meccanismo di Antiterminazione: Per esprimere i geni tardivi, le proteine fagiche

N e Q si legano all’RNA polimerasi batterica, modificandola in modo da impedirle di
riconoscere i segnali di stop fisiologici. Questo permette la “lettura prolungata”
(readthrough) necessaria per trascrivere l’intero operone litico.

🧬 Trascrizione negli Eucarioti

Il processo richiede tre classi distinte di RNA Polimerasi dedicate e complessi sistemi
regolatori a distanza (Enhancer, Silencer, Insulator).

RNA Pol I: Trascrive i geni per il precursore degli rRNA grandi (28S, 18S, 5.8S)
organizzati in cluster tandem.
 RNA Pol II: Trascrive gli mRNA codificanti, miRNA, snRNA e lncRNA.
RNA Pol III: Trascrive i tRNA, l’rRNA 5S e piccoli RNA strutturali.

Il Complesso di Pre-inizio (Pol II)

Il reclutamento basale sul promotore (che può contenere la TATA box o essere TATA-less)
richiede i fattori generali della trascrizione (GTF):

1. TFIID: Contiene la TBP (TATA-Binding Protein), che lega il solco minore introducendo
una curvatura di 80° nel DNA.
2. Reclutamento coordinato di TFIIB, TFIIF, TFIIE e TFIIH (attività elicasica e chinasica).
3. La Coda CTD (Carbossi-Terminale): Formata dalla ripetizione dell’eptapeptide
Y1 S2 P3 T4 S5 P6 S7 . Il profilo di fosforilazione ne coordina la transizione: la
​ ​ ​ ​ ​ ​ ​

fosforilazione della Serina 5 avvia l’inizio e recluta i macchinari di capping; la

fosforilazione della Serina 2 coordina l’allungamento massivo e lo splicing finale.
4. Il Complesso del Mediatore: Grande impalcatura proteica che funge da ponte
molecolare, trasmettendo i segnali coordinati dai fattori di trascrizione legati agli
enhancer distanti direttamente alla RNA Pol II basale.

8. MATURAZIONE POST-TRASCRIZIONALE DELL’RNA

(PROCESSING)

Maturazione del pre-mRNA Eucariotico

L’RNA neosintetizzato non è subito funzionale, ma deve subire tre modifiche co/post-
trascrizionali:

1. Capping al 5’: Aggiunta covalente di una 7-metilguanosina tramite legame

anomalo 5′ − 5′ trifosfato. Protegge dall’esonucleasi e avvia la traduzione.
2. Poliadenilazione al 3’: Il complesso CPSF riconosce la sequenza AAU AAA,
mentre CstF lega una regione ricca in GU a valle. Avviene il taglio endonucleasico e
la PAP (PoliA Polimerasi) sintetizza la coda di Poli(A), stabilizzata dalla PolyA
Binding Protein (PABP).
Siti di Taglio Alternativi (APA): Generano 3’ UTR di lunghezze variabili,
modificando la stabilità del messaggero per la rimozione o l’aggiunta di
target per miRNA.
3. Splicing del pre-mRNA: Rimozione degli introni non codificanti e unione degli
esoni.
Meccanismo Biochimico dello Splicing

Consiste in due reazioni consecutive di trans-esterificazione coordinate dallo

spliceosoma (complesso dinamico di ribonucleoproteine snRNP):

Il 2’-OH di un’Adenina interna (Sito di ramificazione) compie un attacco

nucleofilo sul fosfato del Sito Donatore 5’ (sequenza consenso GT), generando
una struttura a cappio (lariat).
Il 3’-OH libero dell’esone a monte attacca il fosfato del Sito Accettore 3’ (sequenza
consenso AG), saldando i due esoni e liberando l’introne.

🧮 Meccanismi Autocatalitici (Ribozimi): Alcuni introni compiono autosplicing senza

spliceosoma. Gli Introni di Gruppo I utilizzano una guanosina esogena come
nucleofilo per innescare il taglio; gli Introni di Gruppo II utilizzano un’adenina interna
con un meccanismo biochimico identico a quello dello spliceosoma, suggerendo un
forte legame evolutivo diretto.

Lo Splicing Alternativo e il suo Controllo

Permette l’espressione di diverse isoforme proteiche a partire da un singolo locus genico

(exon skipping, siti donatori/accettori alternativi, ritenzione intronica). È regolato da
elementi di sequenza (cis) riconosciuti da fattori proteici (trans):

Proteine SR: Legano gli enhancer di splicing (ESE/ISE) reclutando lo spliceosoma

per promuovere l’inclusione dell’esone.
Proteine hnRNP: Legano i silencer di splicing (ESS/ISS), mascherando i siti di
giunzione o creando ostacoli strutturali per escludere l’esone.

Classi di RNA Non Codificanti (ncRNA) e Maturazione

Maturazione rRNA: Taglio endo ed esonucleasico di lunghi precursori guidato da

piccoli RNA nucleolari (snoRNA: famiglie C/D box per la 2’-O-metilazione e H/ACA
box per la pseudouridilazione).
Maturazione tRNA: Rimozione delle estremità 5’ e 3’, aggiunta enzimatica della
sequenza terminale 3′ − CCA (sito di legame dell’amminoacido vicino al
nucleotide discriminante) e splicing degli eventuali introni.
MicroRNA (miRNA): Piccoli RNA di regolazione post-trascrizionale (circa 22 nt).

Drosha (Nucleo) Exportin-5

pri-miRNA (Pol II) ​ pre-miRNA (Forcina) ​ Citoplas

Un singolo filamento viene caricato sul complesso RISC (miRISC): un appaiamento

 perfetto con il 3’ UTR del trascritto target ne induce la degradazione immediata; un
appaiamento imperfetto ne blocca la traduzione.
Long Non-Coding RNA (lncRNA): Trascritto > 200 nucleotidi. Agiscono come
Guida per complessi modificatori della cromatina, Scaffold (impalcatura strutturale
per complessi multiproteici) o Decoy (esca per sequestrare fisicamente i miRNA).
Esempio clinico BDNF-AS: Il trascritto antisenso BDNF-AS recluta il complesso
repressivo PRC2 sul locus del gene BDNF, inducendo la metilazione
eterocromatica H3K27me3 e silenziando attivamente il gene.

9. TRADUZIONE E SINTESI PROTEICA

′
L’informazione codificata nell’mRNA viene letta in direzione 5 → 3′ a triplette di
nucleotidi (codoni) dal ribosoma (composto dalle subunità maggiore e minore,
strutturato nei siti funzionali A [Aminoacidico], P [Peptidilico] ed E [Exit]).

Codice Genetico: Avviato dal codone di START (AUG, Metionina) e interrotto dai
codoni di STOP (UAA, UAG, UGA). La corretta cornice di lettura (Reading Frame) è
definita dall’assenza di stop prematuri (ORF).
Caricamento del tRNA: L’amminoacil-tRNA sintetasi ancora covalentemente
l’amminoacido all’estremità 3’ del tRNA corrispondente in due tappe: attivazione
dell’amminoacido tramite AT P (formazione di amminoacil-AMP) → trasferimento
sul tRNA con rilascio di AM P . L’enzima possiede un sito di proofreading idrolitico
per garantire l’estrema fedeltà di accoppiamento.
Fenomeno del Vacillamento (Wobble): Permette a un singolo anticodone di
riconoscere più codoni sinonimi. I primi due nucleotidi del codone (posizioni 5′
dell’mRNA) si appaiano in modo stringente con le posizioni 3′ dell’anticodone; la
terza base del codone (posizione 3′ ) gode di flessibilità geometrica e può formare
appaiamenti non canonici (es. G − U , o interazioni mediate dalla base modificata
Inosina).

Analisi Comparativa dell’Inizio della Traduzione

Procarioti

Primo amminoacido: N -formil-metionina (la formilazione impedisce l’inserimento

dell’amminoacido iniziatore all’interno dell’allungamento).
Riconoscimento: La subunità minore 30S si posiziona grazie all’interazione tra
l’rRNA 16S e la sequenza di Shine-Dalgarno situata a monte del codone AUG.
Fattori: IF1 e IF3 mantengono separate le subunità; IF2-GTP inserisce il tRNA
iniziatore direttamente nel sito P.
Eucarioti

Primo amminoacido: Metionina canonica.

Riconoscimento: Meccanismo di scansione (scanning). Il complesso eIF4F
(composto da eIF4E che lega il Capping 5’, eIF4G strutturale ed eIF4A ad attività
elicasica) distende le strutture secondarie del 5’ UTR. La subunità minore scansiona
il filamento fino a identificare l’AUG inserito nella sequenza consenso di Kozak.
Pseudocircolarizzazione: La PABP (legata al Poli-A 3’) interagisce direttamente con
eIF4G (legato al Cap 5’), inducendo una conformazione circolare dell’mRNA che
ottimizza il riciclo dei ribosomi sul filamento.

Allungamento, Terminazione e Mimetismo Molecolare

Durante l’allungamento, il tRNA carico entra nel sito A veicolato dal fattore EF-Tu-GTP
(EF1 negli eucarioti). Avvenuta la transpeptidazione, il fattore EF-G-GTP (EF2 negli
eucarioti) catalizza la traslocazione del ribosoma di tre nucleotidi.

Mimetismo Molecolare: Il fattore di traslocazione EF-G-GTP presenta

un’architettura tridimensionale quasi identica a quella del complesso binario EF-
Tu/aa-tRNA. Questa analogia strutturale gli permette di occupare stabilmente il sito
A del ribosoma per guidare lo spostamento meccanico.
Terminazione: I fattori di rilascio (RF1/RF2 nei procarioti; eRF negli eucarioti)
riconoscono i codoni di STOP, idrolizzando il legame estere tra la catena
polipeptidica e il tRNA nel sito P.

Meccanismi di Regolazione Traduzionale Globale e Specifica

1. Via di segnalazione mTOR (Proliferazione): In condizioni metaboliche ottimali, la

chinasi mTOR fosforila le proteine inibitrici 4E-BP. Una volta fosforilate, le 4E-BP
perdono affinità per eIF4E, permettendo la formazione del complesso attivo eIF4F
e avviando massivamente la traduzione. In condizioni di stress o apoptosi, le
caspasi degradano eIF4G bloccando irreversibilmente la sintesi.
2. Via dello Stress e Fosforilazione di eIF2: Sotto stress (es. infezione virale, carenza
amminoacidica rilevata dalla chinasi GCN2), eIF2 viene fosforilato sulla subunità α.
Questo blocca il fattore di scambio nucleotidico eIF2B, impedendo la rigenerazione
di eIF2-GTP. La sintesi proteica globale si arresta, ma viene favorita la traduzione
selettiva di mRNA di risposta allo stress (es. il fattore di trascrizione GCN4),
sfruttando lo scorrimento alternativo su piccole cornici di lettura a monte (uORF).
3. Regolazione Mediata da Strutture nel 5’ UTR: * Quartetti G: Strutture stabili nel 5’
UTR bloccano fisicamente lo scanning del ribosoma, richiedendo elicasi specifiche
per l’attivazione.
 Sistema Ferritina/IRE: In assenza di ferro, le proteine IRP legano le sequenze
IRE (Iron Responsive Element) nel 5’ UTR dell’mRNA della ferritina, bloccando
fisicamente l’accesso del ribosoma. L’aumento del ferro induce il distacco
allosterico di IRP, sbloccando la traduzione per immagazzinare il ferro in
eccesso.

10. METODOLOGIE SPERIMENTALI IN BIOLOGIA

MOLECOLARE

🧮 Spettrofotometria degli Acidi Nucleici

Gli acidi nucleici assorbono la luce UV con un picco a 260 nm dovuto alle basi azotate. La
denaturazione termica espone le basi aumentando l’assorbanza complessiva del
campione (Effetto Ipercromico). La temperatura alla quale il 50% del DNA è a singolo
filamento è definita Temperatura di Fusione (Tm ), ed è direttamente proporzionale al
​

contenuto di coppie G ≡ C.
La purezza degli estratti viene stimata tramite rapporti spettrofotometrici:

A260 /A280 ∼ 1.8 (DNA) o ∼ 2.0 (RNA). Valori inferiori indicano

​ ​

contaminazione da proteine o composti fenolici.

A260 /A230 ∼ 2.0 − 2.2. Valori inferiori indicano la presenza di sali caotropici,
​ ​

carboidrati o fenolo.

Estrazione Chimica e Purificazione

Lisi e Inibizione: Rottura delle membrane tramite detergenti (SDS o NP40 per lisi
2+
differenziale citoplasma/nucleo). L’EDTA chela gli ioni M g disattivando le DNasi.
Le RNasi, prive di cofattori metallici e termoresistenti, richiedono l’uso di agenti
denaturanti forti (Guanidina Tiocianato) o inibitori specifici (RNasina).
Estrazione Organica (Fenolo-Cloroformio): Sfrutta la ripartizione di fase indotta
dal pH. A pH neutro il DNA e l’RNA restano nella fase acquosa superiore. A pH
acido (5-6), il DNA si sposta nella fase organica inferiore o nell’interfase proteica,
permettendo l’isolamento selettivo dell’RNA nella fase acquosa.
Fase Solida: Adsorbimento selettivo su membrane di silice in presenza di sali
caotropici, lavaggio ed eluizione in soluzioni a bassa salinità.
Isolamento Specifico di Frazioni di RNA: L’mRNA eucariotico viene isolato
mediante cromatografia d’affinità utilizzando biglie coniugate a catene di timine
(oligo-dT) che legano le code di Poli-A. La deplezione dell’rRNA sfrutta invece sonde
biotinilate complementari alle sequenze ribosomiali.
Reazione a Catena della Polimerasi (PCR)

Consiste nell’amplificazione esponenziale in vitro di un frammento di DNA stampo

compreso tra due primers oligonucleotidici specifici (lunghezza 18-22 basi, Tm bilanciata ​

tra 52-60°C, contenuto GC 40-60%), operata da una polimerasi termostabile (Taq

Polimerasi).

Protocollo Classico a 3 Step (End-Point)

1. Denaturazione (95°C): Apertura termica dei ponti idrogeno del doppio filamento.
2. Appaiamento / Annealing (45-60°C): Legame specifico dei primers ai filamenti
singoli. Temperature troppo basse causano legami aspecifici; temperature troppo alte
impediscono l’appaiamento.
3. Allungamento (72°C): Attività polimerasica ottimale della Taq Pol.

L’amplificazione teorica segue la legge cinetica:

Nf = Ni ⋅ 2n
​ ​

(dove Nf è il numero di molecole finali, Ni le iniziali e n il numero di cicli completati). Nella

​ ​

PCR End-point, il risultato viene analizzato solo al plateau mediante elettroforesi su gel di
agarosio.

PCR Quantitativa in Tempo Reale (qPCR)

Permette la quantificazione dello stampo durante la fase esponenziale della reazione,

evitando l’effetto plateau della PCR tradizionale. Spesso adotta un protocollo rapido a 2
step (fondendo annealing e allungamento a ~60°C). La rilevazione avviene tramite due
chimiche alternative:

SYBR Green: Fluoroforo aspecifico che emette fluorescenza ad alta intensità solo
quando si intercala nel DNA a doppio filamento (dsDN A).
Sonde TaqMan: Oligonucleotidi sequenza-specifici marcati con un fluoroforo
(Reporter, R) al 5’ e uno spegnitore (Quencher, Q) al 3’. Sfruttano l’attività
esonucleasica 5′ → 3′ della polimerasi: durante l’allungamento, l’enzima idrolizza
la sonda separando fisicamente il Reporter dal Quencher ed emettendo così un
segnale luminoso quantificabile.

🧮 Il Parametro Ct ​ (Ciclo Soglia / Threshold Cycle): È il numero di ciclo esatto in cui la

fluorescenza emessa supera significativamente il rumore di fondo (baseline). Il valore
di Ct è inversamente proporzionale alla quantità di stampo iniziale: un campione
​

molto concentrato raggiungerà la soglia a un Ct basso. ​

Metodologie di Indagine Molecolare Genomica e Trascrizionale

Northern Blotting: Separazione dell’RNA mediante elettroforesi in condizioni

denaturanti (es. formaldeide per prevenire strutture secondarie intramolecolari),
trasferimento per capillarità su membrana di nylon e ibridazione con sonde
complementari marcate (es. digossigenina). Richiede l’uso di un gene reporter
costitutivo (housekeeping) come controllo di carico costante.
RT-PCR (Retrotrascrizione-PCR): Conversione dell’mRNA in DNA complementare
(cDNA) stabile mediante l’enzima Trascrittasi Inversa innescato da oligo-dT,
random primers o primer gene-specifici, seguito dall’amplificazione PCR.
Geni Reporter: Sostituzione della CDS di un gene con una sequenza facilmente
tracciabile (es. GFP, proteina verde fluorescente) posta sotto il controllo del
promotore in esame, utile per mappare spazialmente e temporalmente l’attività
trascrizionale dei fattori di regolazione.
EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay): Analisi in vitro delle interazioni
proteina-DNA. Il legame tra una proteina e un frammento di DNA ne aumenta la
massa molecolare, determinando un ritardo di migrazione (uno shift verso l’alto)
durante l’elettroforesi su gel di poliacrilammide rispetto al DNA nudo.
ChIP (Immunoprecipitazione della Cromatina): Consente la mappatura in vivo
dei siti di legame proteici o delle modificazioni istoniche genome-wide. Prevede il
fissaggio chimico reversibile dei complessi tramite formaldeide (cross-linking), la
frammentazione del DNA mediante ultrasuoni (sonicazione) o digestione
enzimatica con Mnasi (utile per mappare il DNA linker nucleosomale),
l’immunoprecipitazione selettiva tramite anticorpi coniugati a biglie magnetiche,
l’inversione del cross-linking termico e l’analisi del DNA purificato tramite qPCR o
sequenziamento massivo (ChIP-seq).
Saggio di Ipersensibilità alla DNasi I: Identifica le regioni di cromatina aperta
(priva di nucleosomi, tipica dei promotori attivi), in quanto selettivamente
suscettibili al taglio da parte dell’endonucleasi DNasi I.

Clonaggio Molecolare e DNA Ricombinante

Tecnica di isolamento e inserimento di una sequenza d’interesse all’interno di un vettore

plasmidico autonomo.

1. Digestione (Taglio): Sfrutta gli Enzimi di Restrizione di Tipo II (endonucleasi

sequenza-specifiche che tagliano all’interno di siti palindromici). Possono generare
estremità sfalsate (Sticky ends, altamente efficienti per l’appaiamento di basi
complementari) o piatte (Blunt ends, prive di sporgenze).
2. Ligazione (Cucitura): La DNA Ligasi catalizza la formazione del legame
fosfodiestere tra l’inserto e il vettore aperto, consumando AT P .
 3. Trasformazione: Introduzione del plasmide ricombinante in batteri resi
chimicamente competenti mediante trattamento con Cloruro di Calcio (CaCl2 ) e ​

agenti crioprotettori (glicerolo). L’ingresso del DNA è indotto da shock termico

(alternanza rapida ghiaccio-42°C) o elettroporazione.
4. Selezione: Piastratura su terreni di coltura solidi contenenti un antibiotico selettivo
(es. ampicillina). Sopravvivono solo i cloni batterici che hanno incorporato il
plasmide contenente il gene di resistenza. Il controllo finale dell’inserto avviene
tramite mappa di restrizione o PCR end-point.

Tecnologie di Sequenziamento del DNA

Metodo Sanger (Enzimatico Classico): Si basa sull’inclusione competitiva di

dideossinucleotidi trifosfato (ddNTPs) privi del gruppo 3’-OH essenziale per
l’allungamento della catena, provocando l’arresto della sintesi in punti casuali. I
frammenti marcati vengono separati ad altissima risoluzione mediante
elettroforesi capillare e rilevati tramite spettrometri laser.
Next Generation Sequencing (NGS - Sequenziamento Massivo Parallelo):
Consente la lettura simultanea di milioni di frammenti genomici. Nella seconda
generazione, prevede la frammentazione genomica e legame di adattatori
(preparazione della Libreria), l’amplificazione clonale su supporto solido (Emulsion
PCR o Bridge Amplification) e il sequenziamento per sintesi, come il
Pirosequenziamento (rilevazione ottica dei fotoni liberati dal rilascio di
pirofosfato a ogni singola incorporazione nucleotidica tramite telecamere CCD).

11. GENOME EDITING ED INGEGNERIA GENETICA

MIRATA

Le tecnologie di editing genomico modificano il DNA inducendo rotture mirate del doppio
filamento (DSB ), attivando forzatamente i sistemi di riparazione endogeni della cellula:

NHEJ (Non-Homologous End Joining): Unione diretta delle estremità interrotte. È un

meccanismo rapido ma incline all’errore, che introduce piccole inserzioni o
delezioni (indels) ideale per il silenziamento genico definitivo (knock-out).
HDR (Homology Directed Repair): Meccanismo di riparazione fedele che utilizza un
filamento stampo omologo. Fornendo un frammento esogeno ingegnerizzato dallo
sperimentatore (donor template), permette l’inserimento preciso di sequenze
specifiche nel genoma (knock-in).

Piattaforme di Editing a Confronto

Le tecnologie storiche (ZFN e TALENs) e le Meganucleasi basano la specificità del
legame sul DNA su complessi domini strutturali di natura proteica: nelle ZFN ogni modulo
riconosce triplette di nucleotidi, mentre nelle TALENs ogni ripetizione amminoacidica
riconosce una singola base. Entrambe le piattaforme richiedono la fusione con il dominio
nucleasico eterodimerico dell’enzima FokI per effettuare il taglio. La difficoltà intrinseca
di ingegnerizzazione proteica sequenza-specifica e l’alto rischio di tagli aspecifici (off-
target) limitano fortemente queste vecchie tecnologie.

Il Sistema CRISPR/Cas9

Derivato dal meccanismo di immunità adattativa dei procarioti contro le infezioni virali
(articolato nelle fasi biologiche di Acquisizione dei frammenti virali nel locus CRISPR,
Espressione/Maturazione dei trascritti a RNA e Interferenza nucleasica).

A differenza dei sistemi precedenti, CRISPR/Cas9 basa la specificità del targeting

sull’appaiamento Watson-Crick di una molecola di RNA guida (sgRNA) sintetica
complementare alla sequenza genomica bersaglio, semplificando drasticamente la
programmazione del sistema nel laboratorio.

Targeting Cas9:
RNA Guida (sgRNA): 5' [--- Seq. Riconoscimento ---]-(Forcina) 3'
DNA Bersaglio: 3' [--- Seq. Complementare ---]-[PAM: NGG] 5'

Il Ruolo del Motivo PAM: La nucleasi Cas9 richiede tassativamente la presenza di

una sequenza conservata PAM (Protospacer Adjacent Motif, es. 5′ − N GG − 3′ )
immediatamente adiacente al sito di legame sul DNA. La PAM permette alla Cas9 di
discriminare il genoma virale esogeno dai loci CRISPR del batterio stesso (che ne
sono privi), evitando fenomeni letali di auto-digestione genomica.
Letalità e Ottimizzazione della Specificità: Per eludere gli effetti off-target
(appaiamenti parziali ed errati dell’RNA guida che causerebbero mutazioni
collaterali), è stata ingegnerizzata la Cas9 nickase (dCas9-Nickase), mutata in uno
dei due domini catalitici in modo da tagliare un singolo filamento per volta (nick).
Utilizzando due distinte nickasi guidate da due sgRNA adiacenti e speculari, si
ottiene un taglio a doppio filamento solo nel punto esatto di cooperazione tra le
due guide, riducendo quasi a zero i tagli aspecifici.
Evoluzioni Biotecnologiche avanzate:
Dead Cas9 (dCas9): Entrambi i domini catalitici di taglio sono disattivati.
dCas9 agisce unicamente come vettore molecolare di precisione cieco,
trasportando attivatori o repressori trascrizionali, sonde fluorescenti o
modificatori epigenetici sui promotori bersaglio senza alterare la sequenza
primaria del DNA.
 Single-Base Editing: Fusione della dCas9 con enzimi deaminasi per
consentire la conversione chimica diretta di singole basi azotate (es.
transizione terapeutica da citosina a uracile) senza indurre pericolose rotture
a doppio filamento.

Principali Applicazioni Terapeutiche di CRISPR/Cas9

1. Retinite Pigmentosa: Inattivazione mirata del fattore di trascrizione retinico Nrl,

forzando la differenziazione cellulare dei precursori dei fotorecettori in bastoncelli
per arrestare la degenerazione tissutale e la perdita della vista.
2. Beta-Talassemia: Inattivazione programmata dell’enhancer del gene BCL11A (un
repressore trascrizionale). Il silenziamento di BCL11A riattiva l’espressione
fisiologica delle globine fetali (γ ) nell’individuo adulto, compensando stabilmente il
difetto patologico delle β -globine.
3. Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD): Induzione di un exon skipping mirato
tramite l’editing dei siti di splicing. Il sistema elimina l’esone genomico contenente
la mutazione non-senso bloccante, permettendo al ribosoma di tradurre una
proteina distrofina accorciata ma parzialmente stabile e funzionale.

🧬 Curiosità Evolutiva (Anti-CRISPR): La costante pressione selettiva tra batteri e

batteriofagi ha spinto i virus a sviluppare proteine anti-CRISPR (Acr). Queste molecole
bloccano fisicamente l’attività della Cas9 o ne simulano l’ingombro sterico del DNA
per distrarre il macchinario di difesa batterico. Oggi queste proteine sono oggetto di
intensi studi clinici come “interruttori di sicurezza” endogeni per spegnere
artificialmente l’attività della Cas9 nel paziente una volta completato l’editing
terapeutico.