INTRODUZIONE AI METODI

SPETTROFOTOMETRICI
• I metodi spettrofotometrici sono un gruppo di tecniche analitiche che
si basano sulla interazione di una radiazione elettromagnetica con la
materia.
• Si misura la quantità della radiazione prodotta o assorbita dalle
specie molecolari o atomiche sotto indagine.
• Tali metodi vengono classificati in base alla regione dello spettro
elettromagnetico coinvolta nella misura (es. raggi X, ultravioletto (UV),
visibile, infrarosso (IR) etc.)
Quando le radiazioni elettromagnetiche interagiscono con la materia
possono avvenire diversi fenomeni:
riflessione
dispersione
assorbimento
fluorescenza o fosforescenza (assorbimento e riemissione)
reazioni fotochimiche (assorbimento e trasformazioni chimiche)

Con il termine radiazione si intende normalmente ogni forma di energia

che si propaga mediante onde o particelle in moto (luce, suono, raggi
cosmici, radioattività, ecc.).
Le radiazioni utilizzate in spettroscopia per perturbare la materia, e
quindi ottenere informazioni sull'analita di interesse, sono
prevalentemente onde elettromagnetiche.
 PROPRIETÀ DELLA RADIAZIONE
ELETTROMAGNETICA

La radiazione elettromagnetica è una forma di energia che viene

trasmessa nello spazio ad elevate velocità.
Si definisce luce la radiazione elettromagnetica nella regione UV/visibile.
La radiazione elettromagnetica può essere descritta come un'onda avente
proprietà quali la lunghezza d'onda, la frequenza, la velocità e l'ampiezza.
Diversamente dalle onde sonore, la luce non richiede un mezzo di
supporto per la sua trasmissione e attraversa velocemente il vuoto;
viaggia con una velocità che è quasi un milione di volte più alta di
quella del suono.
Il modello ondulatorio fallisce nel rendere conto di fenomeni associati
con l'assorbimento e l'emissione di energia radiante.
Per capire questi processi, la radiazione elettromagnetica può essere
trattata come pacchetti discreti di energia o di particelle chiamati fotoni o
quanti.
 Natura ondulatoria della radiazione elettromagnetica
Molte delle proprietà delle radiazioni elettromagnetiche sono
convenientemente descritte trattando le radiazioni come onde sinusoidali
caratterizzate da lunghezza d'onda, , frequenza, , velocità, c, e
ampiezza, A.

(a) (b)
Rappresentazione di un fascio di radiazione monocromatica polarizzata nel piano (tutte
le oscillazioni o del campo elettrico o del campo magnetico giacciono in un unico piano):
campi elettrici e magnetici disposti ad angolo retto sia fra di loro che rispetto alla
direzione di propagazione (a); rappresentazione bidimensionale del vettore elettrico (b).
 PARAMETRI DI UN’ONDA

L'ampiezza A dell'onda sinusoidale è definita come la lunghezza del

vettore elettrico al massimo dell'onda.
Il tempo richiesto per il passaggio di massimi (o minimi) successivi
attraverso un punto fisso nello spazio è chiamato periodo p della
radiazione.
La frequenza  è il numero di oscillazioni del campo per secondo ed è
uguale ad 1/p. È importante tenere presente che la frequenza è
determinata dalla sorgente e rimane costante indipendentemente dal
mezzo attraversato dalla radiazione. L'unità di frequenza è l’hertz
(Hz), che corrisponde ad un ciclo per secondo, cioè, 1 Hz = 1 s–1.
Di contro, la velocità di propagazione, vi, del fronte d'onda attraverso
un mezzo è dipendente sia dal mezzo che dalla frequenza; il pedice i è
impiegato per enfatizzare questa dipendenza.
La lunghezza d'onda i è la distanza lineare fra massimi o minimi
successivi di un'onda. Il prodotto della frequenza in onde per secondo per
la lunghezza d'onda in centimetri dà la velocità vi di propagazione in
centimetri per secondo:

vi = ∙i
La velocità con la quale le radiazioni elettromagnetiche si propagano nel
vuoto, c, è indipendente dalla lunghezza d'onda ed è massima:
c = 2,99792  1010 cm/s
La velocità nell'aria differisce solo leggermente da c (è circa lo 0,03% in
meno). Nel vuoto o nell'aria la velocità della luce è convenientemente
arrotondata a 3.00  1010 cm/s = 3,00  108 m/s .
Nella materia, la radiazione si propaga ad una velocità minore di c
perché il campo elettromagnetico della radiazione, interagendo con gli
elettroni degli atomi o molecole del mezzo, si propaga meno
rapidamente.
Dal momento che la frequenza della radiazione è invariante ed è fissata
dalla sorgente, la lunghezza d'onda della radiazione deve diminuire
nel passare dal vuoto ad un mezzo contenente materia:
Il numero d'onda,  è definito come il numero di onde per centimetro,
ed è uguale a 1/. Per definizione ha le unità di cm-1.
La potenza radiante, P, in watt (W) è l'energia di un raggio che
raggiunge una data area per secondo.
L'intensità, I, è la potenza radiante per unità di angolo solido. Sebbene
non sia strettamente corretto, potenza e intensità sono frequentemente
usate indifferentemente.

L'angolo solido è l'apertura

tridimensionale nel vertice di un
cono misurata come l'area
intersecata dal cono su una
superficie sferica unitaria il cui
centro è nel vertice.
L'angolo viene misurato in
steradianti (sr).
Un fascio parallelo di luce viene fatto passare attraverso una stretta
apertura A. Se la lunghezza d’onda è dello stesso ordine di grandezza
della fenditura questa si comporta come una nuova sorgente che emette
onde come una serie di archi di quasi 180°. La direzione del fronte
dell’onda sembra così piegarsi come conseguenza del passaggio
attraverso i due bordi della fenditura.
 Una volta diffratto il fascio di
luce illumina due fenditure B e
C molto vicine.
La radiazione in uscita da
queste due fenditure viene poi
osservata su uno schermo
posto nel piano XY.

La banda centrale E è quella più intensa. La distanza tra B ed E e tra C

ed E è uguale, avviene così l’interferenza costruttiva dei due raggi diffratti
dalle fenditure portando alla formazione di una banda intensa.
L’intensità delle bande diminuisce gradualmente all’aumentare della
distanza dalla banda centrale. Si possono facilmente ricavare le
condizioni di massima interferenza costruttiva da cui derivano le altre
bande luminose.
 = angolo di diffrazione
Di solito la distanza OE è molto grande rispetto alla distanza BC fra le
fenditure e di conseguenza le linee BD, OD e CD possono essere
considerate parallele.
La linea BF è perpendicolare a CD, formando il triangolo BCF che
possiamo approssimare essere simile al triangolo DOE; di conseguenza
l’angolo CBF risulta uguale all’angolo di diffrazione.
Possiamo allora scrivere
CF = BC sin
La distanza CF è una rappresentazione adeguata della differenza dei
cammini BD e CD percorsa dai due raggi. Affinché i due raggi risultino
in fase nel punto D è necessario che CF corrisponda alla lunghezza
d’onda della radiazione o in altre parole che si abbia
 = CF = BC sin 
Si avrà interferenza costruttiva anche nel caso in cui la differenza
fra i cammini percorsi dai due raggi corrisponda a multipli interi di .
Una espressione più generale è data da:

in cui n è un numero intero chiamato ordine dell’interferenza.

n2
n2
 Natura corpuscolare della radiazione elettromagnetica
Il modello ondulatorio fallisce nel rendere conto di fenomeni associati con
l'assorbimento e l'emissione di energia radiante. Per questi processi, la
radiazione elettromagnetica deve essere trattata come una corrente di
particelle discrete o pacchetti d'onda chiamati fotoni o quanti.
L'energia di un fotone è proporzionale alla frequenza della radiazione.
Questi due aspetti della radiazione, la natura ondulatoria e quella
corpuscolare sono complementari.

dove h è la costante di Planck (6,63 × 10−34 J·s).

Il numero d'onda e la frequenza sono direttamente proporzionali
all'energia del fotone, a differenza della lunghezza d'onda, che invece è
inversamente proporzionale.
La potenza radiante di una radiazione è direttamente proporzionale al
numero di fotoni per secondo.
 hc
E  h   hc


energia
frequenza
lunghezza d’onda
Unità di  più comuni:
m = 10-6 m
nm = 10-9 m
Å = 10-10 m
 Radiazione Elettromagnetica
Esistono due differenti descrizioni della radiazione elettromagnetica (modello
ondulatorio e modello corpuscolare), che però non si escludono a vicenda in
quanto ognuno è più adatto per spiegare particolari aspetti del comportamento della
radiazione elettromagnetica e della sua interazione con la materia.

Modello ondulatorio: la radiazione Modello corpuscolare: la radiazione

elettromagnetica è descritta come un elettromagnetica è descritta come un
fenomeno ondulatorio costituito da campi flusso di particelle (fotoni o quanti) che
elettrici e magnetici in grado di si muovono a velocità pari a c e dotate
propagarsi nel vuoto. Questo modello di una determinata energia. Questo
permette di interpretare fenomeni modello permette di spiegare
come la riflessione, la rifrazione, l’assorbimento e l’emissione della
l’interferenza e la diffrazione. radiazione elettromagnetica da parte
della materia.

E  h
Lo Spettro Elettromagnetico
Lo spettro elettromagnetico copre un intervallo enorme di energie
(frequenze) e quindi di lunghezze d'onda.

Le frequenze utili vanno da >1019 Hz (raggi ) a 103 Hz (onde radio).

Per esempio, un fotone di raggi X (ν < 3 × 1018 Hz, λ <10−10 m), è circa
10000 volte più energetico di uno emesso da una normale lampada (ν < 3
× 1014 Hz, λ < 10−6 m) e 1015 volte rispetto ad uno a radiofrequenza (ν < 3 ×
103 Hz, λ < 105 m).

Si noti che la porzione del visibile, alla quale il nostro occhio è sensibile, è
solo una piccola porzione dell'intero spettro.

I vari tipi di radiazioni, come i raggi gamma () o le onde radio differiscono
dalla luce visibile solo per l'energia (frequenza) dei loro fotoni.
 INTERAZIONE DELLA RADIAZIONE CON LA MATERIA
Le interazioni della radiazione elettromagnetica con la materia possono
essere divise in due categorie:
Assorbimento ed emissione di radiazione. Questi fenomeni dipendono
dall’interazione della radiazione elettromagnetica con i diversi livelli energetici
delle specie coinvolte. Queste interazioni sono molto specifiche, essendo
legate ai livelli energetici della specie in esame, e dipendono fortemente
dall’energia della radiazione elettromagnetica considerata.
Interazioni legate alle proprietà di massa del materiale. Queste interazioni
(riflessione, rifrazione, scattering elastico, interferenza e diffrazione) dipendono
essenzialmente dalla massa del materiale coinvolto piuttosto che dai suoi livelli
di energia, e sono quindi scarsamente specifiche.

Sebbene alcuni di questi processi possano essere utilizzati a

scopi analitici, sia qualitativi che quantitativi (es. sistemi di
rivelazione basati sulle variazioni dell’indice di rifrazione), la
maggior parte dei metodi analitici spettrochimici sfrutta i processi
di assorbimento ed emissione della radiazione elettromagnetica.
Il tipo di perturbazione dell’analita dipende dalla energia della
radiazione perturbante.
Una radiazione UV può provocare transizioni degli elettroni di valenza
e di legame, non una fotoemissione degli elettroni dei livelli molecolari
interni.
Si ricordi che, per quanto possa essere intensa, una radiazione IR non
è utile per eseguire una radiografia. Intensità ed energia sono quantità
differenti.
Regioni dello spettro elettromagnetico che vengono usate nelle analisi
spettroscopiche e tipi di transizioni atomiche o molecolari che derivano
dalle interazioni della radiazione con un campione.
La radiazione a bassa energia usata nella risonanza magnetica nucleare (NMR)
e nella spettroscopia di risonanza a spin elettronico (ESR) provoca piccoli
cambiamenti, come variazione nello spin; la radiazione ad elevata energia utilizzata
nella spettroscopia a raggi  può invece produrre effetti molto più marcati, come
modifiche nella configurazione nucleare.
Radiazioni Elettromagnetiche e Interazione Molecolare
 PROCESSI RADIATIVI

Il campione viene stimolato mediante l'uso di energia sotto forma di

calore, di energia elettrica, di luce, di particelle o di reazione
chimica.

Prima della stimolazione, l'analita si trova prevalentemente nel suo

livello di energia più basso o stato fondamentale. L'applicazione
dello stimolo fa sì che alcune specie dell'analita passino ad uno stato
energetico più alto o stato eccitato.

Possiamo acquisire informazioni sull'analita misurando la radiazione

elettromagnetica emessa per ritornare allo stato fondamentale o
misurando la quantità di radiazione elettromagnetica assorbita come
risultato dell'eccitazione.
Se una sostanza è irradiata con una radiazione elettromagnetica, le
particelle di cui essa è costituita (atomi, ioni, molecole) possono interagire
con i fotoni della radiazione.
Se una particella ha livelli di energia potenziale (elettronica, vibrazionale o
rotazionale) E0, E1, E2 ecc., ed i fotoni hanno una frequenza h0,1 = E1 – E0,
oppure h0,2 = E2 – E0, ecc., un elettrone della particella può essere eccitato
dal livello fondamentale E0 al livello eccitato E1 o E2, rispettivamente.
Il processo in cui il fotone promuove l'eccitazione dell'elettrone si chiama
assorbimento. Secondo la teoria quantistica atomi, molecole o ioni
possiedono solo un numero limitato di livelli energetici discreti; perché si
abbia assorbimento della radiazione l’energia del fotone eccitante deve
essere esattamente uguale alla differenza di energia tra lo stato
fondamentale ed uno degli stati eccitati della specie assorbente.
Lo studio delle frequenze della radiazione assorbita permette di
caratterizzare le specie che costituiscono un campione di materia, dal
momento che queste differenze di energia sono caratteristiche di ciascuna
sostanza.
La particella eccitata si diseccita normalmente per decadimento
termico, trasferendo l'eccesso di energia attraverso collisioni con
altre particelle: in tal caso il decadimento è un processo non
radiativo.
Nella spettroscopia di assorbimento, si misura la quantità di luce
assorbita in funzione della lunghezza d'onda. Essa può fornirci
informazioni sul campione sia qualitative che quantitative.
Occasionalmente la particella non decade termicamente ma riemette il
fotone assorbito. Nella spettroscopia di fotoluminescenza viene
misurata l'emissione dei fotoni a seguito dell'assorbimento.
Le forme della fotoluminescenza più importanti per scopi analitici sono
la spettroscopia di fluorescenza e la spettroscopia di fosforescenza.
La fluorescenza è completa entro 10-5 secondi dal momento
dell’eccitazione. L’emissione per fosforescenza avviene invece in tempi
più lunghi, potendo continuare per minuti o persino ore dopo che è
cessata l’irradiazione.
La particella può anche essere eccitata termicamente, per esempio in
una fiamma; in tal caso la legge di Boltzmann regola la popolazione dei
livelli eccitati:
E1 E 0

n1  n0  cos t  e k T

in cui n1 e n0 sono il numero di particelle negli stati E1 e E0, cost è una

costante dipendente dai livelli coinvolti nella transizione, k = 1,38.10-23
J/°K è la costante di Boltzmann e T la temperatura assoluta.
I livelli popolati per assorbimento di energia termica (regolato dalla
legge di Boltzmann) si possono diseccitare per emissione
spontanea, cioè mediante emissione dei fotoni h0,1 = E1 – E0,
h1,2 = E2 – E1, ecc.
Un quarto processo radiativo è l'emissione stimolata. Se un atomo (o
molecola) si trova in uno stato eccitato, è stimolata l’emissione di un
fotone in presenza di una radiazione avente frequenza uguale a quella
che può essere emessa ( = (E1-E0)/h). I due fotoni che si hanno dopo
l’interazione radiazione/atomo (o molecola) hanno la stessa frequenza,
direzione, polarizzazione, fase.
In pratica l'irraggiamento con una radiazione di frequenza 0,1
stimola sia l'assorbimento sia l'emissione stimolata tra i due
livelli 0 e 1, e il risultato netto dipende dalla popolazione dei due
livelli.
Dato che il livello eccitato, di norma, è quello meno popolato, il
risultato netto è un assorbimento.
Affinché vi sia emissione stimolata deve attuarsi una inversione
di popolazione rispetto alla distribuzione normale degli stati
energetici.
Normalmente, la spettroscopia di emissione comprende i metodi nei
quali lo stimolo è costituto dal calore o dall'energia elettrica mentre nella
spettroscopia di chemiluminescenza l'eccitazione dell'analita avviene
mediante una reazione chimica.
In entrambi i casi, la misura dell'intensità emessa quando l'analita ritorna
nello stato fondamentale può fornire informazioni sulla sua identità e
concentrazione. I risultati di tale misura vengono spesso espressi
graficamente mediante uno spettro, che è un diagramma della radiazione
emessa in funzione della frequenza o della lunghezza d'onda.
 I livelli energetici coinvolti nei processi radiativi hanno natura
diversa a seconda che l’assorbitore/emettitore sia una molecola
o un atomo

SPETTRI ATOMICI

In spettroscopia atomica l’analita è

presente sotto forma di nube atomica.
L’eccitazione può avvenire unicamente
mediante un processo elettronico in cui uno
o più elettroni dell’atomo vengono eccitati ad
un livello energetico più alto.
Essendo impossibili vibrazioni e rotazioni, lo
spettro atomico è a righe.
In condizioni normali, le righe di assorbimento atomico sono estremamente
strette (0,1 – 0,01 nm) e non possono venire misurate (a causa di problemi
connessi alla risoluzione troppo elevata che sarebbe necessaria) con la
normale strumentazione per misure spettrofotometriche.
Si misura, invece, l'assorbimento atomico ad una singola lunghezza d'onda
usando una sorgente monocromatica con una riga molto stretta (lampada a
catodo cavo) .
 SPETTRI MOLECOLARI

Le molecole subiscono tre tipi di transizioni quantizzate quando sono

eccitate dall'assorbimento di radiazione ultravioletta, visibile e infrarossa.
Per la radiazione ultravioletta e visibile, l'eccitazione comporta la
promozione di elettroni residenti in orbitali atomici o molecolari a
bassa energia su orbitali ad energia più alta. Perché tale transizione
abbia luogo, l'energia del fotone, hv, deve essere esattamente uguale
alla differenza di energia fra i due orbitali.
In aggiunta alle transizioni elettroniche, le molecole esibiscono altri
due tipi di transizioni indotte da radiazioni, e precisamente le transizioni
vibrazionali e le transizioni rotazionali.
Le transizioni vibrazionali hanno luogo in quanto le molecole hanno
molteplici livelli energetici quantizzati (o stati vibrazionali) associati ai
legami che tengono insieme la molecola.
Esempi di stati vibrazionali.
Le differenze in energia fra gli stati vibrazionali sono significativamente
più piccole di quelle fra i livelli energetici degli stati elettronici.
Una molecola ha una molteplicità di stati rotazionali quantizzati,
associati al moto rotazionale della molecola intorno al suo centro di
gravità.
Questi stati energetici rotazionali sono sovrapposti su ciascuno degli stati
vibrazionali mostrati nel diagramma energetico. Le differenze di energia fra
questi stati sono più piccole di quelle fra gli stati vibrazionali.
L'energia totale E associata ad una molecola è quindi data da:
Uno spettro a bande è in realtà costituito da una serie di transizioni, che
comportano variazioni di energia elettronica, vibrazionale e rotazionale tanto
vicine fra di loro da non essere osservabili singolarmente. L’energia
complessiva associata ad ogni transizione dipende dalle energie delle
transizioni elettroniche, vibrazionali e rotazionali associate:

E  E e  E v  E r
In funzione dell’energia della radiazione elettromagnetica che investe
la molecola, si possono verificare simultaneamente più tipi di
transizioni:

Microonde → transizioni rotazionali

Infrarosso → transizioni vibrazionali + rotazionali
UV/Visibile → transizioni elettroniche + vibrazionali + rotazionali

In una soluzione, le specie assorbenti sono circondate dal solvente e

la natura a banda dell'assorbimento molecolare spesso diventa
slargata perché le collisioni tendono ad allargare le energie degli stati
quantici, dando così picchi di assorbimento arrotondati e continui.
 Lo spettro di assorbimento molecolare

La relazione fra assorbimento e lunghezza

d’onda della radiazione è spesso impiegata per
caratterizzare le specie chimiche. La
rappresentazione grafica di questa relazione è
detta spettro di assorbimento.
Le bande che si ottengono sono l’inviluppo di
moltissime righe estremamente ravvicinate che
corrispondono ad ogni singola transizione: le
energie in uscita dal monocromatore
provocano, contemporaneamente, transizioni
dai livelli vibrazionali (e rotazionali) associati ai
livelli elettronici.

Le transizioni elettroniche al di sotto di 195 nm non possono essere studiate a

causa della opacità dell'aria: sotto i 185 nm l'ossigeno atmosferico (O2) assorbe
fortemente: il sistema deve venire evacuato dall'aria o messo sotto flusso di N2.
 Assorbimento Molecolare
L’assenza di componenti vibrazionali e rotazionali nelle bande di
assorbimento UV/Visibile è legata al fatto che l’assorbimento viene
misurato in una fase condensata: le interazioni intermolecolari nello
stato condensato determinano un “allargamento” dei livelli di energia, e
quindi la perdita di risoluzione.

Operando in fase gassosa od in solventi che interagiscono debolmente

con la molecola in esame, è possibile invece osservare anche la struttura
dello spettro di assorbimento legata alle transizioni vibrazionali e/o
rotazionali.

L’energia complessiva della banda in assorbimento è determinata

essenzialmente dall’energia della transizione elettronica associata: per una
molecola si ha infatti

E e  E v  Er
Spettro visibile della 1,2,4,5- tetrazina,
ottenuto in tre diverse condizioni:
(a) in fase gassosa
(b) dispersa in un solvente apolare
(c) in soluzione acquosa.
In fase gassosa, le singole molecole di
tetrazina sono sufficientemente separate
da poter vibrare e ruotare liberamente, così
nello spettro appaiono molti picchi di
assorbimento derivanti dalle transizioni tra i
vari stati vibrazionali e rotazionali.
In fase liquida ed in solventi apolari le
molecole di tetrazina non sono in grado di
ruotare liberamente, per cui nello spettro
non vediamo la struttura fine.
In un solvente polare come l'acqua,
poiché le frequenti collisioni e interazioni tra
le molecole di tetrazina e quelle dell'acqua
producono una modifica irregolare
dell'energia dei livelli vibrazionali, lo spettro
appare costituito da un solo ampio picco.