BIOLOGIA

S C O P E RTA D E LLE C E LLULE:

A causa delle loro piccole dimensioni, le cellule possono essere osservate solo servendosi di un
microscopio. La scoperta delle cellule viene attribuita a Robert Hooke, che osservò la prima cellula con un
microscopio rudimentale formato da sottili fettine di sughero. Anton van Leeuwenhoek per primo descrisse
varie forme di batteri che aveva ottenuto da acqua in cui aveva infuso del pepe e dalla patina dei suoi denti,
costruì microscopio più evoluti. Nel 1838 Matthias Schleiden, concludeva che, le piante erano costituite di
cellule e che l’embrione della pianta originava da un’unica cellula. Theodor Schwann, concludeva che le
cellule animali e vegetali sono strutture simili e avanzò i primi due principi della teoria cellulare:

• Tutti gli organismi sono composti da una o più cellule.

• La cellula è l’unità strutturale della vita.

Rudolf Virchow, aveva fornito prove convincenti per il terzo principio della teoria cellulare:

• Le cellule possono avere origine solo per divisione di cellule preesistenti.

Dalla scoperta del DNA come materiale genetico, a volte viene aggiunto un quarto principio alla teoria
cellulare:

• Le cellule contengono informazioni genetiche sotto forma di DNA e tali informazioni vengono
trasmesse dalla cellula parentale alle cellule figlie.

Le cellule sono notevolmente complesse ed organizzate, possiedono un programma genetico e i mezzi per
utilizzarlo, sono capaci di riprodursi, acquisiscono energia e la utilizzano, sono impegnate in numerose
attività meccaniche, sono capaci di rispondere agli stimoli e sono capaci di auto-regolazione.

DUE CLASSI DI CELLULE FONDAMENTALMENTE DIVERSE

Il microscopio elettronico ha consentito ai biologi di esaminare la struttura interna di una vasta varietà di cellule.
Queste ricerche hanno dimostrato la presenza di due classi fondamentali di cellule, procariotiche ed eucariotiche, che
si distinguono per le loro dimensioni e per il tipo di strutture interne, o organelli. Le cellule procariotiche,
strutturalmente più semplici, includono i batteri. Tutti gli altri tipi di organismi (protisti, funghi, piante ed animali) sono
composti da cellule eucariotiche, strutturalmente più complesse.

Il confronto fra cellule procariotiche ed eucariotiche mostra molte differenze fondamentali, ma anche alcune
somiglianze. Queste sono legate al fatto che le cellule eucariotiche si sono evolute da antenati procariotici. Per questa
comune origine, entrambi i tipi di cellule hanno un linguaggio genetico identico, vie metaboliche comuni e molte
caratteristiche strutturali in comune.

Caratteristiche comuni ai due tipi di cellule:

• Membrana plasmatica di struttura simile

• Informazione genetica codificata dal DNA che usa lo stesso codice genetico
• Meccanismi simili per la trascrizione e la traduzione dell’informazione genetica, compresi i ribosomi simili
 • Vie metaboliche condivise (ad es., glicolisi e ciclo degli ATC)
• Apparato simile per la conservazione dell’energia chimica sottoforma di ATP (localizzato nella membrana
plasmatica dei procarioti e nella membrana mitocondriale degli eucarioti)
• Meccanismi simili di fotosintesi (tra cianobatteri e piante verdi)
• Meccanismo simile per la sintesi e l’inserzione delle proteine di membrana
• Proteosomi (strutture che digeriscono le proteine) di struttura simile tra archeobatteri ed eucarioti
• Filamenti del citoscheletro costruiti con proteine simili all’actina e la tubulina

Caratteristiche delle cellule eucariotiche che non si trovano nei procarioti:

• Divisione della cellula in nucleo e citoplasma, separati da un involucro nucleare contenente pori di struttura
complessa
• Cromosomi complessi formati da DNA e proteine associate, capaci di compattarsi in strutture mitotiche
• Organelli citoplasmatici membranosi complessi (comprendenti reticolo endoplasmatico, complesso del Golgi,
lisosomi, endosomi, perossisomi e gliossisomi)
• Organelli citoplasmatici specializzati per la respirazione aerobia (mitrocondi) e per la fotosintesi (cloroplasti)
• Sistema citoscheletrico complesso (comprendente microfilamenti, filamenti intermedi e microtubuli) e
proteine motrici associate
• Flagelli e ciglia complessi
• Capacità di ingerire materiale particolato mediante la formazione di vescicole per introflessione della
membrana plasmatica (fagocitosi)
• Pareti cellulari contente cellulosa (nelle piante)
• Divisione cellulare che utilizza un fuso mitotico contenente microtubuli per separare i cromosomi
• Presenza di due copie dei geni per ogni cellula (diploidi), ognuna derivante da ciascun genitore
• Presenza di tre diversi enzimi deputati alla sintesi di RNA (RNA polimerasi)
• Riproduzione sessuata richiedente meiosi e fecondazione

Al loro interno, le cellule eucariotiche sono molto più complesse, Entrambe possiedono una regione nucleare, in cui
risiede il materiale genetico, circondata dal citoplasma, ma nei procarioti questa regione si identifica nel nucleoide,
che manca di una membrana limitante che lo separi dal citoplasma circostante. Le cellule eucariotiche, al contrario,
posseggono un nucleo, delimitato da una complessa struttura membranosa, l’involucro nucleare. Le cellule
procariotiche contengono quantità di DNA relativamente piccole; entrambi i tipi cellulari hanno cromosomi contenenti
DNA. Le cellule eucariotiche possiedono un numero di cromosomi distinto, ciascuno contenente una singola molecola
lineare di DNA. Al contrario quasi tutti i procarioti studiati contengono un singolo cromosoma circolare. Ancora più
importante inoltre è che il DNA degli eucarioti, a differenza di quello dei procarioti, è strettamente associato con
proteine a formare un materiale nucleoproteico complesso conosciuto come cromatina. Anche il citoplasma dei due
tipi di cellule è molto diverso. Le cellule eucariotiche contengono una serie di organelli delimitati da membrane. Gli
organelli eucariotici comprendono: mitocondri (che producono energia chimica per l’espletamento delle attività
cellulari, un reticolo endoplasmatico dove vengono sintetizzati molti dei lipidi e delle proteine della cellula, il
complesso del Golgi (dove le sostanze vengono selezionate, modificate e smistate verso specifici distretti cellulari), e
una varietà di vescicole semplici, di varie dimensioni e delimitate da membrane.

DIFFERENZIAMENTO CELLULARE

La formazione di organismi unicellulari altamente complessi è una delle direzioni prese dall’evoluzione. Le cellule
specializzate si formano con un processo chiamato differenziamento. La cellula uovo umana, ad esempio, viene
fecondata e progredisce nel corso del suo sviluppo embrionale, che porta alla formazione all’incirca di 250 distinti tipi
di cellule differenziate. Alcune cellule diventano parte di particolari ghiandole digestive, altre parti di grandi muscoli
scheletrici, altre parti del tessuto osseo, e così via…La via del differenziamento seguita da ogni cellula embrionale
dipende innanzitutto dai segnali che riceve dall’ambiente circostante; questi dipendono dalla posizione in cui quella
cellula si trova nell’embrione.

Tipi diversi di cellule acquistano forme differenti e contengono materiali unici.

Nonostante le numerose differenze, tuttavia, le varie cellule di una pianta o di un animale pluricellulare sono costituite
da organelli simili.

INFORMAZIONI
Molte patologie umane derivano dalla morte di specifici tipi di cellule. Il diabete di tipo 1, per esempio, origina dalla
morte delle cellule beta del pancreas; la malattia di Parkinson si sviluppa in seguito alla perdita dei neur oni
dopaminergici cerebrali; l’insufficienza cardiaca può avere origine dalla morte di cellule muscolari cardiache
(cardiomiociti) nel cuore.

DIMENSIONI DELLE CELLULE E DELLE LORO COMPONENTI

il micrometro (µm) ed il nanometro (nm). Un µm è uguale a 10−6 metri e un nm a 10−9 metri. L'angström (Å), che è
uguale a un decimo di 1 nm.

INTRODUZIONE ALLA MEMBRANA PLASMATICA

Le cellule sono separate dall’ambiente esterno da una sottile e fragile struttura, detta membrana plasmatica, il cui
spessore è di soli 5-10 nm. La membrana plasmatica appariva come una struttura a tre strati, formata da due strati
esterni scuri ed uno strato intermedio chiaro.

Le membrane cellulari sono costituite da un doppio strato lipidico; i due strati scuri visibili corrispondono
sostanzialmente alle superfici polari interna ed esterna del doppio strato lipidico.

[Aspetto trilaminare delle membrane. (a) Fotografia al microscopio elettronico (o micrografia elettronica) in cui si nota
la struttura a tre strati (trilaminare) della membrana plasmatica di un eritrocito dopo colorazione con il metallo
pesante osmio. L’osmio si lega preferenzialmente ai gruppi delle teste polari del doppio strato lipidico, determinando
il tipico aspetto trilaminare. Le frecce indicano il limite interno ed esterno della membrana. (b) Il margine esterno di
una cellula muscolare differenziata cresciuta in coltura, nella quale si nota la struttura trilaminare che appare simile
nella membrana plasmatica (MP) e nella membrana del reticolo sarcoplasmatico (RS), un compartimento
citoplasmatico in cui è immagazzinato il calcio.]

PANORAMICA DELLE FUNZIONI DI MEMBRANA

1. Compartimentazione. Le membrane formano superfici continue, ininterrotte e, pertanto, delimitano dei

compartimenti chiusi. La membrana plasmatica racchiude il contenuto dell’intera cellula, mentre le
membrane dell’involucro nucleare e quelle citoplasmatiche delimitano differenti spazi intracellulari.
2. Supporto fisico per attività biochimiche. Le membrane sostituiscono esse stesse un compartimento distinto.
I componenti che sono immersi in una membrana non sono liberi di muoversi e possono essere ordinati per
una efficiente interazione.
3. Barriera con permeabilità selettiva. Le membrane impediscono il libero scambio di molecole da un versante
all’altro ma, allo stesso tempo, forniscono un mezzo di comunicazione tra i compartimenti che separano.
4. Trasporto di soluti. La membrana plasmatica contiene i “meccanismi” necessari per il trasporto fisico di osmosi
sostanze da un suo versante all’altro, spesso da una regione in cui il soluto è presente a bassa concentrazione
verso una in cui è molto più concentrato. I meccanismi del trasporto di membrana consentono alla cellula di
accumulare sostanze, come zuccheri e amminoacidi, necessarie per fornire energia al proprio metabolismo e
 per costruire le proprie macromolecole. La membrana plasmatica è anche in grado di trasportare ioni
specifici, stabilendo, quindi, gradienti ionici tra i due versanti, citoplasmatico ed extracellulare.
5. Risposta a segnali esterni. La membrana plasmatica svolge un ruolo fondamentale nella risposta di una
cellula agli stimoli esterni, un processo noto come trasduzione del segnale. Le membrane contengono dei
recettori, che si combinano con molecole specifiche (dette ligandi) oppure rispondono ad altri tipi di stimoli.
6. Interazioni intercellulari. La membrana plasmatica degli organismi pluricellulari, costituendo il limite esterno
di ogni cellula vivente, media le interazioni fra una cellula e le sue vicine. La membrana plasmatica permette
alle cellule di riconoscersi fra loro, di aderire quando è il caso e di scambiarsi materiali ed informazioni.
7. Trasferimento di energia. Le membrane sono strettamente coinvolte nei processi attraverso i quali una
forma di energia viene convertita in una forma diversa.

STUDI SULLA STRUTTURA DELLA MEMBRANA CELLULARE

I primi indizi relativi alla natura chimica del confine esterno che delimita una cellula furono ottenuti da Ernest Overton
attorno al 1890. I primi a proporre che le membrane cellulari potessero contenere un doppio strato lipidico furono
due scienziati olandesi, E. Gorter e F. Grendel, nel 1925. Questi ricercatori estrassero i lipidi dai globuli rossi umani e
misurarono la superficie occupata dai lipidi quando questi venivano dispersi sulla superficie dell’acq ua. Poiché nei
mammiferi i globuli rossi maturi non contengono nucleo né organuli cellulari, la membrana plasmatica è la sola
struttura contenente lipidi; per questo motivo, si può assumere che tutti i lipidi estratti da questo tipo di cellule si
localizzino nella membrana plasmatica. Gorter e Grendel ipotizzarono che il rapporto effettivo fosse 2:1 e conclusero
che la membrana plasmatica contenesse uno strato bimolecolare di lipidi cioè un doppio strato lipidico . Negli anni ’20
e negli anni ’30 del secolo scorso, i fisiologi cellulari dimostrarono, con i loro esperimenti, che la struttura della
membrana cellulare era più di un semplice doppio strato lipidico. Si calcolò che la tensione superficiale della
membrana era inferiore a quella di una struttura lipidica pura. Questa diminuzione nella tensione superficiale poteva
essere spiegata dalla presenza di proteine nella membrana.

COMPOSIZIONE CHIMICA DELLE MEMBRANE

Tutte le membrane sono associazioni lipoproteiche nelle quali i componenti sono tenuti insieme in uno strato sottile
da legami non covalenti. la parte centrale della membrana consiste di un foglietto lipidico organizzato in un doppio
strato. Il doppio strato lipidico funge principalmente da scheletro strutturale della membrana e costituisce la barri era
che impedisce i movimenti casuali delle molecole idrosolubili verso l’interno o l’esterno della cellula. Le proteine di
membrana svolgono invece la maggior parte delle funzioni specifiche. Ogni tipo di cellula differenziata contiene un
insieme peculiare di proteine di membrana, che contribuisce alle attività specializzate di quel tipo cellulare. Il rapporto
fra lipidi e proteine in una membrana varia ampiamente a seconda del tipo di membrana cellulare, del tipo di
organismo e del tipo di cellula.

LIPIDI DI MEMBRANA

Le membrane contengono un’ampia varietà di lipidi, tutti anfipatici; ossia contengono regioni idrofiliche e regioni
idrofobiche. Esistono tre tipi principali di lipidi di membrana: i fosfogliceridi, gli sfingolipidi e il colesterolo.
Fosfogliceridi: La maggior parte dei lipidi di membrana contiene un gruppo fosfato, da cui il nome fosfolipidi. Dato che
la maggior parte dei fosfolipidi di membrana è sintetizzata a partire da uno scheletro di glicerolo, essi vengono detti
fosfogliceridi. Ognuno di questi gruppi è idrofilico e di ridotte dimensioni e, insieme al gruppo fosfato di carica
negativa a cui è legato, forma una regione fortemente idrosolubile posta ad un estremo della molecola, chiamata
gruppo di testa, o semplicemente testa.
Sfingolipidi: Una classe meno abbondante di lipidi di membrana, chiamati sfingolipidi, è rappresentata dai derivati
della sfingosina, un amminoalcol che contiene una lunga catena idrocarburica. Gli sfingolipidi sono formati da
sfingosina legata ad un acido grasso mediante il suo gruppo amminico.
Colesterolo: Un altro lipide componente di alcune membrane è lo sterolo colesterolo. Le molecole di colesterolo sono
orientate con il loro piccolo gruppo idrofilico verso la superficie della membrana e la loro coda idrofobica (o idrofoba)
immersa nel doppio strato lipidico. Gli anelli idrofobici di una molecola di colesterolo sono piani e rigidi ed
interferiscono con i movimenti delle code di acidi grassi dei fosfolipidi.

NATURA E IMPORTANZA DEL DOPPIO STRATO LIPIDICO

Ogni tipo di membrana cellulare ha la sua composizione lipidica caratteristica, differente da ogni altra per il tipo di
lipidi, per la natura dei gruppi della testa polare e per i tipi particolari di catene di acidi grassi . I lipidi di una membrana
sono molto più che semplici elementi strutturali e possono avere importanti effetti sulle sue proprietà biologiche. La
composizione lipidica può determinare lo stato fisico di una membrana ed influenzare l’attività di specifiche p roteine
di membrana. I lipidi di membrana costituiscono, inoltre, i precursori di messaggeri chimici molto attivi che regolano le
funzioni cellulari. In accordo con le leggi termodinamiche, le catene idrocarburiche del doppio strato lipidico non sono
mai esposte all’ambiente acquoso circostante. Di conseguenza, le membrane non hanno mai un margine libero; sono
sempre strutture continue, ininterrotte. Ne risulta che le membrane formano un sistema continuo e interconnesso
che si ramifica all’interno della cellula. Grazie alla flessibilità del doppio strato lipidico, le membrane sono deformabili
e la loro forma generale può cambiare quando è necessario, come capita durante il movimento cellulare o la divisione
cellulare. Si pensa che il doppio strato lipidico faciliti la fusione o la gemmazione delle membrane.

PROPRIETA’ DINAMICHE DELLA MEMBRANA PLASMATICA

In una cellula in movimento, il margine che avanza contiene spesso dei siti dove la membrana plasmatica forma
increspature ondulate.

La divisione di una cellula è accompagnata dalla deformazione della membrana plasmatica che viene “tirata” verso il
centro della cellula. Diversamente dalla maggior parte delle cellule che si dividono, il solco di divisione di questo uovo
di ctenoforo in fase di divisione inizia ad un unico polo e si estende in un’unica direzione attraverso l’uovo.

Le membrane sono capaci di fondersi con altre membrane. Questa micrografia elettronica mostra un granulo
secretorio che scarica il suo contenuto dopo essersi fuso con la sovrastante membrana plasmatica (frecce).

Un’altra importante caratteristica del doppio strato lipidico è la sua capacità di auto assemblarsi. Per esempio, se una
piccola quantità di fosfatidilcolina viene dispersa in una soluzione acquosa, le molecole fosfolipidiche si assemblano
spontaneamente a formare le pareti di vescicole sferiche riempite di liquido, dette liposomi. Le pareti di questi
liposomi sono costituite da un doppio strato lipidico organizzato allo stesso modo del doppio strato lipidico di una
membrana naturale; per questo motivo, i liposomi si sono dimostrati importantissimi nelle ricerche sulle membrane.
Nei liposomi si possono inserire proteine di membrana per studiare le loro funzioni in un ambiente molto più semplice
di quello di una membrana naturale. I liposomi sono stati, inoltre, utilizzati come sistema di trasporto per veicolare
all’interno del corpo molecole di DNA o di farmaci. Infatti, i farmaci o il DNA possono essere legati alla parete del
liposoma, oppure inseriti ad alta concentrazione nel lume dello stesso. In questi esperimenti, le pareti dei liposomi
sono costruite in modo tale da contenere specifiche proteine (come anticorpi o ormoni) che permettano ai liposomi di
legarsi selettivamente alla superficie di particolari cellule bersaglio dove si intende indirizzare l’azione del farmaco o
del DNA. La maggior parte dei primi studi clinici in cui si utilizzarono liposomi fallì perché le vescicole iniettate
venivano rapidamente rimosse dai fagociti del sistema immunitario. Questo ostacolo è ormai stato superato grazie
allo sviluppo dei cosiddetti “liposomi furtivi”, o “liposomi fantasma”, rivestiti esternamente da un polimero sintetico
che protegge i liposomi dalla distruzione operata dalle cellule immunitarie.
ASIMMETRIE DEI LIPIDI DI MEMBRANA

Il doppio strato lipidico è formato da due foglietti distinti che possiedono una composizione lipidica caratteristica e
differente. Le diverse classi di lipidi mostrano caratteristiche differenti. Tutti i glicolipidi della membrana plasmatica
sono localizzati nel foglietto esterno, dove spesso svolgono la funzione di recettori per ligandi extracellulari. La
fosfatidiletanolammina, più abbondante nel foglietto interno, tende a favorire la curvatura della membrana, una
proprietà fondamentale nei processi di gemmazione e fusione della membrana. La fosfatidilserina, anch’essa
concentrata nel foglietto interno, possiede una carica netta negativa a pH fisiologico, che la rende adatta a legare le
cariche positive dei residui di lisina e arginina.

CARBOIDRATI DI MEMB RANA

Nella membrana plasmatica delle cellule eucariotiche si trovano anche i carboidrati. Più del 90% dei carboidrati di
membrana è legato con legami covalenti alle proteine a formare glicoproteine; i carboidrati rimanenti sono legati ai
lipidi con legami covalenti a formare dei glicolipidi. Tutti i carboidrati della membrana plasmatica sono rivolti verso
l’ambiente extracellulare. ’aggiunta di carboidrati, o glicosilazione, è la più complessa di queste modificazioni. Nelle
glicoproteine, la componente glucidica è presente in forma di brevi oligosaccaridi ramificati idrofilici, che solitamente
possiedono meno di 15 residui monosaccaridici per catena. Diversamente dai carboidrati ad elevato peso molecolare
(come glicogeno, amido o cellulosa), che sono polimeri di un singolo monosaccaride, le oligosaccaridi legati alle
proteine e ai lipidi di membrana possono avere una struttura e una composizione molto varia. Addirittura differenti
catene di zuccheri possono essere legate alla stessa proteina espressa in cellule o tessuti differenti. Le oligosaccaridi
possono essere unite a numerosi amminoacidi diversi mediante due principali tipi di legame. Questi carboidrati che
sporgono dalla membrana svolgono un’importante funzione nel mediare le interazioni di una cellula con il suo
ambiente e nello smistamento delle proteine di membrana ai diversi compartimenti cellulari.

ANTIGENI DEI GRUPPI SANGUIGNI

Il gruppo sanguigno A, B, AB o 0 di un individuo è determinato da una corta catena oligosaccaridica legata

covalentemente ai lipidi ed alle proteine della membrana degli eritrociti. In figura sono illustrati le oligosaccaridi legati
ai lipidi di membrana (che formano un ganglioside) che determinano i gruppi sanguigni A, B e 0. Un individuo con
gruppo sanguigno AB possiede sia i gangliosidi con struttura A sia quelli con struttura B. Gal, galattosio; GlcNAc, N-
acetilglucosammina; Glu, glucosio; Fuc, fucosio; GalNAc, N-acetilgalattosammina.

PROTEINE DI MEMBRANA

A seconda del tipo cellulare e del particolare organello in una certa cellula, una membrana può contenere centi naia di
proteine differenti. Ogni proteina di membrana è orientata in una posizione ben definita rispetto al citoplasma,
pertanto, le proprietà di una delle due superfici della membrana sono nettamente diverse da quelle dell’altra. Questa
asimmetria di membrana può essere definita come “unilateralità” di membrana. Le proteine di membrana possono
essere suddivise in tre classi distinte in relazione al loro rapporto con il doppio strato lipidico.
Tali classi sono:

1. Proteine integrali che penetrano nel doppio strato lipidico. Le proteine integrali sono proteine
transmembrana; ossia queste proteine attraversano completamente il doppio strato lipidico ed hanno perciò
domini che sporgono sia dal lato extracellulare, sia da quello citoplasmatico della membrana.
2. Proteine periferiche situate completamente all’esterno del doppio strato lipidico, o sulla superficie
extracellulare, o su quella citoplasmatica. Queste proteine si legano alla superficie della membrana mediante
legami non covalenti.
3. Proteine ancorate ai lipidi, che si localizzano all’esterno del doppio strato lipidico, sul versante extracellulare
o su quello citoplasmatico, ma sono legate covalentemente a una molecola lipidica situata nel doppio strato.
(a) Le proteine integrali tipicamente contengono una o più eliche transmembrana.
(b) Le proteine periferiche sono legate con legami non covalenti ai gruppi polari delle teste delle molecole lipidiche del
doppio strato e/o ad una proteina integrale di membrana.
(c) Le proteine legate ai lipidi sono unite con legami covalenti ad un gruppo lipidico inserito in uno dei due foglietti del
doppio strato. Il lipide può essere un fosfatidilinositolo, un acido grasso, oppure un gruppo prenile.

PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA

La maggior parte delle proteine di membrana svolge il ruolo di: recettori capaci di legare specifiche molecole sulla
superficie di membrana, canali o trasportatori coinvolti nel movimento di ioni o soluti attraverso la membrana, oppure
agenti che trasferiscono gli elettroni durante i processi di fotosintesi e respirazione. Come i fosfolipidi del doppio
strato, anche le proteine integrali della membrana sono anfipatiche ed hanno sia porzioni idrofiliche, sia porzioni
idrofobiche.

LA TECNICA DEL FREEZE-FACTURE

Tecnica del congelamento-frattura per studiare la struttura delle membrane cellulari.
Quando un blocchetto di tessuto congelato è intaccato con una lama, un piano di frattura percorre il tessuto, spesso
seguendo una traiettoria che lo porta nel mezzo del doppio strato lipidico. Il piano di frattura passa attorno alle
proteine piuttosto che spaccarle a metà e queste si separano con una delle due metà del doppio strato. Le facce
esposte del centro del doppio strato possono poi essere coperte con un deposito di metallo per creare una replica
metallica. Le due facce esposte sono dette, rispettivamente, E, o faccia ectoplasmatica, e P, o faccia protoplasmatica.

PROTEINE PERIFERICHE DI MEMBRANA

Le proteine periferiche sono associate alla membrana mediante legami non covalenti deboli, possono essere
solubilizzate estraendole con soluzioni ad elevata concentrazione salina. Le proteine periferiche meglio studiate sono
situate sulla faccia interna (citosolica) della membrana plasmatica, dove formano una rete fibrillare che agisce come
uno “scheletro” di membrana. Queste proteine forniscono un supporto meccanico alla membrana e siti di ancoraggio
per le proteine integrali di membrana. Altre proteine periferiche sulla superficie interna della membrana plasmatica
agiscono come enzimi, come rivestimenti specializzata hanno normalmente una relazione dinamica con la membrana,
dato che possono essere reclutate in membrana o liberate da essa a seconda delle condizioni prevalenti.

PROTEINE DI MEMBRANA ANCORATE AI LIPIDI

Si distinguono diversi tipi di proteine di membrana ancorate ai lipidi. Numerose proteine presenti sulla superficie
esterna della membrana plasmatica si legano alla membrana mediante un corto e complesso oligosaccaride connesso
ad una molecola di fosfatidilinositolo, inserito nel foglietto esterno del doppio strato lipidico. (Proteine periferiche di
membrana che presentano questo tipo di legame glicosil-fosfatidilinositolo (GPI) sono chiamate proteine ancorate al
GPI).

STUDIO DELLA STRUTTURA E DELLE PROPRIETA’ DELLE PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA

A causa dei loro domini transmembrana idrofobici, è difficile isolare le proteine integrali di membrana in forma
solubile. L’estrazione di queste proteine dalla membrana si ottiene di solito con l’impiego di un detergente (ionico),
che non modifica la struttura terziaria delle proteine. I detergenti sono molecole anfipatiche formate da un’estremità
polare e da una catena idrocarburica non polare; grazie alla loro struttura, i detergenti possono sostituirsi ai fosfolipidi
nello stabilizzare le proteine integrali, rendendole così solubili in soluzione acquosa. Una volta che le proteine sono
state solubilizzate dal detergente, si possono svolgere varie procedure analitiche per determinarne la composizione in
amminoacidi, la massa molecolare, la sequenza amminoacidica e così via.
Solubilizzazione delle proteine di membrana per mezzo di detergenti: Le estremità apolari delle molecole di
detergente si associano ai residui non polari della proteina, che precedentemente erano in contatto con le catene di
acidi grassi del doppio strato lipidico. Le estremità polari delle molecole di detergente, invece, interagiscono con le
molecole di acqua circostanti, mantenendo la proteina in soluzione. I detergenti non ionici portano in soluzione
(solubilizzano) le proteine di membrana senza distruggerne la struttura.

I ricercatori hanno avuto grandi difficoltà nell’ottenere cristalli di proteine integrali di membrana per poterle
sottoporre a cristallografia a raggi X.

LIPIDI E FLUIDITA’ DELLA MEMBRANA

Le membrane sono formate da un doppio strato fluido di fosfolipidi, all'interno del quale le proteine inserite possono
“galleggiare” liberamente.
Le molecole fosfolipidiche possono vibrare, piegarsi avanti e indietro, girare attorno al proprio asse maggiore,
muoversi lateralmente e scambiarsi di posto all'interno di uno stesso emistrato (o strato singolo) del bilayer .
Solo raramente un fosfolipide può passare da uno strato all'altro del doppio strato fosfolipidico mediante un
meccanismo chiamato flip-flop.
I fosfolipidi si scambiano di posizione all'interno di uno stesso strato anche milioni di volte al secondo, rendendo le
molecole fosfolipidiche estremamente dinamiche.

Lo stato fisico dei lipidi di una membrana si può descrivere in base alla loro fluidità (o viscosità). Se la temperatura del
doppio strato è mantenuta relativamente calda (es., 37°C), i lipidi sono in uno stato relativamente fluido . Se la
temperatura è abbassata lentamente, si raggiunge un punto in cui si verifica un netto cambiamento nella natura del
doppio strato. I lipidi, dal loro normale stato cristallino liquido, si trasformano in un gel cristallino congelato. La
temperatura alla quale si verifica questo cambiamento è detta temperatura di transizione. La temperatura di
transizione di un determinato doppio strato lipidico dipende dalla capacità delle molecole lipidiche di addensarsi fra
loro, capacità che, a sua volta, dipende dal tipo di lipidi da cui è formato il doppio strato. Gli acidi grassi saturi hanno la
forma di bastoncelli diritti e flessibili, mentre quelli cis-insaturi presentano piegature della catena nei punti in cui è
presente un doppio legame. i fosfolipidi con catene sature possono disporsi affiancati, addensati fra loro in modo
molto più stretto di quanto possano fare quelli che contengono catene insature. Quanto maggiore è il grado di
insaturazione degli acidi grassi del doppio strato, tanto più bassa sarà la temperatura necessaria per far gelificare il
doppio strato.

Un altro fattore che influenza la fluidità delle membrane è la lunghezza delle catene di acidi grassi: più queste sono
corte, più bassa sarà la loro temperatura di fusione. Lo stato fisico di una membrana è influenzato anche dalla
presenza di colesterolo; a causa del loro orientamento all’interno del doppio strato, le molecole di colesterolo
rompono lo stretto impaccamento delle catene di acidi grassi ed interferiscono con la loro mobilità. La presenza di
colesterolo tende a ridurre le temperature di transizione nette e crea una condizione di fluidità intermedia. In termini
fisiologici, il colesterolo tende ad aumentare la stabilità e a diminuire la permeabilità della membrana.

IMPORTANZA DELLA FLUIDITA’ DELLA MEMBRANA

La fluidità della membrana fornisce un perfetto compromesso fra una struttura rigida e ordinata, in cui la mobilità
sarebbe assente, ed un liquido non viscoso completamente fluido, in cui i componenti della membrana non
potrebbero essere orientati e l’organizzazione strutturale ed il supporto meccanico sarebbero assenti. Inoltre, la
fluidità della membrana consente che avvengano interazioni all’interno di essa. Grazie alla fluidità della membrana, le
molecole che interagiscono tra loro possono avvicinarsi, dar luogo alle reazioni necessarie e s epararsi. La fluidità gioca,
inoltre, un ruolo fondamentale nell’assemblaggio della membrana stessa.

MANTENIMENTO DELLA FLUIDITA’ DELLA MEMBRANA

Dato che per molte attività è necessario che le membrane di una cellula rimangano allo stato fluido, le cellule
rispondono alle mutevoli condizioni modificando il tipo di fosfolipidi di cui sono costituite le membrane. Il
mantenimento della fluidità della membrana è un esempio di omeostasi cellulare.

NATURA DINAMICA DELLA MEMBRANA PLASMATICA

il doppio strato lipidico è in uno stato relativamente fluido. Quindi, un fosfolipide si può spostare lateralmente
all’interno di un foglietto con grande facilità. Si è stimato che un fosfolipide può diffondere da un estremo all’altro di
una cellula batterica in uno o due secondi. Diversamente, possono essere necessari ore o giorni affinché una molecola
di fosfolipide si sposti da un foglietto all’altro. Quindi, di tutti i possibili movimenti che un fosfolipide può effettuare, il
suo “flip-flop” verso l’altro versante della membrana è il più limitato

DIFFUSIONE DELLE PROTEINE DI MEMBRANA DOPO FUSIONE CELLULARE

La fusione cellulare è una tecnica mediante la quale è possibile unire due tipi diversi di cellule, oppure cellule di due
specie diverse, per formare una singola cellula con un citoplasma comune ed un’unica membrana plasmatica
continua. La fusione cellulare ha avuto un ruolo importante nella biologia cellulare ed è attualmente impiegata in una
preziosa tecnica per preparare anticorpi specifici.

I primi esperimenti per dimostrare che le proteine di membrana possono muoversi nel piano della membrana
utilizzarono la fusione cellulare e furono descritti da Larry Frye e Michael Edidin, questi ricercatori fusero insieme
cellule murine ed umane, seguendo poi nel tempo le posizioni di specifiche proteine della membrana plasmatica dopo
che le due membrane erano diventate un’unica struttura continua. Per seguire contemporaneamente nel tempo la
distribuzione delle proteine di membrana delle cellule di topo e quella delle proteine delle cellule umane dopo la
fusione, furono prima preparati anticorpi contro l’uno o l’altro tipo di proteine, che furono poi legati con legami
covalenti a coloranti fluorescenti. Gli anticorpi anti-proteine di topo furono legati a un colorante fluorescente verde e
quelli anti-proteine umane legati a un colorante fluorescente rosso. Quando gli anticorpi furono aggiunti alle cellule
fuse, essi si legarono alle proteine umane o di topo e la loro posizione poté essere seguita usando un microscopio a
fluorescenza. Al momento della fusione, la membrana plasmatica della cellula ibrida appariva per metà umana e per
metà di topo; cioè, i due tipi di proteine marcate rimanevano segregate nel proprio emisfero. Con il passare del tempo
dopo la fusione, si osservò che le proteine di membrana si muovevano lateralmente all’interno della membrana
spostandosi verso l’emisfero opposto. Dopo circa 40 minuti dalla fusione, le proteine delle due specie erano distribuite
in modo uniforme sull’intera membrana della cellula ibrida. Se lo stesso esperimento fosse stato condotto ad una
temperatura più bassa, la viscosità del doppio strato lipidico sarebbe aumentata e la mobilità delle proteine di
membrana diminuiva. Questi primi esperimenti di fusione cellulare diedero l’impressione che le proteine integrali di
membrana potessero muoversi in modo virtualmente illimitato.

RESTRIZIONI ALLA MOBILITA’ DELLE PROTEINE E DEI LIPIDI

Esistono diverse tecniche che permettono ai ricercatori di seguire al microscopio ottico i moviment i delle molecole
nelle membrane di cellule viventi. Nella tecnica chiamata recupero della fluorescenza dopo foto sbiancamento, FRAP, i
componenti integrali della membrana plasmatica di cellule in coltura sono in primo luogo marcati grazie al legame con
un colorante fluorescente. Una particolare proteina di membrana può essere marcata utilizzando una sonda specifica,
come un anticorpo fluorescente. Una volta marcate, le cellule sono poste sotto al microscopio ed irradiate con un
sottile raggio laser focalizzato che scolora irreversibilmente le molecole fluorescenti nell’area colpita, lasciando sulla
superficie della cellula una chiazza circolare priva di fluorescenza. Se le proteine di membrana marcate sono mobili, i
loro spostamenti casuali porteranno ad una graduale ricomparsa della fluorescenza nel cerchio irradiato. La velocità di
recupero della fluorescenza fornisce una misura diretta della velocità di diffusione delle molecole mobili. Il grado di
recupero della fluorescenza fornisce una misura della percentuale di molecole marcate che sono libere di diffondere.
I primi esperimenti effettuati utilizzando la tecnica FRAP suggerirono che:
(1) le proteine di membrana si muovono molto più lentamente nella membrana plasmatica di come farebbero in un
doppio strato lipidico puro e
(2) una significativa frazione delle proteine di membrana non è libera di tornare a diffondere nella zona irradiata.
Nella tecnica detta tracciamento di singole particelle, SPT, singole proteine di membrana sono marcate, solitamente
con etichette molecolari fluorescenti. Il movimento delle molecole così marcate può essere seguito con un particolare
microscopio noto come TIRF che è specializzato per visualizzare molecole fluorescenti sulla superficie delle cellule. I
risultati di queste ricerche spesso dipendono dalla particolare proteina che si sta studiando. Per esempio:

• Alcune proteine di membrana si muovono casualmente nella membrana, generalmente ad una velocità
minore rispetto a quella che si osserverebbe in un doppio strato lipidico artificiale.
• Alcune proteine di membrana non riescono a muoversi e sono considerate immobili
• In alcuni casi, si trova che una proteina si muove in maniera altamente direzionale verso l’una o l’altra parte
della cellula.
• Nella maggior parte degli esperimenti, si è osservato che la maggioranza delle specie proteiche evidenzia un
movimento casuale all’interno della membrana con velocità paragonabili a quella della diffusione libera,
tuttavia, queste molecole sono incapaci di migrare liberamente.

CONTROLLO DELLA MOBILITA’ DELLE PROTEINE DI MEMBRANA

È chiaro che le proteine della membrana plasmatica non sono completamente libere di vagare in modo casuale nel
“mare” dei lipidi, ma sono soggette a varie influenze che ne modificano la mobilità. Alcune membrane sono molto
ricche di proteine, così che i movimenti casuali di una molecola possono essere impediti dalle sue vicine. La membrana
plasmatica di molte cellule possiede una rete fibrillare, o “scheletro di membrana”, costituita da proteine periferiche
situate sulla superficie citoplasmatica della membrana. Una certa porzione delle proteine integrali di membrana è
ancorata allo scheletro di membrana oppure è condizionata da esso in altro modo. Evidenze relative alla presenza di
barriere nella membrana sono state ottenute grazie a una tecnica (che usa pinzette ottiche) che permette ai
ricercatori di intrappolare le proteine integrali e di trascinarle lungo la membrana con una forza nota. Questa tecnica
sfrutta le minuscole forze ottiche prodotte da un raggio laser focalizzato.
Le proteine integrali da studiare sono marcate con particelle rivestite da anticorpi che servono come “maniglie” che
possono essere “afferrate” dal raggio laser.
Un altro approccio per lo studio dei fattori che influenzano la mobilità delle proteine di membrana è quello di
modificare geneticamente le cellule per far loro produrre delle proteine di membrana alterate.

MOBILITA’ DEI LIPIDI DI MEMBRANA

Le proteine sono molecole enormi, quindi, non sorprende che il loro movimento all’interno del doppio strato lipidico
possa essere limitato.
Alcuni studi hanno dimostrato che anche la diffusione dei fosfolipidi (piccole molecole che costituiscono la tessitura
del doppio strato lipidico) è limitata.

DOMINI DELLA MEMBRANA E POLARITA’ CELLULARE

La maggior parte degli studi sulle membrane è condotta su membrane plasmatiche relativamente omogenee posta su
superfici superiori o inferiori di cellule poste in una piastra di coltura. Molte membrane mostrano variabilità nella
composizione proteica e nella mobilità (es. le cellule epiteliali che delimitano la parete intestinale o quelle che
formano i microscopici tubuli renali, sono cellule altamente polarizzate, nelle quali le diverse superfici svolgono
funzioni differenti).
Fra tutti i tipi di cellule di mammifero, gli spermatozoi possono presentare la struttura più altamente differenziata. In
uno spermatozoo maturo si riconosce una testa, una parte centrale ed una coda, ognuna con funzioni specializzate.
Anche se si può suddividere in parti distinte, uno spermatozoo è circondato da una membrana plasmatica continua
che, come rivelato da diverse tecniche, è formata da un mosaico di diversi tipi di domini localizzati. (Ad esempio,
quando gli spermatozoi sono trattati con diversi anticorpi specifici, ogni anticorpo si combina con la superficie della
cellula in uno schema topografico peculiare che riflette la distribuzione della particolare proteina antigenica all’interno
della membrana plasmatica.)

GLOBULO ROSSO: UN ESEMPIO DI STRUTTURA DELLA MEMBRANA PLASMATICA

Fra tutti i tipi diversi di membrana, la più studiata e conosciuta è quella degli eritrociti umani. Le ragioni della
popolarità di questa membrana sono varie: le cellule si possono ottenere a basso costo e sono facilmente disponibili in
gran numero dal sangue intero; sono già presenti come cellule isolate e non c’è bisogno di isolarle da un tessuto
complesso; rispetto ad altri tipi cellulari, gli eritrociti sono molto semplici, dato che mancano di involucro nucleare e di
membrane citoplasmatiche che, inevitabilmente, contaminano i campioni di membrana plasmatica allestiti da altre
cellule. Inoltre, si possono ottenere membrane plasmatiche purificate e intatte di eritrociti semplicemente mettendo
le cellule in una soluzione salina diluita (ipotonica). Le cellule rispondono a questo shock osmotico assorbendo acqua e
gonfiandosi, un fenomeno chiamato emolisi. Con l’eccessivo aumento della superficie della cellula, la membrana
plasmatica si rompe e il contenuto cellulare, formato quasi esclusivamente da emoglobina disciolta, fluisce all’esterno
della cellula lasciando pressoché intatta l’“ombra” di membrana plasmatica.

MOVIMENTO DI MOLECOLE ATTRAVERSO LE MEM BRANE CELLULARI

Poiché i contenuti di una cellula sono completamente avvolti dalla sua membrana plasmatica, tutte le comunicazioni
tra la cellula e l’ambiente extracellulare devono essere mediate da questa struttura. La membrana plasmatica è una
membrana che trattiene le molecole in soluzione nella cellula in modo che esse non filtrino semplicemente
nell’ambiente esterno, ma, allo stesso tempo, deve consentire i necessari scambi di sostanze verso l’interno e verso
l’esterno della cellula. Il doppio strato lipidico della membrana è perfettamente adatto per evitare che la cellula perda
soluti polari e dotati di carica ma è necessario che la cellula prenda alcuni provvedimenti speciali per permettere il
movimento verso l’interno e verso l’esterno di essa di sostanze nutritive, ioni, prodotti di rifiuto ed altre sostanze. Il
movimento di sostanze attraverso la membrana può avvenire fondamentalmente in due modi: in modo passivo, per
diffusione, oppure in modo attivo per mezzo di un processo di trasporto che richiede energia. Entrambi i tipi di
movimento portano ad un flusso netto (indica che il movimento della sostanza verso l’interno della cellula (flusso in
ingresso) e quello verso l’esterno (flusso in uscita) non sono in equilibrio ma che uno è maggiore rispetto all’altro) di
un particolare ione o composto.

Ci sono 4 diversi processi mediante i quali le sostanze si spostano attraverso le membrane:

• la diffusione semplice attraverso il doppio strato lipidico

• diffusione facilitata attraverso un canale acquoso delimitato da proteine (canale semplice o ad accesso
agevolato)
• la diffusione facilitata da una proteina di trasporto (definite anche trasportatori o carrier)
• trasporto attivo il quale richiede una “pompa “proteica che utilizza energia, capace di spostare sostanze
contro un gradiente di concentrazione.

La diffusione è un processo spontaneo nel quale una sostanza si muove da una regione ad elevata concentrazione ad
una a bassa concentrazione, annullando alla fine la differenza di concentrazione fra le due regioni; essa dipende
dall’agitazione termica casuale dei soluti ed è un processo esoergonico guidato da un aumento di entropia. Ogni
singola molecola che si muove per diffusione non sa in quale direzione deve muoversi e si muoverà con la stessa
probabilità verso una regione a < o > concentrazione.

DIFFUSIONE SEMPLICE ATTRAVERO IL DOPPIO STRATO LIPIDICO

La membrana plasmatica è una barriera selettivamente permeabile che permette il passaggio dei soluti con
meccanismi diversi, tra i quali la diffusione semplice attraverso il doppio strato lipidico. La diffusione è un processo
indipendente dall'energia in cui un soluto si muove seguendo un gradiente elettrochimico, dissipando l'energia libera
immagazzinata nel gradiente stesso. Affinché una sostanza priva di carica possa diffondere passivamente attraverso
una membrana plasmatica, è necessario che siano soddisfatte due condizioni: la sostanza deve essere presente a
concentrazione più elevata su un lato della membrana rispetto all’altro e la membrana deve essere permeabile a
quella particolare sostanza.
Una membrana può essere permeabile ad un dato soluto perché (1) il soluto può pas sare direttamente attraverso il
doppio strato lipidico oppure perché (2) il soluto può oltrepassare un poro acquoso che attraversa la membrana.

La discussione della diffusione semplice ci porta a considerare la polarità di un soluto.

La velocità di penetrazione di un composto attraverso una membrana dipende da un coefficiente di ripartizione (ossia
il rapporto fra la sua solubilità in un solvente apolare e quella in acqua) e dalla sua dimensione.
Se due molecole hanno coefficienti di ripartizione pressoché equivalenti, la molecola più piccola tende a penetrare
attraverso il doppio strato lipidico di una membrana più rapidamente di quella più grande.
Molecole molto piccole, prive di carica, attraversano rapidamente le membrane cellulari. Di conseguenza, le
membrane sono fortemente permeabili a piccole molecole inorganiche, come O2, CO2, NO e H2O, che si pensa si
introducano tra due fosfolipidi adiacenti. Diversamente, le molecole polari più grandi, come gli zuccheri, gli
amminoacidi e i composti intermedi fosforilati, manifestano una scarsa penetrabilità nella membrana.

DIFFUSIONE DELL’ACQUA ATTRAVERSO LE MEMBRANE

L’acqua si muove attraverso una membrana cellulare rapidamente rispetto ai soluti per cui le membrane vengono
dette semipermeabili. L’acqua si sposta facilmente attraverso una membrana semipermeabile da una regione a
concentrazione inferiore di soluto ad una regione a concentrazione di soluto più elevata. Questo processo viene detto
osmosi (è il movimento netto di molecole d'acqua, attraverso una membrana selettivamente permeabile, da una
soluzione con concentrazione di soluto minore, verso una soluzione a concentrazione di soluto maggiore e può essere
facilmente dimostrato ponendo una cellula in una soluzione che abbia una concentrazione di un soluto incapace di
attraversare la membrana diversa da quella presente al suo interno).
Quando due compartimenti con diversa concentrazione di soluto sono separati da una membrana semipermeabile, il
compartimento in cui la concentrazione di soluto è più elevata è definito ipertonico (o iperosmotico) rispetto a quello
con concentrazione di soluto inferiore, che è detto ipotonico (o ipoosmotico). Quando una cellula è in una soluzione
ipotonica, essa assorbe acqua per osmosi e si gonfia. Viceversa, quando una cellula è posta in una soluzione
ipertonica, perde rapidamente acqua per osmosi e si restringe. Il volume cellulare è controllato dalla differenza fra la
concentrazione dei soluti all’interno della cellula e quella presente nell’ambiente extracellulare. (Il rigonfiamento ed il
restringimento delle cellule in un mezzo leggermente ipotonico o ipertonico sono solitamente fenomeni transitori,
infatti, nel giro di pochi minuti la cellula ritorna al suo volume originario. In un mezzo ipotonico, le condizioni normali
si ristabiliscono non appena le cellule liberano ioni nel mezzo, riducendo di conseguenza la propria pressione osmotica
interna. In un mezzo ipertonico, le condizioni normali si ristabiliscono quando le cellule acquistano ioni dal mezzo ).
Una volta che la concentrazione interna dei soluti eguaglia quella esterna, i fluidi interni ed esterni sono isotonici (o
isosmotici) e non si verifica alcun movimento netto di acqua verso l’interno o verso l’esterno delle cellule.

INFORMAZIONI UTILI
L’osmosi è un fenomeno importante in un gran numero di funzioni corporee. Il tratto digerente, per esempio, ogni
giorno secerne vari litri di liquido, che sono riassorbiti per osmosi dalle cellule che rivestono l’intestino. Se questo
processo di assorbimento non avvenisse, come accade in caso di diarrea acuta, ci disidrateremmo rapidamente.
Infatti, il colera, una malattia di origine batterica, uccide circa 100.000 persone ogni anno, per lo più a causa della
perdita d’acqua nell’intestino, che è guidata dall’osmosi. Invece le piante utilizzano l’osmosi in vari modi.

ACQUAPORINE

Non tutte le cellule sono permeabili all'acqua allo stesso modo. Infatti, molte cellule sono molto più permeabili
all’acqua di quanto non si possa spiegare con la semplice diffusione attraverso il doppio strato lipidico. Una fa miglia di
piccole proteine integrali, dette acquaporine, permette il movimento passivo di acqua da un lato all’altro della
membrana plasmatica. Ogni subunità di acquaporina contiene un canale centrale, rivestito principalmente da residui
amminoacidici idrofobici, che è altamente specifico per le molecole d’acqua.

DIFFUSIONE DI IONI ATTRAVERSO LE MEMBRANE

Il doppio strato lipidico che costituisce lo strato centrale delle membrane biologiche è fortemente impermeabile a
sostanze con carica elettrica, compresi i piccoli ioni come Na+, K+, Ca2+ e Cl−. Nonostante questo, il rapido
movimento (conduttanza) di questi ioni attraverso la membrana gioca un ruolo fondamentale in numerose attività
cellulari:

• la formazione e la propagazione di un impulso nervoso

• la secrezione di sostanze nello spazio extracellulare
• la contrazione muscolare
• la regolazione del volume cellulare
• l’apertura degli stomi nelle foglie delle piante

I canali ionici sono aperture nelle membrane permeabili a determinati ioni ne esistono un numero sbalorditivo e sono
tutti formati da proteine integrali di membrana che circondano un poro acquoso.

La maggior parte dei canali ionici è molto selettiva nel consentire il passaggio, attraverso il poro, di un solo particolare
tipo di ione. Come accade per la diffusione di altri tipi di soluti attraverso le membrane, la diffusione di ioni attraverso
un canale è sempre “in discesa”, cioè da una condizione di elevata energia verso una ad energia inferiore. La maggior
parte dei canali ionici che sono stati identificati può esistere in una conformazione aperta o chiusa; canali di questo
tipo vengono definiti canali a sbarramento (gated). Si possono distinguere tre categorie principali di canali ionici a
sbarramento:

• canali a controllo di voltaggio (o voltaggio-dipendenti), Lo stato conformazionale dipende da differenze nella

carica ionica sui due lati della membrana
• canali a controllo di ligando (o ligando dipendenti), o stato conformazionale dipende dal legame di una
specifica molecola (il ligando)
• canali a controllo meccanico,la conformazione dipende da meccaniche (es., la tensione di stiramento)
applicate alla membrana.

MISURAZIONE DELLA CONDUTTANZA DI UN CANALE MEDIANTE LA REGISTRAZIONE PATCH -CLAMP

In questa tecnica, una micropipetta di vetro ben levigata è appoggiata contro una parte della superficie esterna di una
cellula; successivamente è applicata una lieve aspirazione per sigillare il bordo della pipetta contro la membrana
plasmatica. Dato che la pipetta contiene un filo metallico che funge da elettrodo è possibile applicare una differenza di
potenziale, o voltaggio, attraverso l’area di membrana racchiusa dalla pipetta e si può misurare il corrispondente
flusso di ioni attraverso i canali della membrana. La micropipetta può racchiudere un’area della membrana
contenente un solo canale ionico; ciò consente ai ricercatori di monitorare l’apertura e la chiusura di un singolo canale
a sbarramento come pure la sua conduttanza ai differenti voltaggi applicati.

DIFFUSIONE FACILITATA

La diffusione di sostanze attraverso una membrana avviene sempre da una regione a concentrazione più elevata verso
una regione a concentrazione inferiore, ma non sempre le sostanze diffondono attraverso il doppio strato lipidico o
attraverso un canale.. In numerosi casi, la sostanza che deve diffondere si lega prima selettivamente ad una proteina
che attraversa la membrana, detta trasportatore facilitante, che agevola il processo di diffusione. Si ritiene che il
legame del soluto al trasportatore facilitante, a livello di un versante della membrana, provochi un cambiamento
conformazionale della proteina, che espone il soluto sull’altro versante della membrana, dal quale può diffondere
seguendo il suo gradiente di concentrazione. La diffusione facilitata è simile per molti aspetti ad una reazione
catalizzata da un enzima. I trasportatori facilitanti, come gli enzimi sono specifici per le molecole che trasportano e
inoltre proprio come gli enzimi possiedono una cinetica di saturazione. A differenza dei canali ionici la maggior parte
dei trasportatori facilitanti può muovere attraverso la membrana solo da qualche centinaio a qualche migliaio di
molecole di soluto al secondo; quindi, una volta che la concentrazione degli ioni aumenta, la velocità di trasporto si
stabilizza al valore massimo di concentrazione e i trasportatori son saturati. Infine la loro attività può essere regolata.
La diffusione facilitata è particolarmente importante nel mediare l’entrata e l’uscita di soluti polari che non possono
penetrare nel doppio strato lipidico.

TRASPORTO ATTIVO

La vita non sarebbe possibile in condizioni di equilibrio. È molto evidente se si considera lo squilibrio ionico ai due lati
della membrana plasmatica. La capacità di una cellula di generare queste ripide differenze nel gradiente di
concentrazione attraverso la membrana plasmatica può derivare solo da un trasporto attivo il quale può essere
primario (in cui la stessa proteina responsabile del trasporto di una molecola è anche in grado di idrolizzare l'ATP per
alimentare direttamente il trasporto) o secondario (Il trasporto è accompagnato indirettamente dall'idrolisi dell'ATP;
le proteine trasportatrici non sono capaci di degradare l'ATP, ma utilizzano come loro fonte di energia un gradiente
favorevole di concentrazione di ioni, creato grazie ad un trasporto attivo primario, per sostenere il trasporto attivo di
una molecola o di uno ione diverso da quello che crea il gradiente). Il trasporto attivo, come la diffusione facilitata,
dipende da proteine integrali di membrana capaci di legare in modo selettivo un particolare soluto e di spostarlo
attraverso la membrana in seguito a modificazioni conformazionali della proteina. Tuttavia, il movimento di un soluto
contro un gradiente di concentrazione richiede di essere accoppiato al rilascio di energia. Pertanto, il movimento
endoergonico di ioni o altri soluti attraverso la membrana contro un gradiente di concentrazione è accoppiato ad un
processo esoergonico. Le proteine che effettuano un trasporto attivo vengono spesso chiamate “pompe”.
Nel trasporto attivo primario tutte le pompe di trasporto attivo primario spostano ioni carichi positivamente (H+,
Ca2+, Na+, e K+) attraverso le membrane. I gradienti di ioni positivi sono fondamentali per funzioni essenziali alla vita
cellulare.
Le pompe H+ (pompe protoniche) generano un potenziale di membrana nella membrana plasmatica dei procarioti,
delle piante e dei funghi; mantengono il pH basso in organelli come i lisosomi degli animali e i vacuoli di piante e
funghi, attivando in questo modo, gli enzimi contenuti al loro interno.
La pompa del Ca2+ trasferisce ioni Ca2+ dal citoplasma verso l'ambiente extracellulare, oppure dal citoplasma verso le
vescicole del reticolo endoplasmatico (RE). Di conseguenza, la concentrazione di ioni Ca2+ è tipicamente elevata
all'esterno della cellula e all'interno delle vescicole del RE, mentre è bassa nel citoplasma. Questo gradiente ionico di
Ca2+ è utilizzato dagli eucarioti come sistema di controllo di numerose attività cellulari (processi di secrezione,
l'assemblaggio dei microtubuli e la contrazione muscolare).

Nel trasporto attivo secondario (o cotrasporto) la formazione di gradienti di concentrazione fornisce un mezzo per
poter immagazzinare energia libera nella cellula. L’energia potenziale immagazzinata nei gradienti ionici è impegnata
dalla cellula in vari modi per svolgere un lavoro, compreso il trasporto di altri soluti. Ad esempio, l’attività fisiologica
dell’intestino, nel suo lume, gli enzimi scindono i polisaccaridi ad alto peso molecolare in zuccheri semplici, che sono
assorbiti dalle cellule epiteliali che lo rivestono. Il movimento di glucosio attraverso la membrana plasmatica apicale
delle cellule epiteliali, contro un gradiente di concentrazione, avviene per cotrasport o con gli ioni sodio. La
concentrazione di Na+ nelle cellule è mantenuta molto bassa grazie a un sistema di trasporto attivo primario (Na+/K+-
ATPasi), situato nella membrana plasmatica laterale e basale, che pompa gli ioni sodio fuori della cellula contro un
gradiente di concentrazione. La tendenza degli ioni sodio a diffondere “all’indietro” attraverso la membrana
plasmatica apicale, seguendo il loro gradiente di concentrazione, è sfruttata dalle cellule epiteliali per attuare il
cotrasporto di molecole di glucosio all’interno della cellula contro un gradiente di concentrazione. Le molecole di
glucosio sono trasportate da un sistema di trasporto attivo secondario. In questo caso, la proteina trasportatrice,
chiamata cotrasportatore Na+/glucosio, trasporta due ioni sodio ed una molecola di glucosio per ogni ciclo. Una volta
all’interno, le molecole di glucosio diffondono nella cellula ed attraversano la membrana basale mediante diffusione
facilitata. Il trasporto attivo secondario del glucosio nelle cellule epiteliali dell’intestino e il trasporto del saccarosio
nelle cellule vegetali sono esempi di simporto, in cui le due specie trasportate (Na+ e glucosio o H+ e saccarosio) si
muovono nella medesima direzione. Sono state isolate numerose proteine di trasporto secondario che sono coinvolte
in un meccanismo di antiporto, in cui le due specie trasportate si spostano in direzioni opposte.

Le molecole più grandi che possono essere trasportate attraverso le membrane cellulari sfruttando i meccanismi di
trasporto attivo e passivo sono dell'ordine di grandezza degli amminoacidi o dei monosaccaridi, come il glucosio.
Esistono però meccanismi che permettono il trasporto di molecole più voluminose.

DIFETTI NEI CANALI IONIOCI E NEI TRASPORTATORI COME CAUSA DI MALATTIE ERE DITARIE.
Numerose malattie ereditarie gravi sono state attribuite a mutazioni a carico di geni che codificano per proteine dei
canali ionici.

Una spiegazione per gli effetti debilitanti sulla funzionalità polmonare indotti dall’assenza del prodotto proteico del
gene CFTR. A livello dell’epitelio respiratorio di un individuo sano, l’acqua esce dalle cellule epiteliali in risposta al
movimento verso l’esterno degli ioni, idratando così lo strato di muco presente sulla superficie respiratoria. Lo strato
mucoso idratato, insieme ai batteri intrappolati in esso, è prontamente rimosso dalle vie respiratorie. A livello
dell’epitelio respiratorio di un individuo malato di CF, il movimento anomalo degli ioni induce un flusso di acqua nella
direzione opposta, disidratando così lo strato mucoso. Come conseguenza, i batteri intrappolati non possono essere
eliminati dalle vie respiratorie e questo permette loro di proliferare come un biofilm e di causare l’insorgenza di
infezioni croniche.

POTENZIALI DI MEMBRANA E IMPULSI NERVOSI

Tutti gli organismi rispondono attivamente agli stimoli esterni; questa proprietà viene definita irritabilità. Le cellule
nervose, o neuroni, sono specializzate per la raccolta, la conduzione e la trasmissione dell’informazione, codificate
sotto forma di rapidi impulsi elettrici. Il nucleo del neurone è situato in una regione espansa, detta corpo cellulare o
pirenoforo, che è il centro metabolico della cellula e il sito in cui è sintetizzata la maggior parte dei componenti
cellulari. Dal corpo cellulare della maggior parte dei neuroni si estendono una serie di sottili estroflessioni, chiamate
dendriti, che ricevono le informazioni in entrata dall’esterno, generalmente da altri neuroni. Dal corpo cellulare
emerge anche una singola estroflessione, l’assone, che conduce gli impulsi in uscita dal corpo cellulare verso le cellule
bersaglio. La maggior parte degli assoni si ramifica all’estremità in processi più piccoli, ognuno dei quali finisce in un
bottone terminale, una regione specializzata dove gli impulsi sono trasmessi dal neurone alla cellula bersaglio. A livello
cerebrale, molti neuroni possono terminare in migliaia di bottoni terminali permettendo a queste cellule di
comunicare con migliaia di potenziali cellule bersaglio. La maggior parte dei neuroni presenti nei vertebrati è avvolta
da una guaina mielinica ricca di lipidi.

POTENZIALE DI RIPOSO

Quando fra due regioni vi è un eccesso di ioni positivi da un lato e un eccesso di ioni negativi dall’altro si instaura un
voltaggio, o ddp elettrico, tra i due punti. È possibile misurare i voltaggi attraverso le membrane plasmatiche
inserendo un sottile elettrodo di vetro) nel citoplasma di una cellula, posizionando un secondo elettrodo nel liquido
extracellulare e collegando i due elettrodi ad un voltmetro. La presenza di un potenziale di membrana non è esclusiva
delle cellule nervose ma in esse o in una cellula muscolare in uno stato di non eccitazione, questo potenziale è definito
potenziale di riposo poiché è soggetto ad ampie variazioni.

POTENZIALE D’AZIONE

I cambiamenti nel potenziale di membrana sono detti potenziale d’azione.

PROPAGAZIONE DI POTENZIALI D’AZIONE

Quando un potenziale d’azione è stato innescato, esso non rimane localizzato in un punto particolare ma si propaga
lungo la cellula come impulso nervoso fino ai terminali nervosi. Gli impulsi nervosi si propagano lungo una membrana
perché il potenziale d’azione in una zona esercita un effetto sulla zona adiacente. L’ampia depolarizzazione che
accompagna un potenziale d’azione crea una differenza di carica lungo la superficie interna e quella esterna della
membrana plasmatica. Come conseguenza, gli ioni positivi si muovono verso il sito di depolarizzazione sulla superficie
esterna della membrana, mentre si allontanano da quel punto sulla superficie interna. A causa di questo flusso locale
di corrente, la membrana della regione situata a valle del potenziale d’azione si depolarizza anch’essa. Poiché la
depolarizzazione che accompagna il potenziale d’azione è molto ampia, la membrana nella regione adiacente è
prontamente depolarizzata ad un livello superiore al valore soglia, evento che induce l’apertura dei canali del sodio in
questa regione adiacente, generando un altro potenziale d’azione. Così, una volta innescato un potenziale d’az ione,
una serie di potenziali d’azione procede per tutta la lunghezza dell’assone senza perdere di intensità ed arriva alla
cellula bersaglio con la stessa intensità che aveva nel punto di origine. Dal momento che tutti gli impulsi che viaggiano
lungo un neurone hanno la stessa intensità, stimoli più forti non possono produrre impulsi maggiori di quelli generati
da stimoli più deboli. Eppure, siamo in grado di distinguere tra stimoli più o meno intensi. La capacità di discriminare a
livello sensoriale dipende da diversi fattori.

CONDUZIONE SALTATORIA
Durante la conduzione saltatoria, solo la membrana a livello della zona nodale dell’assone si depolarizza e diventa
capace di originare un potenziale d’azione. Questo evento si realizza in quanto la corrente fluisce lungo l’assone
direttamente da un nodo attivato a quello successivo ancora in uno stato di riposo.

TRASMISSIONE NERVOSA: ATTRAVERSARE LO SPAZIO SINAPTICO

I neuroni sono connessi alle loro cellule bersaglio da giunzioni specializzate, dette sinapsi le quali sono separate da un
intervallo detto fessura sinaptica.). Una cellula presinaptica (una cellula recettoriale o un neurone) conduce gli impulsi
verso una sinapsi e sul “lato ricevente” di una sinapsi si trova una cellula postsinaptica.

La giunzione neuromuscolare è il sito in cui le ramificazioni terminali di un assone motore formano sinapsi con le fibre
muscolari di un muscolo scheletrico.

Sequenza degli eventi durante la trasmissione sinaptica che coinvolge il neurotrasmettitore acetilcolina. Nel corso
degli stadi 1-4, un impulso nervoso raggiunge il bottone terminale dell’assone, i canali del calcio si aprono con
conseguente ingresso di ioni Ca2+, l’acetilcolina è rilasciata dalle vescicole sinaptiche e si lega ai recettori sulla
membrana postsinaptica. Se il legame delle molecole di neurotrasmettitore provoca una depolarizzazione della
membrana postsinaptica, si può generare un impulso nervoso. Tuttavia, se il legame del neurotrasmettitore provoca
un’iperpolarizzazione della membrana postsinaptica, la cellula bersaglio risulterà inibita, rendendo più difficile in
questa cellula la generazione di un impulso in seguito a un’altra stimolazione eccit atoria.

Un neurotrasmettitore può avere un effetto stimolatorio su una particolare membrana postsinaptica ed un effetto
inibitorio su un’altra.

Acetilcolina inibisce la contrattilità delle cellule muscolari cardiache, ma stimola quella delle fibre muscolar i
scheletriche.

Nell’encefalo, il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitatorio, mentre l’acido gamma-amminobutirrico

(GABA) è il principale neurotrasmettitore inibitorio.

Numerosi anestetici generali, come pure il Va l i u m e i suoi derivati, agiscono legandosi al recettore per il GABA e
aumentando l’attività del principale “interruttore di spegnimento” dell’encefalo.

Molti farmaci che incidono su disturbi come ansia, depressione, insonnia e schizofrenia esercitano la loro azione
agendo sulle sinapsi. Un neurotrasmettitore è eliminato dalla sinapsi in due modi:

• Degradazione: enzimi degradano le molecole del neurotrasmettitore nello spazio sinaptico.

• Ricaptazione: proteine trasportano indietro le molecole di neurotrasmettitore ai terminali presinaptici.

A causa della degradazione o della ricaptazione delle molecole di neurotrasmettitore, l’effetto di ogni impulso ha una
durata nel tempo non superiore a pochi millisecondi.

ESOCITOSI ED ENDOCITOSI

Molecole e particelle di dimensioni consistenti possono essere spostate all’interno o all’esterno delle cellule mediante
endocitosi ed esocitosi. Questi meccanismi permettono alle sostanze di entrare o di uscire senza passare direttamente
attraverso la membrana plasmatica.

Nell’esocitosi, una vescicola, che porta sostanze da secernere, entra in contatto e si fonde con il lato citosilico della
membrana plasmatica. La fusione porta alla liberazione del contenuto vescicolare all’esterno della cellula e
all’integrazione della membrana vescicolare nella membrana plasmatica.

Nell’endocitosi, le sostanze all’esterno della cellula sono intrappolate da una porzione di membrana plasmatica che si
incurva verso l’interno della cellula e poi si separa dal lato citoplasmatico, dando origine a una vescicola endocitica.
L’endocitosi avviene secondo due meccanismi generali: l’endocitosi di massa (pinocitosi) o l’endocitosi mediata da
recettori. la maggior parte delle sostanze che entrano nella cellula viene digerita in subunità molecolari piccole a
sufficienza per essere trasportati nel citoplasma attraversi le membrane delle vescicole.

RIEPILOGO
STRUTTURA E FUNZIONE DELLA MEMBR ANA

• sia i fosfolipidi, sia le proteine di membrana presentano regioni idrofiliche e idrofobiche che forniscono loro
proprietà di duplice solubilità (molecole anfipatiche)
• le membrane sono organizzate a formare un doppio strato fluido di fosfolipifi , in cui le regioni polari dei
fosfolidi si posizionano a livello delle superfici del doppio strato mentre le code apolari si raccolgono insieme
verso l’interno del doppio strato.
• Le proteine di membrana sono sospese individualmente all’interno del doppio strato e si dispongono con le
loro regioni idrofiliche alla superficie della membrana e le loro regioni idrofobiche affondate verso l’interno.
• Il doppio strato lipidico forma l’intelaiatura strutturale di tutte le membrane e agisce come una barriera che
impedisce il passaggio della maggior parte delle molecole idrofobiche affondate verso l’interno.
• Le proteine inserite nel doppio strato di fosfolipidi svolgono la maggior parte delle funzioni della membrana,
incluso il trasporto di specifiche sostanze idrofiliche, il riconoscimento, la ricezione dei segnali, l’adesione
cellulare e il metabolismo.
• Le proteine integrali di membrana sono inserite profondamente nel doppio strato; mentre, le proteine
periferiche di membrana sono associate con le superfici della membrana
• Le membrane sono asimmetriche, ossia le die metà del doppio strato penetrano differenti proporzioni di
diversi tipi di fosfolipidi.
• Le membrane svolgono funzioni diverse, che includono il circoscrivere i limiti delle cellule e dei
compartimenti interni, svolgere un ruolo di barriere alla permeabilità e facilitare la conduzione di segnali
elettrici. Le proteine di membrana mostrano anche diverse attività, in qualità di enzimi, proteine canale,
proteine di trasporto, recettori e molecole di adesione cellulare.

LE FUNZIONI DELLE MEMBRANE NEL PROCESSO DI TRASPORTO: IL TRASPORTO PASSIVO

• Il trasporto passivo si basa sulla diffusione, ossia il movimento netto di molecole secondo il gradiente di
concentrazione, da una regione a concentrazione maggiore verso una regione a concentrazione minore. Il
trasporto passivo non richiede il consumo di energia da parte delle cellule.
• La diffusione semplice è il trasporto passivo di sostanze attraverso la regione lipidica delle membrane cellulari
secondo il loro gradiente di concentrazione. la diffusione semplice si attiva molto rapidamente per piccole
molecole solubili nei lipidi.
• La diffusione semplice è il trasporto passivo delle sostanze attraverso la porzione lipidica delle membrane
cellulari. Essa procede più rapidamente per le piccole molecole liposolubili.
• La diffusione facilitata è la diffusione delle molecole polari e cariche attraverso una membrana sostenuta da
proteine di trasporto situate nella membrana. Essa segue il gradiente di concentrazione, è specifica per
alcune sostanze e può essere saturata ad alte concentrazioni della sostanza trasportata.
• La maggior parte delle proteine responsabili della diffusione facilitata di ioni è controllata da “barriere
molecolari “ che aprono e chiudono i canali di itrasporto.

IL TRASPORTO PASSIVO DELL’ACQUA E L’OSMOSI

L’osmosi è la diffusione netta di molecole d’acqua attraverso una membrana selettivamente permeabile in risposta a
diff3erenze nella concentrazione di molecole di soluto. L’acqua si muove dalla soluzione ipotonica (concentrazione
minore di molecole di soluto) verso la soluzione ipertonica (concentrazione maggiore di molecole di soluto). Nel
momento in cui le soluzioni ai due lati della membrana sono tra loro isotoniche, non si verifica alcun movimento
osmotico netto di acqua in alcuna delle due direzioni.

IL TRASPORTO ATTIVO
• Il trasporto attivo sposta sostanze contro il loro gradiente di concentrazione e richiede che le cellule
consumino energia. Il trasporto attivo dipende da proteine di membrana, è selettivo nei confronti di
specifiche sostanze e si satura ad alte concentrazioni della sostanza trasportata.
• Le proteine responsabili del trasporto attivo possono essere pompe di trasporto primario, che utilizzano
direttamente le molecole di ATP come fonte di energia, oppure pompe di trasporto secondario, che , per
ottenere l’energia necessaria al trasporto, sfruttano gradienti di concentrazione favorevoli di ioni carichi
positivamente, a loro volta generati da pompe di trasporto primario.
• Il trasporto attivo secondario può avvenire con un meccanismo di simporto, in cui la sostanza trasportata si
muove nella stessa direzione del gradiente di concentrazione usato come fonte di energia, oppure seguendo
un meccanismo di antiporto, nel quale la sostanza trasportata si muove in direzione opposta al gradiente di
concentrazione usato come fonte di energia.
LA RESPIRAZIONE CELLULARE

Le piante e quasi tutti gli altri organismi ottengono l'energia necessaria per le attività cellulari grazie alla respirazione
cellulare, il processo molecolare che trasferisce elettroni da molecole organiche donatrici ad una molecola accettrice
finale come l'ossigeno; l'energia che viene liberata dal meccanismo sostiene la sintesi di ATP.
Le reazioni di ossido-riduzione, chiamate reazioni redox, trasferiscono elettroni in maniera parziale o completa da
atomi donatori ad atomi accettori; il donatore si ossida rilasciando gli elettroni, mentre l'accettore si riduce.

Negli eucarioti, l’utilizzo dell’ossigeno per estrarre energia ha luogo in un organello specializzato, il mitocondrio. Sono
abbastanza grandi da poter essere osservati al microscopio. In funzione del tipo cellulare, i mitocondri possono
presentarsi con caratteristiche morfologiche molto diverse. Inoltre, i mitocondri si possono fondere tra loro oppure
dividersi in due, processi conosciuti rispettivamente come fusione mitocondriale e fissione (o scissione) mitocondriale.

L’intero processo della respirazione cellulare avviene in tre fasi: glicolisi, ossidazione del piruvato e fosforilazione
ossidativa.

MEMBRANE MITOCONDRIALI

Il margine più esterno del mitocondrio contiene due membrane: la membrana mitocondriale esterna e la membrana
mitocondriale interna. La membrana mitocondriale esterna racchiude completamente il mitocondrio e ne rappresenta
il confine esterno. La membrana mitocondriale interna è suddivisa in due principali domini che contengono diverse
proteine e svolgono funzioni distinte. Uno di questi domini, chiamato membrana delimitante interna, si estende
appena sotto la membrana mitocondriale esterna, formando un rivestimento esterno a doppia membrana. La
membrana delimitante interna è particolarmente ricca in proteine implicate nell'importazione delle proteine della
matrice mitocondriale. L’altro dominio della membrana mitocondriale interna si estende verso l’interno dell’organello
con una serie di invaginazioni membranose, chiamate creste. Il ruolo dei mitocondri come trasduttori di energia è
strettamente correlato con le membrane delle creste mitocondriali. Le creste generano una superficie di membrana
molto grande che ospita i componenti richiesti per la respirazione aerobica e per la produzione di ATP.

Le membrane mitocondriali dividono questo organello in due compartimenti ripieni di fluido, uno al centro del
mitocondrio, detto matrice, e un secondo tra membrana esterna e membrana interna, detto spazio intermembrana.
La matrice ha consistenza di gel, dovuta ad un’alta concentrazione di proteine idrosolubili. Le membrane esterna e
interna hanno proprietà molto differenti. La membrana esterna è formata per circa il 50% da lipidi e contiene una
curiosa miscela di enzimi interessati ad attività estremamente diverse. La membrana interna, invece, contiene più di
100 diversi tipi di polipeptidi ed ha un alto rapporto proteine/lipidi. La membrana interna è praticamente priva di
colesterolo e ricca di un insolito fosfolipide, la cardiolipina (la quale svolge un ruolo importante nel facilitare l’attività
di alcuni grandi complessi proteici coinvolti nel trasporto degli elettroni e nella sintesi dell’ATP. Ambedue le
membrane contengono porine (proteine integrali che formano canali). le porine della membrana mitocondriale sono
in grado di chiudersi reversibilmente a seconda delle condizioni all’interno della cellula. Quando i canali delle porine
sono ben aperti, la membrana esterna è permeabile alle molecole come l’ATP, il NAD e il coenzima A, che hanno un
ruolo chiave nel metabolismo energetico all’interno del mitocondrio. Al contrario, la membrana mitocondriale interna
è altamente impermeabile e, praticamente, tutte le molecole e tutti gli ioni hanno bisogno di trasportatori specifici
per entrare nella matrice.

METABOLISMO AEROBICO NEL MITOCONDRIO

A cominciare dal glucosio, i primi stadi del processo di ossidazione vengono condotti dagli enzimi della glicolisi,
localizzati nel citosol. Solo una piccola porzione dell’energia libera contenuta nel glucosio viene resa disponibile per la
cellula durante la glicolisi, (avviene nel citosol) abbastanza per la sintesi netta di due molecole di ATP per molecola di
glucosio ossidata. La maggior parte dell’energia resta immagazzinata nel piruvato. I due prodotti finali della glicolisi
possono essere metabolizzati in due modi diversi, a seconda del tipo di cellula in cui essi sono stati prodotti e a
seconda della presenza o assenza di ossigeno. Oltre al glucosio e ad altri zuccheri a sei atomi di carbonio, anche
un'ampia varietà di carboidrati, lipidi e proteine può entrare in punti diversi della serie di reazioni della glicolisi.
In sintesi, durante la glicolisi, la molecola di glucosio viene trasformata, attraverso una serie di tappe, in due molecole
di acido piruvico, che passano alla fase successiva della respirazione, il ciclo di Krebs.

CICLO DELL’ACIDO CI TRICO

È la seconda fase della respirazione cellulare, chiamato così poiché il primo prodotto di questa fase è l’acido citrico.
Nonostante il suo rendimento in ATP sia minimo soltanto due molecole il ciclo dell’acido citrico è un passaggio
fondamentale perché sottrae alle molecole dell’acido piruvico gli elettroni ad alto contenuto energetico e li invia
all’ETC, la fase conclusiva della respirazione è quella in cui viene prodotta la maggior parte dell’ATP.

Come la glicolisi, anche il ciclo dell'acido citrico è regolato in punti chiave per coordinare la sua velocità alle esigenze
cellulari di ATP. Per esempio, l'enzima che catalizza la prima reazione del ciclo dell'acido citrico, il citrato sintasi, è
inibito da elevate concentrazioni di AT P. Quando la produzione di AT P eccede le richieste cellulari, l'inibizione
automaticamente rallenta o blocca il ciclo, in modo da risparmiare le molecole combustibili cellulari.

FASE FINALE

Completato il ciclo di Krebs, si giunge all’evento culminante della respirazione cellulare, la produzione delle 32
molecole dell’ATP per metto della catena di trasporto o ETC, che costituisce la terza fase del processo aerobico di
estrazione dell’energia. L’ETC è la destinazione finale degli elettroni trasportati dalle molecole di NADH e FADH2
prodotte durante le due fasi precedenti del processo. Gli anelli di cui è formata la catena di trasporto degli elettroni
sono in realtà molecole, ciascuna delle quali ha un’affinità per gli elettroni maggiore di quella che le precede: in
questo modo gli elettroni vengono spostati lungo la catena fino all’accettore finale di elettroni, l’ossigeno. Ogni catena
di trasporto degli elettroni si compone di grossi complessi proteici, collegati da molecole mobili più piccole e situati
sulla membrana interna dei mitocondri. Con l’ETC, infatti, l’azione si sposta dalla matrice del mitocondrio alla
membrana mitocondriale interna. quando le molecole di NADH giungono sulla membrana interna dei mitocondri ,
vengono a contatto con la prima molecola trasportatrice della catena e le cedono gli elettroni e il protone,
ossidandosi.

FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA

I prodotti più importanti della glicolisi, dell'ossidazione del piruvato e del ciclo dell'acido citrico sono i molti elettron i
ad alta energia rimossi dalle molecole energetiche e raccolti dalle molecole trasportatrici NAD+ e FAD come risultato
delle reazioni redox. Questi elettroni sono liberati dalla forma ridotta di questi trasportatori a livello del sistema di
trasferimento degli elettroni che si trova nei mitocondri (negli eucarioti). Il sistema mitocondriale di trasferimento
degli elettroni è composto da una serie di complessi proteici che, in successione, accettano e cedono gli elettroni per
trasferirli, alla fine, al loro accettore finale, che è l'ossigeno. Mentre gli elettroni fluiscono lungo il sistema, rilasciano
energia libera, che è utilizzata per generare un gradiente di H+ attraverso la membrana mitocondriale interna. Il
gradiente è caratterizzato da un'elevata concentrazione di H+ nello spazio intermembrana e da una bassa
concentrazione di H+ nella matrice mitocondriale. Il gradiente di H+ fornisce l'energia necessaria per guidare la sintesi
di AT P ad opera dell'ATP sintasi mitocondriale.

Quando la formazione dell’ATP è guidata dall’energia che è liberata dagli elettroni rimossi durante l’ossidazione di
substrati, il processo è detto fosforilazione ossidativa (da non confondere con la fosforilazione si substrato nella quale
si forma ATP direttamente).

PRINCIPALI MANIFESTAZIONI DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI

• Sistema nervoso centrale: emicrania, mioclono, regressione/ritardo psicomotorio, demenza, emiparesi,
convulsioni, atassia, emianopsia, cecità corticale, distonia, parkinsonismo, tremore
• Sistema nervoso periferico: neuropatia periferica Muscolo: debolezza, oftalmoplegia, ptosi palpebrale,
intolleranza all’esercizio fisico, mioglobinuria

• Apparato visivo: retinopatia pigmentosa, cataratta, atrofia ottica

• Apparato acustico: sordità/ipoacusia neurosensoriale

• Sistema gastroenterico: malassorbimento, pseudo-ostruzioni intestinali, disfunzione del pancreas esocrino

• Reni: sindrome di Fanconi

• Sistema endocrino: diabete mellito, bassa statura, ipoparatiroidismo

• Sistema cardiocircolatorio: cardiomiopatia, blocchi di conduzione

• Sistema ematopoietico: anemia sideroblastica

I MICROSCOPI

I microscopi sono strumenti che producono immagini di oggetti ingrandite. esistono di due tipi: ottico ed elettronico.

OTTICO:
Una sorgente di luce, che può essere esterna al microscopio o inserita all’interno della sua base, è necessaria per
illuminare il campione. Il condensatore, posto sotto il tavolino portaoggetti, è necessario per concentrare i raggi diffusi
dalla sorgente di luce e per illuminare il campione con un piccolo cono di luce sufficientemente intensa da permettere
di vedere ogni piccola parte del campione, una volta ingrandita. I raggi luminosi centrati sul campione dal
condensatore sono poi raccolti dalle lenti dell’obiettivo del [Link] sono due gruppi di raggi luminosi che
entrano nell’obiettivo quelli modificati e quelli non. Il secondo gruppo consiste in un cono di luce proveniente dalle
lenti del condensatore che passa direttamente nell’obiettivo e crea la luce di fondo del campo visivo. Il primo gruppo
di raggi luminosi è quello che emana dai vari punti che compongono il campione. Questi raggi luminosi sono messi a
fuoco dall’obiettivo per formare un’immagine reale e ingrandita dell’oggetto all’interno della colonna del microscopio .
L’immagine formata dall’obiettivo è usata poi come oggetto da un secondo sistema di lenti, l’oculare, per ottenere
un’immagine ingrandita virtuale. Un terzo sistema di lenti, localizzato nella parte anteriore dell’occhio, usa l’immagine
virtuale prodotta dall’oculare come un oggetto per generare un’immagine reale sulla retina. Quando si ruota la
manopola per la messa a fuoco del microscopio, la distanza relativa tra il campione e l’obiettivo varia, permettendo
all’immagine finale di essere messa a fuoco sul piano della retina. L’ingrandimento totale ottenuto dal microscopio è il
prodotto dell’ingrandimento dato dall’obiettivo moltiplicato per quello dell’oculare. La risoluzione raggiunta da un
microscopio è limitata dall’effetto di diffrazione. A causa della diffrazione la luce raccolta da un punto del campione
non crea mai un punto conforme nell’immagine, bensì un piccolo disco. Se i due dischi prodotti da due punti di un
oggetto vicini, ma non separati da una distanza sufficiente, si sovrappongono, essi sono visti come una struttura unica,
ovvero non possono essere risolti. Quindi, il potere di risoluzione di un microscopio può essere definito in termini della
capacità di vedere due punti adiacenti nel campo visivo come entità distinte. La risoluzione otten ibile da un
microscopio è limitata dalla lunghezza d’onda della sorgente luminosa utilizzata secondo l’equazione

D= 0,61λ/nsenα

dove d la distanza minima dalla quale due punti del campione devono essere separati per essere risolti, λ è la
lunghezza d’onda della luce (527 nm per la luce bianca), n è l’indice di rifrazione del mezzo presente tra il campione e
le lenti dell’obiettivo. Alfa (α) è uguale al semiangolo del cono di luce che entra nell’obiettivo (misura della capacità
della lente di raccogliere la luce ed è correlata all sua apertura). (Il denom. È chiamato apertura numerica ed è
costante per ogni lente). (Se poniamo nell’equazione il minimo possibile della lunghezza d’onda e l’apertura numerica
massima possibile, possiamo determinare il limite di risoluzione del microscopio ottico).

• Limite di risoluzione del microscopio ottico:0,2 µ𝑚

• Limite di risoluzione dell’occhio nudo: 0.1 mm

In microscopia, un punto di vista più pratico di quello della risoluzione è il concetto di visibilità, che riguarda i fattori
che permettono ad un oggetto di essere effettivamente osservato. Un altro termine per definire la visibilità è
contrasto, ovvero la differenza di aspetto fra parti adiacenti di un oggetto o fra l’oggetto e il suo sfondo.

MICROSCOPIO A CAMPO CHIARO.

In un microscopio a campo chiaro, il cono di luce illuminante appare come uno sfondo luminoso sul quale l’immagine
del preparato deve avere contrasto. La microscopia a campo chiaro è adatta a campioni ad alto contrasto, come
sezioni colorate di tessuti. Uno dei metodi migliori per rendere visibile un campione sottile e traslucido al microscopio
è quello di trattarlo con un colorante, che assorba solo certe lunghezze d’onda all’interno dello spettro visibile.
Coloranti diversi si legano a differenti tipi di molecole biologiche e, perciò, questi procedimenti non solo rendono il
campione maggiormente visibile, ma possono anche indicare, nelle cellule o nei tessuti, dove si trovano diversi tipi di
sostanze. I campioni da osservare con il microscopio ottico possono essere divisi generalmente in due categorie:
preparati in toto (intatti) o sezioni.

FASI DI PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

1. Frazione e inclusione
2. Taglio delle sezioni: il microtomo
3. Posizionamento e asciugature delle sezioni
4. Colorazione istologica
5. osservazione

La prima fase del processo è l’uccisione delle cellule mediante immersione del tessuto in una soluzione chimica, detta
fissativo. Un buon fissativo è in grado di penetrare rapidamente la membrana cellulare e di immobilizzare tutto il
materiale macromolecolare in modo tale che la struttura della cellula si mantenga il più possibile vicino allo stato
vivente. Dopo la fissazione, il tessuto è disidratato mediante trasferimento attraverso una serie di alcoli e incluso in
paraffina (cera), che dà il supporto meccanico durante il sezionamento. I vetrini contenenti queste sezioni in paraffina
sono semplicemente immersi in toluene per rimuovere la paraffina, lasciando sottili sezioni di tessuto attaccate al
vetrino, dove possono essere colorate o trattate con enzimi, anticorpi o altri agenti. Dopo la procedura di colorazione,
si monta un vetrino coprioggetto sul tessuto usando un mezzo di montaggio con lo stesso indice di rifrazione del
portaoggetto e del coprioggetto.

MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FAS E

Il microscopio a contrasto di fase rende più visibili oggetti altamente trasparenti. La possibilità di vedere le diverse
parti di uno stesso oggetto dipende dalla loro capacità di interagire con la luce in maniera diversa l’una dall’altra. Alla
base di questa differenza c’è l’indice di rifrazione, regioni a composizione diversa dovrebbero avere differente indice
di rifrazione. Il microscopio a contrasto di fase converte le differenze di indice di rifrazione in differenze di intensità
che sono visibili all’occhio. Raggiunge questo risultato (1) separando la luce diretta dalla luce diffratta dall’oggetto e
(2) facendo sì che i raggi di luce da queste due sorgenti interfersiscano tra di loro. Il microscopio a contrasto di fase è
un tipo di microscopio a interferenza.

MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
Il microscopio a fluorescenza permette di osservare la localizzazione di certe molecole (dette fluorocromi o fluorofori).
I fluorofori assorbono radiazioni di lunghezza d’onda ultravioletta, invisibile, e rilasciano parte dell’energia in forma di
luce visibile con lunghezza d’onda maggiore, un fenomeno chiamato fluorescenza.

Una sorgente di luce del microscopio produce un fascio di luce ultravioletta che passa attraverso un particolare
sistema di filtri che impediscono il passaggio a tutte le lunghezze d’onda tranne quelle che eccitano un fluorocromo
specifico. Il raggio di luce monocromatica viene quindi focalizzato sul campione contenente il fluorocromo, che
eccitato emette luce visibile che viene raccolta dalle lenti dell’obiettivo.

L’immagine che ne deriva può essere osservata o catturata digitalmente.

Ci sono vari modi in cui i composti fluorescenti possono essere utilizzati in biologia molecolare e cellulare. In una delle
prime e più comuni applicazioni, piccoli fluorocromi organici, come ad esempio rodamina o fluoresceina, sono legati in
modo covalente (coniugato) ad un anticorpo che può essere usato per indicare la localizzazione di una proteina
specifica nella cellula. Questa tecnica è detta immunofluorescenza.

FASE DI PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

1. congelamento
2. taglio sezioni (criostato)
 3. preparazione vetrini
4. immunofluorescenza

Per la microscopia ottica, gli anticorpi sono generalmente complessati con piccole molecole fluorescenti per formare
derivati che sono poi incubati con cellule o sezioni di cellule. I siti di legame sono quindi visualizzati con il microscopio
a fluorescenza. Questa tecnica è chiamata immunofluorescenza diretta. Una variante di questa tecnica è
l’immunofluorescenza indiretta nella quale le cellule sono incubate con un anticorpo non marcato, che forma un
complesso con il corrispondente antigene. La localizzazione del complesso antigene-anticorpo è rilevata in una
seconda fase, usando una preparazione di anticorpi marcati con molecole fluorescenti i cui siti di combinazione sono
diretti contro la molecola dell’anticorpo usata per la prima fase. Questa produce immagini più brillanti.

L’immunofluorescenza ha sia dei vantaggi che degli svantaggi:

•Buona sensibilità e specificità di reazione;

•Tecnica semplice e facile identificazione di elementi anche molto piccoli;
•Il risultato visualizzabile subito dopo la reazione immunologica;
•Permette di indagare contemporaneamente la presenza di autoanticorpi rivolti contro diversi tipi di
antigeni;
•Ha un costo contenuto;

ma:

•La fluorescenza decade rapidamente;

•Strutture tissutali difficilmente identificabili;

MICROSCOPIO CONFOCALE A SCANSIONE LASER

Marvin Minsky ha inventato un nuovo strumento rivoluzionario, il microscopio confocale che produce l’immagine di
un sottile piano all’interno di un preparato di spessore assai maggiore. In questo tipo di microscopio, il campione è
illuminato da un raggio laser finemente focalizzato che passa rapidamente attraverso il campione a una determinata
profondità, illuminando così soltanto una sezione ottica all’interno dell’oggetto.

La luce monocromatica, di lunghezza d’onda breve (blu), è emessa da una sorgente d’illuminazione laser, passa
attraverso un piccolo diaframma ed è riflessa nell’obiettivo da uno specchio dicroico (che permette il passaggio ai soli
raggi di determinate lunghezze d’onda riflettendo gli altri). Le lenti dell’obiettivo focalizzano la luce riflessa in un punto
nel piano del campione.

Fluorocromi presenti nel campione assorbono la luce riflessa incidente ed emettono raggi di luce di lunghezza d’onda
maggiore, capaci di attraversare lo specchio dicroico e focalizzarsi nel piano del foro stenopeico. La luce, quindi,
raggiunge il tubo del fotomoltiplicatore, che amplifica l’intensità del segnale e lo trasmette al computer che costruisce
l’immagine digitale. La luce che proviene dai piani superiori o inferiori al piano focale del campione non passa
attraverso il foro stenopeico e non contribuisce alla formazione dell’immagine.

MICROSCOPIA A FLUORESCENZA A SUPER RIS OLUZIONE

Nell’ultima decade sono state sviluppate una serie di tecniche ottiche che consentono ai ricercatori di localizzare
proteine fluorescenti con una risoluzione di poche decine di nanometri.

MICROSCOPIA FLUORESCENTE A FOGLIO DI LUCE

È un tipo di microscopia che permette di acquisire immagini di campioni tridimensionali di grandi dimensioni. Questa
tecnica utilizza un laser di eccitazione focalizzato su un foglio sottile e piatto che illumina il campione lungo un piano
perpendicolare all’angolo di osservazione. In questo modo si ottiene una riduzione del fotodanneggiamento e un
incremento nella velocità di acquisizione, poiché i fluorofori sono eccitati solo alla profondità osservata lungo un
intero piano. Nel 2014 venne sviluppata una nuova tecnica chiamata microscopia a foglio di luce reticolare, che
illumina il campione utilizzando numerosi fogli leggeri ultrasottili. L’impiego di questo tipo di microscopia permette la
generazione di immagini 3D di campioni biologici vivi ad alta risoluzione spazio-temporale e lungo un arco temporale
prolungato ed al contempo riduce al minimo i fenomeni di fotosbiancamento e fotodanneggiamento.

EMATOSSILINA-EOSINA
Nucleo e componenti acidi del citoplasma colorati in blu-viola dall’ematossilina, un colorante basico di cui esistono
diverse varianti (ad es. di Mayer o Carazzi). Il citoplasma e i vari componenti basici vengono colorati in rosa da eosina.

PAS (ACIDO PERIODICO-REATTIVO SHIFF)

Evidenzia, colorandoli in rosso magenta, componenti tissutali contraddistinti da gruppi glicolici o aminoidrossilici
adiacenti. I componenti maggiormente evidenziati da questa tecnica sono quelli glucidici del glicocalice delle
membrane.

TRICROMICA
Queste colorazioni hanno la particolarità di affiancare ad un colorante basico due o più coloranti acidi che
differenziano in modo più preciso le varie componenti tissutali.

ANALISI ISTOLOGICA

Può essere qualitativa o quantitativa.

LA COMUNICAZIONE CELLULARE

All’interno di un organismo pluricellulare, le attività di ogni singola cellula sono regolate da segnali molecolari rilasciati
da cellule di controllo. Benché le cellule di controllo liberino numerose molecole segnale ogni cellula ricevente, la
cellula bersaglio, possiede dei recettori che sono sintonizzati per riconoscere solo alcuni dei segnali molecolari che
circolano nelle sue vicinanze; tutti gli altri segnali invece passano oltre senza indurre alcun effetto perché la cellula
non ha recettori specifici per tagli segnali. In seguito al legame con una molecola segnale, una cellula bersaglio
modifica le sue attività interne. Le risposte della cellula bersaglio possono includere:

• variazioni a carico di attività genica

• sintesi proteica
• trasporto di molecole attraverso la membrana plasmatica
• reazioni metaboliche
• secrezione
• movimento
• divisione
• morte programmata della cellula ricevente

La serie di passaggi che vanno dalla molecola segnale alla risposta cellulare è chiamata VIA DI SEGNALAZIONE. Il
sistema di comunicazione tra cellule è chiamato segnalazione cellulare, la quale è essenziale per coordinare le attività
delle cellule. La capacità delle cellule di comunicare l’una con l’altra in maniera coordinata è alla base della
regolazione della crescita e dello sviluppo animale, come l’integrazione delle attività dei vari tessuti e dei diversi
organi.

LE CELLULE COMUNICANO TRA DI LORO IN TRE MODI:

1. CONTATTO DIRETTO: le cellule adiacenti tra loro usano un metodo che sfrutta canali diretti tra le cellule dove
lo scambio di piccole molecole o ioni tra i due citoplasmi funziona da mezzo di comunicazione. Nelle cellule
animale i canali di comunicazione sono le giunzioni comunicanti, sono siti specializzati per la comunicazione
intercellulare. Il ruolo principale delle giunzioni comunicanti è quello di sincronizzare le attività metaboliche o
i segnali elettrici tra le diverse cellule in un tessuto. (es. le giunzioni comunicanti giocano un ruolo essenziale
della propagazione dei segnali elettrici tra una cellula e la successiva nel muscolo cardiaco). Nei vertebrati, le
giunzioni comunicanti si trovano tra le cellule di quasi tutti i tessuti corporei, ma mai tra cellule di tessuti
diversi. Nelle cellule vegetali i canali di comunicazione sono i plasmodesmi. Le cellule possono
comunicare anche grazie a contatti specifici tra le cellule. Infatti, presentano sulla loro superficie delle
molecole che interagiscono direttamente con molecole localizzate su altre cellule, permettendo lo scambio di
informazioni. (es. nei mammiferi alcune cellule del sistema immunitario usano molecole presenti sulla loro
superficie cellulare per riconoscere altre molecole presenti sulla superficie di patogeni invasori).
2. SEGNALAZIONE LOCALE: in essa una cellula rilascia una molecola segnale che si diffonde attraverso il fluido
extracellulare e provoca una risposta da parte delle cellule bersaglio vicine. In questo caso, la segnalazione
cellulare è locale, la molecola segnale è chiamata regolatore locale e il processo si chiama regolazione
paracrina. In alcuni casi il regolatore locale agisce sulla stessa cellula che lo produce e questo caso si chiama
autocrina.
3. SEGNALAZIONE A LUNGA DISTANZA: qui una cellula di controllo secerne una molecola di segnalazione a
lunga distanza, ormone, che produce una risposta in cellule bersaglio che possono essere lontano dalla cellula
di controllo. Questo metodo è il mezzo più comune di comunicazione cellulare. (gli ormoni sono presenti sia
nelle piante che negli animali in questi ultimi gli ormoni secreti dalle cellule di controllo entrano nel sistema
circolatorio dove viaggiano per raggiungere cellule che si trovano in altre parti del corpo. (es. in risposta allo
stress le ghiandole surrenali secernono l’ormone epinefrina nel sangue che stimola le cellule bersaglio ad
aumentare le quantità di glucosio ematico).
ESPERIMENTI DI SUTHERLAND

Questi misero in evidenza che l’attivazione dell’enzima non coinvolgeva direttamente l’epinefrina ma richiedeva una
sostanza. Sutherlan chiamò l’ormone primo messaggero del sistema e la sostanza secondo messaggero e propose una
catena di eventi secondo la quale: l’epinefrina porta alla formazione del secondo messaggero, il quale attiva l’enzima
che converte il glicogeno in glucosio. Questo lavoro rappresentò il punto di partenza per le ricerche che ci hanno
portato all’attuale conoscenza del sistema di comunicazione cellulare.

LE CELLULE BERSAGLIO ESAMINANO IL SEGNALE SECONDO TRE PASSAGGI:

• RICEZIONE DEL SEGNALE: consiste nel legame della molecola segnale da parte di uno specifico recettore sulle
cellule bersaglio. I segnali molecolari possono essere molecole polari (cariche e idrofiliche) o apolari
(idrofobiche) d i loro recettori hanno una conformazione che permette loro di riconoscere e legare in maniera
specifica la propria molecola segnale.
• TRASDUZIONE DEL SEGNALE: rappresenta il meccanismo mediante il quale il segnale molecolare viene
convertito nella forma necessaria ad attivare la risposta cellulare. (il legame della molecola segnale non è
direttamente responsabile della risposta cellulare).
• RISPOSTA AL SEGNALE: il segnale trasdotto induce una specifica risposta cellulare, questa risposta dipende
dal segnale e dai recettori presenti a livello della superficie della cellula bersaglio.

Tutte le vie di segnalazione possiedono uno “spegnimento” che serve per fermare la risposta cellulare quando non è
necessaria.

LE CARATTERISTICHE DEI SISTEMI DI COMUNICAZIONE CELLULARE BASATI SU RECETTORI DI

SUPERFICIE

I sistemi di comunicazione cellulare basati su recettori di superficie hanno tre elementi essenziali:

(1) le molecole segnale extracellulari

(2) i recettori di superficie localizzati sulle cellule bersaglio che ricevono il segnale
(3) le vie di risposta interne alla cellula , che vengono attivate in seguito al legame della molecola segnale ai recettori

Nei mammiferi e in altri vertebrati, i recettori di superficie riconoscono e legano molecole segnale idrosolubili di
natura polare. Queste molecole vengono liberate da cellule di controllo ed entrano nei fluidi che circondano le cellule,
inclusa la circolazione sanguigna. i due tipi principali di molecole segnale polari sono gli ormoni polari e
neurotrasmettitori.

I recettori di superficie che riconoscono e legano molecole segnale sono tutti glicoproteine, ossia proteine con catene
glucidiche legate. Sono proteine integrali di membrana che si estendono interamente attraverso la membrana
plasmatica. L’adattamento strutturale è specifico così che un determinato recettore può legare solo una molecola
segnale. Una molecola segnale causa cambiamenti specifici nelle cellule a cui si lega. Quando una molecola segnale si
lega a un recettore di superficie la struttura molecolare di tale recettore si modifica in modo da trasmettere
l’informazione attraverso la membrana plasmatica attivando l’estremità citoplasmatica del recettore. Il recettore
attivato da inizio al primo passaggio di una cascata di eventi molecolari che innesca la risposta cellulare.

LA TARSDUZIONE DEL SEGNALE CHE COINVOLGE RECETTORI DI SUPERDICIE HA TRE CARATTERISTICHE:

 1) Il legame di una molecola segnale al recettore di superfice è sufficiente per dare il via alla risposta cellulare,
non è necessario che la molecola segnale entri all’interno della cellula. Gli esperimenti hanno dimostrato che:
(1) la molecola segnale non produce alcuna risposta cellulare se è iniettata direttamente nel citoplasma e
che
(2) molecole non correlate con la molecola segnale extracellulare , ma che ne minimo la struttura, possono
bloccare o indurre una risposta cellulare completa finché possono legare il sito di riconoscimento del
recettore.
2) Il segnale viene trasmesso dalla superficie all’interno della cellula grazie a proteine chinasi, enzimi che
trasferiscono un gruppo fosfato dall’ATP a uno o più siti di particolari proteine. Spesso le proteine chinasi per
trasmettere il segnale agiscono in successione creando una successione concatenata di reazioni conosciuta
come cascata di proteine chinasi o cascata di fosforilazione. La prima chinasi catalizza la fosforilazione della
seconda chinasi che a sua volta diventa attiva e fosforila la terza chinasi e così di seguito. L’ultima proteina
della cascata è la proteina bersaglio.
Gli effetti indotti dalle proteine chinasi nelle vie di trasduzione del segnale sono controbilanciati o annullati
da un altro gruppo di enzimi, chiamati proteine fosfatasi, che rimuovono i gruppi fosfato dalle proteine
bersaglio. A differenza delle proteine chinasi, che sono attive solo in seguito al legame di una molecola
segnale allo specifico recettore di superficie, la maggior parte delle proteine fosfatasi è costitutivamente
(cioè, permanentemente) attiva all'interno delle cellule. Rimuovendo continuamente i gruppi fosfato dalle
proteine bersaglio, le proteine fosfatasi garantiscono, in modo rapido, lo spegnimento di una via di
trasduzione del segnale nel caso in cui la molecola segnale non sia più legata alla superficie cellulare.
3) Una terza caratteristica è l’amplificazione, si verifica perché molte delle proteine che portano a compimento i
singoli passaggi delle vie sono enzimi. Una volta attivato, ogni singolo enzima può attivare centinaia di
proteine, compresi altri enzimi, che entrano nel passaggio successivo della via. Maggiore è il numero di
passaggi catalizzati da enzimi nella via di segnalazione, più grande sarà l'amplificazione del segnale.
L’amplificazione è una caratteristica anche delle vie traduzione del segnale che coinvolgono recettori interni
alla cellula.

LE VIE DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE HANNO DEGLI INTERRUTTORI

Dopo che sono rilasciate le molecole segnale restano in circolo solo per un determinato periodo di tempo. Esse sono
poi demolite, con un ritmo costante, per via enzimatica in organi quali il fegato oppure escrete dai reni. Il processo di
rimozione assicura che le molecole segnale siano attive solo per il tempo necessario. Una volta innescata la
trasduzione del segnale, i recettori e le loro molecole segnale legate sono eliminati dalla superficie cellulare mediante
endocitosi. Una volta entrati nella cellula, sia il recettore, sia la molecola segnale legata possono essere degradati nei
lisosomi. Alternativamente, i recettori possono essere separati dalle molecole segnale e riciclati verso la superficie
cellulare, lasciando proseguire le sole molecole segnale lungo la via degradativa. Per tanto i recettori di superficie
partecipano al fenomeno della conversione cellulare.
I RECETTORI DI SUPERFICIE CON ATTIVITA’ PROTEINA CHINASICA INTRINSECA: I RECETTORI
TIROCINA CHINASI

Il recettore tirosina chinasi presenta la propria attività chinasica sull’estremità citoplasmatica della proteina. Il legame
di una molecola segnale a questo tipo di recettore accende la proteina chinasi e di conseguenza l'attivazione del
recettore. Il recettore attivato inizia quindi una cascata di segnalazione che induce una risposta cellulare. Per questo
tipo di recettore, l'inizio degli eventi di trasduzione si attua quando due molecole di recettore, legando ciascuna u na
molecola segnale, si avvicinano l'un l'altra in membrana e si associano a formare una coppia chiamata dimero . questo
attiva la porzione proteina chinasica dei recettori, aggiungendo gruppi fosfato a siti specifici presenti sui recettori
stessi, secondo un meccanismo conosciuto come autofosforilazione. I recettori tirosina chinasi sono rappresentati in
tutti gli animali pluricellulari tranne che nelle piante o nei funghi. Le risposte cellulari innescate dai recettori tirosina
chinasi appartengono ai più importanti processi delle cellule animali. (Per esempio, il recettore tirosina chimasi che
lega l'ormone peptidico insulina, una molecola regolatrice del metabolismo dei carboidrati porta all'attivazione di
numerose risposte cellulari).

I RECETTORI ACCOPPI ATI A PROTEINE G

Una seconda famiglia numerosa di recettori di superficie la quale risponde a una molecola segnale attivando una
proteina localizzata sulla superficie interna della membrana plasmatica, chiamata proteina G, così denominate perché
si legano ai nucleotidi guaninici GDP e GTP. Quasi la totalità dei recettori di questa famiglia è costituita da estese
glicoproteine, costituite da una singola catena polipeptidica ancorata nella membrana plasmatica da sette domini
della catena amminoacidica che attraversano avanti ed indietro la membrana plasmatica per sette volte.

LE PROTEINE G SONO INTERRUTTORI MOLECOLARI CHIAVE NELLE VIE DI RISPOSTA MEDIATE DA

SECONDI MESSAGGERI
Nelle vie di trasduzione del segnale controllate dai recettori accoppiati a proteine G, la molecola segnale extracellulare
è definita il primo messaggero. Il legame del primo messaggero da parte del recettore attiva un sito localizzato sull'
estremità citoplasmatica del recettore stesso. Il sito attivo nel recettore attiva la proteina G inducendo la sostituzione
del GDP legato alla proteina G con una molecola di GTP. La proteina G è un esempio di proteina che funziona come
interruttore molecolare data la sua capacità di passare reversibilmente da uno stato inattivo ad uno stato attivo. Il
ruolo di una proteina G nello stato attivo è quello di attivare un enzima associato alla membrana plasmatica, chiamato
effettore, a sua volta, l'effettore dà origine ad una o più molecole segnale interne, non proteiche, che vengono
chiamate secondi messaggeri, i quali attivano delle proteine chinasi che inducono la risposta cellulare aggiungendo
gruppi fosfato a specifiche proteine bersaglio.

Tutte le diverse proteine chinasi, attivate da queste vie di trasduzione, aggiungono gruppi fosfato ai residui
amminoacidici di serina e treonina delle proprie proteine bersaglio, che tipicamente sono:

• enzimi che catalizzano passaggi nelle varie vie metaboliche;

• canali ionici localizzati nella membrana plasmatica o nelle altre membrane cellulari;

• proteine regolatrici che controllano l'attività genica e la divisione cellulare.

Finché il recettore accoppiato a proteina G è legato al primo messaggero, il reattore mantiene la proteina G nello stato
attivo. La proteina G a sua volta mantiene attivo l’effettore e di conseguenza la produzione dei seguenti messaggeri.
Come risultato finale l’effettore ritorna nello stato inattivo spegnendo la via di risposta cellulare. Tipicamente, le
tossine sono enzimi che modificano le proteine G rendendole sempre attive.

DUE IMPORTANTI VIE DI RISPOSTA CELLULARE DEI RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G

COINVOLGONO SECONDI MESSAGGERI DIVERSI
Le proteine G attivate innescano una risposta cellulare attraverso due principali vie di risposta dei recettori
caratterizzate da diversi effettori che producono diversi messaggeri. Una via coinvolge il secondo messaggero AMP
ciclico, una molecola piccola ed idrosolubile che deriva dall’ATP. L’effettore responsabile della sintesi del cAMP è
l’adenilato ciclasi (enzima che converte l’ATP in cAMP. Una volta sintetizzato il cAMP diffonde attraverso il citoplasma
ed attiva proteine chinasi che aggiungono gruppi fosfato a proteine bersaglio specifiche. L’altra via che coinvolge due
secondi messaggeri: l’inositolo trifosfato (IP) e il diacilglicerolo (DAG). Le vie di segnalazione del cAMP sono coinvolte
anche nei processi che avvengono nel sistema nervoso, come l’apprendimento, la memoria e la dipendenza da
droghe.

Entrambe le principali vie di risposta associate ai recettori accoppiati alle proteine G sono in equilibrio con reazioni che
costantemente eliminano i loro secondi messaggeri. Per esempio, il cAMP è degradato rapidamente ad AMP
(adenosina monofosfato) dalla fosfodiesterasi, un enzima che è sempre attivo nel citoplasma. L'eliminazione repentina
dei secondi messaggeri garantisce che la via di segnalazione venga efficacemente “spenta”, assicurando che le
proteine chinasi vengano prontamente disattivate alla disattivazione del recettore. Un ulteriore elemento che facilita
lo spegnimento della via è fornito dalle proteine fosfatasi che eliminano i gruppi fosfato aggiunti dalle proteine chinasi
ai loro bersagli molecolari. Come nel caso delle vie mediate dai recettori tirosina chinasi, le attività delle vie controllate
dai secondi messaggeri cAMP e IP3/DAG sono bloccate anche dall'endocitosi dei recettori con le loro molecole segnale
legate. I recettori che legano questi ormoni controllano un'ampia varietà di risposte cellulari:

• assorbimento e ossidazione del glucosio

• sintesi e degradazione del glicogeno

• trasporto di ioni ed amminoacidi all'interno delle cellule

• divisione cellulare

Per esempio, una via di segnalazione che utilizza il cAMP è coinvolta nella regolazione del livello di glucosio, la
molecola che funziona da combustibile fondamentale per le cellule. Quando il livello di glucosio nel sangue dei
mammiferi si abbassa troppo, cellule specifiche del pancreas secernono l'ormone peptidico glucagone. Questo
ormone, legandosi ad un recettore del glucagone accoppiato a proteine G che si trova sulla superficie delle cellule
epatiche, innesca la via recettore-risposta cellulare mediata da cAMP e stimola la degradazione del glicogeno a singole
unità di glucosio, le quali passano dalle cellule epatiche nel torrente circolatorio, aumentando il livello di glucosio del
sangue. Quando questo livello raggiunge valori troppo alti si verifica l'opposto: l'enzima glicogeno sintasi aggiunge
unità di glucosio al glicogeno. Alcune vie di segnalazione importanti nella regolazione genica associano alcuni recettori
tirosina chinasi ad una specifica proteina G chiamata Ras.

VIE CHE COINVOLGONO IP3/DAG

Le vie di risposta cellulare basate sulla coppia IP3/DAG sono attivate da un ampio numero di ormoni peptidici
(compresi i fattori di crescita) e neurotrasmettitori.

Queste vie portano a risposte cellulari molto diverse come:

• trasporto di zuccheri e ioni

• ossidazione del glucosio

• crescita e divisione cellulare

• movimenti come la contrazione della muscolatura liscia

Nei mammiferi, gli ormoni che attivano questo genere di vie includono la vasopressina, e l'angiotensina. La
vasopressina, conosciuta anche come ormone antidiuretico, aiuta il corpo a conservare la propria quantità di acqua
riducendo la quantità di urina escreta. L'angiotensina aiuta a mantenere la pressione e il volume sanguigno.

Difetti nei recettori o in altri punti delle vie, che portano ad avere livelli cellulari di DAG superiori al normale in risposta
a fattori di crescita, spesso sono correlati alla rapida progressione di alcune forme tumorali. Questo effetto si verifica
perché il DAG, di riflesso, causa un'iperattività delle proteine chinasi che stimolano la crescita e la divisione cellulare.
Le vie di segnalazione che coinvolgono l'IP3 e il DAG sono state correlate anche a malattia mentale, precisamente in
relazione al disordine bipolare (prima chiamata depressione maniacale), in cui i pazienti mostrano periodicamente dei
drastici cambiamenti di umore. Il litio è stato ampiamente utilizzato per moltissimi anni come agente terapeutico nei
casi di disordine bipolare. Recenti ricerche hanno messo in evidenza che il litio attenua le vie di segnalazione di
IP3/DAG che portano al rilascio di neurotrasmettitori, alcuni dei quali partecipano alle funzioni cerebrali.

Alcune vie di segnalazione importanti nella regolazione genica associano alcuni recettori tirosina chinasi ad una
specifica proteina G chiamata Ras.

LE VIE DI SEGNALAZIONE INNESCATE DAI RECETTORI INTERNI ALLA CELLULA: I RECETTORI DEGLI
ORMONI STEROIDEI

Molti tipi cellulari possiedono recettori interni capaci di rispondere a segnali molecolari che arrivano dall'esterno della
cellula. questi segnali molecolari penetrano attraverso la membrana plasmatica per innescare vie di risposta cellulare
all'interno delle cellule. I recettori interni, chiamati recettori degli ormoni steroidei sono tipicamente delle proteine di
controllo che accendono (a volte spengono) specifici geni quando vengono attivate dal legame di una molecola
segnale. Gli ormoni steroidei sono molecole apolari, relativamente piccole, che derivano dal colesterolo. Gli ormoni
steroidei si combinano con proteine trasportatrici idrofiliche che mascherano i loro gruppi idrofobici e, qui ndi, li
mantengono in soluzione sia nel sangue, sia nei fluidi extracellulari. Quando un complesso ormone steroideo -proteina
trasportatrice entra in contatto con la superficie di una cellula, l'ormone viene rilasciato e penetra all'interno della
cellula direttamente attraverso la regione apolare della membrana plasmatica. Una volta superata la membrana e
giunto sul lato citoplasmatico, l'ormone si lega al suo recettore interno. I diversi ormoni si distinguono solo per i
gruppi laterali legati ai loro anelli carboniosi. Le differenze sono minime ma sono responsabili di effetti particolari e
specifici. recettori degli ormoni steroidei sono proteine caratterizzate da due domini principali :un dominio è
responsabile del riconoscimento e del legame di un ormone steroideo specifico, mentre l'altro dominio interagisce
con le regioni dei geni bersaglio che ne controllano l'espressione stessa.

INTEGRAZIONE DI DIVERSE VIE DI COMUNICAZIONE CELLULARE

Le cellule dell'organismo si trovano continuamente sotto l'influenza simultanea di molte molecole segnale. Le diverse
vie di segnalazione cellulare attivate devono essere in erado di comunicare tra loro per integrare le informazioni e le
risposte cellulari da mettere in atto. L'interazione tra le varie vie di comunicazione è chiamata cross-talk (colloquio
trasversale). Il cross-talk spesso porta a modificare le risposte cellulari controllate dalle vie stesse. Sono proprio queste
modificazioni ad armonizzare i vari effetti delle combinazioni delle molecole segnale che si legano ai recettori cellulari.
RIEPILOGO

PANORAMICA COMUNICAZIONE CELLULARE

• Le cellule comunicano tra loro per contatto diretto, segnalazione locale o segnalazione a lunga distanza.

• Nella segnalazione a lunga distanza una cellula di controllo libera una molecola segnale che determina una risposta
da parte delle cellule bersaglio. La cellula bersaglio risponde alla molecola segnale in tre passaggi successivi: la
ricezione del segnale, la traduzione del segnale e la risposta al segnale. La serie di eventi, che partono dalla ricezione
del segnale e si concludono con la riposta cellulare, è comunemente chiamata traduzione del segnale

• Alcune proprietà della comunicazione cellulare sono antiche dal punto di vista evolutivo. In alcuni casi, intere vie di
segnalazione cellulare sono conservate in organismi diversi.

LE CARATTERISTICHE DEI SISTEMI DI COMUNICAZIONE CELLULARE BASATI SUI RECETTORI DI

SUPERFICIE
• I sistemi di comunicazione cellulare basati su recettori di superficie presentano tre componenti fondamentali:
(1) le molecole segnale extracellulari,
(2) i recettori di superficie che ricevono i segnali e
(3) le vie di risposta interne alla cellula che si attivano in seguito al legame della molecola segnale al recett ore.

• I sistemi basati su recettori di superficie rispondono ad ormoni polari ed a neurotrasmettitori . Gli ormoni polari
includono gli ormoni peptidici e i fattori di crescita che intervengono nei processi di crescita, divisione e
differenziamento cellulare. I neurotrasmettitori includono piccoli peptidi, singoli amminoacidi e loro derivati, ed
altre sostanze chimiche.

• I recettori di superficie sono proteine integrali di membrana che si estendono interamente attraverso la
membrana plasmatica. Il legame di una molecola segnale induce dei cambi. altri conformazionali nel recettore
con conseguente attivazione dell'estremità citoplasmatica.

• Molte vie di risposta cellulare agiscono attraverso l'attivazione di proteine chinasi. I gruppi fosfato aggiunti dalle
proteine chinasi stimolano, oppure inibiscono, le attività della prole. ne bersaglio, determinando la risposta
cellulare. La risposta è annullata da pro. teine fosfatasi che rimuovono i gruppi fosfato dalle proteine bersaglio.
Inoltre, una volta che la trasduzione del segnale ha avuto luogo, i recettori vengono allontanati dalla membrana
plasmatica grazie al processo di endocitosi.

• Ogni singolo passaggio di una via di risposta cellulare catalizzato da un enzima è amplifica-to, poiché ogni singolo
enzima è capace di attivare centinaia, e persino migliaia, delle proteine che innescano il passaggio successivo nella
via. L'amplificazione permette una risposta cellulare completa anche se solo poche molecole segnale si legano ai
recettori.
I RECETTORI DI SUPERFICIE CON ATTIVITA’ PROTEINA CHINASICA INTRINSECA: I RECETTORI TIROSINA
CHINASI
• Quando un recettore tirosina chinasi lega una molecola segnale, si ha l'attivazione del sito proteina chinasi, il
quale aggiunge gruppi fosfato ai residui di tirosina di proteine bersaglio e del recettore stesso. Quando una
proteina di segnalazione si lega ad un sito attivo, iniziala via di traduzione che porta ad una risposta cellulare. Dal
momento che diversi recettori tirosina chinasi legano diverse combinazioni di proteine di segnalazione, i recettori
avviano risposte diverse.

I RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G

• Nelle vie di traduzione del segnale attivate da recettori accoppiati a proteine G, il legam e ed una molecola segnale
extracellulare (il primo messaggero) attiva un sito del recettore localizzato sulla sua estremità citoplasmatica. Un
recettore attivato "accende» una proteina C5, la quale funziona come un interruttore molecolare. Infatti, la
proteina G è attiva se legata al GTP, mentre risulta inattiva quando è legata al GDP.

• Quando una proteina G è attiva, questa attiva un effettore della via di segnalazione, ossia un enzima che produce
piccole molecole segnale interne chiamate secondi messaggeri. I secOl di messaggeri attivano le proteine chinasi
della via di segnalazione.

• In una delle due principali vie di segnalazione innescate dai recettori accoppiati a proteine G ,l'effettore, cioè
l'adenilato ciclasi, produce il secondo messaggero AMP ciclico (CAMPA) Il cAMP a sua volta attiva specifiche
proteine chinasi.

• Nell’altra via principale di segnalazione, l’effettore attivato, la fosfolipasi C, genera due secondi messaggeri,
l’inositolo trifosfato (IP3) ed il diaciglicerolo (DAG). L’IP3 attiva le proteine di trasporto sul RE, che determinano il
rilascio di calcio nel citoplasma. II Ca2+ liberato, da solo o in collaborazione con il DAG, attiva specifiche proteine
chinasi che aggiungono gruppi fosfato alle loro proteine bersaglio.

• Sia la via di segnalazione del CAMP, sia quella dell'IP;/DAG sono controbilanciate da rea-ioni che, in maniera
costante, degradano i loro secondi messaggeri. Entrambe le vie sono, inoltre, bloccate dall'azione di proteine
fosfatasi, che rimuovono continuamente i gruppi fosfato dalle proteine bersaglio e dall'endocitosi dei recettori di
membrana legati alle proprie molecole segnale extracellulari.

• In sistemi che hanno subito mutazioni, le vie di segnalazione possono risultare attive in maniera permanente,
contribuendo alla progressione di alcune forme di tumore maligno.

• Alcune vie di segnalazione importanti nella regolazione genica mettono in comunicazione alcuni recettori tirosina
chinasi con una particolare proteina G chiamata Ras. Quando il recettore lega la molecola segnale, questo va
incontro ad autofosforilazione; i siti fosforilati permettono l'attacco di proteine adattatrici che, facendo da ponte
tra il recettore e Ras, favoriscono l'attivazione di Ras mediata dal recettore tirosina chinasi. Una volta attivata, la
proteina Ras innesca la cascata delle MAP chinasi. L'ultima MAP chinasi della cascata, quando attivata, fosforila
una serie di proteine bersaglio localizzate nel nucleo, attivandole, le quali, a loro volta, "accendono" specifici geni.
Molti di quei geni sono coinvolti nel controllo della divisione cellulare.
LE VIE DI SEGNALAZIONE INNESCATE DAI RECETTORI INTERNI ALLA CELLULA: I RECETTORI DEGLI
ORMONI STEROIDEI
• Gli ormoni steroidei diffondono all'interno della cellula passando direttamente attraverso la membrana
plasmatica per legarsi a recettori interni alla cellula, attivandoli. I recettori interni sono proteine regolatrici
che "accendono" specifici geni quando sono attivate dal legame con la molecola segnale, inducendo quindi la
risposta cellulare.

• I recettori per gli ormoni steroidei hanno un dominio che riconosce e lega uno specifico ormone steroideo ed
un dominio che interagisce con le regioni di controllo dei suoi geni bersaglio. La capacità di una cellula di
rispondere a un ormone steroideo dipende dal fatto che abbia o meno un recettore interno specifico per
l'ormone; all'interno della cellula, poi, il tipo di risposta dipende dai geni che sono riconosciuti ed "accesi" dal
recettore attivato.

L’INTEGRAZIONE DI DIVERSE VIE DI COMUNICAZIONE CELLU LARE

• Nel fenomeno di cross-talk, diverse vie di segnalazione cellulare comunicano tra loro allo 'Scopo di integrare
le risposte ai vari segnali. Il cross-talk può dare luogo ad una complessa tete di interazioni tra le varie vie di
comunicazione cellulare. Spesso il cross-talk porta a modificare le risposte cellulari controllate dalle vie
stesse, armonizzando i vari effetti delle combinazioni delle molecole segnale che si legano ai recettori
cellulari.
• Negli animali, anche le informazioni derivanti da altri sistemi di risposta cellulare, come le molecole di
adesione cellulare o le molecole diffuse attraverso le giunzioni comunicanti, possono essere integrate nella
rete di cross-talk.

UNA PANORAMICA SUL METABOLISMO ENERGETICO

• Le piante e quasi tutti gli altri organismi ottengono l’energia necessaria per le attività cellulare grazie alla
respirazione cellulare, il processo molecolare che trasferisce elettroni da molecole organiche donatrici ad una
molecola accettrice finale come l’ossigeno; l’energia che viene liberata dal meccanismo sostiene la sintesi di
ATP.

• Le reazioni di ossido-riduzione, chiamate reazioni redox, trasferiscono elettroni in maniera parziale o

completa da atomi donatori ad atomi accettori, il donatore si ossida rilascia. do gli elettroni, mentre
l'accettore si riduce.

• La respirazione cellulare avviene in tre passaggi successivi:

(1) nella glicolisi, il glucosio: convertito in due molecole di piruvato attraverso una serie di reazioni catalizzate
da enzimi,
(2) nell'ossidazione del piruvato e nel ciclo dell'acido citrico, il piruvato è convertito in un composto acetilico
che, successivamente, è completamente ossidato ad anidride carbonica; infine,
(3) nella fosforilazione ossidativa che comprende il sistema di trasferimento degli elettroni e la chemiosmosi,
gli elettroni ad alta energia prodotti dai primi due pas. saggi fluiscono lungo il sistema di trasferimento e la
maggior parte della loro energia vie ne utilizzata per generare un gradiente di H* attraverso la membrana
mitocondriale in. terna; questo gradiente sospinge la sintesi di ATP a partire da ADP e Pi.
 • Negli eucarioti, la maggior parte delle reazioni della respirazione cellulare avviene nei mitocondri. Nei
procarioti, la glicolisi, l'ossidazione del piruvato e il ciclo dell'acido citrico si verificano nel citosol, mentre il
resto della respirazione cellulare avviene nella membrana plasmatica.

LA GLICOLISI: LA SCISSIONE DELLO ZUCCHERO A META’

• Nella glicolisi, che avviene nel citosol, il glucosio (sei carboni) è ossidato in due molecole di piruvato (tre
carboni l'uno). Gli elettroni rimossi nelle reazioni di ossidazione sono inviati al NAD*, che si converte in NADH.
La sequenza di reazioni produce un guadagno netto di 2 ATP, 2 NADH e 2 molecole di piruvato per ogni
molecola di glucosio ossidata

L’OSSIDAZIONE DEL PIRUVATO E IL CICLO DELL’ACIDO CITRICO

• Durante l’ossidazione del piruvato, che si attua all’interno dei mitocondri, una molecola di piruvato è ossi data
a un gruppo acetilico e ad una molecola di CO2. Gli elettroni rimossi durante l’ossidazione sono raccolti da un
NAD+, che si converte in NADH. Il gruppo acetilico è traferito al coenzima A, che lo porta al ciclo dell’acido
citrico.
• Nel ciclo dell’acido citrico i gruppi acetilici sono ossidati completamente a CO2. Gli elettroni rimossi nelle
ossidazioni sono accettati da molecola di NAD* o di FAD e, grazie alla fosforilazione a livello del substrato, si
producono molecole di ATP. Per ogni gruppo acetilico ossidato da un ciclo completo si producono 2CO2,
1ATP.

LA FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA: IL SISTEMA DI TRASFERIMENTO DEGLI ELETTRONI E LA

CHEMIOSMOSI

• Gli elettroni raccolti dal NADH e FADH, sono trasferiti al sistema di trasferimento degli elettroni, che consiste
di quattro complessi proteici e due piccoli trasportatori "navetta". man mano che gli elettroni fluiscono da un
trasportatore all'altro del sistema, parte della loro energia è utilizzata dai complessi proteici per pompare
protoni attraverso la membrana mitocondriale interna.
• I tre principali complessi proteici pompano H+ dalla matrice allo spazio intermembrana, creando un gradiente
di H* caratterizzato da una concentrazione di H* più elevata nello spazio intermembrana rispetto a una
concentrazione più bassa nella matrice mitocondriale (Figura 8.13).
• Il gradiente di I* prodotto dal sistema di trasferimento degli elettroni è utilizzato dall' ATP sintasi come fonte
di energia per la sintesi di ATP partendo da ADP a P. L'ATP sintasi è inserita nella membrana mitocondriale
interna, come il sistema di trasferimento degli elettroni.
• Si è stimato che, per ogni coppia di elettroni trasferiti lungo il sistema mitocondriale di trasferimento degli
elettroni, dal NADH fino all'ossigeno, sono sintetizzate 2,5 molecole di ATP. Diversamente, circa 1,5 molecole
di ATP sono sintetizzate per ogni coppia di elettroni trasferiti attraverso il sistema dal FADH2 all'ossigeno. Se il
gradiente di H* è utilizzato esclusivamente per sintetizzare ATP, da queste stime si ottiene che la respirazione
cellulare ha un'efficienza superiore al 30% nell'utilizzo dell'energia liberata dall'ossidazione del glucosio.

LA FERMENTAZIONE

• La fermentazione lattica e la fermentazione alcolica sono vie metaboliche di reazioni che inviano gli elettroni
ottenuti dalla glicolisi e portati dal NADH a molecole accettrici organi che, con riconversione del NADH a
NAD+. In questo modo, il NAD* può nuovamente accettare elettroni provenienti dalla glicolisi, permettendo
alla glicolisi di soddisfare la necessità cellulare di ATP sfruttando il meccanismo di fosforilazione a livello del
substrato.
SISTEMI DELLE MEMBRANE CI TOPLASMATICHE: STRUTTURA, FUNZIONE E TRAFFICO DI
MEMBRANA

Il citoplasma della maggior parte delle cellule viventi appare relativamente privo di struttura al microscopio ottico ,
solo con lo sviluppo del microscopio elettronico negli anni ’40 del secolo scorso che i biologi iniziarono a rendersi
conto delle strutture membranose presenti nel citoplasma della maggioranza delle cellule eucariotiche. Divenne
evidente che il citoplasma delle cellule eucariotiche era suddiviso in vari compartimenti distinti delimitati da barriere
costituite da membrane. Con il passare del tempo si osservò che le strutture membranose del citoplasma
componevano organelli distinti che potevano essere identificati nelle cellule eucariotiche, dal lievito alle piante
superiori e agli animali.

Dall’immagine si può vedere quanto spazio

occupano le strutture membranose nel
citoplasma di una cellula eucariotica. Ognuno di
questi organelli contiene un particolare corredo
di proteine ed è specializzato per particolari tipi
di attività.

Descriveremo: la struttura e le funzioni del reticolo endoplasmatico, del complesso del Golgi, degli endosomi, dei
lisosomi e dei vacuoli. Sebbene ciascuno di questi organelli circondato da membrane abbia la sua propria struttura e
funzione, il loro insieme costituisce un sistema di endomembrane strutturalmente e funzionalmente interconnesso .

Gli organelli del sistema di endomembrane sono elementi di una rete dinamica e integrata in cui i materiali sono
trasportati da un distretto all’altro della cellula. Per la maggior parte, i materiali sono trasportati da un organello
all’altro.

Le vie biosintetiche/secretorie ed endocitiche uniscono le endomembrane in una

rete dinamica e interconnessa.

Diagramma schematico che illustra il processo di trasporto vescicolare attraverso cui

i materiali sono trasferiti dal compartimento donatore al compartimento accettore.
Le vescicole si formano per gemmazione dalla membrana, processo durante il quale
le proteine di membrana (sfere verdi) del compartimento donatore possono essere
incorporate nella membrana della vescicola, e proteine solubili (sfere viola) nel
compartimento donatore sono legate a specifici recettori. Quando successivamente
la vescicola di trasporto si fonde con un’altra membrana, le proteine di membrana
della vescicola diventano parte della membrana accettrice e le proteine solubili
vengono sequestrate nel lume del compartimento ricevente.
 Nell’immagine l flusso di materiali segue la via biosintetica (o secretoria) dal reticolo
endoplasmatico, attraverso il complesso del Golgi, fino alle diverse localizzazioni che
includono i lisosomi, gli endosomi, le vescicole secretorie, i granuli di secrezione, i vacuoli e la
membrana plasmatica. La via endocitica trasporta materiali dalla superficie della cellula
all’interno attraverso gli endosomi ed i lisosomi, dove vengono in genere degradati dagli
enzimi lisosomali.

(in sintesi, sono state illustrate le varie vie che sono state identificate nel citoplasma)

Si può distinguere una via esocitica che trasporta il materiale al di fuori della cellula la quale è definita anche via
biosintetica (in cui le proteine sono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico, modificate nel passaggio attraverso il
complesso del Golgi e trasportate da questo alle varie destinazioni quali la membrana plasmatica, i lisosomi o il grande
vacuolo di una cellula vegetale) oppure via secretoria (,dal momento che molte delle proteine sintetizzate nel reticolo
endoplasmatico sono destinate ad essere trasportate al di fuori della cellula (secrete o esocitate)).

Inoltre, possiamo distinguere anche una via endocitica in cui i materiali si muovono dalla superficie esterna della
cellula verso i compartimenti interni, come gli endosomi e i lisosomi, situati all’interno del citoplasma.

Le attività secretorie delle cellule si possono dividere in due tipi: costitutive e regolate.

• Nella secrezione costitutiva, i materiali sono trasportati, in vescicole secretorie, dai loro siti di sintesi e
rilasciati nello spazio extracellulare in maniera continua. La maggior parte delle cellule svolge una secrezione
costitutiva, processo che contribuisce non soltanto alla formazione della matrice extracellulare ma anche alla
formazione della stessa membrana plasmatica.
• Nella secrezione regolata, i materiali che devono essere secreti sono accumulati in comparti delimitati da
membrana e rilasciati soltanto in risposta ad uno stimolo appropriato. (La secrezione regolata avviene, per
esempio, nelle cellule endocrine che rilasciano ormoni, nelle cellule degli acini pancreatici che producono
enzimi digestivi e nelle cellule nervose che rilasciano neurotrasmettitori, In alcune di queste cellule, i
materiali che devono essere secreti sono accumulati in grossi granuli di secrezione densamente impacchettati
e rivestiti di membrana).
 Uso dell’autoradiografia per mettere in evidenza i siti di sintesi ed il successivo trasporto
delle proteine di secrezione.

Micrografia elettronica di una sezione di una cellula acinosa del pancreas che è stata
incubata per tre minuti con amminoacidi radioattivi, fissata immediatamente e preparata
per l’autoradiografia. I grani di argento che compaiono in nero nell’emulsione dopo lo
sviluppo sono localizzati sul reticolo endoplasmatico (RER).

Diagrammi di una sequenza di autoradiografie che mostrano il

movimento di proteine di secrezione marcate (rappresentate
dai grani di argento in rosso) attraverso una cellula acinosa del
pancreas. Quando la cellula è esposta ai precursori radioattivi
per tre minuti (“pulse”) e poi immediatamente fissata, la
radioattività si localizza nel reticolo endoplasmatico. Dopo tre
minuti di “pulse” e 17 minuti di “chase” con materiale non
marcato, la marcatura si concentra nel complesso del Golgi e
nelle vescicole adiacenti. Dopo tre minuti di marcatura e 117
minuti di “chase” con materiale non marcato, la radioattività è
concentrata nei granuli di secrezione e comincia ad essere
rilasciata nei dotti pancreatici.

ALCUNI APPROCCI ALLO STUDIO DELLE ENDOMEMBRANE

Tra le numerose cellule differenti in un organismo, le cellule acinose del pancreas possiedono uno dei sistemi di
endomembrane meglio sviluppati. Queste cellule funzionano soprattutto nella sintesi e nella secrezione di enzimi
digestivi, inviati attraverso i dotti dal pancreas, in cui sono stati sintetizzati, al duodeno, dove degradano il materiale
ingerito. Tutte le tappe del processo di secrezione avvengono simultaneamente all’interno della cellula e per seguire
tutti questi passaggi di un singolo ciclo dalla sintesi di una proteina alla sua secrezione della cellula, James Jamieson e
George Palade della Rockefeller University utilizzarono la tecnica dell’autoradiografia.

L’autoradiografia fornisce il mezzo per visualizzare processi biochimici permettendo al ricercatore di determinare la
posizione del materiale marcato radioattivamente all’interno della cellula.

Tecniche che si basano sull’uso di isotopi radioattivi sono state ampiamente abbandonate dai moderni biologi cellulari
a favore di tecniche che si basano “sull’etichettare” proteine di interesse usando proteine fluorescenti come la
proteina fluorescente verde (GFP, green fluorescent protein), che permettono di monitorare il movimento di una
proteina in una cellula vivente osservando le cellule al microscopio ottico.

Mostra una coppia di immagini microscopiche che rappresentano cellule contenenti una proteina di fusione con GFP.
In questo caso le cellule sono state infettate con un ceppo del virus della stomatite vescicolare (VSV) nel quale uno dei
geni virali (VSVG) è fuso al gene GFP. I virus sono molto utili in questo tipo di studi in quanto trasformano cellule
infettate in fabbriche per la produzione di una o più proteine virali. Queste vengono trasportate come qualsiasi altra
proteina cargo attraverso la via biosintetica. Quando una cellula viene infettata con il virus VSV, grandi quantità di
proteina VSVG sono prodotte nel reticolo endoplasmatico (RE), veicolate attraverso il complesso del Golgi e
trasportate alla membrana plasmatica della cellula infettata dove vengono incorporate negli involucri virali. L’uso di
GEMMAZIONE=
produzione vescicole,
trasporto
ANALISI BIOCHIMICA DELLE FRAZIONI SUBCELLULARI

La microscopia elettronica, l’autoradiografia e l’uso di proteine fluorescenti forniscono informazioni sulla struttura e la
funzione degli organelli cellulari, ma non indicazioni sulla composizione biochimica di queste strutture.

OMOGENEIZZAZIONE: frammentazione controllata della cellula mediante agenti chimici o meccanicamente. La

tecnica di omogeneizzazione delle cellule e di isolamento fi particolari tipi di organelli furono introdotte negli anni ’50
e ’60. Quando una cellula è rotta per omogeneizzazione, le membrane citoplasmatiche si frammentano e i margini si
fondono a formare vescicole sferiche di diametro inferiore ai 100 nm. Le vescicole derivate da membrane di differenti
organelli (nucleo, mitocondri, membrana plasmatica, reticolo endoplasmatico, ecc.) hanno proprietà differenti, che
permettono la loro separazione uno dall’altro, con un approccio chiamato frazionamento subcellulare. Le vescicole
membranose che derivano dal sistema di endomembrane formano un insieme di vescicole eterogenee di grandezza
simile chiamate microsomi. La frazione microsomale può essere ulteriormente suddivisa in frazioni lisce e rugose; una
volta isolate, si può determinare la composizione biochimica delle varie frazioni.

Isolamento di una frazione microsomale mediante

centrifugazione differenziale.

Quando una cellula è rotta mediante omogeneizzazione

meccanica (stadio 1), i diversi organelli membranosi
vengono frammentati e formano vescicole membranose
sferiche. Le vescicole derivate da organelli diversi possono
essere separate con differenti tecniche di centrifugazione.
Nella procedura qui descritta l’omogenato cellulare è
dapprima sottoposto ad una centrifugazione a bassa velocità
per precipitare le cellule ancora intere, e le particelle più
grandi e più pesanti, come i nuclei e i mitocondri, lasciando
nel sopranatante le vescicole più piccole (microsomi) (stadio
2). I microsomi possono essere rimossi dal sopranatante
mediante centrifugazione a velocità più elevate per periodi
più lunghi (stadio 3). Una frazione microsomale grezza di
questo tipo può essere ulteriormente suddivisa in differenti
tipi di vescicole attraverso tappe successive.

Fotografia al microscopio elettronico di una frazione microsomale liscia in cui le vescicole membranose mancano dei
ribosomi.

Fotografia al microscopio elettronico di una frazione microsomale rugosa contenente ribosomi adesi alla membrana.
RETICOLO ENDOPLASMATICO

Il reticolo endoplasmatico (RE) comprende un intreccio di membrane tra loro interconnesse che si estende per tutto il
citoplasma. Le membrane del RE delimitano uno spazio (o lume) abbastanza esteso, separato dal citosol circostante. la
composizione dello spazio luminale (o cisternale) all’interno delle membrane del reticolo endoplasmatico è del tutto
differente da quella dello spazio citosolico che le circonda. Come altri organelli cellulari, il RE è una struttura
estremamente dinamica, che va incontro a continuo ricambio e riorganizzazione.

Il reticolo endoplasmatico rugoso (RER) e il reticolo endoplasmatico liscio (REL).

• Il RER è definito dalla presenza di ribosomi legati alla sua

superficie citosolica, appare come un organello composto da
una rete di sacchi appiattiti (cisterne) dove ogni cisterna è
connessa alla sua vicina attraverso membrane elicoidali. Il RER è
continuo con la membrana esterna dell’involucro nucleare, la
quale presenta anch’essa ribosomi sul suo versante citosolico

Micrografia elettronica a scansione del RER in una cellula acinosa pancreatica.

• Il REL non presenta ribosomi associati. e membrane del REL sono

tipicamente molto curvate e tubulari e formano un sistema di tubuli
interconnessi, simili a condotti, che si diramano nel citoplasma

Quando le cellule sono omogeneizzate, il REL si frammenta in vescicole dalla superficie liscia, mentre il RER in
vescicole dalla superficie rugosa
 Micrografia elettronica a scansione del RER in una cellula acinosa pancreatica.

La microscopia elettronica ad alta risoluzione ha rivelato che i sacchi di RE sono collegati

attraverso strutture membranose elicoidali. Una ricostruzione tridimensionale di tale struttura è
mostrata qui.

Lipidi e proteine marcati con fluorescenza sono in grado di diffondere da un tipo di RE ad un altro, il che indica che le
loro membrane sono interconnesse. Infatti, i due tipi di RE presentano molte proteine in comune e sono coinvolti in
alcune attività comuni, come la sintesi di certi lipidi e di colesterolo. Allo stesso tempo, comunque, molte proteine si
trovano solo in un tipo di RE. Tipi diversi di cellule hanno quantità marcatamente differenti di un tipo di RE o dell’altro,
in base all’attività della cellula.

RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO

Le funzioni del REL includono:

• Sintesi di ormoni steroidei nelle cellule endocrine delle gonadi e della corteccia surrenale.
• Detossificazione nel fegato di un gran numero di composti organici fra cui, per esempio, barbiturici ed
etanolo, il cui uso cronico può condurre alla proliferazione del REL nelle cellule epatiche. La detossificazione è
svolta da un sistema di enzimi che trasferiscono l’ossigeno (ossigenasi), tra cui la famiglia del citocromo P450.
Questi enzimi sono caratteristici per la mancanza di specificità del substrato, essendo capaci di ossidare
migliaia di composti idrofobici differenti che convertono in derivati più idrofilici, più facilmen te escreti. Gli
effetti non sono sempre positivi. I citocromi P450 metabolizzano molti farmaci di uso comune. Variazioni
genetiche di questi enzimi fra gli esseri umani possono spiegare le differenze che si riscontrano da individuo a
individuo nell’efficacia e negli effetti collaterali di molti farmaci.
• Sequestro di ioni calcio nel citoplasma delle cellule. Il rilascio regolato di Ca 2+ dal REL di cellule muscolari
scheletriche o cardiache (noto come reticolo sarcoplasmatico nel caso delle cellule muscolari) attiva la
contrazione.

RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO:

Una fotografia al microscopio elettronico di una cellula di Leydig del

testicolo che mostra un esteso RE liscio dove sono sintetizzati gli
ormoni steroidei.

RETICOLO ENDOPLASMATICO RUGOSO

Le prime ricerche sulla funzione del RER furono effettuate su cellule che secernono grandi quantità di proteine, come
le cellule acinose del pancreas o le cellule del rivestimento del tubo digerente che secernono muco.
 Gli organelli di tali cellule epiteliali secernenti sono disposti nella cellula in
modo da produrre una polarità distinta da una parte all’altra. Il nucleo ed un
gran numero di cisterne del RER sono localizzati vicino alla superficie basale
della cellula, che è rivolta verso il circolo sanguigno. Il complesso del Golgi è
situato nella regione centrale della cellula. La superficie apicale della cellula
è rivolta verso un dotto che trasporta le proteine secrete fuori dall’organo. Il
citoplasma al polo apicale della cellula contiene granuli di secrezione, il cui
contenuto è pronto per essere rilasciato nel dotto all’arrivo di un
appropriato segnale. La polarità di queste cellule epiteliali ghiandolari
riflette il flusso di proteine secrete attraverso la cellula, dal loro sito di
sintesi al sito di secrezione.

Le funzioni del RER comprendono la sintesi di proteine e la sintesi della maggior parte dei lipidi delle membrane
cellulari.

SINTESI DI PROTEINE SUI RIBOSOMI LEGATI A MEMBRANE O SUI RIBOSOMI “LIBERI”

Esperimenti hanno mostrato che le proteine sono sintetizzate in due siti distinti all’interno della cellula:

o un terzo delle proteine codificate dal genoma dei mammiferi è sui ribosomi attaccati alla superficie citosolica
delle membrane del RER e rilasciato nel lume del RE in un processo chiamato traslocazione co-traduzionale.
Queste comprendono:
1. proteine secrete dalla cellula
2. proteine integrali di membrana
3. proteine solubili che risiedono all’interno dei compartimenti del sistema delle endomembrane, che
includono RE, complesso del Golgi, lisosomi, endosomi, vescicole e vacuoli vegetali.

o Altri polipeptidi sono sintetizzati sui ribosomi “liberi”, cioè i ribosomi che non aderiscono al RE, e
successivamente rilasciati nel citosol. Questa classe comprende:
1. proteine destinate a rimanere nel citosol
2. le proteine periferiche della superficie interna delle membrane
3. proteine che sono trasportate nel nucleo
4. proteine che devono essere incorporate in perossiomi, cloroplasti e mitocondri.

SINTESI DELLE PROTEINE SECRETORIE, LISOSOMALI O DEL VACUOLO VEGETALE

La sintesi di proteine secrete, lisosomali o dei vacuoli delle cellule vegetali avviene attraverso un meccanismo di
traslocazione co-traduzionale. n questo processo, le proteine di neosintesi sono rilasciate nel lume del RE da un
ribosoma attaccato alla membrana del RE.

La sintesi del polipeptide inizia dopo che un RNA

messaggero si lega ad un ribosoma libero non ancora
legato ad una membrana. I ribosomi che sintetizzano
proteine di secrezione, lisosomali o dei vacuoli delle piante sono indistinguibili da quelli utilizzati per la produzione di
proteine che rimangono nel citosol.

I polipeptidi che devono essere assemblati sui ribosomi legati alle membrane contengono una sequenza segnale, che
include una successione di 6-15 residui amminoacidici idrofobici, che indirizza il polipeptide nascente alle membrane
del RE e porta alla compartimentazione del polipeptide all’interno del lume del RE (un polipeptide nascente è un
polipeptide in via di sintesi e come tale non completamente ripiegato o assemblato). Benché la sequenza segnale sia
generalmente localizzata all’N-terminale o vicino ad esso, essa può occupare una posizione interna in alcuni
polipeptidi. Non appena emerge dal ribosoma, la sequenza segnale idrofobica è riconosciuta da una particella di
riconoscimento del segnale (SRP), che nelle cellule dei mammiferi consiste di 6 distinti polipeptidi ed una piccola
molecola di RNA. L’SRP si lega sia alla sequenza segnale presente sulla catena polipeptidica nascente sia al ribosoma
arrestando temporaneamente la traduzione e quindi l’allungamento del polipeptide nascente. Il complesso SRP-
ribosoma-polipeptide nascente è poi reclutato sulle membrane del RE attraverso l’interazione tra SRP e il recettore
per l’SRP che si trova sulle membrane del RE. Il ribosoma con il polipetide nascente è, poi, consegnato dall’SRP al
traslocone (è un canale costituito da proteine, immerso nella membrana del RE, attraverso il quale il polipeptide
nascente è in grado di muoversi nel suo passaggio dal citosol al lume del RE).

CRISTALLOGRAFIA A RAGGI X DEL TRASLOCONE

La cristallografia a raggi X del traslocone ha fornito importanti informazioni su come avvioene il processo di
traslocazione.

Ciò ha rivelato la presenza nel traslocone di un poro a forma di clessidra con un anello di sei
amminoacidi idrofobici situato a livello del suo diametro minore. Nello stato inattivo (cioè “non-
traslocante”), l’apertura dell’anello del poro è occluso da una corta α-elica. Si ritiene che questa
occlusione sigilli il canale, impedendo il passaggio indesiderato di calcio e di altri ioni tra il citosol
ed il lume del RE. Una volta che il ribosoma si lega al traslocone, la sequenza segnale è
riconosciuta e il polipeptide nascente è inserito nello stretto canale acquoso del traslocone . È
stato proposto che il contatto della sequenza segnale con l’interno del traslocone porti allo
spostamento dell’α-elica che occlude il canale e all’apertura del passaggio. Il polipeptide nascente è poi traslocato
attraverso l’anello del poro idrofobico nel lume del RE. Poiché l’anello del poro osservato nella struttura
cristallografica ha un diametro (5-8 Å) che è considerevolmente più piccolo di quello di una catena polipeptidica ad α -
elica, si presume che il poro si possa espandere quando la catena nascente attraversa il canale. Una volta che la
traduzione è terminata e il polipeptide completo è passato attraverso il traslocone, il ribosoma legato alla membrana
è rilasciato dalla membrana del RE e il canale viene prontamente sigillato dall’α-elica.

COME UNA PROTEINA NEOSINTETIZZATA VIENE PROCESSATA NEL RET ICOLO ENDOPLASMATICO

Appena un polipeptide nascente entra nelle cisterne del RER, si trova ad interagire con una moltitudine di enzimi
localizzati sia nella membrana che nel lume del RER. La porzione N-terminale contenente il peptide segnale viene
rimossa dalla maggior parte dei polipeptidi nascenti, ad opera di un enzima proteolitico, la peptidasi del segnale. I
carboidrati vengono aggiunti alla proteina nascente per mezzo dell’enzima oligosaccariltrasferasi. Sia la peptidasi del
segnale che la oligosaccariltrasferasi sono proteine integrali di membrana che risiedono in prossimità del traslocone
ed agiscono sulle proteine nascenti appena esse fanno il loro ingresso post-traduzionale nel lume del RE.

SINTESI DELLE PROTEINE DI MEMBRANA SUI RIBOSOMI LEGATI ALL E MEMBRANE

Anche le proteine integrali di membrana (tranne quelle dei mitocondri e dei cloroplasti) vengono sintetizzate
mediante traslocazione co-traduzionale utilizzando lo stesso macchinario molecolare descritto per la sintesi delle
proteine di secrezione e per le proteine lisosomali. Però, a differenza delle proteine di secrezione solubili e delle
proteine lisosomali, le proteine integrali contengono uno o più segmenti transmembrana idrofobici che fuoriescono
dal canale del traslocone e sono inseriti direttamente nel doppio strato lipidico.
Le proteine che attraversano la membrana una sola
volta possono essere orientate con l’estremità N-
terminale che si affaccia nel citosol o nel lume del RE.
il fattore più comune che determina l’allineamento
delle proteine di membrana è la presenza di residui
amminoacidici carichi positivamente all’estremità citosolica di un segmento transmembrana. la disposizione
all’interno della membrana è determinata dalla direzione in cui è inserito il primo segmento transmembrana. Ogni
ulteriore segmento transmembrana deve essere ruotato di 180° prima che possa uscire dal traslocone. un traslocone è
da solo capace di orientare nella maniera corretta i segmenti transmembrana. Sembrerebbe che il traslocone sia più
che una semplice via di passaggio attraverso la membrana del RE, ma un complesso “macchinario” in grado di
riconoscere diverse sequenze segnale e in grado di svolgere complesse attività meccaniche.

PROTEINE TRANSM EMBRNA CHE NON UTILIZZANO IL TRASLOCONE

Una di queste classi di proteine, chiamate proteine ancorate con la coda hanno estesi domini citosolici N -terminale e
un singolo dominio C-terminale di ancoraggio alla membrana che serve anche come sequenza segnale. Poiché la
sequenza segnale è all’estremità C-terminale, è l’ultimo segmento della proteina ad essere tradotta dal ribosoma,
quindi queste proteine non possono essere indirizzate al RE attraverso un meccanismo co-traduzionale. Tuttavia, esse
riescono ad essere inserite correttamente nelle membrane del RE. Infatti, dopo che sono state sintetizzate nel
citoplasma, queste proteine sono guidate al RE attraverso una serie d’interazioni con proteine che costituiscono la via
GET (Guided Entry of Tail-Anchored proteins, cioè entrata guidata delle proteine ancorate con la coda).

VIA GET: passaggi chiave  Nel citosol le proteine ancorate con la coda sono prima catturate da una proteina
citosolica e poi trasferite ad un “complesso di indirizzamento” diretto al RE formato da proteine Get (nel lievito
composto da Get3, Get4 e Get5). Sulla membrana del RE, un altro complesso di proteine transmembrana (formato da
Get1 e Get2) lega tali proteine e le inserisce all’interno della membrana del RE. Si stima che ci siano centinai a di
proteine ancorate con la coda negli eucarioti che devono utilizzare la via GET o vie alternative per essere
correttamente localizzate sulle membrane del RE.

BIOSINTESI DELLE MEMBRANE NEL RETICOLO ENDOPLASMATICO

Le membrane non si originano ex novo piuttosto si pensa che esse derivino solo da membrane preesistenti.

Le membrane crescono quando le proteine neosintetizzate e i lipidi sono inseriti nelle membrane del RE già esistenti. I
componenti di membrana si muovono dal RE ad ogni altro compartimento nella cellula. Quando una membrana si
muove da un compartimento ad un altro, le sue proteine e i suoi lipidi sono modificati da enzimi che risiedono nei vari
compartimenti cellulari. Queste modificazioni contribuiscono a conferire ad ogni compartimento membranoso una
propria peculiare composizione ed una distinta identità.

Le membrane cellulari sono asimmetriche: i due strati fosfolipidici (foglietti) della membrana hanno differente
composizione. Questa asimmetria è stabilita inizialmente nel reticolo endoplasmatico ed è mantenuta quando la
membrana passa da un compartimento al successivo per gemmazione e per fusione. Come risultato, i domini situati
sulla superficie citosolica delle membrane del RE possono essere identificati sulla superficie citosolica delle vescicole di
trasporto, sulla superficie citosolica delle cisterne del Golgi e sulla superficie interna (citoplasmatica) della membrana
plasmatica. Similmente, i componenti situati sulla superficie luminale della membrana del RE mantengono il loro
orientamento e alla fine si ritrovano nella superficie esterna (esoplasmatica) della membrana plasmatica. Infatti, il
lume del RE (come pure degli altri compartimenti della via secretoria) è molto simile allo spazio extracellulare per
molte caratteristiche, come la sua elevata concentrazione di Ca 2+ , e abbondanza di proteine con legami disolfuro e
catene di carboidrati.
 Quando una proteina è sintetizzata nel RER, viene subito inserita nel doppio strato
lipidico in un orientamento prevedibile determinato dalla sua sequenza
amminoacidica. Questo orientamento è mantenuto durante il suo viaggio nel
sistema delle endomembrane.

Le catene di carboidrati, che vengono aggiunte per prime nel RE, forniscono un modo
conveniente per determinare l’asimmetria della membrana perché esse sono sempre
presenti sul lato luminale delle membrane citoplasmatiche che diventa il monostrato
esoplasmatico, o esterno, della membrana plasmatica, dopo la fusione delle
vescicole con essa.

La maggior parte dei lipidi di membrana è sintetizzata nel reticolo endoplasmatico. Le eccezioni sono rappresentate
dalle sfingomieline e dai glicolipidi, la cui sintesi inizia nel RE ed è completata nel complesso del Golgi, e da alcuni dei
lipidi particolari delle membrane di mitocondri e cloroplasti, che sono sintetizzati da enzimi che risiedono in quelle
membrane.

Gli enzimi coinvolti nella sintesi di fosfolipidi sono essi stessi proteine integrali della membrana del RE, con il loro sito
attivo rivolto verso il citosol. I fosfolipidi di nuova sintesi sono inseriti nella metà del doppio strato rivolta al citosol.
Alcune di queste molecole lipidiche vengono trasportate più tardi nel foglietto opposto grazie ad enzimi detti flippasi. I
lipidi sono trasportati dal RE al complesso del Golgi e verso la membrana plasmatica come parte del doppi o strato che
costituisce le pareti delle vescicole di trasporto.

Il fatto che le membrane di organelli differenti abbiano una

composizione in lipidi marcatamente differente indica che durante
il flusso di membrane nella cellula avvengono molti cambiamenti.
Ci sono molti fattori che possono contribuire a questi cambiamenti:

1. La maggior parte degli organelli membranosi possiede enzimi che

modificano i lipidi già presenti nella membrana, cambiando un tipo di
fosfolipide in un altro.
2. Quando le vescicole gemmano da un compartimento, alcuni tipi di
fosfolipidi possono essere inclusi preferenzialmente nella membrana di
vescicole che si stanno formando mentre altri tipi possono esserne esclusi.
3. Regioni del RE formano contatti diretti e dinamici con altri organelli,
compreso il complesso del Golgi, i mitocondri e la membrana plasmatica.
Questi siti di contatto rappresentano regioni dove due compartimenti
intracellulari sono tenuti in stretta vicinanza (entro 30 nm) senza fondere i
doppi strati di membrana. Una funzione di questi siti di contatto è lo
scambio di lipidi tra compartimenti. Tale scambio può essere facilitato da
proteine in grado di trasportare lipidi, che possono essere proteine solubili o
legate alle membrane. Il trasferimento di lipidi da una membrana di un
organello ad un’altra può anche verificarsi attraverso la formazione di un
canale proteico idrofobico tra i compartimenti.

GLICOSILAZIONE NEL RETICOLO ENDOPLASMATICO RUGOSO

Quasi tutte le proteine prodotte sui ribosomi legati alla membrana diventano glicoproteine. I gruppi oligosaccaridici
hanno un ruolo chiave nelle funzioni di molte glicoproteine, in particolare come siti di legame nella loro interazione
con altre macromolecole, come avviene in molti processi cellulari. Essi, inoltre, facilitano la proteina a cui sono
attaccati nel ripiegarsi correttamente. Le sequenze degli zuccheri che compongono le oligosaccaridi delle glicoproteine
sono altamente specifiche; se le oligosaccaridi sono isolati da una proteina purificata da un determinato tipo cellulare,
le loro sequenze sono coerenti e prevedibili.

COME È DETERMINATA LA SEQUENZA DEGLI ZUCCHERI NEGLI OLIGOSACCARIDI.

L’aggiunta di zuccheri ad una catena oligosaccaridica in crescita è catalizzata da un gruppo di enzimi legati a
membrane chiamati glicosiltrasferasi, enzimi che trasferiscono uno specifico monosaccaride da uno zucchero
nucleotidico all’estremità in crescita della catena carboidratica. sequenza secondo la quale gli zuccheri vengono
trasferiti durante l’assemblaggio di un’oligosaccaride dipende dalla sequenza delle glicosiltrasferasi che intervengono
nel processo. Questa, a sua volta, deriva dalla disposizione degli enzimi specifici all’interno delle varie membrane della
via secretoria. Così, l’organizzazione degli zuccheri nelle catene oligosaccaridiche di una glicoproteina dipende dalla
localizzazione spaziale di particolari enzimi lungo la catena di montaggio.

Fasi della sintesi del segmento base di un oligosaccarideN-linked nel RER.

Sono mostrati i passaggi iniziali che si verificano durante l’assemblaggio

delle oligosaccaridi legati al gruppo amminico delle asparagine, sia di
proteine solubili che integrali di membrana.
Subito dopo il trasferimento al polipeptide nascente, la catena
oligosaccaridica subisce progressive modificazioni. Queste
modificazioni iniziano nel RE attraverso la rimozione enzimatica di
due dei tre residui terminali di glucosio da parte delle glicosidasi.
Questo è un passaggio chiave nella vita di una glicoproteina
neosintetizzata in cui essa è vagliata da un sistema di controllo di
qualità che determina se essa sia adatta o meno a muoversi verso il
successivo compartimento della via biosintetica. Per iniziare questo
processo, ogni glicoproteina, i cui oligosaccaridi contengono un
singolo glucosio residuo, si lega ad uno chaperone. Il glucosio
residuo viene rimosso enzimaticamente dalla glucosidasi II e ciò
porta al rilascio della glicoproteina. Se a questo stadio la
glicoproteina non ha ancora completato il suo ripiegamento o se ha
assunto conformazioni non native, essa viene riconosciuta da un
“enzima di monitoraggio” della struttura proteica (detto UGGT, UDP-Glucose: glycoprotein glucosyltransferase), che
aggiunge nuovamente un singolo residuo di glucosio ad uno dei residui di mannosio dell’estremità esposta
dell’oligosaccaride appena generato. UGGT riconosce le proteine ripiegate in modo incompleto o scorretto perché
queste mostrano residui amminoacidici idrofobici che sono generalmente assenti in quelle ripiegate correttamente.
Una volta che il residuo di glucosio viene aggiunto, la glicoproteina “etichettata” viene riconosciuta dagli stessi
chaperoni del RE, che le danno un’altra possibilità di ripiegarsi correttamente. Dopo un po’ di tempo assieme allo
chaperone, il residuo di glucosio viene rimosso e l’enzima di monitoraggio verifica nuovamente se è stata raggiunta la
corretta struttura tridimensionale. Se la proteina è ancora non completamente ripiegata o piegata male, viene
aggiunito un altro residuo di glucosio ed il processo si ripete finché, alla fine, la glicoproteina o è ripiegata
correttamente e prosegue per la sua via, oppure resta ripiegata male e viene degradata al fine di mantenere
l’“omeostasi” nel RE. La “decisione” di distruggere la proteina difettosa avvenga a partire da un enzima ad azione lenta
nel RE; esso taglia un residuo di mannosio da una estremità esposta di un’oligosaccaride appartenente a una proteina
che è stata nel RE per un lungo periodo. Una volta che uno o più di questi residui di mannosio sono stati rimossi, la
proteina non può più essere riciclata e, invece, è re-traslocata nel citosol ed inviata alla degradazione.

COMPLESSO DEL GOLGI

Negli ultimi anni del XIX secolo Camillo Golgi stava sperimentando una serie di colorazioni con nitrato d’argento su
cellule nervose del cervelletto e scoprì una rete di colorazione scura situata nelle vicinanze del nucleo cellulare.
Questa rete, che fu più tardi identificata in altri tipi di cellule, venne chiamata complesso del Golgi (o apparato del
Golgi).

Il complesso del Golgi ha una morfologia caratteristica che consiste

di cisterne membranose appiattite, a forma di disco con bordi
dilatati, associate a vescicole e tubuli. Le cisterne sono disposte a
sembrare pile ordinate, e sono curvate. Il complesso del Golgi è
diviso in diversi compartimenti distinti per funzionalità e disposti
secondo un asse che va dalla faccia cis o di entrata, la più vicina al
RE, alla faccia trans o di uscita, dalla parte opposta della pila. La
faccia più cis dell’organello si compone di una rete di tubuli
interconnessi detta rete cis del Golgi (cis Golgi network, CGN). La
massa del complesso del Golgi è composta da larghe cisterne
appiattite, che si dividono in: cisterne cis, mediali e trans. La faccia più trans dell’organello contiene una rete distinta
di tubuli e di vescicole chiamata rete trans del Golgi (trans Golgi network, TGN). La faccia più trans dell’organello
contiene una rete distinta di tubuli e di vescicole chiamata rete trans del Golgi (trans Golgi network, TGN). Come CGN,
anche TGN è un centro di smistamento. Le proteine sono segregate nel TGN in differenti tipi di vescicole che si
dirigono verso la membrana plasmatica o verso varie destinazioni intracellulari.

Tutte le cisterne hanno delle caratteristiche ben precise:

• I diametri delle cisterne sono tipicamente di 0,5-1,0 µm

• Meno di otto cisterne sono generalmente sovrapposte in un complesso del Golgi
• Una singola cellula può contenere da poche a parecchie migliaia di complessi, secondo il tipo cellulare

• Micrografia elettronica di parte di una cellula del cappuccio

della radice di tabacco che mostra una chiara polarità tra le cisterne
cis e trans.

• Ricostruzione tomografica di una cellula beta del pancreas di topo che sintetizza e
rilascia insulina. Le singole cisterne appaiono chiaramente interconnesse a formare
un nastro ininterrotto e continuo. La porzione trans (TGN) è colorata in rosso, mentre
la faccia cis (CGN) è colorata in blu.

• Micrografia mediante immunofluorescenza di una cellula umana in coltura. La

posizione del Golgi è indicata dal colore rosso, che corrisponde ad anticorpi diretti contro
la proteina COPI (coat protein I)
 • Micrografia elettronica a scansione (osservazione tridimensionale) di una
singola cisterna di Golgi che mostra due domini distinti : uno concavo centrale e
uno mperiferico più irregolare. Il dominio periferico consiste in una rete tubulare
da dove gemmano vescicole rivestite. La spaccatura del campione ha diviso la
cisterna.

Il complesso del Golgi non è uniforme nella sua composizione da un’estremità all’altra. Le differenze nella
composizione dei compartimenti di membrana che si osservano tra la faccia cis e quella trans riflettono il fatto che il
complesso del Golgi è soprattutto “un impianto di lavorazione”. Le proteine di membrana neosintetizzate, come le
proteine di secrezione e quelle lisosomali, lasciano il RE ed entrano nel complesso del Golgi nella sua faccia cis e p oi
viaggiano attraverso la pila fino alla faccia trans. Mentre progrediscono lungo la pila, le proteine neosintetizzate nel
RER vengono modificate, sequenzialmente, in modi specifici.

Differenze nella composizione delle membrane attraverso il complesso del Golgi:

a) Il tetrossido di osmio b) L’enzima mannosidasi II, c) L’enzima nucleoside

ridotto impregna che è coinvolto nel taglio dei difosfatasi, che scinde i
preferenzialmente le residui di mannosio dalla dinucleotidi (per esempio
cisterne cis del complesso parte centrale l’UDP) dopo che hanno
del Golgi. dell’oligosaccaride come rilasciato il loro zucchero, è
descritto nel testo, si trova di situato preferenzialmente
preferenza localizzato nelle nelle cisterne trans.
cisterne mediali.
GLICOSILAZIONE NEL COMPLESSO DEL GOLGI

Il complesso del Golgi svolge un ruolo chiave nell’assemblaggio dei carboidrati che fanno parte delle glicoproteine e
dei glicolipidi. Quando le proteine solubili e le glicoproteine di membrana neosintetizzate attraversano le cisterne cis e
quelle mediali del Golgi, anche la maggior parte dei residui di mannosio viene rimossa dalle oligosaccaridi di base ed
altri zuccheri vengono aggiunti in sequenza da varie glicosiltrasferasi.

Nel complesso del Golgi, così come nel RER, la sequenza in cui gli zuccheri sono incorporati negli oligosaccaridi è
determinata dalla disposizione spaziale delle specifiche glicosiltrasferasi che entrano in contat to con la proteina
neosintetizzata mentre si muove attraverso il complesso del Golgi.

Tappe nella glicosilazione di un’oligosaccaride legato all’azoto nel complesso del Golgi di un mammifero.

Dopo la rimozione di tre residui di

glucosio, sono rimossi successivamente
diversi residui di mannosio, mentre vari
zuccheri (N-acetilglucosammina,
galattosio, fucosio e acido sialico) sono
aggiunti all’oligosaccaride da
glicosiltrasferasi specifiche. Questi enzimi
sono proteine integrali di membrana, i cui
siti attivi si affacciano sul lume delle
cisterne del Golgi. Questa è solo una delle
numerose vie di glicosilazione.

Il complesso del Golgi è anche il luogo della sintesi della maggior parte dei polisaccaridi complessi della cellula,
comprese le catene di glucosamminoglicani dei proteoglicani, le pectine e l’emicellulosa presenti nelle pareti cellulari
delle piante.

TRASPORTO DEI MATERIALI ATTRAVERSO IL COMPLESSO DEL GOLGI

Due opposte scuole di pensiero sul modo in cui il complesso del Golgi accade hanno dominato il campo per anni. Fino
alla metà degli anni 1980 si pensava che le cisterne del Golgi fossero strutture transitorie.

Modello della maturazione delle cisterne (ogni cisterna “matura” nella cisterna seguente”:

Le cisterne del Golgi sono strutture transitorie. Le cisterne si formano alla faccia
cis per fusione delle vescicole e delle strutture vescicolo-tubulari provenienti dal
RE e dall’ERGIC (endoplasmic reticulum golgi intermediate compartment). Ogni
cisterna si muove fisicamente dall’estremità cis verso quella trans, cambiando
composizione quindi le cisterne progrediscono gradualmente da una posizione cis
ad una trans e poi si disperdono nel TGN. Le vescicole di trasporto muovono
enzimi residenti nel Golgi in una direzione retrograda. Gli oggetti rosso scuro a
forma di lente rappresentano grossi carichi di materiali, come i complessi di
procollagene nei fibroblasti.
Modello del trasporto vescicolare:

Le cisterne sono compartimenti stabili.

Il cargo (cioè, le proteine di secrezione, lisosomiali e di membrana) viene

trasportato dal CGN al TGN in direzione anterograda dalle vescicole di trasporto,
in vescicole che gemmano dalla membrana di un compartimento e si fondono
con il compartimento adiacente a valle lungo la pila di cisterne, le quali restano
degli elementi stabili.

Il modello di trasporto vescicolare e la sua accettazione è dovuta in gran parte a due tipi di osservazioni:

1) Ciascuna delle varie cisterne del Golgi ha una popolazione distinta di enzimi residenti. Come potrebbero le
varie cisterne avere tali proprietà differenti se ogni cisterna desse origine a quella seguente, come suggerito
dal modello di maturazione delle cisterne.
2) Nelle foto al microscopio elettronico si può osservare un gran numero di vescicole che gemmano dai margini
delle cisterne del Golgi.

Micrografia elettronica di un’area del complesso del Golgi in una sezione sottile
congelata di una cellula infettata con il virus della stomatite vescicolare (VSV). I
punti neri sono particelle di oro della grandezza di nanometri legate per mezzo di
anticorpi alla proteina VSVG, una molecola cargo del flusso anterogrado. Il cargo
è limitato alle cisterne e non compare nelle vescicole adiacenti (frecce).

Micrografia elettronica con particelle di oro legate alla mannosidasi II, un

enzima residente nelle cisterne mediali del Golgi. L’enzima compare sia nelle
cisterne che un una vescicola (freccia). L’enzima compare sia nelle cisterne che
in una vescicola (freccia). La vescicola marcata sta presumibilmente
trasportando l’enzima in direzione retrograda per compensare il movimento
anterogrado dell’enzima come risultato dalla maturazione delle cisterne.

Anche se entrambi i modelli della funzione del Golgi continuano ad avere loro sostenitori, negli ultimi anni l’opinione
generale si è spostata nuovamente verso il modello di maturazione delle cisterne. Diversi dei motivi principali:

• Il modello di maturazione delle cisterne prevede un complesso del Golgi altamente dinamico in cui i principali
elementi dell’organello, le cisterne, sono continuamente formati alla faccia cis e dispersi alla faccia trans.
 Quando la formazione di vescicole di trasporto dal RE è bloccata mediante il trattamento di cellule con
specifici inibitori o mediante l’uso di mutanti temperatura-sensibili, il complesso del Golgi scompare. Quando
gli inibitori sono rimossi o le cellule mutanti sono riportate ad una temperatura permissiva, il trasporto RE-
Golgi è ripristinato ed il complesso del Golgi si riassembla rapidamente.

(la reale esistenza del complesso del Golgi dipende dal continuo afflusso di vescicole di trasporto dal RE all’ERGIC
(endoplasmic reticulum golgi intermediate compartment).

• Si può dimostrare che alcuni materiali che vengono prodotti nel reticolo endoplasmatico e viaggiano
attraverso il complesso del Golgi rimangono all’interno delle cisterne del Golgi e non compaiono mai
all’interno delle vescicole di trasporto associate al Golgi. Studi sui fibroblasti indicano che i grandi complessi
di molecole di procollagene (i precursori del collagene extracellulare) si muovono dalle cisterne cis verso le
cisterne trans senza mai lasciarne il lume.
• Fino a metà degli anni ’90 si supponeva che le vescicole di trasporto si muovessero sempre in avanti (in senso
anterogrado), cioè da un’origine cis a una destinazione più trans. Molte evidenze hanno indicato però che
alcune vescicole si muovono all’indietro (in senso retrogrado) cioè da una membrana donatrice trans verso
una membrana accettrice cis.
• Studi su cellule di lievito di Saccharomyces cerevisiae, contenenti proteine del Golgi marcate con sonde
fluorescenti hanno dimostrato direttamente che la composizione di una cisterna individuale del Golgi può
variare nel tempo – da un contenente proteine del Golgi precoci (cis) ad un contenente proteine del Golgi
tardive (trans).

VESCICOLE DI TRASPORTO

I materiali sono trasportati fra i vari compartimenti da vescicole (o altri trasportatori delimitati da membrana), che
gemmano dalle membrane donatrici e si fondono con le membrane accettrici. Se si osservano attentamente le foto al
microscopio elettronico di vescicole colte nell’atto di gemmare, si scopre che le membrane di queste vescicole sono
rivestite sulla loro superficie esterna (citosolica) da uno specifico rivestimenti proteico formato da proteine solubili
che si accumulano sul versante citosolico della membrana donatrice nei siti dove avviene la gemmazione. Ogni gemma
rivestita si distacca a formare una vescicola rivestita.

vescicola rivestita da COPI

vescicola rivestita da COPII
I rivestimenti proteici hanno almeno due funzioni distinte:

1. fungono da dispositivo meccanico che induce la membrana a curvarsi e a formare una vescicola in
gemmazione
2. costituiscono un meccanismo per la selezione dei componenti che devono essere trasportati nella vescicola.

I componenti selezionati includono:

a. il cargo da trasportare formato da proteine di secrezione, lisosomali e di membrana

b. il macchinario richiesto per indirizzare e far ancorare la vescicola alla membrana ricevente

Il rivestimento è composto di due strati proteici distinti:

• uno esterno di impalcatura che forma la rete per il rivestimento

• uno strato interno di adattatori che legano sia la superficie esterna del doppio strato lipidico sia il cargo

Sono state identificate diverse categorie di vescicole rivestite che sono distinte in base alle proteine che compongono
il loro rivestimento, al loro aspetto al microscopio elettronico ed al loro ruolo nel traffico cellulare.

I tipi di vescicole rivestite meglio studiate sono:

1. Le vescicole rivestite da COPII trasportano i materiali dal RE in senso anterogrado

verso l’ERGIC ed il complesso del Golgi
2. Le vescicole rivestite da COPI trasportano il materiale in un senso retrogrado:
(1) dall’ERGIC e dal Golgi “all’indietro” verso il RE e
(2) dalle cisterne trans del Golgi alle cisterne cis del Golgi
3. Le vescicole rivestite da clatrina trasportano il materiale dal TGN verso gli
endosomi, i lisosomi ed i vacuoli delle cellule vegetali. Esse trasportano anche i
materiali dalla membrana plasmatica ai compartimenti citoplasmatici lungo la via
endocitica e sono anche coinvolte nel traffico dagli endosomi e dai lisosomi.

VESCICOLE RIVESTITE DA COPII: TRASPORTO DELLE PROTEINE CARGO DAL RE AL COMPLESSO DEL
GOLGI

Le vescicole rivestite da COPII mediano la prima tappa del viaggio lungo la via biosintetica, dal RE all’ERGIC ed al
complesso del Golgi. È stato osservato che queste vescicole gemmano da domini specializzati del RE che sono chiamati
siti di uscita dal RE (ERES, ER exit sites).

Il rivestimento di COPII contiene varie proteine identificate per la prima volta in cellule mutanti di lievito che non
potevano effettuare il trasporto dal RE al complesso del Golgi. Proteine omologhe a queste del lievito sono state
identificate nei rivestimenti delle vescicole che gemmano dal RE nelle cellule di mammifero. Gli anticorpi anti-proteine
del rivestimento di COPII bloccano la gemmazione delle vescicole dalle membrane del RE, ma non hanno effetto sul
movimento del cargo in altre fasi della via di secrezione. Si pensa che i rivestimenti di COPII selezionino e concentrino
determinati componenti che trasportano. Certe proteine integrali di membrana del RE vengono selettivamente
catturate perché contengono i segnali “di esportazione dal RE” nella loro coda citosolica.

Questi segnali interagiscono specificamente con le proteine COPII del rivestimento della vescicola.

Ruoli proposti per le proteine del rivestimento COPII nella creazione della curvatura della membrana,
nell’assemblaggio del rivestimento proteico e nella cattura del cargo.
Assemblaggio di una vescicola rivestita da COPII.

L’assemblaggio ha inizio quando Sar1 è reclutato a livello della

membrana del RE e attivato dallo scambio del suo GDP legato con GTP.

1. Le molecole Sar1-GDP sono state reclutate a livello della

membrana del RE da una proteina detta GEF (guanine-exchange
factor, fattore che promuove lo scambio GTP/GDP), che
catalizza lo scambio del GDP legato con un GTP.
2. ciascuna molecola Sar1-GTP estende un’α-elica lungo la
membrana entro il foglietto citosolico. Questo evento induce la
curvatura del doppio strato lipidico.
3. Un dimero composto da due polipeptidi COPII è reclutato dalla
SAr 1-GTP legata. Il dimero favorisve ulteriormente la curvatura
della membrana necessaria alla formazione di una vescicola.
4. I recettori transmembrana del cargo si accumulano entro la
vescicola COPII in formazione quando le loro code citosoliche si
legano a COPII.
 Le proteine cargo che sono nel lume del RE (sfere e rombi rossi) che hanno superato l’attento
controllo di qualità nel RE possono legarsi alle estremità luminali dei recettori transmembrana per
il cargo. Questi recettori poi si concentrano all’interno della vescicola rivestita attraverso
interazioni fra le loro code citosoliche ed i componenti del rivestimento di COPII. Le proteine del
RE (es. BiP) sono generalmente escluse dalle vescicole rivestite. Quelle che casualmente vengono
incluse in una vescicola rivestita sono riportate al RE.

Una volta che l’intero rivestimento COPII è assemblato, la vescicola in fase di gemmazione si separa dalla membrana
del RE e forma una sfera interamente rivestita da COPII. Prima che la vescicola rivestita possa fondersi con la
membrana bersaglio, il rivestimento proteico deve essere disassemblato ed i relativi componenti liberati nel citosol. Il
disassemblaggio è innescato dall’idrolisi del GTP legato che produce una subunità Sar1 -GDP, la quale ha minore
affinità per la membrana della vescicola. La dissociazione della Sar1-GDP dalla membrana è seguita dal rilascio delle
altre subunità di COPII.

VESCICOLE RIVESTITE DA COPI: TRASPORTO RETROGADO DELLE PROTEINE VERSO IL RE

Il rivestimento COPI è composto di un complesso, chiamato coatomero, formato da sette proteine. Singole subunità
del coatomero sono reclutate alla membrana e sembrano legarsi, in maniera flessibile, l’un l’altra in differenti modi
per accomodare vescicole di diversa grandezza. I coatomeri COPI formano uno spesso rivestimento proteico
direttamente sulla membrana. Le vescicole rivestite da COPI sono implicate nel trasporto retrogrado delle proteine
incluso il movimento di enzimi del Golgi, in direzione da trans a cis e enzimi residenti nel RE dall’ERGIC e dal complesso
del Golgi, indietro verso il RE.

Se le vescicole gemmano continuamente dai comparti membranosi, come fa ogni compartimento a mantenere la
propria composizione?

Le proteine vengono mantenute in un determinato organello tramite una combinazione di due meccanismi: la
ritenzione e il recupero.

1) La ritenzione delle molecole residenti che sono escluse dalle vescicole di trasporto. La ritenzione può essere
basata principalmente sulle proprietà fisiche della proteina.
2) Il recupero delle molecole “sfuggite” che vengono riportate di nuovo nel comparto in cui risiedono
normalmente.
Come vengono recuperare le proteine del RE

Le proteine che risiedono nel RE contengono alla loro estremità sequenze di

amminoacidi che servono da segnali di recupero, assicurando il loro ritorno al RE
se dovessero essere accidentalmente trasportate in avanti verso l’ERGIC o il
complesso del Golgi. Le proteine solubili del lume del RE possiedono tipicamente il
segnale di recupero KDEL. Queste proteine sono riconosciute e riportate al RE dal
recettore KDEL, proteina integrale di membrana che fa la spola dalla porzione cis
del Golgi ai compartimenti del RE. Se da una proteina del RE viene eliminita la
sequenza KDEL la proteina è trasportata in avanti attraverso il complesso del Golgi.
Al contrario, quando una cellula viene geneticamente modificata per esprimere
una proteina lisosomale o di secrezione contenente un segnale KDEL aggiunto
all’estremità C-terminale, quella proteina viene ricondotta al RE.

Anche le proteine di membrana del RE hanno un segnale di recupero all’estremità

C-terminale KKXX che si lega al rivestimento di COPI, facilitando il loro ritorno al RE.

SUPERAMENTO DEL COMOLESSO DEL GOLGI: SMISTAMENTO DELLE PROTEINE AL TGN

Smistamento e trasporto di enzimi lisosomali

Le proteine lisosomali sono sintetizzate sui ribosomi legati alla membrana del RE e trasportate al complesso del Golgi
insieme ad altri tipi di proteine. Una volta entrate nelle cisterne del Golgi, le proteine lisosomali solubili vengono
riconosciute da enzimi che in due tappe catalizzano l’aggiunta di un gruppo fosfato a certi zuccheri mannosio delle
catene di carboidrati N-linked.

Gli enzimi lisosomali sono riconosciuti nelle

cisterne cis da un enzima in grado di trasferire
una N-acetilglucosammina fosforilata da un
nucleotide donatore, ad uno o più residui di
mannosio di oligosaccaridi legati all’N. La
componente di glucosammina è poi rimossa, in
una seconda fase, da un secondo enzima che
lascia i residui di mannosio-6-fosfato come
parte della catena oligosaccaridica.
Gli enzimi lisosomali possiedono residui di mannosio fosforilati che funzionano come segnali di smistamento. Gli
enzimi lisosomali che portano questo segnale di mannosio-6-fosfato sono riconosciuti e “catturati” dai recettori per il
mannosio-6-fosfato (MPR), che sono proteine integrali di membrana che attraversano le membrane del TGN.

1) I residui di mannosio dell’enzima lisosomiale sono fosforilati nelle cisterne del Golgi
2) Gli enzimi lisosomiali vengono selettivamente incorporati in vescicole rivestite da clatrina a
livello del TGN
3) Gli enzimi lisosomiali che portano questo segnale di mannosio-6-fosfato sono riconosciuti e
“catturati” dai recettori per il mannosioi-6-fosfato (MPR).
4) I recettori per il mannosio-6-fosfato si separano dagli enzimi
5) I recettori per il mannosio-6-fosfato sono riportati al complesso del Golgi
6) Gli enzimi lisosomiali sono inviati ad un endosoma e infine a un lisosoma.
7) I recettori per il mannosio-6-fosfato sono anche presenti sulla membrana plasmatica dove
sono in grado di catturare enzimi lisosomali secreti nello spazio extracellulare, riportandoli
alla via che li indirizza in un lisosoma

MALATTIE CHE DERIVANO DA DIFETTI NELLA FUNZIONE LISOSOMALE

Patologie caratterizzate dalla mancanza di un singolo enzima lisosomale con il corrispondente accumulo del substrato
non degradato sono dette malattie da accumulo lisosomale. I loro sintomi variano da una estrema gravità a situazioni
in cui sono a malapena evidenziabili, in funzione del grado in cui la mutazione ha alterato l’enzima. Diverse patologie
sono state anche attribuite a mutazioni a carico di proteine di membrana lisosomali che bloccano il trasporto di
sostanze dal lume del lisosoma al citosol.

- Fotografia al microscopio elettronico di una sezione di un neurone

di un paziente con una malattia da accumulo lisosomale
caratterizzata dall’incapacità di degradare i gangliosidi GM2. Questi
vacuoli citoplasmatici si colorano per la presenza sia di enzimi
lisosomali che di gangliosidi, indicando che essi sono lisosomi in cui si
sono accumulati i glicolipidi non digeriti.
INDIRIZZAMENTO DELLE VESCICOLE VERSO UN PARTICOLARE COMPARTIMENTO

La fusione di una vescicola con l’opportuno organello accettore richiede interazioni specifiche fra differenti
membrane. La fusione selettiva è uno dei fattori che assicura la precisione del flusso direzionale attraverso i
compartimenti membranosi della cellula.

MOVIMENTO DELLA VESCICOLA VERSO IL COMPARTIMENTO BERSAGLIO SPECIFICO.

In molti casi, le vescicole di membrana devono spostarsi per distanze considerevoli attraverso il citoplasma prima di
raggiungere il loro obiettivo finale. Si pensa che questi tipi di movimenti siano diretti principalmente dai microtubuli,
che si comportano come binari capaci di trasportare vagoncini carichi lungo un percorso ben definito che si conclude
in una predeterminata destinazione

ORMEGGIO DELLE VESCICOLE AL COMPARTIMENTO BERSAGLIO.

Secondo questo modello, le proteine Rab (proteine G che
passano ciclicamente dallo stato attivo, quando esse sono
legate a GTP, a quello inattivo in cui sono legate a GDP) sulla
membrana bersaglio e sulla vescicola sono coinvolte nel
reclutamento di una o più proteine di ormeggio che mediano il
contatto iniziale tra le due membrane. Sono rappresentati due
tipi di proteine di ormeggio: proteine fibrose molto allungate
(come golgine ed EEA1) e complessi multiproteici (come exocist
e TRAPPI).
 La ricostruzione tomografica al microscopio elettronico di una
sezione di un terminale nervoso di mammifero mostra un folto
gruppo di vescicole sinaptiche presenti nelle immediate vicinanze
della membrana presinaptica.

I due ingrandimenti nella parte sinistra della figura (corrispondenti al

rettangolo delineato in bianco) evidenziano la presenza di
connessioni filamentose tra le due vescicole (AI, pannello in alto) e
tra una delle due vescicole e la membrana presinaptica (AII, pannello
in basso).

ATTRACCO DELLE VESCICOLE AL COMPARTIMENTO BERSAGLIO

Ad un certo punto del processo che conduce alla fusione, le membrane della vescicola e del compartimento bersaglio
si avvicinano ulteriormente e si giustappongono l’una all’altra, in seguito all’interazione tra le regioni citosoliche di
alcune proteine integrali delle due membrane. Le proteine più importanti che mediano queste interazioni sono dette
SNARE (famiglia di proteine integrali di membrana). Le SNARE sono divise in due categorie, v-SNARE, che sono
incorporate nelle membrane delle vescicole di trasporto durante la gemmazione, e t-SNARE, che sono situate nelle
membrane dei compartimenti bersaglio.

Durante la fase di attracco che porta alla fusione delle

membrane, la v-SNARE nella membrana della vescicola interagise
con le t-SNARE nella membrana bersaglio a formare un fascio a
quattro filamenti a α-elica che porta le due membrane in intimo
contatto.

FUSIONE FRA LA VESCICOLA E LA MEMBRANA BERSAGLIO.

Quando vescicole lipidiche artificiali (liposomi), contenenti t-SNARE purificate, sono incubate con liposomi contenenti
il corrispondente v-SNARE, i due tipi di vescicole si fondono l’uno con l’altro.

Modello dell’interazione tra le v- e le t-SNARE che porta alla fusione delle membrane e alla esocitosi.

La vescicola sinaptica risulta attraccata alla membrana plasmatica

tramite la formazione di fasci a quattro filamenti costituiti da α-eliche
fornite dalla sintaxina (in rosso), sinaptobrevina (in blu) e la SNAP-25
(in verde).
 Ipotesi sullo stato di transizione nella fusione delle due membrane.
Una piccola cavità ripiena di acqua è presente al centro del fascio di
eliche transmembrana.

Le eliche transmembrana che prima si trovavano nelle due

membrane separate sono ora presenti nello stesso strato lipidico e
si è aperto un poro di fusione tra la vescicola e la membrana
bersaglio. I neurotrasmettitori contenuti nella vescicola possono
adesso essere rilasciati per esocitosi.

Micrografia elettronica a scansione della superficie

extracellulare di una coppia di cellule alveolari (del
polmone) in coltura stimolata a secernere proteine che
erano state preventivamente immagazzinate in granuli
secretori. Si vede del materiale che viene espulso dalla
cellula attraverso aperture circolari lisce che si presume
siano pori di fusione dilatati. La freccia indica un poro di
fusione non dilatato, che si distingue subito da una
“lacerazione” artificiale (testa di freccia) formatasi
accidentalmente durante la preparazione del campione.

LISOSOMI
 I lisosomi funzionano come organelli digestivi nella cellula animale.
Un tipico lisosoma contiene circa cinquanta diversi enzimi idrolitici
prodotti nel RER e di qui indirizzati a questi organelli. Considerati nel
loro insieme, gli enzimi lisosomali sono in grado di idrolizzare
pressoché ogni tipo di macromolecola biologica. Gli enzimi di un
lisosoma hanno in comune una proprietà importante: tutti hanno
l’attività ottimale a pH acido e sono, quindi, delle idrolasi acide. Il pH
ottimale di questi enzimi è correlato con il basso pH del
compartimento lisosomale che è circa 4,6. Il loro aspetto ak
microscopio elettronico non risulta né distinto né uniforme.

una piccola porzione di una cellula di Kupffer, una cellula del fegato 
che è responsabile della fagocitosi degli eritrociti invecchiati e altro
materiale che deve essere rimosso dal circolo. I lisosomi di una cellula di
Kupffer hanno una forma irregolare ed una densità elettronica variabile che
rendono difficoltosa l’identificazione di questi organelli soltanto in base alla
morfologia.

RUOLO DEI LISOSOMI

Il ruolo più studiato dei lisosomi è la degradazione delle sostanze portate nella cellula dall’ambiente esterno.

Molti organismi unicellulari ingeriscono particelle di cibo che vengono degradate enzimaticamente nel lisosoma. Le
sostanze nutritizie passano nel citosol attraverso la membrana del lisosoma. Nei mammiferi le cellule fagocitarie,
come i macrofagi e i neutrofili, funzionano come “depuratori” che ingeriscono detriti o microrganismi potenzialmente
dannosi. I batteri ingeriti sono generalmente inattivati dal basso pH del lisosoma e poi digeriti enzimaticamente. I
peptidi prodotti da questo processo digestivo sono poi “esposti” sulla superficie cellulare, dove allert ano il sistema
immunitario della presenza di un agente estraneo.

I lisosomi hanno anche un ruolo chiave nel turnover (ricambio) degli organelli, cioè nella loro distruzione regolata e
sostituzione.
Durante questo processo chiamato autofagia, un organello, come il
mitocondrio è circondato da una doppia membrana (fagoforo) in
modo da costituire un compartimento a doppia membrana che
sequestra materiale citoplasmatico, chiamato autofagosoma.

fotografia al microscopio elettronico mostra

un mitocondrio e un perossisoma racchiusi in
un involucro a doppia membrana. Questo
vacuolo autofagico (o autofagosoma) si può
fondere con un lisosoma e il suo contenuto
digerito.

Nelle cellule di mammifero gli autofagosomi si formano ex novo a livello dei siti di contatto tra RE e mitocondri. Una
volta formato, la membrana esterna dell’autofagosoma si fonde poi con un lisosoma formando un autofagolisosoma,
in cui la membrana interna dell’autofagosoma e il contenuto in esso racchiuso sono degradati. I prodotti di
degradazione sono resi nuovamente disponibili per la cellula.
CITOSCHELETRO E MOBILITÀ CELLULARE

Il citoscheletro è una struttura di supporto per le cellule.

Il citoscheletro è formato da tre tipi di strutture filamentose ben definite — i microtubuli (MT), i filamenti di actina
(microfilamenti) e i filamenti intermedi (IF) — che formano una complessa rete interattiva e dinamica.

I tre tipi di filamenti citoscheletrici sono polimeri di subunità proteiche, legati da legami deboli non covalenti. Questo
tipo di costruzione fa sì che il citoscheletro possa rapidamente assemblarsi e disassemblarsi, processi che dipendono
da una complessa regolazione cellulare e conferiscono la caratteristica di dinamicità a queste strutture.

• I microtubuli sono lunghi tubi cavi, non ramificati, formati da subunità della proteina tubulina. (diametro 25
nm)
• I filamenti intermedi sono robuste fibre a forma di corda, composte da diverse proteine tra loro correlate.
(10-12 nm)
• I filamenti di actina sono strutture piene, sottili, spesso organizzate in una rete ramificata. ( 8nm)

Il citoscheletro funziona come:

• Un’impalcatura dinamica che fornisce il supporto strutturale, determina la forma della cellula e resiste alle
forze che tendono a deformarla.
• Un reticolo interno che stabilisce la posizione dei vari organuli all’interno della cellula.
• Una rete di binari per dirigere i movimenti di materiali e di organuli nella cellula.
• Un apparato generatore di forza che permette lo spostamento delle cellule. Gli organismi unicellulari si
muovono strisciando sulla superficie di un substrato solido oppure spingendosi attraverso il loro ambiente
liquido per mezzo di strutture specializzate per il moto (ciglia e flagelli) contenenti microtubuli, che sporgono
dalla superficie cellulare. Gli organismi pluricellulari possiedono una gran varietà di cellule capaci di
locomozione indipendente, quali gli spermatozoi, i globuli bianchi ed i fibroblasti.
• Un componente essenziale del macchinario per la divisione cellulare. Gli elementi del citoscheletro formano
l’apparato responsabile della separazione dei cromosomi, durante la mitosi e la meiosi, e della suddivisione
della cellula madre in due cellule figlie durante la citocinesi (o citodieresi).
Visione d’insieme della struttura e delle funzioni del citoscheletro:

Disegni schematici di (a) una cellula epiteliale, (b) una cellula nervosa (c) una cellula in divisione. I microtubuli delle
cellule epiteliali e nervose servono soprattutto da supporto e per il trasporto degli organuli, mentre i microtubuli della
cellula in divisione formano il fuso mitotico necessario per la separazione dei cromatidi fratelli. I filamenti intermedi
forniscono supporto strutturale sia per le cellule epiteliali sia per le cellule nervose. I microfilamenti sostengono i
microvilli della cellula epiteliale e sono parte integrante dell’apparato di motilità necessario per l’allungamento
dell’assone e per la divisione cellulare.

Esempio del ruolo dei microtubuli nel trasporto degli

organuli.

Cellula in coltura: perossiomi marcati con la proteina

fluorescente verde (GFP) strettamente associati ai
microtubuli del citoscheletro (in rosso marcati con un
anticorpo marcato con un fluorocromo) del
citoscheletro.

STRUTTURA E FUNZIONE DEI MICROTUBULI

I microtubuli sono strutture cave, tubulari, relativamente rigide, pressoché presenti in tutte le
cellule eucariotiche che vengono assemblate a partire dalla proteina tubulina. I microtubuli sono i
componenti di svariate strutture che comprendono il fuso mitotico delle cellule in divisione e l’asse
centrale di ciglia e flagelli. Essi hanno un diametro esterno di 25 nm, una parete dello spessore di
circa 4 nm e possono estendersi per tutta la lunghezza e la larghezza di una cellula.

La parete di un microtubulo è formata da proteine globulari disposte in file longitudinali, dette

protofilamenti, allineate parallelamente all’asse longitudinale del tubulo.

Visti in sezione trasversale, i microtubuli appaiono formati da 13 protofilamenti,

disposti secondo un disegno circolare a formarne la parete

Ogni protofilamento è costituito da blocchi dimerici, formati da una subunità di α -

tubulina e da una di β-tubulina. I due tipi di subunità globulari della tubulina hanno
una struttura tridimensionale simile e si adattano strettamente l’una all’altra
formando un eterodimero.

I dimeri di tubulina sono disposti in successione lineare lungo ogni protofilamento.

Dato che ogni unità dimerica contiene due componenti non identici, il
protofilamento è asimmetrico, con un’α-tubulina ad un’estremità ed una β-
tubulina all’altra.

Tutti i protofilamenti di un microtubulo hanno la stessa polarità e, di conseguenza,

l’intero polimero ha una polarità.

Una delle estremità del microtubulo è definita estremità più e termina con una fila di subunità di
β-tubulina.

L’estremità opposta è definita estremità meno e termina con una fila di subunità di α -tubulina.

La polarità strutturale dei microtubuli è un fattore importante nell’accrescimento di queste

strutture e nel determinare la loro capacità di partecipare ad attività meccaniche mirate.
PROTEINE ASSOCIATE AI MICROTUBULI

I microtubuli preparati da tessuti vivi generalmente contengono proteine accessorie, dette proteine associate ai
microtubuli (MAP).

Microscopia crioelettronica, che mostra la forma e posizione

sul reticolo dei microtubuli. Molte di queste MAP si legano a
più di un dimero di tubulina e tenendo unita la struttura
rendono il microtubulo più stabile. Questa immagine mostra
l’ampia varietà di forme e regioni di legame che possono
avere MAP diverse.

MICROTUBULI COME SUPPORTO STRUTTURALE E COME ORGANIZZATORI

I microtubuli sono abbastanza rigidi da resistere a forze di compressione o piegamento. Questa proprietà li rende
capaci di fornire un supporto meccanico. La distribuzione dei microtubuli citoplasmatici in una cellula contribuisce a
determinarne la forma.

Nelle cellule animali in coltura, i microtubuli si estendono radialmente verso la periferia del citoplasma a partire
dall’area intorno al nucleo, conferendo a queste cellule la tipica forma rotonda ed appiattita.

In una cellula di topo in coltura la posizione dei

microtubuli viene rivelata da anticorpi fluorescenti
antitubulina. È visibile l’estensione a raggiera dei
microtubuli a partire dalla regione perinucleare della
cellula. È possibile seguire i singoli microtubuli che si
curvano gradualmente, conformandosi alla forma
della cellula.

MICROTUBULI COME AGENTI DELLA MOTILITÀ INTRACELLULARE

Uno dei ruoli fondamentali del citoscheletro è quello del trasporto. E lo studio della mobilità intracellulare è attribuito
alle cellule nervose i cui movimenti intracellulari si basano su una disposizione altamente ordinata di microtubuli e di
altri filamenti citoscheletrici.
Il centro di produzione del neurone è il suo corpo cellulare, quella parte arrotondata della cellula che risiede
all’interno del midollo spinale. Quando vengono iniettati nel corpo cellulare amminoacidi marcati, essi vengono
incorporati in proteine che saranno a loro volta marcate; queste ultime si muovono all’interno dell’assone,
percorrendo gradualmente tutta la sua lunghezza. La maggior parte dei materiali, comprese le molecole dei
neurotrasmettitori, viene rinchiusa in vescicole membranose nel reticolo endoplasmatico e nel complesso del Golgi
presenti nel corpo cellulare e poi trasportata lungo l’assone. Anche il materiale non delimitato da membrana, come
l’RNA, i ribosomi e spesso gli elementi del citoscheletro, è trasportato lungo questa estesa espansione citoplasmatica.
I diversi materiali si muovono con velocità differenti.

Rappresentazione schematica di una cellula nervosa in cui

viene mostrato il movimento delle vescicole all’interno
dell’assone lungo i binari costituiti dai microtubuli. 

Le vescicole si muovono all’interno dell’assone in

entrambe le direzioni.

Le vescicole che contengono il materiale da trasportare

sono attaccate ai microtubuli mediante proteine che
formano legami crociati, tra cui le proteine motrici.

• Fotografia al microscopio elettronico a trasmissione di una

porzione dell’assone di un neurone in coltura, che mostra i numerosi
microtubuli paralleli che funzionano come binario per il trasporto
assonale.
I due organelli delimitati da membrana, mostrati in questa
microfotografia, sono stati osservati al microscopio ottico mentre si
muovevano lungo l’assone nel momento in cui la cellula nervosa è stata
fissata.

LE PROTEINE MOTRICI

Le proteine motrici della cellula convertono l’energia chimica (immagazzinata nell’ATP) in energia meccanica, che
viene usata per generare forze come si verifica quando una cellula muscolare si contrae, o per trasportare i carichi
cellulari legati alla proteina-motore.

I tipi di carichi trasportati da queste proteine comprendono particelle ribonucleoproteiche, vescicole, mitocondri,
lisosomi, cromosomi ed altri filamenti citoscheletrici.

Una singola cellula può contenere un centinaio di differenti proteine motrici, ognuna di esse presumibilmente
specializzata per il trasporto di un particolare tipo di carico (cargo), in una particolare regione della cellula.

suggerire la direzione alla proteina-motore.

Le proteine motrici possono essere raggruppate in tre grandi famiglie:

• Miosine che si muovono lungo i microfilamenti

• Chinesine che si muovono lungo i microtubuli
• Dineine che si muovono lungo i microtubuli

Particolarità: Non si conoscono proteine motrici che usano i filamenti intermedi come binari. Questo non è
sorprendente, considerando che i filamenti intermedi non sono polarizzati e non possono quindi provvedere a

CHINESINE

Esistono diverse chinesine.

La chinesina-1 è un tetramero, la struttura della molecola di chinesina-1, formata da due catene pesanti avvolte l’una
sull’altra a spirale nella regione dello stelo e da
due catene leggere associate alle terminazioni
globulari delle catene pesanti. Il genoma umano
codifica per tre differenti catene pesanti e quattro
diverse catene leggere per la chinesina-1. Le teste
che generano forza si legano al microtubulo e la
coda al materiale da trasportare. Con una massa
molecolare di circa 380 kDa, la chinesina è
considerevolmente più piccola delle altre proteine
motrici, miosina (miosina muscolare, 520 kDa) e
dineina (più di 1000 kDa).

Diagramma schematico del movimento di una molecola

di chinesina lungo un binario microtubulare. Nel
modello “hand-over-hand” qui illustrato le due teste
effettuano movimenti identici ma alternati. la testa della
catena pesante che trascina (gamba) si muove in avanti
di 16 nm, alternativamente sul lato destro e sul lato
sinistro dello stelo (corpo).

DINEINA CITOPLASMATICA

Ne esistono solo due.

La dineina citoplasmatica è una proteina enorme (di massa molecolare pari a circa 1,5 milioni di dalton), contiene due
catene pesanti ed un certo numero di catene leggere ed intermedie, più piccole, alla base della molecola. Ciascuna
catena pesante è formata da una grande testa globulare generante forza, un peduncolo contenente un sito di legame
per il microtubulo ed uno stelo.
 La dineina citoplasmatica è presente in tutto il regno animale, ma sembra
essere assente nelle piante superiori.

La dineina citoplasmatica svolge almeno die ruoli:

1) Agisce come agente generatore di forza nella disposizione del

fuso mitotico e nel movimento dei cromosomi durante la mitosi
2) Agisce come motore microtubulare diretto verso l’estremità
meno, che determina la posizione del centrosoma e del complesso del
Golgi ed il movimento di vescicole ed organuli nel citoplasma.

Nelle cellule nervose, la dineina è implicata nel movimento retrogrado

degli organuli membranosi e nel movimento anterogrado dei microtubuli. Nei fibroblasti ed in altre cellule non
neuronali, la dineina citoplasmatica è ritenuta responsabile del movimento degli organuli membranosi dalla periferia
verso il centro della cellula. I carichi mossi dalla dineina comprendono gli endosomi, i lisosomi, le vescicole derivanti
dal RE e dirette verso il complesso del Golgi, molecole di RNA ed il virus dell’HIV, che è trasportato al nucl eo di una
cellula infettata.

Rappresentazione schematica del movimento di due vescicole

nelle due direzioni opposte lungo lo stesso microtubulo, l’uno
dovuto al movimento anterogrado della chinesina verso
l’estremità più, l’altro al movimento retrogrado della dineina
citoplasmatica verso l’estremità meno del binario.

Ogni vescicola lega ambedue i tipi di proteine motrici, ma le

molecole di chinesina sono inattivate nella vescicola superiore
mentre quelle di dineina sono inattivate nella vescicola
inferiore. Ambedue le proteine motrici sono unite alla
membrana della vescicola da un intermediario: la chinesina
può essere legata alle vescicole da svariate proteine di membrana, integrali o periferiche, e la dineina da un complesso
proteico detto dinactina.

TRASPORTO DI VESCICOLE, CLUSTER VESCICOLO-TUBULARI (VTC) ED

ORGANULI, MEDIATO DA CHINESINA O DINEINA IN UNA CELLULA IN COLTURA
NON POLARIZZATA.
CENTRI DI ORGANIZZAZI ONE DEI MICROTUBULI (MTOC)

La funzione di un microtubulo all’interno di una cellula dipende dalla sua posizione. L’assemblaggio dei microtubuli a
partire dai dimeri di αβ-tubulina avviene in due fasi distinte: una fase lenta di nucleazione ed una fase più rapida di
allungamento. la nucleazione dei microtubuli avviene rapidamente all’interno della cellula in cui si realizza grazie a
diverse strutture specializzate dette centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC). Il MTOC più studiato è il
centrosoma. Il centrosoma è una struttura complessa che contiene due centrioli a forma di barilotto, circondati da un
materiale pericentriolare (PCM) amorfo ed elettron-denso.

I CENTRIOLI

I centrioli sono strutture cilindriche di circa 0,2 µm di diametro e di solito lunghi il doppio. Essi
contengono nove fibrille, regolarmente spaziate, ognuna delle quali appare formata, in
sezione trasversale, da tre microtubuli, indicati come tubuli A, B e C.

Solo il tubulo A è completo. I nove tubuli A sono collegati a un mozzo centrale con nove raggi,
denominati ruota di carro. I nuovi centrioli si formano, in genere, adiacenti e ad angolo rett
rispetto a centrioli preesistenti.

Fotografia al microscopio
otografia al microscopio elettronico a
elettronico a trasmissione che
trasmissione della sezione trasversale di
mostra due coppie di centrioli. Ogni
un centriolo, che mostra la disposizione
coppia è formata da un centriolo
a girandola delle nove fibrille
parentale, più lungo, ed un
periferiche, ciascuna delle quali è
centriolo figlio, più corto (freccia),
formata da un microtubulo completo e
quest’ultimo in allungamento
da due incompleti.
durante questa fase del ciclo
cellulare
Fotografia al microscopio a fluorescenza di cellule di mammifero in coltura, che
mostra il centrosoma (marcato in giallo da un anticorpo diretto contro una
proteina centrosomale) al centro di un’estesa fitta rete microtubulare.

Esperimento che dimostra il ruolo del centrosoma nell’iniziazione e nell’organizzazione del citoscheletro
microtubulare. I microtubuli di una cellula unama MKN-1 in coltura sono stati prima depolimerizzati attraverso
incubazione delle cellule con nocodazolo. Il riassemblaggio dei microtubuli è stato poi monitorato rimuovendo
l’agente chimico, fissando le cellule a tempi successivi e trattando le cellule fissate con anticorpi fluorescenti anti -
tubulina. Entro pochi minuti dalla rimozione delle condizioni inibenti, compaiono uno o due punti luminosi di
fluorescenza nel citoplasma di ciascuna cellula. Dopo 5 minuti, si osserva che i microtubuli iniziano a crescere tutti
dallo stesso punto della cellula: il centrosoma. In 15-30 minuti, il numero di filamenti marcati che si irradia da questi
punti aumenta rapidamente.

I microtubuli sono nucleati nel centrosoma e crescono alle estremità più, mentre le estremità meno rimangono
ancorate al centrosoma.
CORPI BASALI ED ALTRI MTOC

I centrosomi non sono gli unici MTOC nelle cellule. i microtubuli localizzati in un ciglio o in un flagello sono generati da
microtubuli organizzati in una struttura, detta corpo basale, posta alla base dell’organulo. I corpi basali hanno la stessa
struttura dei centrioli e di fatto possono essere convertiti gli uni negli altri.

MECCANISMI ALLA BASE DELLA DINAMICA DEI MICROTUBULI

Modello struttura che spiega come si allungano e accorciano i microtubuli, i quali dipendono dallo stato dei dimeri di
tubulina all’estremità più del microtubulo.

Quando un microtubulo è in accrescimento, l’estremità più, vista al microscopio elettronico, ha la forma di un foglietto
aperto al quale vengono aggiunti dimeri con GTP. Durante i periodi con rapido accrescimento del microtubulo, i dimeri
di tubulina vengono aggiunti più rapidamente di quanto il loro GTP possa essere idrolizzato. Si ritiene che la presenza
di un cappuccio di dimeri di tubulina-GTP all’estremità più dei protofilamenti favorisca l’aggiunta di altre subunità e
l’accrescimento del microtubulo. si pensa che i microtubuli con estremità aperte siano soggetti ad una reazione
spontanea che porta alla chiusura del tubulo. In questo modello, la chiusura del tubulo è accompagnata dall’idrolisi del
GTP legato, e questo genera subunità che contengono tubulina legata a GDP. Le subunità tubulina-GDP hanno una
differente conformazione rispetto ai loro precursori tubulina-GTP e sono meno adatte ad incastrarsi in un
protofilamento diritto. La tensione meccanica che ne risulta destabilizza il microtubulo. La tensione viene rilasciata
quando i protofilamenti curvano verso l’esterno dall’estremità più del tubulo e vanno incontro ad una
depolimerizzazione catastrofica.

-Fase 1: In un microtubulo in accrescimento, l’estremità

consiste in un foglietto aperto contenente subunità di tubulina-
GTP.

-Fase 2: Il tubulo ha cominciato a chiudersi, provocando l’idrolisi

del GTP legato.

-Fase 3: Il tubulo si è chiuso all’estremità, asciando soltanto

subunità di tubulina-GDP.

-Fase 4: La tensione risultante dalla presenza di subunità di

tubulina-GDP all’estremità del microtubulo viene rilasciata
quando i protofilamenti si curvano verso l’esterno del tubulo e
sono sottoposti ad un accorciamento “catastrofico”.
STRUTTURA E FUNZIONE DI CIGLIA E FALGELLI

Ciglia e flagelli sono sottili organuli simili a peli, a volte mobili, che sporgono dalla superficie di una gran varietà di
cellule eucariotiche.

CIGLIA

Molte cellule del corpo umano contengono un singolo ciglio non mobile:

Immagine di immunofluorescenza che mostra un singolo ciglio primario (verde) che

si proietta dalla superficie apicale di ogni cellula in una coltura di cellule dei tubuli
collettori del rene. Le giunzioni tra le cellule epiteliali sono mostrate in rosso

Ciglia in un embrione di topo in via di sviluppo visualizzate mediante microscopia

elettronica a scansione.

Ciuffi di ciglia mobili che rivestono la trachea.

Un ciglio può essere paragonato ad un remo, dato che muove la cellula in una direzione
perpendicolare a sé stesso. Nella fase di spinta, il ciglio è mantenuto in uno stato di rigidezza
e spinge contro il mezzo circostante. Nella fase di ritorno, il ciglio diventa flessibile, offrendo
poca resistenza al mezzo.
 Le ciglia tendono ad essere presenti in gran numero sulla superficie di
una cellula ed il loro battito, di solito, è coordinato.

Le ciglia sulla superficie di un protozoo battono secondo onde

metacronali, in cui le ciglia di una determinata fila sono nella stessa
fase del ciclo del battito, mentre quelle della fila adiacente si trovano
in una fase differente. FR, ciglia nella fase di ritorno; FA, ciglia nella
fase attiva.

Cellule epiteliali bronchiali umane in cui le ciglia sulla superficie luminale sono colorate
in rosso e i nuclei in blu.

L’epitelio cigliato che riveste le vie respiratorie spinge il muco ed i detriti in esso
intrappolati lontano dai polmoni.

I FLAGELLI

I flagelli sono presenti singolarmente o in coppia e mostrano differenti tipi

di battito (a forma d’onda), a seconda del tipo cellulare.

Ad esempio, l’alga unicellulare si

muove in avanti agitando i suoi due flagelli asimmetricamente. Questa stessa
alga unicellulare può anche spingersi indietro attraverso il mezzo, usando un
battito simmetrico che assomiglia a quello di uno spermatozoo. Il grado di
asimmetria nel battito dell’alga unicellulare è regolato dalla concentrazione
interna degli ioni calcio.

STRUTTURA DI CIGLIA E FLAGELLI

Tutta l’estroflessione del ciglio o del flagello è coperta da una membrana che è continua con la membrana plasmatica
della cellula. La parte centrale del ciglio, detta assonema, contiene un insieme di microtubuli che decorre
longitudinalmente all’interno dell’intero organulo. L’assonema di un ciglio o di un flagello mobile è formato da nove
coppie (o doppiette) periferiche di microtubuli, che circondano un paio di microtubuli separati, in posizione centrale.
Questa struttura dell’assonema, conosciuta come disposizione 9 + 2, è presente in tutti gli assonemi. Tutti i
 microtubuli dell’assonema hanno la stessa polarità: le loro estremità più sono all’apice dell’estroflessione e le
estremità meno alla base. Le coppie periferiche sono formate da un microtubulo completo, il tubulo A, ed uno
incompleto, il tubulo B, quest’ultimo formato da 10 o 11 protofilamenti invece che dagli usuali 13.

Sezione trasversale dell’assonema di uno spermatozoo. Si distinguono

le coppie periferiche costituite da un microtubulo completo ed uno
incompleto, mentre i due microtubuli centrali sono completi. I bracci
di dineina sono visualizzabili come proiezioni “frastagliate” dalla parete
del microtubulo completo.

Rappresentazione schematica
di un assonema di un protista
che mostra la struttura delle
fibre microtubulari, i due tipi di
bracci di dineina (i bracci
esterni a tre teste e quelli
interni a due teste), i legami di
nexina tra le doppiette
periferiche, la guaina centrale
che circonda i microtubuli
centrali ed i raggi che sporgono
dalle coppie esterne verso la
guaina centrale.

Vista longitudinale di un assonema.

Fotografia al microscopio Rappresentazione

elettronico di una sezione schematica di una coppia
longitudinale mediana della periferica flagellare in visione
regione diritta di un ciglio. longitudinale. I raggi
Sono visibili i raggi che emergono a gruppi di tre, che
uniscono la guaina centrale si ripetono (a 96 nm in
con il microtubulo A della questo caso) lungo il
coppia periferica. microtubulo. I bracci esterni
di dineina sono distanziati ad
intervalli di 24 nm.
Un ciglio o un flagello parte da un corpo basale la cui struttura è paragonabile al
centriolo. il ciglio che genera è chiamato ciglio primario.

CRESCITA MEDIANTE TRASPORTO INTRAFAGELLARE

Quando ciglia e flagelli si assemblano, la crescita è limitata alle loro estremità distali. Ciò richiede che le proteine
prodotte all’interno della cellula raggiungano la punta dei microtubuli dove appunto si verifica l’assemblaggio. I biologi
videnziarono il movimento di particelle nello spazio compreso tra le coppie periferiche e la circostante membrana
plasmatica e chiamarono questo movimento trasporto intraflagellare (intraflagellar transport, IFT).

Le particelle in movimento viste nel IFT sono complesse di 20 proteine, note come proteine IFT, che si assemblano in
un complesso proteico chiamato particella IFT. Queste particelle IFT si allineano quindi a formare disposizioni lineari
chiamate treni IFT, e i treni vengono spostati verso l’estremità del ciglio da un motore proteico di chinesina, la
chinesina-2, diretto verso l’estremità più dei microtubli. I treni IFT vengono quindi riportati nel corpo cellulare da un
complesso citoplasmatico di dineina. Le particelle IFT trasportano proteine come la tubulina, necessarie per la
costruzione delle ciglia, fino alla punta, per permetterne l’assemblaggio sui microtubuli; infatti, l’inibizione dell’IFT
impedisce la formazione di ciglia e flagelli. Le mutazioni nei geni che codificano per le proteine IFT sono state
strumenti importanti per testare la funzione delle ciglia nello sviluppo e nella fisiologia perché provocano la completa
perdita di ciglia.

Fotografia al microscopio elettronico a trasmissione della sezione longitudinale di un

flagello di Chlamydomonas, mostrante due file di particelle situate tra la coppia di
microtubuli esterni e la membrana plasmatica flagellare. Ciascuna fila di particelle,
con il suo carico costituito da proteine assonemali, è mossa lungo una doppietta
esterna di microtubuli da una proteina motrice: o la dineina citoplasmatica 2, se essa
si muove verso la base del flagello, o la chinesina-2, se la fila di particelle si muove
verso l’apice del flagello.
MECCANISMO DI LOCOMOZIONE CIGLIARE E FLAGELLARE

Le ciglia si muovono facendo scorrere le doppiette di microtubuli adiacenti l’una rispetto all’altra. Le braccia di dineina
fungono da ponti trasversali oscillanti che generano le forze necessarie per il movimento cigliare o flagellare.

Nell’assonema intatto, lo stelo di ciascuna molecola di dineina (cui sono associate

catene intermedie e catene leggere) è strettamente ancorato alla superficie esterna del
tubulo A, con le teste globulari ed i peduncoli proiettati verso il tubulo B della coppia
adiacente.

Nella fase 1, i bracci di dineina, ancorati lungo il tubulo A della coppia inferiore, si
attaccano ai siti di legame sul tubulo B della coppia superiore.

Nella fase 2, le molecole di dineina subiscono un cambiamento conformazionale, o

colpo di potenza, che causa lo scivolamento della coppia inferiore verso l’estremità
basale della coppia superiore.

Nella fase 3, i bracci di dineina si staccano dal tubulo B della coppia superiore.

Nella fase 4, i bracci si riattaccano alla coppia superiore, in modo che possa
ricominciare un altro ciclo.

La nexina, componente dell’N-DRC (complesso regolatorio nexina-dineina), forma un

ponte elastico che collega le coppie adiacenti. Questi ponti di nexina rivestono un ruolo
importante nel movimento cigliare/flagellare in quanto limitano l’estensione dello
scorrimento reciproco delle doppiette adiacenti. La resistenza allo scorrimento fornita dai
ponti di nexina causa una flessione dell’assonema in risposta alla forza di scorrimento.

Lo scorrimento su un lato dell’assonema si alterna con lo scorrimento sul lato opposto, in

modo tale che una parte del ciglio o del flagello si piega prima in una direzione e poi nella
direzione opposta.

Ciò richiede che, in un dato momento, i bracci di dineina su di un lato dell’assonema siano
attivi, mentre quelli sull’altro lato siano inattivi.

Come risultato di questa differenza nell’attività della dineina, le coppie sul lato interno
della curvatura si estendono oltre quelle sul lato opposto dell’assonema.

Quando il ciglio è dritto, tutte le coppie di microtubuli periferiche terminano allo stesso livello (al centro).

Il ciglio si curva quando le coppie del lato più interno della curva scorrono su quelle dell’altro lato (in alto e in basso).

I FILAMENTI INTERMEDI

Sono filamenti pieni e non ramificati, del diametro di circa 10-12 nm.

I filamenti intermedi sono fibre forti e flessibili, simili a corde, che provvedono alla resistenza meccanica delle cellule
soggette a stress fisici, inclusi i neuroni, le cellule muscolari e le cellule epiteliali che rivestono le cavità corporee.
Contrariamente ai microfilamenti e ai microtubuli, gli IF sono un gruppo di strutture chimicamente eterogenee le cui
proteine, nell’uomo, sono codificate da circa 70 geni diversi.
Le subunità polipeptidiche degli IF possono essere suddivise in cinque classi principali in base sia al tipo di cellula in cui
si trovano sia a criteri biochimici, genetici ed immunologici.

Gli IF si estendono attraverso il citoplasma di una ampia varietà di cellule animali e sono spesso interconnessi ad altri
tipi di filamenti citoscheletrici da sottili ed esili ponti trasversali formati dalla proteina fibrosa plectina. La plectina è
stata localizzata con anticorpi legati a particelle d’oro.

Sebbene i polipeptidi che costituiscono gli IF siano caratterizzati da differenti sequenze amminoacidiche, tutti
condividono un’organizzazione strutturale comune, che consente loro di formare filamenti apparentemente simili.

In particolare, i polipeptidi degli IF presentano un dominio centrale a α-elica, di forma bastoncellare, con lunghezza e
sequenza amminoacidica simili. Questo lungo dominio fibroso rende le subunità dei filamenti intermedi molto divers e
dalle subunità globulari di tubulina e actina dei microtubuli e dei microfilamenti.

1- Ciascun monomero è costituito da domini terminali (rosso o giallo) di forma

globulare separati da una lunga regione ad α-elica.

2- Coppie di monomeri si associano con orientamento parallelo, con le loro

estremità allineate a formare dimeri

3- A seconda del tipo di filamento intermedio, i dimeri possono essere composti

da monomeri identici (omodimeri) o diversi (eterodimeri). A loro volta, i dimeri
si associano in maniera antiparallela e sfalsata per formare tetrameri che si
pensa siano le subunità di base nell’assemblaggio dei filamenti intermedi.
4-otto tetrameri si associano lateralmente a formare una unità di lunghezza del
filamento intermedio

5-I lunghi filamenti intermedi si formano poi per associazione testa-coda di queste
unità di lunghezza

6- Una volta formati, i filamenti intermedi vanno incontro ad un processo di

rimodellamento dinamico che, si pensa, implichi l’intercalazione di unità di lunghezza
del filamento nel corpo di un filamento esistente (la struttura verde si intercala, mentre
quella rosa si dissocia)

ASSEMBLACCIO E DISASSEMBLAGGIO DEI FILAMENTI INTERMEDI

L’unità base di assemblaggio degli IF si pensa sia un tetramero bastoncellare formato da due dimeri che si accostano
lateralmente in modo sfalsato, con le estremità N- e C-terminali orientate in direzioni opposte.

TIPI DI FILAMENTI INTERMEDI E LE LORO FUNZIONI

I filamenti intermedi cheratinici costituiscono le principali proteine strutturali delle cellule epiteliali.

i filamenti intermedi si irradiano nella cellula e si ancorano sia alla

superficie esterna del nucleo sia alla superfice interna della
membrana plasmatica.

Le connessioni al nucleo sono realizzate mediante proyeine che

attraversano entrambe le membrane dell’involucro nucleare mentre
quelle alla membrana plasmatica mediante siti di adesione
specializzati, come i desmosomi e gli emidesmosomi.

Gli IF sono interconnessi ad entrambi gli altri elementi del

citoscheletro. Le connessioni con i microtubuli (MT) e i microfilamenti
(MF) sono dovute principalmnente ai membri della famiglia delle
planchine, come la proteina dimerica plectina.

Distribuzione di filamenti intermedi contenenti cheratina in cellule

epidermiche in coltura (cheratinociti). I filamenti formano un reticolo
simile ad una gabbia intorno al nucleo e si estendono anche alla
periferia della cellula.
ACTINA E MIOSINA

Acitina è stata indivuata per la prima volta negli anni 50 nelle cellule muscolari.

Le cellule sono capaci di una notevole motilità sia cellulare che intracellulare.

L’actina ha un ruolo importante nel determinare la forma delle cellule e nel fornire un supporto strutturale per diversi
tipi di estroflessioni cellulari.

L’actina favorisce la mobilità cellulare:

⁻ Cellule della cresta neurale di un embrione di vertebrato abbandonano il sistema nervoso in sviluppo e
migrano per tutto l’embrione, dando origine a formazioni diverse (cellule pigmentate dalla cute, denti e
cartilagine delle mascelle).
⁻ Legioni di leucociti perlustrano i tessuti del corpo alla ricerca di detriti e di microrganismi.
⁻ larghe espansioni delle cellule epiteliali ai bordi di una ferita agiscono come dispositivi mobili che aiutano a
tirare lo strato di cellule sopra l’area danneggiata, chiudendo la ferita.
⁻ il margine guida di un assone estende processi microscopici che esplorano il substrato e guidano la cellula
verso un bersaglio sinaptico.

L’actina è anche coinvolta nei processi di motilità intracellulari, come il movimento di vescicole, la fagocitosi e la
citocinesi.

STRUTTURA DELL’ACTINA

I filamenti di actina (microfilamenti) hanno un diametro di circa 8 nm e sono composti

dalle subunità globulari della proteina actina (i subdomini sono marcati con 1,2,3 e 4).

I termini “filamento di actina”, “microfilamento” e “F-actina” sono tutti sinonimi.

In base al tipo di cellula ed all’attività in cui è impegnata, i filamenti di actina possono

essere organizzati in sistemi altamente ordinati, in reticoli altamente ramificati o in fasci
strettamente compatti.

L’unione dei monomeri di actina avvengono in presenza di ATP e polimerizzano formando

un filamento flessibile ad elica.

I filamenti di actina hanno una polarità strutturale e tutte le subunità di un filamento di

actina sono orientate nella stessa direzione, l’intero microfilamento risulta avere una sua
polarità con le cosiddette point end e barbed end (estremità + e estremità -).

La polarità è molto importante perché nei filamenti del citoscheletro la polarità viene sfruttata per orientare
determinati spostamenti o fenomeni. (come avveniva nei microtubuli la cui polarità viene sfruttata dalle proteine
motore).
 - Fotografia al microscopio elettronico di una replica di un filamento di actina a doppia elica.

Come risultato dell’organizzazione delle subunità, un filamento di actina è essenzialmente una

struttura a elica a doppio filamenti, con due solchi che decorrono lungo tutta la sua lunghezza.

La barbed end è anche chiamata estremità più e la point end estremità meno del
filamento di actina. Questa definizione convenzionale è nata da una tecnica utilizzata
per identificare e decorare i filamenti di actina nella preparazione per la microscopia
elettronica.

Questo metodo ha sfruttato la capacità di un frammento proteolitico di miosina,

chiamato S1, il legare strettamente e “decorare” i filamenti di actina per tutta la loro
lunghezza. Quando i frammenti S1 sono legati all’actina si dispongono in modo ordinato
e con il medesimo orientamento formando complessi a punta di freccia, cosicché
un’estremità del microfilamento appare appuntita come la punta di una freccia (pointed
end), mentre l’altra mostra i barbigli della freccia (barbed end).

ASSEMBLAGGIO E DISASSEMBLAGGIO DEI MICROFILAMENTI

ASSEMBLAGGIO IN VITRO:
 tutte le info che abbiamo relative alla funzionalità delle fibre dell’actina
derivano da studi in vitro in soluzioni contenenti monomeri di actina-ATP.
Nel caso dei microtubuli la fase iniziale della formazione dei filamenti
(nucleazione) avviene lentamente in vitro, mentre la fase seguente di
allungamento del filamento avviene molto più rapidamente. La lenta fase di
nucleazione nella formazione del filamento può essere aggirata dall’aggiunta
di filamenti di actina preformati nella miscela di reazione.

ASSEMBLAGGIO/DISASSEMBLAGGIO IN VITRO:

gli eventi che avvengono in questa fase in vitro dei filamenti di actina dipendano
dalla concentrazione dei monomeri e dalla dinamica di allungamento delle
estremità del filamento.

Le estremità più e meno richiedono differenti concentrazioni minime di

monomeri di ATP-actina per l’allungamento, una condizione nota come
concentrazione critica. La concentrazione critica dell’estremità barbed è molto
più bassa di quella dell’estremità pointed, questo significa che l’estremità barbed
può continuare ad allungarsi a concentrazioni di ATP-actina inferiori rispetto
all’estremità pointed. Supponiamo di cominciare ad aggiungere filamenti di
actina preformati (seme) ad una soluzione di actina in presenza di ATP.

Finché la concentrazione dei monomeri di actina resta alta, le subunità

continueranno ad essere aggiunte ad entrambe le estremità del filamento.

Man mano che i monomeri nella miscela di reazione vengono aggiunti alle due estremità dei filamenti, la
concentrazione di actina-ATP libera continua a scendere, sino ad un punto in cui l’aggiunta netta di monomeri
continua all’estremità più, che ha una più alta affinità per l’actina-ATP, ma termina all’estremità meno, che ha una più
bassa affinità per l’actina-ATP.

Via via che l’allungamento del filamento procede, la concentrazione dei monomeri liberi scende ulteriormente. A
questo punto, i monomeri continuano ad essere aggiunti alle estremità più dei filamenti, ma una perdita netta di
subunità si verifica alla loro estremità meno. Quando la concentrazione di monomero libero diminuisce, si raggiunge
un punto in cui le due reazioni, alle estremità opposte dei filamenti, sono bilanciate, così che le lunghezze dei filamenti
e la concentrazione di monomeri liberi rimangono costanti.

Questo tipo di equilibrio tra due opposte attività è un esempio di stato stazionario e si verifica quando la
concentrazione dell’actina-ATP è approssimativamente 0,3 µM. Poiché allo stato stazionario, le subunità di actina-ATP
tendono ad aggiungersi all’estremità più del filamento e tendono ad essere rimosse dall’estremità meno di ciascun
filamento, la posizione relativa delle singole subunità all’interno di ciascun filamento è in continuo movimento, con un
flusso costante di subunità dalla barbed alla pointed end, un processo noto come “treadmilling”.

Sebbene i filamenti di actina possano generare forze da soli, la maggior parte dei processi che coinvolgono l’actina
richiedono l’attività di proteine motrici, in modo particolare quelle della superfamiglia delle miosine.
MIOSINA

L’actina utilizza la miosina.

La miosina è caratterizzata da due catene pesanti che si separano all’apice in due strutture globulari chiamate teste, il
corpo si arrotola in un superfilamento arrotolato ad elica, la corruzione tra la coda e la testa si chiama collo ed è lì che
sono legate varie catene di basso peso molecolare chiamate catene [Link] catene delle teste sono molto simili tra
le varie miosine mentre ciò che cambia è la struttura della coda. Sono le teste che si legano all?atp e si legano
all’actina per svolgere le varie funzioni.

Le miosine vengono generalmente divise in due ampi gruppi:

• le miosine convenzionali (o tipo II), che sono state identificate per la prima volta nel tessuto muscolare,
• le miosine non convenzionali, che sono suddivise, sulla base delle sequenze amminoacidiche, in almeno 17
classi differenti

L’uomo presenta circa 40 differenti miosine appartenenti ad almeno 12 classi, ciascuna con una presunta funzione
specializzata. Delle varie miosine, le molecole di tipo II sono le più conosciute.

MIOSINE CONVENZIONALI (TIPO II)

Le miosine della classe II rappresentano i principali motori della contrazione muscolare ma si trovano anche in molte
cellule non muscolari dove avranno funzioni particolari.

Il genoma umano codifica per 16 diverse catene pesanti di miosine II, 3 delle quali operano in cellule non muscolari.

Tutte le miosine II si muovono verso l’estremità più (barbed end) di un filamento di actina.

Tra le loro attività non muscolari, le miosine di tipo II sono necessarie per dividere la cellula in due durante la divisione
cellulare, per generare tensione alle adesioni focali, per la migrazione cellulare e sono coinvolte nel cambiamento di
direzione dei coni di crescita dei neuroni.

-struttura di miosina II

Ha un peso molecolare di 520000 dalton e ha una struttura

composta da due catene pesanti che si organizzano nelle due
porzioni globulari esterne (teste) le quali contengono il sito
catalitico della molecola (sito di legame ATP), contiene un paio
di colli dove sono legate le catene leggere e infine una singola
lunga coda a forma di bastoncino, formata dall’avvolgimento
delle porzioni ad alfa-elica delle due catene pesanti.
In sintesi: La molecola è costituita da una coppia di catene pesanti e due coppie di catene leggere. La coppia di catene
pesanti è costituita da una coda a forma di bastoncello, in cui le porzioni delle due catene polipeptidiche sono avvolte
l’una sull’altra a formare un superavvolgimento, e da un paio di teste globulari. Il trattamento blando con una proteasi
taglia la molecola nel punto di congiunzione tra collo e coda, producendo il frammento S1.

-Fotografia al microscopio elettronico a trasmissione di molecole di miosina dopo colorazione

negativa. Le due teste e la coda delle molecole sono chiaramente visibili.

Saggio di motilità in vitro per la miosina

Questo saggio ha permesso di conoscere una particolarità funzionale dell’accoppiata actina-

miosina. le teste di miosina sono legate ad un vetrino coprioggetto ricoperto di silicone, che
viene poi incubato con una preparazione di filamenti di actina. Dopo di che sono stati lasciati
in incubazione e successivamente sono state prese immagini a tempi differenti, le quali sono
state sovrapposte.

Risultati dell’esperimento hanno dato vita a queste immagini. In queste sono state misurate le
migrazioni delle estremità a punta din freccia delle varie actine. Le linee tratteggiate con le
estremità a punta di freccia mostrano il movimento dei filamenti di actina sulle teste di miosina
durante il breve periodo tra le esposizioni.

Le molecole di miosina II si assemblano con la coda in modo tale che le estremità delle code siano rivolte verso il
centro del filamento e le teste globulari siano dirette verso le estremità.

Fotografia al microscopio elettronico a trasmissione di un

filamento bipolare di miosina formatosi in vitro. Ad entrambe le
estremità sono visibili le teste del filamento, che lasciano un
segmento liscio al centro.
MIOSINE NON CONVENZIONALI

Nessuna delle miosine non convenzionali è in grado di formare filamenti, ma tutte sembrano funzionare
principalmente come singole molecole proteiche.

Le miosine non convenzionali meglio studiate sono capaci di muoversi in modo processivo (senza staccarsi) lungo i
filamenti di actina in modo analogo a quello con cui le molecole di chinesina e dineina citoplasmatica si muovono
lungo i microtubuli.

 micrografie ottenute da un microscopio a forza atomica, che catturano una singola

molecola mentre si muove rapidamente lungo un filamento di actina in vitro in presenza
di ATP. Ad un centro punto si vede comparire la miosina che scorre lungo la superficie
dell’actina. Nel continuo dell’esperimento vengono aggiunti degli ostacoli e la miosina
riesce a superarli slittando sulla fibra di actina senza mai staccarsi.

Il movimento hand over hand di una singola miosina V (non

convenzionali) che attraverso l’attacco delle sue teste fa dei
passetti e riesce a superare gli ostacoli posti nel tragitto (in
questo caso sono state messe le molecole proteiche di
streptavidina). Il movimento è dall’estremità – all’estremità +.

Grazie ai suoi lunghi colli, che durante il movimento agiscono come bracci oscillanti (o
leve), la miosina V può compiere passi molto lunghi.

L’elica dell’actina si ripete ogni 13 subunità circa (36 nm), che è approsimativamente la
misura del passo di una molecola di miosina V.

Per compiere questo tipo di movimento ogni testa della miosina deve muoversi di una
distanza pari a 72 nm, ossia il doppio della distanza tra due successivi siti di legame sul
filamento di actina.

 Rappresentazione schematica di una molecola di miosina V dimerica completa,

incluse le sue numerose catene leggere, che presenta entrambe le teste legate al
filamento di actina ed il dominio della coda legato ad una vescicola. Rab27a e
melanofilina fungono da adattatori che legano la terminazione globulare della coda alla
membrana della vescicola. Il lungo collo della miosina V lega sei catene leggere.

Diverse miosine non convenzionali (comprese le miosine I, V e VI) sono associate a diversi tipi di vescicole ed organuli
citoplasmatici. In alcuni casi queste miosine possono agire come funi per gli organuli ed in altri casi come trasportatori
degli stessi. Si è visto che alcune vescicole contengono motori microtubulari (chinesine e/o dineina citoplasmatica) e
motori basati sui microfilamenti (miosine non convenzionali) e, di fatto, i due tipi di motori possono essere legati
fisicamente l’uno all’altro. Il movimento di vescicole e di altri trasportatori membranosi su lunghe distanze, all’interno
delle cellule, si svolge sui microtubuli, come già è stato descritto. Tuttavia, si ritiene che, quando si avvicinano alla fine
del microtubulo, queste vescicole membranose passino sui binari formati da microfilamenti per il movimento locale,
mediato dalle miosine, attraverso la periferia cellulare ricca di actina.

Cellule capellute dell’orecchio interno: (sfruttate molto per studiare la struttura e la funzione delle fibre di actina e
delle miosine non convenzionali)
Le cellule capellute sono così chiamate per il fascio di stereociglia rigide, simili a
peli, che sporgono dalla superficie apicale della cellula verso il fluido che riempie
la cavità dell’orecchio interno. Lo spostamento delle stereociglia per stimoli
meccanici porta all’apertura di canali del Ca2+ nella membrana plasmatica ed alla
succesiva generazione di impulsi nervosi che noi percepiamo come suono.
le stereociglia non contengono microtubuli, ma ogni
stereociglio è sostenuto da un fascio di filamenti di
<- actina paralleli.

(cellula capelluta del vestibolo dell’orecchoo interno di ratto)

Incorporazione delle subunità di actina marcate con la GFP ( proteina utilizzata per studiare
fenomeni dinamici) alla barbed end di ciascun filamento.
Le punte delle stereociglia appaiono verdi per l’incorporazione di monomeri di GFP-actina
alle loro barbed end. Le stereociglia più lunghe contengono una colonna più lunga di
subunità marcate con GFP, il che riflette un’incorporazione più rapida dei monomeri di
actina. Le stereociglia appaiono rosse per la marcatura con falloidina marcata con
rodamina, che si lega ai filamenti di actina.
 (cellula capelluta dell’orecchio interno di una rana toro)
Fotografia al microscopio a fluorescenza di una cellula capelluta dell’orecchio
interno di una rana toro. La localizzazione della miosina VIIa è indicata in
verde. Le bande arancioni in prossimità della base delle stereociglia (dovute
alla sovrapposizione del rosso e del verde) indicano una concentrazione di
miosina VIIa.

La miosina XVa (in verde) è localizzata alla punta delle sterociglia di una cellula capelluta
dell’orecchio di ratto.

 Fotografia al microscopio elettronico a scansione delle cellule

capellute della coclea di un topo di controllo. Le stereociglia sono disposte in
file a forma di V.

 Una micrografia corrispondente delle cellule capellute di un topo

con mutazioni nel gene che codifica per la miosina VI. Le stereociglia delle
cellule capellute hanno una disposizione disordinata.

La miosina VI, un trasportatore processivo di organuli nel citoplasma di molte cellule, ha la peculiarità di muoversi in
“direzione inversa”, cioè verso la pointed end (meno) di un filamento di actina.

Inoltre è stato scopert che la miosina VI interviene in diversi processi di traffico di membrana, compresa l’endocitosi
mediata da clatrina, il movimento delle vescicole non rivestite verso gli endosomi precoci, il mantenimento della
morfologia del Golgi e l’autofagia. Nelle stereociglia e nei microvilli, la miosina VI funziona come un legante di actina
necessario per il mantenimento della normale morfologia cellulare. Mutazioni della miosina VI sono la causa di diverse
malattie ereditarie.

ORGANIZZAZIONE DEL MUSCOLO E CONTRAZIONE

Actina e miosina sono coinvolte in un importante processo che è la contrazione del muscolo scheletrico (infatti l’actina
è stata scoperta analizzando una cellula del muscolo scheletrico).

I muscoli scheletrici devono il proprio nome al fatto che la maggior parte di essi è ancorata alle ossa di cui
determinano il movimento.
Una singola cellula muscolare di forma cilindrica ha un diametro variabile da 10 a 100 µm, una lunghezza oltre i 100
mm e contiene centinaia di nuclei. Per queste proprietà, una cellula muscolare scheletrica è più correttamente
chiamata fibra muscolare. Le fibre muscolari hanno più nuclei perché ogni fibra è prodotta dalla fusione di un grande
numero di mioblasti mononucleati (precursori delle cellule muscolari) nell’embrione.

ORGANIZZAZIONE DEL SARCOMERO

Le cellule del muscolo scheletrico hanno probabilmente la struttura più altamente ordinata di qualsiasi altra cellula del
corpo. Una sezione longitudinale di una fibra muscolare. Una fibra muscolare è come un cavo formato da centinaia di
filamenti cilindrici più sottili , detti miofibrille. Ogni miofibrilla consiste di
una successione lineare ripetitiva di unità contrattili, dette sarcomeri.
Ciascun sarcomero, a sua volta, mostra un caratteristico sistema di bande,
che conferisce alla fibra muscolare un aspetto rigato o striato. L’esame di
fibre muscolari contrastate al microscopio elettronico mostra che la
bandeggiatura deriva da una parziale sovrapposizione di due distinti tipi di
filamenti, indicati come filamenti sottili e filamenti spessi . Ogni sarcomero
si estende da una linea Z alla successiva e contiene diverse bande scure e
chiare. Un sarcomero presenta una coppia di bande I, chiare (poco
elettrondense), localizzate ai margini esterni; una banda A, scura
(elettrondensa), situata tra le bande esterne I, ed una zona H chiara,
collocata al centro della banda A. Una linea M, più contrastata, si trova al
centro della zona H. La banda I contiene solamente filamenti sottili, la zona
H solamente filamenti spessi e le due parti della banda A su entrambi i lati
della zona H rappresentano la regione di sovrapposizione e contengono
entrambi i tipi di filamenti.
INTERAZIONI TRA LE CELLULE E IL LORO AMBIENTE

Il legame che si crea tra l’esterno e l’interno crea dei punti di legame importanti: adesioni focali e gli emidesmosomi.

ADESIONI FOCALI

Le adesioni focali sono osservate più comunemente in

cellule che crescono in vitro, sebbene tipi analoghi di
contatti adesivi si trovino in alcuni tessuti, come
muscoli e tendini.

Le adesioni focali sono capaci di creare o rispondere a

sollecitazioni meccaniche.

EMIDESMOSOMI

si trovano nei punti di contatto tra le cellule epiteliali e la

membrana basale (è considerata un esempio ben organizzato di
matrice extracellulare). Gli emidesmosomi contengono una placca
densa sulla superficie interna della membrana plasmatica e
filamenti citoplasmatici che si estendono verso l’interno della
cellula.

Gli emidesmosomi contengono una placca densa sulla superficie

interna della membrana plasmatica e filamenti citoplasmatici che
si estendono verso l’interno della cellula.

i filamenti degli emidesmosomi sono più spessi e sono formati

dalla proteina cheratina. I filamenti contenenti cheratina sono
classificati come filamenti intermedi e hanno principalmente funzioni di sostegno. I filamenti di cheratina di un
emidesmosoma sono legati alla matrice extracellulare mediante integrine transmembrana, tra cui α6β4 .

Le molecole di integrina α6β4 delle cellule epidermiche sono collegate ai filamenti intermedi citoplasmatici da una
proteina chiamata plectina, che è presente nelle placche dense, e alla membrana basale da filamenti di ancoraggio
formati da un tipo particolare di laminina. Negli emidesmosomi è presente anche una seconda proteina
transmembrana (BP180). Le fibre di collagene fanno parte del derma sottostante.

Oltre alle Integrine esistono altre proteine che possono permettere un contatto con l'esterno e queste proteine sono
divise in quattro grandi categorie:

• Le selectine che possono essere di diverso tipo e vengono chiamate in modo diverso a seconda della
localizzazione, sono tutte transmembrana, sono formate dalla coda citoplasmatica, dalla porzione
transmembrana e da un dominio esterno di lunghezza variabile formato dai domini strutturati che terminano
tutti con questa porzione che viene chiamata lectina simile. Tutte queste selectine si legano ad uno stesso
ligando carboidratico comune e sono utilizzati interazioni transitorie tra leucociti circolanti e le pareti.
 • La seconda famiglia è rappresentata dalle proteine L1, anche queste proteine sono transmembrana; sono
caratterizzate da un dominio immunoglobulinico terminale che è quello con cui crea un legame con la
proteina L1 della cellula adiacente.

• La terza famiglia invece proprio rappresentata dalla superfamiglia delle quindi tutte quelle proteine
transmembrane che sono proprio coinvolte nel sistema immunitario. La maggior parte dei membri di IgSF è
coinvolta in diversi aspetti della funzione immunitaria, ma alcune di queste proteine mediano l’adesione
cellula-cellula indipendente da ioni calcio. La maggior parte delle molecole di adesione cellulare del tipo IgSF
media le interazioni specifiche dei linfociti con cellule necessarie per la risposta immunitaria. Tuttavia, alcuni
membri IgSF, come la VCAM (vascular cell-adhesion molecule), la NCAM (neural cell-adhesion molecule) ed
L1 (anche detto L1CAM), mediano l’adesione fra cellule non appartenenti al sistema immunitario.

• Poi c’è la grande famiglia delle caderine le quali sono proprio proteine transmembrana che sono sfruttate
dalle cellule per riconoscersi: per cui cellule dello stesso organo che si riconoscono e quindi possono svolgere
il processo di maturazione. Si legano in maniera differente, alcune si legano con un grado di sovrapposizione
diverso ed è tipico delle caderine e anche della posizione in cui si trovano quindi possono attaccarsi
sovrapponendosi in maniera variabile.

MOLECOLE DI ADESIONE CELLULARE

uno dei casi in cui vengono reclutate è il processo di infiammazione il processo di infiammazione è un processo che
avviene normalmente quando entra in un tessuto un patogeno, ad esempio, un batterio e come difesa le cellule del
sistema immunitario (es. i globuli bianchi) devono essere chiamati in quel sito per eliminare il patogeno.

I globuli bianchi circolano sfruttando queste molecole d’adesione:

RUOLO DELL’ADESIONE CELLULARE NELL’INFIAMMAZIONE

I diversi stadi del

movimento dei
neutrofili dal
circolo sanguigno
durante
l’infiammazione
acuta in cui i
globuli bianchi si
devono mettere
in azione.

Il primo stadio inizia quando le pareti delle venule si attivano in risposta a “segnali” chimici provenienti dai vicini
tessuti danneggiati. Le cellule endoteliali che rivestono queste venule diventano più adesive per i neutrofili circolanti,
un tipo di leucociti specializzati nella fagocitosi, che svolgono un attacco rapido e non specifico verso i patogeni
invasori. Quest’aumentata adesione è mediata dall’espressione temporanea delle selectine P ed E sulla superficie
delle cellule endoteliali attivate nella zona danneggiata. Quando i neutrofili interagiscono con le selectine, essi
formano delle adesioni transienti, che rallentano notevolmente il loro movimento attraverso il vaso. In questo stadio, i
neutrofili sembrano “rotolare” lentamente lungo la parete del vaso. Quando i neutrofili interagiscono con l’endotelio
delle venule infiammate, si verificano delle interazioni tra altre molecole esposte sulla superficie dei due tipi di cellule.
Una delle molecole presenti sulla superficie delle cellule endoteliali è il fosfolipide chiamato fattore attivante le
piastrine (PAF). PAF si lega ad un recettore sulla superficie del neutrofilo, inviando un segnale all’interno del neutrofilo
che porta a un aumento nell’attività di legame di alcune integrine già presenti sulla superficie dei neutrofili. Le
integrine attivate si legano con alta affinità alle molecole IgSF (es., ICAM-1 e VCAM-1) sulla superficie delle cellule
endoteliali e, di conseguenza, i neutrofili fermano il loro rotolamento e aderiscono fermamente alla parete dei vas i. In
seguito, i neutrofili adesi si deformano e si appiattiscono passando tra cellule endoteliali adiacenti (diapedesi) nel
tessuto danneggiato I neutrofili nella fase di invasione sembrano capaci di disassemblare le giunzioni aderenti (come
discusso in seguito in questo paragrafo) che formano la principale barriera tra le cellule della parete dei vasi. Questa
cascata di eventi, che coinvolge tipi diversi di molecole dell’adesione cellulare, garantisce che l’adesione delle cellule
del sangue alla parete dei vasi e la successiva penetrazione, si verifichino solamente in quei siti dove è necessaria
l’invasione dei leucociti.

in questo processo vengono coinvolte in maniera transitoria le selectine(perché sono le prime che vengono espresse
che favoriscono l’attracco) e poi queste proteine della famiglia delle immunoglobuline le bloccano e quindi
favoriscono poi che il processo continui.

L’infiammazione può anche essere innescata inopportunamente. Ad esempio, si può verificare un danno ai tessut i del
cuore o dell’encefalo, quando il flusso sanguigno in questi organi è bloccato durante un infarto cardiaco o un ictus.
Quando nell’organo viene ristabilito il flusso sanguigno, i leucociti circolanti possono attaccare il tessuto danneggiato
causando una condizione nota come danno da riperfusione. Molte ricerche si sono concentrate sul trovare le risposte
a diverse domande relative a queste condizioni e le risposte a queste domande sull’infiammazione portano
l’attenzione su tre tipi di molecole di adesione cellulare: selectine, integrine e molecole della superfamiglia delle
immunoglobuline (IgSF).

Il cancro è una malattia in cui le cellule eludono i meccanismi di controllo della crescita normale e proliferano in modo
non regolato. Se le cellule maligne rimangono compatte in una singola massa tumorale, i tumori possono essere
facilmente curati chirurgicamente mediante rimozione del tessuto malato. La maggior parte dei tumori maligni,
tuttavia, produce cellule che sono in grado di lasciare la massa tumorale primaria ed entrare nel circolo sanguigno o
linfatico, iniziando la crescita di tumori secondari in altre parti del corpo questa diffusione di un tumore
nell’organismo è chiamata metastasi.

Si pensa che le cellule delle metastasi abbiano delle speciali proprietà nella loro superficie cellulare, che non sono
presenti nella maggior parte delle altre cellule del tumore. Ad esempio:

1) Le cellule delle metastasi devono essere meno adesive delle altre cellule per liberarsi dalla massa tumorale.
2) Le cellule delle metastasi devono essere in grado di penetrare numerose barriere, come le matrici extracellulari
del tessuto connettivo circostante e i vasi sanguigni che le trasportano in siti lontani.
3) Le cellule delle metastasi devono essere in grado di invadere i tessuti normali e sopravvivere per formare colonie
secondarie.

GIUNZIONI ADERENTI E DESMOSOMI

Le caderine partecipano anche alla formazione di giunzioni intercellulari specializzate, chiamat e giunzioni aderenti e
desmosomi.

immagine grafica di una cellula epiteliale che poggia sulla matrice

extracellulare. l complesso è costituito da una giunzione stretta o giunzione
occludente (zonula occludens), da una giunzione aderente (zonula
adherens) e da un desmosoma (macula adherens). Altri desmosomi e
giunzioni comunicanti sono localizzati più profondamente lungo le superfici
laterali delle cellule. Le giunzioni strette e quelle aderenti circondano la
cellula, mentre i desmosomi e le giunzioni comunicanti sono ristretti a
particolari siti tra le cellule adiacenti. Gli emidesmosomi sono mostrati alla
superficie basale della cellula.

Fotografia al microscopio elettronico di un complesso giunzionale fra due cellule

epiteliali delle vie respiratorie di ratto. (GO, giunzione stretta o occludente; GA,
giunzione aderente; D, desmosoma).
 In una giunzione aderente, le cellule sono tenute insieme da
legami calcio-dipendenti che si stabiliscono tra i domini
extracellulari delle molecole di caderina che fanno da ponte
attraverso lo spazio di 30 nm tra cellule adiacenti. Il dominio
citoplasmatico di ciascuna molecola di caderina è collegato
ai filamenti di actina del citoscheletro mediante proteine di
connessione, fra cui β-catenine, α-catenine e varie proteine
che legano l’actina.

L’altro tipo di contatto è il desmosoma (o macula adherens) sono giunzioni adesive a forma di disco con un diametro
di circa 1 µm presenti in diversi tessuti. Sono Caderine specializzate, chiamate desmogleine e desmocolline, instaurano
legami nello spazio extracellulare. Nel citoplasma le caderine desmosomiali legano indirettamente tramite proteine di
contatto i filamenti intermedi.

I desmosomi sono particolarmente abbondanti nei tessuti soggetti a stress meccanici, come il muscolo cardiaco e gli
strati epiteliali della cute e della cervice uterina.

I filamenti intermedi sono legati ai domini citoplasmatici delle caderine

desmosomiali da altre proteine.

GIUNZIONI STRETTE: BARRIERA ALLO SPAZIO EXTRACELLULARE

Le connessioni con le cellule vicine possono avvenire anche tramite le giunzioni strette e le giunzioni comunicanti.

Le giunzioni strette sono dei punti di contatto in cui le membrane si attaccano l'una con l'altra in maniera s tretta e
sono presenti fra cellule epiteliali vicine.

Fotografia al microscopio elettronico di una sezione attraverso la regione

apicale di due cellule epiteliali affiancate; si può notare che le membrane
plasmatiche delle due cellule sono associate in punti intermittenti
all’interno della giunzione stretta. Il riquadro mostra la struttura della
giunzione stretta ad un maggiore ingrandimento.
 Un modello di giunzione stretta che mostra i punti di contatto
intermittenti fra le proteine integrali di due membrane adiacenti.
Ciascuno di questi siti di contatto si estende come una doppia fila di
proteine all’interno delle membrane, formando una barriera che blocca il
passaggio dei soluti all’interno dello spazio fra le due cellule.

GIUNZIONE COMUNICANTE

Le giunzioni comunicanti (gap junctions) sono siti specializzati per la comunicazione intercellulare presenti fra cellule
animali. (vedere comunicazione cellula-cellula)

Immagini al microscopio elettronico rivelano che le giunzioni comunicanti sono punti in cui le membrane plasmatiche
di cellule adiacenti si avvicinano strettamente fra loro (fino a circa 3 nm), ma non prendono diretto contatto. Infatti, lo
spazio fra le cellule è riempito da filamenti molto sottili che sono in realtà delle “condutture” molecolari che
attraversano le membrane plasmatiche adiacenti e si aprono nel
citoplasma delle due cellule vicine. Le giunzioni comunicanti hanno una
semplice composizione molecolare:
sono composte interamente da una
proteina integrale di membrana
chiamata connessina. Le connessine
sono raggruppate nella membrana
plasmatica a formare un complesso
costituito da più subunità, detto
connessone, che attraversa
completamente la membrana. Ciascun
connessone è composto da sei subunità di connessina organizzate intorno
ad un’apertura centrale, o annulus, di circa 1,5 nm di diametro alla sua
superficie extracellulare. Durante la formazione delle giunzioni comunicanti, i connessoni delle membrane
plasmatiche di cellule adiacenti si legano fra loro mediante estese interazioni non covalenti fra i domini extracellulari
delle subunità di connessina. na volta allineati, i connessoni delle membrane plasmatiche adiacenti formano dei canali
intercellulari completi che collegano il citoplasma di una cellula con il citoplasma della cellula vicina.
GLI ACIDI NUCLEICI

Gli acidi nucleici hanno come funzioni principali l’archiviazione e la trasmissione dell’informazione genetica, ma
possono avere anche ruoli strutturali e catalitici. Negli organismi viventi sono presenti due tipi di acidi nucleici: l’acido
desossiribonucleico (DNA) e l’acido ribonucleico (RNA).

Il DNA costituisce il materiale genetico di tutti gli organismi cellulari; è una macromolecola
altamente conservata, è uguale in tutte le forme viventi .

Le informazioni sono conservate nel DNA (nella doppia elica), le info del DNA sono copiate in RNA d infine le
informazioni nell’RNA guidano le sintesi delle proteine.

Gli acidi nucleici sono macromolecole

biologiche costituite da lunghe catene
(filamenti) di monomeri chiamati nucleotidi.
Ogni nucleotide è costituito da tre parti:uno
zucchero a cinque atomi di carbonio, una
base azotata e un gruppo fosfato.

Le pirimidine sono molecole più piccole, costituite da un solo

anello; le purine sono più grandi e costituite da due anelli.

Le purine possono essere adenina e guanina e le due

pirimidine possono essere citosina, uracile e timina.

Lo zucchero ci dice quale è l’acido nucleico che stiamo analizzando, se OH e c’è il ribosio ci troveremo di fronte ad un
RNA, e invece se come zucchero abbiamo il desossiribosio avremo un DNA.
Il legame tra azoto e carbonio è legame covalente.

Le catene laterali sono formate dagli zuccheri che

prendono contatto con i gruppi fosfato e si crea
quello che viene chiamato legame
fosfodiesterico.

Un'altra differenza tra queste due

macromolecole è la tipologia di fasi che vengono
impiegate. Infatti, il DNA utilizza la citosina,
l’adenina, la guanina e la timina, l’RNA utilizza la
citosina, l’adenina, la guanina e l’uracile.
 Caratteristica della doppia elica è la direzione destrorsa (o
destrogira) = rotazione completa.

Ogni giro completo della doppia elica è composto da poco più

di dieci coppie di basi.

Lo spazio tra la doppia elica può essere coperto solo da delle

base combinate in un modo specifico.

L’adenina si lega sempre e solo con la timina e la guanina si lega

sempre e solo con la citosina e viceversa.

Questo legame obbligatorio determina una sequenza specifica che

si dice complementare.
NATURA DEL GENE E DEL GENOMA

La scienza della genetica ebbe origine intorno al 1860 con il lavoro di Gregor Mendel, un frate dell’abbazia di St.
Thomas, nell’attuale Repubblica Ceca. Il laboratorio di Mendel era un piccolo lotto di terreno appartenente al
monastero. Non sappiamo esattamente che cosa abbia motivato Mendel ad iniziare i suoi studi, ma evidentemente il
piano sperimentale che aveva in mente era molto chiaro e prevedeva una serie di accoppiamenti, o meglio, di incroci
tra piante di piselli con caratteri ereditari differenti con l’obiettivo di individuare il modo in cui tali caratteri venivan o
trasmessi alla discendenza. Mendel scelse il pisello odoroso per vari motivi pratici, non ultimo la possibilità di
acquistare un’ampia varietà di semi, che avrebbero prodotto piante con caratteristiche distinte. Mendel concentrò
l’attenzione su sette caratteri chiaramente definibili, come l’altezza della pianta e il colore del fiore, ciascuno dei qua-li
si presentava in due forme alternative, chiaramente identificabili. Mendel incrociò le piante per varie generazioni e
contò il numero di esemplari ottenuti con le diverse caratteristiche. Dopo diversi anni di ricerche, Mendel trasse le
seguenti conclusioni, qui riportate utilizzando la terminologia della genetica moderna:

1. I caratteri delle piante sono determinati da fattori (o unità) ereditari, quelli che più tardi vennero definiti geni.
Una singola pianta possiede due copie di ciascuno dei geni responsabili dell’espressione e della trasmissione
di un dato carattere; di queste copie, che tra di loro possono essere identiche o non, una è ereditata da un
genitore e l’altra dall’altro. Le diverse forme in cui si può trovare un singolo gene vennero definite in seguito
come alleli. Per ognuno dei sette caratteri studiati, uno dei due alleli è dominante sull’altro. Quando entrambi
sono presenti insieme nella stessa pianta, l’allele dominante maschera l’altro, che viene definito recessivo.
2. Ogni cellula riproduttiva (o gamete) generata da una pianta contiene solo una copia di un gene per ogni
carattere. Quindi, per un dato carattere, un gamete può presentare l’allele recessivo o quello dominante, ma
non entrambi. Ogni pianta origina dall’unione di un gamete maschile con un gamete femminile. Di
conseguenza, uno degli alleli che determina ciascun carattere in una pianta viene ereditato dal genitore
femminile, mentre l’altro allele viene ereditato dal genitore maschile.
3. I due alleli che determinano un carattere si trovano insieme durante l’intera vita di una singola pianta e
vengono separati (o segregati) l’uno dall’altro durante la formazione dei gameti. (legge della segregazione)
4. Il modo in cui una coppia di alleli per un determinato carattere si divide nei gameti, non ha alcun effetto sulla
segregazione degli alleli per un altro carattere. Un determinato gamete, per esempio, può ricevere un gene
paterno per il colore del seme e un gene materno per la forma del seme. (legge dell’assorbimento
indipendente)

SCOPERTA DEI CROMOSOMI

Le osservazioni sulla divisione cellulare condotte dal biologo tedesco Walther Flemming intorno al 1880 rivelarono che
i componenti citoplasmatici erano trasferiti in una o nell’altra delle cellule figlie in modo casuale, a seconda del piano
in cui compariva il solco di divisione cellulare. Durante la divisione cellulare, il contenuto nucleare si organizzava in
“filamenti” resi visibili dalla colorazione con coloranti basici, che per questo vennero chiamati cromosomi, ossia “corpi
colorati” (dal greco chroma, cioè colore, e soma, corpo).

Osservazioni sulle uova di riccio di mare fecondate da due spermatozoi (polispermia) è caratterizzata da divisioni
cellulari alterate e da morte prematura dell’embrione. Il secondo spermatozoo fornisce una serie di cromosomi in più
e un ulteriore centriolo. La presenza di questi componenti aggiuntivi porta a divisioni cellulari anormali nell’embrione,
in seguito alle quali le cellule figlie ricevono un numero di cromosomi variabile.

L’osservazione si concluse con:

il processo ordinato che conduce allo sviluppo normale “dipende da una specifica combinazione di cromosomi e
questo può significare solamente che i singoli cromosomi devono avere qualità differenti”.

Questa era la prima prova di differenze qualitative tra cromosomi.

• Nel 1883 il biologo belga Edouard van Beneden notò che le cellule somatiche di Ascaris avevano quattro
grandi cromosomi, ma che i nuclei maschile e femminile presenti nell’uovo appena dopo la fecondazione
(prima che i due nuclei si uniscano l’uno con l’altro) avevano solo due cromosomi ciascuno.
• All’incirca nello stesso periodo, venne descritto il processo della meiosi: nel 1887 il biologo tedesco August
Weismann suggerì che la meiosi includesse una “divisione riduzionale”, durante la quale il numero dei
cromosomi veniva dimezzato prima della formazione dei gameti. Se questo tipo di divisione riduzionale non
avvenisse ed ogni gamete contenesse lo stesso numero di cromosomi della cellula adulta, allora l’unione di
due gameti raddoppierebbe il numero di cromosomi nelle cellule della progenie. Il numero di cromosomi
raddoppierebbe ad ogni generazione, cosa che ovviamente non avviene e non può avvenire.

CROMOSOMI COME PORTATORI DELL’INFORMAZIONE GENETICA

La riscoperta del lavoro di Mendel e la sua conferma ebbero un’influenza immediata sulla ricerca in biologia cellulare.

Nel 1903, Walter Sutton, un giovane laureato della Columbia University, pubblicò un articolo nel quale asseriva che i
cromosomi fossero i portatori fisici dei caratteri genetici di Mendel. Sutton studiò la formazione degli spermatozoi
nella cavalletta. Le cellule che danno origine agli spermatozoi sono dette spermatogoni e possono andare incontro a
due diversi tipi di divisione cellulare. Uno spermatogonio può dividersi per mitosi e produrre altri spermatogoni
oppure può dividersi per meiosi e generare cellule che differenziano in spermatozoi.

Sutton contò 23 cromosomi, che si presentavano simili a due a due per forma e
dimensione (undici coppie di cromosomi) più un cromosoma singolo, chiamato
cromosoma accessorio (che in seguito è stato dimostrato essere il cromosoma X,
che determina il sesso), che non faceva parte di una coppia.

Sutton comprese che le coppie di cromosomi, o cromosomi omologhi, come

presto vennero definiti, correlavano perfettamente con le coppie di caratteri
ereditari scoperte da Mendel.

ANALISI GENETICA IN DRODOPHILA

La ricerca genetica presto si focalizzò su un particolare organismo, la Drosophila o moscerino della frutta. I moscerini
della frutta hanno un tempo di generazione di 10 giorni e nell’arco della vita possono produrre fino a 1000 uova. essi
sono molto piccoli, sono semplici da allevare e da incrociare e il loro mantenimento ha un costo contenuto. a
Drosophila sembrò essere l’organismo perfetto per Thomas Hunt Morgan. C’era, tuttavia, un notevole svantaggio
nell’iniziare il lavoro con questo insetto: era disponibile solo un “ceppo” di moscerino, il t ipo selvatico (wild type).
Mentre Mendel aveva semplicemente comperato varietà di semi di pisello, Morgan dovette produrre le sue varietà di
Drosophila. Egli si aspettava che dal tipo selvatico si sarebbero originate varianti. Dopo un anno, trovò il suo primo
mutante, cioè un individuo con un carattere ereditario che lo differenziava dal tipo selvatico. Il mutante, diversamente
dal selvatico che ha occhi rossi, presentava occhi bianchi. Con il tempo Morgan e i suoi studenti avevano trovato 85
mutanti con una grande varietà di caratteri differenti dall’originale.

Fu evidente che in rare occasioni all’interno di un gene poteva

verificarsi un cambiamento spontaneo, o mutazione, che lo modificava
in modo permanente, così che il carattere alterato poteva essere
trasmesso di generazione in generazione.

Le mutazioni sono necessarie per l’evoluzione, ma sono anche uno

strumento per i genetisti poiché costituiscono elementi di
diversificazione dalla forma selvatica.

Le 85 mutazioni non segregavano tutte indipendentemente ma appartenevano a

quattro gruppi di associazione diversi, uno dei quali conteneva pochi geni mutanti.
Questa scoperta era in perfetto accordo con l’osservazione che le cellule di
Drosophila hanno quattro coppie di cromosomi omologhi, uno dei quali molto
piccolo. Rimanevano ben pochi dubbi, quindi, che i geni risiedessero nei cromosomi.

I due cromosomi diversi sono quelli che determinano il sesso. Come nell’uomo, nella
Drosophila i moscerini maschio sono XY, le femmine XX.

CROSSING OVER E RICOMBINAZIONE

Nel 1909 F. A. Janssens aveva osservato che i cromosomi omologhi dei bivalenti si
“arrotolavano” l’uno sull’altro durante la fase iniziale della meiosi. Janssens aveva
proposto che questa interazione tra i cromosomi paterni e materni poteva risultare nella
rottura e nello scambio di tratti. Tenendo presente questa osservazione, Morgan suggerì
che tale fenomeno, che definì crossing over (o ricombinazione genetica), poteva essere
responsabile della comparsa di discendenti (ricombinanti) con combinazioni inattese di
caratteri genetici.
Il crossing over fornisce il meccanismo per riassortire gli alleli tra cromosomi materni e paterni. Le frequenze di
ricombinazione vennero usate per preparare le mappe cromosomiche di diversi organismi, da virus e batteri ad una
grande varietà di specie eucarioti.

Formazione di un bivalente (tetrade) durante la meiosi; vengono mostrati tre possibili

chiasmi (indicati dalle frecce).

Analizzando i discendenti di un gran numero di incroci fra adulti che portavano una serie di mutazioni sullo stesso
cromosoma, osservò che:

(1) la percentuale di ricombinazione tra una determinata coppia di geni su un cromosoma, come il colore dell’occhio e
la lunghezza dell’ala, era essenzialmente costante da un esperimento all’altro e

(2) le percentuali di ricombinazione tra coppie differenti di geni, come tra il colore dell’occhio e la lunghezza dell’ala
rispetto al colore dell’occhio e il colore del corpo, potevano essere molto diverse.

MUTAGENESI E CROMOSOMI GIGANTI

Ricerca di mutanti

• Procedura lenta che dipendeva dalla comparsa spontanea di geni alterati

• Raggi x e radiazioni ultraviolette
 • Mutageni chimici (etilmetano solfato)

NATURA CHIMICA DEL GENE

STRUTTURA DEL GENE

Per capire la funzione di una macromolecola, sia essa una proteina o un polisaccaride, un lipide o un acido nucleico, è
essenziale conoscerne la struttura. Il mistero della struttura del DNA venne investigato in alcuni laboratori si a negli
Stati Uniti sia in Inghilterra nei primi anni ’50 del secolo scorso, e fu risolto nel 1953 da James Watson e Francis Crick
alla Cambridge University.

L’unità strutturale del DNA è un nucleotide costituito da uno zucchero a cinque atomi di carbonio, il desossiribosio,
con un fosfato esterificato nella posizione 5′ dell’anello dello zucchero, e con una base azotata legata al carbonio 1′ .

Esistono due tipi di basi azotate negli acidi nucleici, le pirimidine, che contengono un anello singolo, e le purine, che
contengono un anello doppio. Il DNA contiene due diverse pirimidine, la timina (T) e la citosina (C), e due diverse
purine, la guanina (G) e l’adenina (A). I nucleotidi sono legati tra di loro da legami fosfodiesterici che si instaurano tra
l’OH al carbonio 3′ del desossiribosio di un nucleotide e il fosfato al carbonio 5′ del desossiribosio del nucleotide
successivo. Si forma così un polimero lineare, o filamento, con uno scheletro composto da gruppi zucchero e fosfato
alternati. Si supponeva che le basi legate ad ogni zucchero sporgessero dallo scheletro come una serie di gradini
disposti l’uno sopra l’altro. Un nucleotide ha una struttura polarizzata: possiede un’estremità 5′ , dove è situato il
fosfato, e un’estremità 3′ in cui è presente il gruppo OH.
PROPOSTA DI WATSON-CRICK

1. La molecola è composta da due filamenti di nucleotidi.

2. I due filamenti si avvolgono a spirale attorno ad un asse centrale
formando una doppia elica destrorsa.
3. I due filamenti che costituiscono una doppia elica sono orientati
in direzioni opposte, ossia sono antiparalleli. Così, all’estremità 5′ di
un filamento corrisponde l’estremità 3′ dell’altro.
4. Lo scheletro zucchero-fosfato-zucchero-fosfato di ciascun
filamento è situato all’esterno della molecola con i due gruppi di
basi diretti verso il centro. I gruppi fosfato conferiscono alla
molecola una forte carica negativa.
5. Le basi sono approssimativamente perpendicolari all’asse della
molecola e disposte le une sopra le altre. Le interazioni idrofobiche e
le forze di van der Waals fra basi impilate e planari danno stabilità
all’intera molecola di DNA.
6. I due filamenti sono tenuti insieme da legami idrogeno tra ogni
base di un filamento e quella complementare sull’altro filamento. I
singoli legami idrogeno sono deboli e possono rompersi facilmente,
permettendo, quindi, ai filamenti di DNA di separarsi durante lo
svolgimento di alcune attività.
7. La distanza tra l’atomo di fosforo dello scheletro e il centro
dell’asse è di 1 nm (quindi, il diametro di una doppia elica è di 2 nm).
8. Una pirimidina di un filamento è sempre appaiata con una purina
dell’altro filamento. Questa disposizione produce una molecola che
mantiene 2 nm di diametro per tutta la sua lunghezza.
9. Le modalità di avvolgimento della molecola generano due solchi
di differente grandezza, un solco maggiore più grande, ed un solco
minore, più piccolo. Le proteine che si legano al DNA si trovano
spesso all’interno di questi solchi.
[Link] doppia elica forma un giro completo ogni 10 coppie di basi (3,4
nm) o 150 giri per milione di dalton di massa molecolare.
[Link]é una A di un filamento è sempre appaiata ad una T
dell’altro filamento, ed una G è sempre appaiata ad una C, la
sequenza nucleotidica di un filamento determina automaticamente
quella dell’altro. Questo rapporto si chiama complementarità.

IMPORTANZA DEL MODELLO DI WATSON-CRICK

Per essere considerato come materiale genetico, il DNA doveva soddisfare tre
fondamentali funzioni:

1. Deposito dell’informazione genetica. il DNA deve contenere l’informazione

necessaria alla sintesi di tutte le proteine di un organismo
2. Replicazione ed ereditarietà. Il DNA deve contenere l’informazione per la
propria replicazione (duplicazione). La replicazione del DNA permette la
trasmissione delle informazioni genetiche da una cellula madre alle cellule
figlie e da un individuo alla sua progenie.
3. Espressione del messaggio genetico. Il DNA è più di un centro di deposito; è
anche il centro direzionale delle attività cellulari. Di conseguenza, l’informazione codificata nel DNA deve
 essere espressa in modo tale da poter prendere parte agli eventi che avvengono all’interno della cellula. Più
specificamente, l’informazione contenuta nel DNA deve essere utilizzata per stabilire l’ordine con cui specifici
amminoacidi sono incorporati in una catena polipeptidica.

SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA

Nel 1963, si scoprì che due molecole circolari di DNA di peso molecolare identico potevano avere velocità di
sedimentazione molto diverse quando venivano centrifugate in gradiente di densità. Ulteriori analisi indicarono che le
molecole di DNA che sedimentavano più velocemente mostravano una forma più compatta, perché erano avvolte su
sé stesse, come un elastico con le due estremità ruotate in direzioni opposte.

Il DNA in questo stato viene definito superavvolto. Dal momento che il DNA superavvolto è più compatto di una
molecola di DNA rilassato della stessa lunghezza, esso occupa meno volume e si muove più rapidamente se sottoposto
ad una forza centrifuga o ad un campo elettrico. Una molecola di DNA con minor grado di avvolgimento, sotto avvolta
ha un numero maggiore di coppie di basi per giro di elica.

una molecola ha il numero tipico di 10 coppie di basi per giro dell’elica

ed è detta rilassata. Il DNA risulterebbe ancora rilassato se entrambe le
estremità fossero semplicemente unite per formare un cerchio.

Quando una miscela di molecole di DNA di SV40 rilassato e

superavvolto è sottoposta ad elettroforesi su gel, la forma di DNA
altamente condensata e superavvolta (parte bassa del gel) migra
molto più rapidamente rispetto alla forma rilassata. Le molecole di
DNA sono visualizzate colorando il gel con bromuro di etidio, una
molecola fluorescente che si intercala nella doppia elica.

I gradi di superavvolgimento sono importanti per certi processi.

Il DNA è definito superavvolto negativamente quando in realtà è “sottoavvolto” e superavvolto positivamente quando
è superavvolto. Vengono coinvolti due enzimi che regolano il grado adi avvolgimento della molecola di DNA e sono la
topoisomerasi I e II e agiscono in modo differente. Vengono definiti topoisomerasi poiché cambiano la topologia del
DNA.

TOPOISOMERASI I:

L’enzima taglia un filamento del DNA (la

topoisomerasi ne taglia due),
permettendo al filamento complementare
intatto di ruotare, in modo da rilassare la
molecola superavvolta.

La topoisomerasi I è essenziale in processi

quali la duplicazione e la trascrizione per
prevenire lo sviluppo di un eccessivo
superavvolgimento nel momento in cui i filamenti complementari di un duplex di DNA si separano e si srotolan o.

TOPOISOMERASI II:
 Le topoisomerasi di tipo II provocano una rottura transitoria in
entrambi i filamenti del duplex di DNA, fanno passare attraverso tale
rottura un segmento di DNA e, quindi, risaldano i filamenti rotti. questo
complesso meccanismo di reazione si accompagna ad una serie di
drastici cambiamenti conformazionali.

Nello stadio 1, l’enzima ha legato il segmento di G-DNA, così detto perché forma il
“cancello” (gate) attraverso il quale passa il segmento di T-DNA (o DNA trasportato).
Nello stadio 2, l’enzima dimerico ha idrolizzato 2 molecole di ATP e ha subito un
cambiamento conformazionale, determinando la chiusura dei 2 domini ATPasici.
Nello stadio 3 il segmento G è scisso e il segmento T passa attraverso il cancello
aperto. In questo stadio entrambe le estremità tagliate del segmento G sono legate
covalentemente all’enzima. Nello stadio 4 le due estremità del segmento G sono
riunite e il segmento T viene rilasciato attraverso il cancello C.

Ricapitolando: ->
 Micrografia elettronica di una coppia di molecole di DNA
circolare interconnesse fra loro (concatenate). Molecole di
questo tipo si ritrovano in batteri privi di una specifica
topoisomerasi.

COMPLESSITÀ DEL GENE

Per capire la complessità del genoma, è anzitutto necessario considerare una delle più importanti proprietà della
doppia elica del DNA: la sua capacità di separarsi nei due filamenti che la compongono, una proprietà definita
denaturazione.

I due filamenti di una molecola di DNA sono tenuti assieme da legami deboli, non covalenti. Se il DNA è sciolto in una
soluzione salina e lentamente riscaldato, ad una specifica temperatura inizierà la separazione dei suoi due filamenti. In
un intervallo di pochi gradi, il processo è completato e la soluzione contiene solo molecole a singolo filamento
completamente separate dalle loro complementari.

Il processo di denaturazione termica (o fusione del DNA) può essere seguito misurando l’incremento nell’assorbanza
di luce ultravioletta da parte del DNA in soluzione. A mano a mano che i due filamenti di DNA si separano, infatti, le
interazioni idrofobiche derivanti dall’impilamento delle basi si riducono e ciò cambia la natura elettronica delle basi e
ne incrementa l’assorbimento di radiazione ultravioletta.

La denaturazione del DNA (separazione dei filamenti) si verifica

nell’ambito di un piccolo intervallo di temperatura, specialmente per
i DNA più semplici di piccoli virus. Il punto mediano della curva di
assorbanza viene definito temperatura di fusione (melting
temperature), Tm.

RINATURAZIONE O RIAPPAIAMENTO DEL DNA

La separazione dei due filamenti del duplex di DNA mediante calore è un fenomeno abbastanza prevedibile, ma che
possa avvenire una riassociazione dei singoli filamenti in molecole a doppio filamento stabili e correttamente appaiate
potrebbe sembrare quasi impossibile. Le molecole di DNA a singolo filamento complementari sono capaci di
riassociarsi, un evento definito rinaturazione o riappaiamento.
 Lo studio della velocità con cui i genomi di differenti organismi
effettuano la rinaturazione ha permesso l’identificazione delle diverse
tipologie di sequenza presenti.

Più grande è il genoma, più bassa è la concentrazione dei frammenti

complementari in soluzione e maggiore è il tempo richiesto per il
completamento della rinaturazione.

L’ibridazione degli acidi nucleici svolge un ruolo cruciale nelle più

importanti tecniche di biologia molecolare, quali il sequenziamento, il
clonaggio e l’amplificazione del DNA

La rinaturazione di frammenti di DNA virali e batterici è espressa da curve singole e simmetriche, suggerendo che
questi genomi semplici sono costituiti principalmente da sequenze arrangiate in modo lineare. Al contrario, quando il
DNA di piante e animali è sottoposto a rinaturazione la curva mostra generalmente tre gradini distinti, corrispondenti
al riappaiamento di tre ampie classi di sequenze di DNA. Le tre classi rinaturano a velocità diversa, perché è diverso il
numero di volte che la loro sequenza di nucleotidi è ripetuta all’interno della popolazione di frammenti. Le tre classi
sono definite come frazione altamente ripetitiva, frazione moderatamente ripetitiva e frazione non ripetitiva.

Quando il DNA a singolo filamento è lasciato

rinaturare, si possono distinguere tre classi diverse di
frammenti, che si differenziano per la loro frequenza
di ripetizione all’interno del genoma: una frazione di
DNA altamente ripetitiva, una frazione di DNA
moderatamente ripetitiva ed una frazione di DNA non
ripetitiva (a copia singola).

Sequenze di DNA altamente ripetitive (dette anche ripetizioni in tandem) rappresentano l’1-10% circa del DNA totale.

Le sequenze altamente ripetitive sono tipicamente corte (qualche centinaio di nucleotidi al massimo) e s ono presenti
in gruppi nei quali una determinata sequenza si ripete più volte senza interruzione.

Una sequenza disposta in questa maniera si dice in tandem. Le sequenze altamente ripetitive fanno parte di diverse
categorie di DNA, che includono DNA satellite, DNA minisatellite e DNA microsatellite.

• I DNA satellite. rappresentano regioni del genoma molto ampie ciascuna delle quali formata dalla ripetizione
in grande numero di corte sequenze (ciascuna lunga da 5 a poche centinaia di paia di basi).
• I DNA minisatellite. sono costituiti dalla ripetizione fino a 3000 volte di sequenze di 10-100 coppie di basi.
Quindi, le sequenze minisatellite occupano tratti considerevolmente più corti del genoma rispetto alle
sequenze satellite.
 • I DNA microsatellite. sono regioni di DNA lunghe dalle 10 alle 40 coppie di basi costituite da ripetizioni di 1 -9
coppie di basi. Si tratta quindi delle regioni di DNA ripetuto più corte, distribuite in modo abbastanza
omogeneo nel genoma.

STABILITÀ DEL GENOMA

Dato che il DNA è il materiale genetico, abbiamo la tendenza a pensare ad esso come ad una molecola conservativa, il
cui contenuto di informazione cambia solo molto lentamente nel corso dei lunghi periodi del tempo evolutivo. Le
prove indicano, invece, che l’organizzazione delle sequenze nel genoma può cambiare rapidamente, non solo da una
generazione alla successiva ma addirittura nell’arco della vita di un determinato individuo.

DUPLICAZIONE DELL’INTERO GENOMA (POLIPLOIDIZZAZIONE)

le piante

di pisello e i moscerini della frutta (Drosophila) hanno coppie di cromosomi omologhi in ogni cellula. Si dice che queste
cellule hanno un numero diploide di cromosomi. Se si compara il numero di cromosomi presenti nelle cellule di
organismi strettamente imparentati, specialmente le piante superiori, si trova che molte specie hanno un numero di
cromosomi molto più grande di altre a loro prossime. Queste discrepanze possono essere spiegate con un processo
conosciuto come poliploidizzazione o duplicazione di tutto il genoma. La poliploidizzazione è un evento per cui i
discendenti hanno il doppio del numero di cromosomi dei loro genitori diploidi; i discendenti hanno quattro omologhi
di ciascun cromosoma piuttosto che due.

La poliploidizzazione si pensa avvenga in uno dei due seguenti modi:

(1) l’accoppiamento di due specie vicine determina la formazione di un organismo ibrido che contiene i cromosomi
combinati di entrambi i genitori;

(2) lo zigote va incontro a duplicazione cromosomica senza successiva divisione cellulare, e quindi la cellula indivisa si
sviluppa in un embrione vitale tetraploide. Il primo meccanismo avviene più spesso nelle piante, mentre il secondo
negli animali.

DUPLICAZIONE E CAMBIAMENTO DI SEQUENZA DI DNA

La poliploidizzazione è un caso estremo di duplicazione genomica e si verifica solo raramente nel corso
dell’evoluzione. la duplicazione genica, che si riferisce alla duplicazione di una piccola porzione di un singolo
cromosoma, si verifica con una frequenza sorprendentemente elevata e può essere facilmente documentata con
l’analisi genomica.

La duplicazione di un gene i ritiene che il più delle volte sia prodotta da un processo di crossing over ineguale.

Il crossing over ineguale ha luogo quando l’appaiamento fra cromosomi omologhi alla meiosi avviene senza che essi
siano perfettamente allineati.
Lo stato iniziale mostra due geni correlati (1 e 2). In un individuo diploide, durante la meiosi il gene 1 su un omologo
può allinearsi con il gene 2 sull’altro omologo. Se si verifica un crossing over durante questo allineamento scorretto,
metà dei gameti mancheranno del gene 2 e metà avranno un gene 2 aggiuntivo.

Se il crossing over ineguale continua a verificarsi durante le divisioni meiotiche delle generazioni s uccessive, si verrà a
creare gradualmente una disposizione di sequenze di DNA ripetute in tandem.

La maggior parte delle duplicazioni geniche o viene persa per delezione durante l’evoluzione o è resa non funzionale
da una mutazione sfavorevole. Tuttavia, in una piccola percentuale dei casi la copia “extra” accumula mutazioni
favorevoli e acquisisce nuove funzioni. Più spesso entrambe le copie del gene subiscono mutazioni, così che ciascuna
evolve una funzione più specializzata rispetto a quella del gene originale. i due geni avranno sequenze altamente simili
e codificheranno polipeptidi simili, cioè codificheranno isoforme diverse di una certa proteina, ad esempio α - e β-
tubulina. Quindi le duplicazioni successive di un gene possono generare famiglie geniche che codificano polipeptidi
con sequenze amminoacidiche simili.

NATURA DINAMICA DEL GENOMA: “GENI CHE SALTANO”

le sequenze ripetute che si sono originate durante il normale corso dell’evoluzione, si troverà che queste ripetizioni
sono a volte presenti con una organizzazione in tandem, su due o più cromosomi, e altre volte disperse in tutto il
genoma.

Certe mutazioni sono molto instabili, poiché appaiono in una generazione e spariscono in quella successiva.

certi elementi generici si spostavano nel cromosoma da un punto ad un altro, completamente diverso, questo
ragionamento genetico viene chiamato trasposizione ed elementi trasponibili gli elementi genetici mobili.

Trasposizione di un trasposone batterico mediante meccanismo di “taglia e incolla”.

le due estremità di questo trasposone batterico Tn5 sono fiancheggiate da

sequenze ripetute e sono avvicinate per effetto della dimerizzazione di una
coppia di subunità della trasposasi.

Entrambi i filamenti della doppia elica sono tagliati a ciascuna estremità e il

trasposone è escisso come parte di un complesso con la trasposasi.

Il complesso trasposone-trasposasi è “catturato” da un DNA bersaglio ed il

trasposone viene inserito in modo tale da produrre una piccola duplicazione che
fiancheggia l’elemento trasposto.

Due principali tipi di elementi trasponibili eucariotici, i trasposoni a DNA e i retrotrasposoni, ed i loro differenti
meccanismi di trasposizione
la maggior parte dei trasposoni a DNA eucariotici è escisso dal sito donatore e si inserisce in un sito bersaglio distante.
Questo meccanismo di “taglia e incolla” è utilizzato, ad esempio, da membri della famiglia dei trasposoni mariner
(letteralmente navigatori), che si trovano sia nel regno vegetale che in quello animale. I retrotransposoni, al contrario,
operano secondo un meccanismo di “copia e incolla” che coinvolge un intermediario a RNA. Il DNA dell’elemento
trasponibile è trascritto in RNA, il quale è poi “retrotrascritto” in DNA da un enzima chiamato trascrittasi i nversa,
producendo una copia complementare di DNA. La copia di DNA è resa a doppio filamento e poi integrata nel sito
bersaglio del DNA. In molti casi, il retrotrasposone stesso porta la sequenza che codifica per la trascrittasi inversa. I
retrovirus, quali il virus responsabile dell’AIDS, utilizzano un meccanismo molto simile per replicare il loro genoma di
RNA e integrare la copia di DNA nel cromosoma della cellula ospite.

SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI

Tra gli eucarioti di cui è stato sequenziato il genoma, il numero di geni

codificanti per proteine (barre blu) varia da circa 6200 nel lievito a circa
57.000 nella mela, mentre i vertebrati si pensa ne posseggano circa 20.000.
(Il numero elevato dei geni della mela indica una duplicazione dell’intero
genoma relativamente recente). È particolarmente interessante notare
come all’aumentare della complessità degli organismi non corrisponda un
aumento significativo del numero dei geni. Ad esempio, né (1) il passaggio
da eucarioti unicellulari, come Clamydomonas, ai più semplici animali
pluricellulari, come le spugne, né (2) quello da invertebrati a vertebrati, è
accompagnato da importanti variazioni nel numero di geni codificanti
proteine. Mentre il numero di geni stimato varia in un intervallo ristretto tra
gli eucarioti, la quantità di DNA contenuta in un genoma varia molto (barre
rosse), raggiungendo valori di 90 miliardi di coppie di basi in alcune
salamandre (il numero di geni effettivo in questi anfibi è sconosciuto).

L’apparente differenza in complessità tra gruppi diversi di organismi pluricellulari non è dovuta tanto alla quantità
d’informazione genetica contenuta nel genoma quanto piuttosto al modo in cui questa informazione è utilizzata.
 • un singolo gene può codificare per più di un polipeptide. Quindi il numero effettivo di proteine codificate dal
genoma umano è diverse volte più grande del numero di geni che esso contiene.
• Piu del 70% del genoma è trascritto in una incredibile varietà di RNA che svolgano una funzione nella
regolazione dell’espressione genica. il numero e la complessità di questi RNA non codificanti possano essere
correlati con il livello di complessità dei diversi organismi. i microRNA sono una delle classi di RNA regolatori
meglio studiate.

DAL DNA ALL’RNA ALLE PROTEINE

Dal DNA che ha le info, le passa all’RNA che le rilegge e questo permette la produzione di tutte le proteine del nostro
corpo.

PROVA CHE IL DNA È IL MATERIALE GENETICO

I ipotesi: un gene specifico portava le informazioni per la costruzione di un dato enzima: “un gene - un enzima”.

AFFERMAZIONE: gli enzimi sono spesso composti da più di una catena polipeptidica, ciascuna delle quali è codificata
da un gene diverso: “un gene - una catena polipeptidica”.

I geni contengono le informazioni necessarie per costruire i polipeptidi, ma questa informazione è immagazzinata in
una forma inerte, una catena di basi di DNA, che non è in grado di avere alcuna funzione metabolica nella cellula. Con
espressione genica ci si riferisce alla sintesi di un prodotto funzionale utilizzando l’informazione codificata in un gene.

L’informazione presente in un segmento di DNA è resa disponibile alle cellule grazie a una molecola di RNA e quindi
poi espressa nella struttura delle proteine

Il processo avviene in due stadi:

• Trascrizione da DNA a mRNA

• Traduzione da mRNA a proteine

modificazioni prostituzionali che rendono le proteine funzionanti.

RNA:

• RNA messaggero (mRNA): trasporta l’informazione genetica dal DNA nel nucleo citoplasma dove le proteine
sono sintetizzate
• RNA transfer (tRNA): trasferisce un amminoacido specifico di una catena polipeptidica in crescita al sito
ribosomiale della sintesi proteica durante la traduzione
• RNA ribosomale (rRNA): insieme alle proteine ribosomali forma i ribosomi dove gli aminoacidi sono uniti per
formare la struttura primaria delle proteine.
• Small nuclear RNA (snRNA): associato a proteine nucleari forma le “small nuclear ribonucleoprotein
particles” (snRNPs) che elidono gli introni dal premRNA.

La sintesi delle proteine avviene in due fasi:

1. trascrizione: si forma mRNA; avviene nel nucleo

2. Traduzione: avviene nel citoplasma, sui ribosomi ed è la fase in cui dal mRNA si forma la proteina. Quindi è
necessario passare dalla sequenza di nucleotidi nel RNA, alla sequenza di amminoacidi delle proteine: questo
passaggio avviene attraverso il codice genetico.

TRASCRIZIONE
 1. la doppia catena del DNA si apre per una lunghezza di circa 1000 nucleotidi da un punto detto “inizio” a un
punto detto di “termine” o “terminazione”.
2. Un enzima detto RNA polimerasi porta in corrispondenza
ai nucleotidi di una delle due catene di DNA, i nucleotidi
complementari e li lega insieme, (A si lega con T e C con
G). Nell’RNA U al posto della T.
3. l filamento di RNA è composto anch’esso da nucleotidi. Il
filamento che si forma, lungo circa mille nucleotidi è
quello del mRNA; una volta formatosi l’enzima si stacca,
le due catene del DNA tornano a chiudersi e il filamento
di mRNA esce dal nucleo, entra nel citoplasma e si porta
sui ribosomi.

TRADUZIONE

• Inizio: il mRNA scorre tra le due parti dei ribosomi, i tRNA portano i singoli amminoacidi ai ribosomi; il primo
amminoacido è sempre la metionina. I primi tre nucleotidi che entrano sono A, U,G (per il codice genetico a
questi tre corrisponde la metionina).
• Allungamento: il mRNA continua a scorrere e in corrispondenza di ogni tripletta (gruppo di tre nucleotidi), un
tRNA porta un amminoacido. Gli amminoacidi vengono legati tra di loro e si forma una catena di circa 300
amminoacidi.
• Terminazione: gli ultimi tre nucleotidi del mRNA sono U, G,A. Questo è il segnale di termine della sintesi; la
catena di amminoacidi si stacca dai ribosomi e costituisce la struttura primaria della proteina che in seguito
acquista la sua struttura finale.

Solo una frazione del genoma viene trascritta, quella CODIFICANTE, organizzata in unità funzionali dette GENI.

Trend evolutivo: con l’aumentare delle dimensioni del genoma aumenta la frazione non codificante
Nei procarioti i singoli geni sono separati da brevi sequenze non codificanti

Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze non codificanti

SPLICING

Nei geni degli eucarioti le sequenze codificanti per proteine (esoni) sono
interrotte da sequenza non codificanti (introni). Il trascritto primario,
prima di abbandonare il nucleo, viene sottoposto ad un processo di taglio
e ricucitura (splicing): gli introni vengono eliminati e gli esoni sono riuniti
uno all’altro. La molecola di mRNA maturo che esce dal nucleo sarà
costituita da una sequenza codificante continua.
INIZIO DELLA TRASCRIZIONE:

PROMOTORE:

È una sequenza specifica del DNA che viene riconosciuta dalla RNA polimerasi e determinata dove la sintesi del mRNA
inizia e quale filamento del DNA debba essere utilizzato come stampo.

ALLUNGAMENTO DELLA CATENA DELL’RNA:

I due filamenti di DNA si svolgono e il DNA può

essere copiato.

la RNA polimerasi, a differenza del DNA

polimerasi, non ha bisogno di un innesco.

PROCARIOTI: RNA polimerasi si lega direttamente al promotore

EUCARIOTI: Ehi fattori di trascrizione proteici legano il promotore prima dell’RNA polimerasi II
La polimerasi copre circa 35 coppie di basi del DNA, la bolla di trascrizione composta da DNA a singolo filamento
(denaturato) contiene circa 15 coppie di basi, mentre il segmento presente come ibrido DNA-RNA include 9 coppie di
basi. L’enzima genera DNA super spiralizzato (super avvolto positivamente) davanti ad esso e DNA despiralizzato
(super avvolto negativamente) dietro ad esso. Queste condizioni sono risolte dalle topoisomerasi.

Sequenze specifiche sul DNA (terminator) determinano l’arresto della trascrizione in corrispondenza di un
determinato nucleotide (STOP site)

Nei procarioti il trascritto viene tradotto in proteina

Nel nucleo delle cellule eucariotiche invece avviene un complicato processo di MATURAZIONE prima che il trascritto
venga esportato nel citoplasma e tradotto.
PANORAMICA DEL FLUSSO DI INFORMAZIONI ATTRAVERSO LA CELLULA

Questo processo di comunicazione si verifica nei due distretti, una parte a livello nucleare e il citoplasma.

Il DNA dei cromosomi, localizzato nel nucleo,

contiene l’intero corredo di informazioni
genetiche.

Siti selezionati nel DNA sono trascritti nei pre-

mRNA (passaggio 1), che a loro volta sono
maturati a RNA messaggeri (passaggio 2). Gli
RNA messaggeri sono trasportati fuori dal nucleo
(passaggio 3) nel citoplasma, dove vengono
tradotti in polipeptidi dai ribosomi che scorrono
lungo l’mRNA (passaggio 4). Dopo la traduzione,
il polipeptide si ripiega nella sua conformazione
nativa (passaggio 5).

La sintesi di un RNA da uno stampo di DNA si chiama trascrizione. Il termine trascrizione indica un processo in cui
l’informazione codificata nei quattro desossiribonucleotidi del DNA è trascritta, in un linguaggio simile che utilizza i
quattro ribonucleotidi dell’RNA.

Le proteine sono sintetizzate nel citoplasma attraverso un processo molto complesso, chiamato traduzione. La
traduzione richiede la partecipazione di molti componenti diversi, fra cui i ribosomi. Queste complesse “macchine”
citoplasmatiche possono essere programmate per tradurre le informazioni codificate da qualsiasi RNA. I ribosomi sono
costituiti da RNA e proteine.

Nella trascrizione gli RNA polimerasi sono gli enzimi che permettono in processo di allungamento e lettura dello
stampo DNA

• L’RNA polimerasi copre circa 35 coppie di basi

del DNA
• L’RNA polimerasi si muove lungo il filamento
stampo di DNA verso la sua estremità 5 (ovvero, in
direzione 3’ -> 5’)
• la bolla di trascrizione composta da DNA a
singolo filamento (denaturato) contiene circa 15 coppie
di basi, mentre il segmento presente come ibrido DNA-RNA include 9 coppie di basi.
• Il segmento presente come ibrido DNA-RNA include 9 coppie di basi.
• L’enzima genera DNA superspiralizzato (superavvolto positivamente) davanti ad esso e DNA despiralizzato
(superavvolto negativamente) dietro ad esso. Queste condizioni sono risolte dalle topoisomerasi.
• Modello schematico di una RNA polimerasi durante l’attività di
allungamento della trascrizione. Il DNA a valle giace in un solco dentro alla
polimerasi, fissato ad un paio di “pinze” formate dalle due subunità più
grandi dell’enzima. Il DNA compie una curvatura netta nella regione del
sito attivo, cosicché il DNA a monte si estende verso l’alto in questo
disegno. L’RNA nascente esce dal sito attivo dell’enzima attraverso un
canale.
 fotografia al microscopio elettronico di diverse molecole di RNA polimerasi legate ad uno
stampo di DNA fagico. L’analisi cristallografica ai raggi X del nucleo enzimatico della RNA
polimerasi batterica mostra una molecola con una forma simile ad una “chela di granchio”
con un paio di pinze (o ganasce) che racchiudono un canale interno carico positivamente.

TRASCRIZIONE NEI BATTERI

I batteri contengono un solo tipo di RNA polimerasi, composta da cinque subunità che sono
strettamente associate per formare il nucleo enzimatico. Il nucleo non è capace di legarsi al
DNA; quindi, da sola l’RNA polimerasi sola non funziona ma deve associarsi ad altro per poi
legarsi al sito promotore (il punto di inizio della trascrizione), questo fattore è il fattore sigma.

Quando il nucleo enzimatico è associato con il fattore σ, l’enzima completo (o oloenzima) è in

grado di riconoscere e legare la regione promotrice del DNA, separare i filamenti della doppia
elica del DNA ed iniziare la trascrizione al sito di inizio appropriato

In assenza del fattore sigma (σ), il nucleo dell’enzima non può interagire con il DNA a livello di
specifici siti di inizio. Quando il fattore σ si lega al nucleo enzimatico, l’affinità dell’enzima per i
promotori del DNA aumenta, mentre si riduce la sua affinità per il DNA in generale. Di
conseguenza, si ritiene che l’enzima completo possa scivolare liberamente sul DNA, finché
riconosce e lega una regione promotrice appropriata.

i promotori sono i siti del DNA che legano l’RNA polimerasi. Queste porzioni di DNA precedenti il sito di inizio sono
dette a monte di quel sito. Le porzioni di DNA che lo seguono (verso l’estremità 5′ dello stampo) sono dette a valle di
quel sito. L’analisi delle sequenze di DNA a monte di un gran numero di geni batterici indica la presenza di due brevi
tratti che sono simili da un gene all’altro.
Uno di questi tratti è a circa 35 basi a
monte del sito d’inizio e tipicamente si
trova come sequenza TTGACA. Questa
sequenza TTGACA (nota come regione –35)
è definita come una sequenza consenso, il
che indica che è la versione più comune di
una sequenza conservata, ma che esistono
alcune variazioni da un gene all’altro. La
seconda sequenza conservata si trova 10
basi a monte del sito di inizio ed è presente
come sequenza consenso TATAAT. Questo sito nel promotore è responsabile dell’identificazione del nucleotide
preciso in cui inizia la trascrizione. Così come la trascrizione inizia in punti specifici sul cromosoma, allo stesso modo
termina quando viene raggiunta una specifica sequenza di nucleotidi. In circa metà dei casi, una proteina a forma di
anello chiamata rho è richiesta per la terminazione della trascrizione batterica. Rho circonda l’RNA neosintetizzato e si
muove lungo il filamento verso la polimerasi in direzione 5′ → 3′ dove separa il trascritto di RNA dal DNA a cui è
legato. In altri casi, la polimerasi interrompe la trascrizione quando raggiunge una sequenza di terminazione. Le
sequenze di terminazione spesso si avvolgono a formare delle strutture a forcina che inducono la RNA polimerasi a
rilasciare il filamento di RNA completo senza richiedere ulteriori fattori.

TRASCRIZIONE E MATURAZIONE DELL’RNA NELLE CELLULE EUCARIOTICHE

Le cellule eucariotiche posseggono tre distinti enzimi di trascrizione all’interno del nucleo, ciascuno responsabile della
sintesi di un diverso gruppo di RNA.

Tutti i precursori degli mRNA eucariotici sono sintetizzati dalla RNA polimerasi II,
un enzima composto da una dozzina di diverse subunità che è notevolmente
conservato dal lievito ai mammiferi.

L’RNA polimerasi II lega il promotore in cooperazione con una serie di fattori

generali di trascrizione (GTF) per formare un complesso di preinizio (preinitiation
complex, PIC).

Una regione cruciale del promotore di tali geni si trova tra 24 e 32 basi a monte
del sito di inizio della trascrizione. Questa regione spesso contiene una sequenza
consenso che è identica o molto simile all’oligonucleotide 5′-TATAAA-3′
conosciuto anche come TATA box.

TBT: TATA-binding. Protein

TFIID: fattore di trascrizione per la polimerasi II, frazione D)

STRUTTURA DEGLI MRNA

Tutti gli RNA messaggeri condividono certe proprietà:

• Contengono una sequenza continua di nucleotidi codificanti per uno specifico polipeptide.
• Si trovano nel citoplasma
• Sono associati ai ribosomi quando sono tradotti.
• La maggior parte degli mRNA contiene un tratto non codificante, cioè una porzione che non partecipa
all’assemblaggio degli amminoacidi
• Gli mRNA eucariotici presentano modificazioni particolari alle loro estremità 5′ e 3′ che non sono presenti nei
mRNA batterici, nei tRNA e rRNA. l terminale 3′ di quasi tutti gli mRNA eucariotici presenta una stringa di
 adenosine (da 50 a 250 residui) che forma una coda di poli(A), mentre l’estremità 5′ ha un cappuccio di
guanosina metilata.

Struttura dell’mRNA per la β-globina umana.

L’mRNA contiene un cappuccio di metilguanosina al 5′, due regioni non

codificanti che fiancheggiano il segmento codificante al 5′ ed al 3′, ed una
coda di poli(A) al 3′.

Le cellule eucariotiche possiedono milioni di ribosomi, ciascuno dei quali contiene diverse molecole di rRNA, assieme a
dozzine di proteine ribosomali. I ribosomi sono così numerosi che, nella maggior parte delle cellule, più dell’80%
dell’RNA consiste di RNA ribosomale.

Fotografia al microscopio ottico di fibroblasti umani di polmone marcati con un

colorante fluorescente che lega l’RNA. I nuclei (marcati in blu grazie a un colorante
fluorescente specifico per il DNA) contengono nucleoli multipli, dove vengono prodotti i
ribosomi e che sono arricchiti in RNA e proteine ribosomali.

Immagine al microscopio elettronico di una sezione di parte del nucleo

contenente il nucleolo. Si possono distinguere tre regioni morfologicamente
distinte. La maggior parte del nucleolo consiste di un componente granulare
(gc). Immersi entro le regioni granulari, ci sono dei centri fibrillari (fc) circondati
da un componente fibrillare più denso (dfc). Il riquadro mostra un disegno
schematico di queste parti del nucleolo. Secondo un modello proposto, gli fc
contengono il DNA che codifica per l’RNA ribosomale, mentre i dfc contengono i trascritti nascenti di pre-rRNA e le
proteine associate. Secondo questo modello, la trascrizione del precursore di pre-rRNA avviene al confine fra fc e dfc.
La barra in b corrisponde a 1 µm.
RNA TRANSFER

Si stima che le cellule di animali e piante abbiano circa 50 specie diverse di RNA transfer, ciascuna codificata da una
sequenza di DNA che è ripetuta più volte all’interno del genoma. Il grado di ripetizione varia da organismo ad
organismo. Gli RNA transfer sono sintetizzati da geni che si trovano in piccoli gruppi (cluster) sparsi nel genoma. Un
singolo cluster contiene generalmente copie multiple di differenti geni per il tRNA e, viceversa, la sequenza di DNA che
codifica un dato tRNA si trova generalmente in più di un cluster. Il DNA all’interno di un cluster (tDNA) è composto in
gran parte da sequenze spaziatrici che non vengono trascritte, mentre le sequenze codificanti per i tRNA sono situate
ad intervalli irregolari organizzate come ripetizioni in tandem.

I tRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi III. Il trascritto primario di una molecola di RNA transfer è più grande del
prodotto finale e tratti del precursore localizzati su entrambe le estremità 5′ e 3′ (e in alcuni casi anche al suo interno)
devono essere rimossi. Inoltre, numerose basi devono essere modificate. Uno degli enzimi coinvolti nell’elaborazione
dei pre-tRNA è una endonucleasi denominata ribonucleasi P, presente sia nelle cellule batteriche che eucariotiche e
costituita sia da RNA che da proteine. È la subunità a RNA della ribonucleasi P a catalizzare il taglio del pre-tRNA.

CODIFICAZIONE DELL’INFORMAZIONE GEN ETICA

Si pensava, invece, che l’informazione memorizzata nella

sequenza dei nucleotidi fosse presente in qualche forma di
codice genetico.
L’effetto della sostituzione di una singola base nel contenuto informazionale di un mRNA, nel caso il codice sia
sovrapposto o non sovrapposto.

un codice a triplette ha la capacità di specificare 64 differenti

amminoacidi, mentre in realtà ce ne sono solo 20.

Un codice di questo tipo viene chiamato degenerato poiché quasi tutti i 64 possibili codoni specificano amminoacidi;
quindi, almeno alcuni degli amminoacidi sono specificati di più di un codone.

Quelli che non lo fanno (3 sui 64) hanno una specifica funzione di “punteggiatura”: sono riconosciuti dal ribosoma
come codoni di terminazione e causano la fine della lettura del messaggio.

IDENTIFICAZIONE DEI CODONI

Questa tavola di decodificazione universale elenca ciascuno dei 64 possibili codoni dell’mRNA e i corrispondenti
amminoacidi specificati da quel codone.

Le prime eccezioni all’assegnazione dei codoni furono trovate nei codoni degli mRNA mitocondriali.

la corrispondenza fra amminoacido e codone è chiaramente un fenomeno non casuale. Se si guardano i riquadri di
uno specifico amminoacido, si vede che essi tendono ad essere raggruppati in una zona della tavola. Questo
raggruppamento riflette la somiglianza nei codoni che specificano lo stesso amminoacido. In questo modo, le
mutazioni spontanee che causano cambiamenti a livello di singole basi in un gene spesso non producono cambiamenti
nella sequenza amminoacidica della corrispondente proteina.
 Un cambiamento nella sequenza nucleotidica che non altera la
sequenza amminoacidica è detto sinonimo, mentre un
cambiamento che determina una sostituzione amminoacidica è
detto non sinonimo.

Le mutazioni non senso (o codoni di terminazione prematura) (in

questo caso UGU verso UGA) inducono la fine della traduzione
dell’mRNA da parte del ribosoma nel sito della mutazione,
portando a una prematura conclusione della traduzione.

Le mutazioni di cambiamento del modulo di lettura (frameshift),

che possono essere dovute a una inserzione o una delezione di una
o due basi, spostano il ribosoma in un modulo di lettura scorretto,
portando a una sequenza anomala di amminoacidi dal punto della mutazione in poi.

Gli acidi nucleici e le proteine rappresentano due linguaggi scritti utilizzando tipi diversi di lettere. Questa è la ragione
per cui la sintesi proteica è detta anche traduzione. La traduzione richiede che l’informazione codificata nella
sequenza nucleotidica di un mRNA sia decodificata e utilizzata per dirigere l’assemblaggio sequenziale degli
amminoacidi in una catena polipeptidica. La decodificazione dell’informazione di un mRNA è possibile grazie agli RNA
transfer, che agiscono quali adattatori. Da un lato, ogni tRNA è legato ad uno specifico amminoacido (come un aa-
tRNA), mentre dall’altro, lo stesso tRNA è in grado di riconoscere un particolare codone nell’mRNA. L’interazione tra
codoni successivi nell’mRNA e gli specifici aa-tRNA porta alla sintesi di un polipeptide con una sequenza di
amminoacidi ordinata.

Il tRNA è composto da
77 nucleotidi, 10 dei
quali sono diversi dai
quattro nucleotidi
standard (A, G, C, U)
normalmente presenti
nell’RNA.

Gli RNA transfer traducono una sequenza di codoni di un mRNA in una sequenza di residui amminoacidici.
L’informazione contenuta nell’mRNA è decodificata attraverso la formazione di coppie di basi tra sequenze di basi
complementari presenti negli RNA transfer e su quelli dei messaggeri. Così come in altri processi che coinvolgono gli
acidi nucleici, il processo di traduzione si basa sull’appaiamento complementare delle basi. La parte del tRNA che
partecipa a questa interazione specifica con il codone dell’mRNA è una sequenza di tre nucleotidi, chiamata
anticodone, che si trova nell’ansa centrale della molecola di tRNA. Questa ansa è invariabilmente composta da sette
nucleotidi, di cui i tre centrali formano l’anticodone. L’anticodone è situato ad un’estremità della molecola di tRNA a
forma di L, dalla parte opposta a quella dove è attaccato l’amminoacido.
lo stesso RNA transfer potesse essere in grado di riconoscere più di un codone, questo è detto ipotesi del vacillamento
(wobble) e suggerì che, mentre i requisiti sterici tra l’anticodone del tRNA e il codone dell’mRNA sono molto forti per
le basi nelle prime due posizioni, essi sono più flessibili per la terza posizione. due codoni che specificano lo stesso
amminoacido e che sono diversi solamente a livello della base della terza posizione, possono usare lo stesso tRNA
nella sintesi proteica.

Le regole che sono alla base del vacillamento a livello della terza posizione del codone sono le seguenti):

⁻ la U dell’anticodone può accoppiarsi con A o con G dell’mRNA;

⁻ G dell’anticodone può accoppiarsi con U o C dell’mRNA;
⁻ I (inosina, che deriva dalla guanina nella molecola originale di tRNA) dell’anticodone può accoppiarsi con U, C
o A dell’mRNA.

TRADUZIONE DELL’INFORMAZIONE GENETICA

La sintesi delle proteine, o traduzione, può essere considerata l’attività di sintesi più complessa che si verifica nella
cellula. La sintesi di una catena polipeptidica può essere divisa in tre fasi distinte: l’inizio della catena, l’allungamento
della catena e la terminazione della catena.

INIZIO SINTESI PROTEICA PROCARIOTI

Un ribosoma, una volta legato ad un mRNA, si

muove lungo la molecola da un codone al
successivo, ossia in blocchi consecutivi di tre
nucleotidi. Per garantire che siano lette le
triplette appropriate, il ribosoma si attacca ad un
mRNA in un sito specifico, chiamato codone di
inizio, che è specificato come AUG. Il legame a
questo codone automaticamente pone il
ribosoma nell’appropriato modulo di lettura
(reading frame), così che esso legge
correttamente l’intero messaggio da quel punto
in poi.
  Passaggio 1: La subunità minore del ribosoma si
porta sul codone di inizio
 Passaggio 2: Il primo aa-tRNA si inserisce sul
ribosoma
 Passaggio 3: Assemblaggio del complesso di
inizio completo

INIZIO SINTESI PROTEICA EUCARIOTI

la fase di inizio comincia con l’unione

di due complessi, uno (chiamato
complesso 43S) contenente la
subunità ribosomale 40S legata a
diversi fattori di inizio (eIF) e al tRNA
iniziatore, l’altro contenente l’mRNA
legato ad un gruppo separato di
fattori di inizio. Questo legame è
mediato da un’interazione tra eIF3
sul complesso 43S e eIF4G sul
complesso dell’mRNA. Si ritiene che
e IF1 e eIF1A introducano un
cambiamento conformazionale nella
subunità minore che apre un
“catenaccio” che permette l’entrata
dell’mRNA. Una volta che il
complesso 43S si è legato all’estremità 5′ dell’mRNA, esso scorre lungo il messaggio finché raggiunge l’appropriato
codone di inizio AUG.
RUOLO DEL RIBOSOMA

i ribosomi sono macchine programmabili: l’informazione conservata nell’mRNA determina la sequenza degli
amminoacil-tRNA che il ribosoma usa nella traduzione.

Gli RNA ribosomali svolgono numerosi ruoli importanti, selezionando i tRNA, assicurando l’accurat ezza della
traduzione, legando fattori proteici e polimerizzando gli amminoacidi.

Ogni ribosoma ha tre siti di associazione per le molecole di RNA transfer. Questi tre siti, denominati sito A
(amminoacidico), sito P (peptidico), e sito E (exit, di uscita), ricevono ciascun tRNA in passaggi successivi del ciclo di
allungamento, come descritto nel paragrafo seguente. I tRNA si legano a questi siti e riempiono lo spazio tra le due
subunità ribosomali. L’estremità dell’anticodone del tRNA legato contatta la subunità minore, che svolge un ruolo
chiave nella decodificazione delle informazioni contenute nell’mRNA. Per contro, l’estremità del tRNA legato che porta
l’amminoacido contatta la subunità maggiore, che ha un ruolo catalitico nella formazione del legame peptidico.

ALLUNGAMENTO

I passaggi fondamentali del processo di allungamento della traduzione nelle cellule procariotiche i ripete
continuamente man mano che gli amminoacidi vengono polimerizzati nella catena polipeptidica nascente.

⁻ Passaggio 1: Selezione dell’amminoacil-tRNA

⁻ Passaggio 2: Formazione del legame peptidico
⁻ Passaggio 3: Traslocazione
TERMINAZIONE DELLA SINTESI PROTEICA

3 tre dei 64 possibili codoni trinucleotidici funzionano da codoni di stop, la cui funzione è di interro mpere la
formazione del polipeptide, invece di codificare un altro amminoacido. Non esiste alcun tRNA i cui anticodoni siano
complementari ai codoni di stop. Sul codone stop si lega un fattore di rilascio che favorisce il distacco della catena
polipeptidica e la separazione delle subunità del ribosoma. Quando l'mRNA è stato tradotto, viene scomposto nei suoi
nucleotidi, che saranno reimpiegati in una nuova trascrizione. Prima di disgregarsi, però, l'mRNA può essere tradotto
da molti ribosomi contemporaneamente, formando una struttura detta poliribosoma o polisoma. In questo modo si
producono moltissime catene polipeptidiche con un solo mRNA.

CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE GENICA

Le cellule esprimono i geni solo quando sono necessari. I cambiamenti dell’espressione genica svolgano un ruolo
critico nell’evoluzione consentendo ai geni normalmente attivi in una parte dell’embrione di essere attivati in una
regione differente. Cambiamenti dell’espressione genica si riscontrano in molte patologie, nel cancro in particolare.

Le cellule procariotiche ed eucariotiche controllano l’espressione genica, assicurando in tal modo che alcuni RNA e
proteine siano sintetizzati ed altri no.

Consideriamo le conseguenze del trasferimento di una coltura batterica da un terreno minimo ad uno contenente
lattosio oppure triptofano.

Il triptofano è un amminoacido necessario per la sintesi delle proteine.

Nell’uomo, il triptofano è un amminoacido essenziale e deve essere assunto con l’alimentazione. Le cellule batteriche
possono sintetizzare triptofano grazie a una serie di reazioni che richiedono l’attività di diversi enzimi e quando
crescono in assenza di triptofano attivano i geni che codificano per questi enzimi. Se però tale amminoacido diventa
disponibile nel mezzo di coltura, le cellule non hanno più bisogno di sintetizzare il triptofano ed entro pochi minuti si
blocca la produzione degli enzimi responsabili della sua produzione. Nei batteri, i geni che codificano per gli enzimi
necessari per sintetizzare il triptofano sono raggruppati insieme nel cromosoma, in un complesso funzionale chiamato
operone. (Tutti i geni di un operone sono controllati in modo
coordinato mediante un meccanismo).
Gli enzimi che fanno parte di una stessa via
metabolica sono codificati da una serie di
geni strutturali localizzati uno di seguito
all’altro nel cromosoma batterico. Tutti i
geni strutturali di un operone batterico
sono trascritti in un unico mRNA, il quale
viene tradotto in polipeptidi separati. La
trascrizione dei geni strutturali è
controllata da una proteina repressore che
è sintetizzata da un gene regolatore, che fa
anch’esso parte dell’operone. Quando si
lega al sito operatore del DNA, la proteina
repressore blocca il movimento della RNA
polimerasi dal promotore verso i geni
strutturali.

Il lattosio è un disaccaride composto da glucosio e galattosio, la cui degradazione ossidativa può fornire alla cellula
intermedi metabolici ed energia. Avviene una regolazione all’interno dei geni e avviene un processo completamente
opposto al triptofano.

L’INVOLUCRO NUCLEARE

Una differenza fondamentale tra gli organismi procariotici e quelli eucariotici è la presenza di un nucleo nelle cellule
eucariotiche.

Il contenuto del nucleo si presenta come una massa di materiale viscoso e amorfo, racchiusa da un complesso
involucro nucleare che costituisce il confine tra il nucleo e il citoplasma. All’interno del nucleo di una tipica cellula in
interfase (cioè non mitotica) vi sono:

1. i cromosomi, presenti come fibre nucleoproteiche molte estese, definite cromatina;

2. uno o più nucleoli, strutture elettrondense di forma irregolare in cui avviene la sintesi dell’RNA ribosomale e
l’assemblaggio dei ribosomi
 3. il nucleoplasma, la sostanza fluida in cui sono disciolti i soluti del nucleo.

COMPLESSO DEL PORO NUCLEARE E SUO RUOLO NEL TRAFFICO TRA NUCELO E CITOPLASMA

L’involucro nucleare è la barriera fra il nucleo e il citoplasma, e i pori nucleari sono le vie di passaggio attraverso tale
barriera. l’involucro nucleare è un centro di attività per il movimento di RNA e proteine tra nucleo e citoplasma in
entrambe le direzioni. I pori nucleari contengono una struttura a forma di ciambella, chiamata complesso del poro
nucleare (CPN), che si estende per tutta la lunghezza del poro,
sporgendo sia verso il citoplasma sia verso il nucleoplasma. Il CPN
è un enorme complesso sopramolecolare – da 15 a 30 volte la
massa di un ribosoma – che presenta una simmetria ottagonale
dovuta alla ripetizione per otto volte di specifiche strutture. CPN
contengono solo circa 30 proteine differenti, chiamate
nucleoporine, ampiamente conservate dal lievito ai vertebrati.
Ciascuna nucleoporina è presente in copie multiple, 8, 16 o 32, in
accordo con la simmetria ottagonale del CPN.
CROMOSOMI E CROMATINA

Una tipica cellula umana contiene una quantità di DNA corrispondente a circa 6,4 miliardi di coppie di basi, suddivisa
in 46 cromosomi (in un corredo diploide di cromosomi). Ciascun cromosoma contiene una singola molecola di DNA
lineare: più grande è il cromosoma, più lungo è il DNA che esso contiene.

Nel 1974, utilizzando i dati ottenuti dagli esperimenti di digestione con nucleasi e da altri
studi, Roger Kornberg propose un nuovo tipo di struttura della cromatina. Kornberg suggerì
che il DNA e gli istoni fossero organizzati in subunità ripetute, dette nucleosomi. Oggi
sappiamo che ciascun nucleosoma contiene una particella centrale (core) formata da 146
coppie di basi di DNA superavvolto che gira per quasi due volte intorno ad un complesso a
forma di disco formato da otto molecole di istoni. Tale complesso consiste di due molecole
di ciascuno degli istoni H2A, H2B, H3 e H4 assemblati in un ottamero. L’ultimo istone, il tipo
H1, è localizzato fuori dal core. L’istone H1 viene definito istone di connessione in quanto
lega una parte del DNA di connessione (DNA linker) che unisce due particelle centrali (core) successive.

Un nucleosoma contiene una particella centrale (core) formata da 146 coppie di basi di DNA superavvolto che gira per
quasi due volte intorno ad un complesso a forma di disco formato da otto molecole di istoni.
 Immagine al microscopio elettronico di fibre di cromatina rilasciate dal nucleo
di una cellula di DROSOPHILA: le particelle core del nucleosoma hanno un
diametro di circa 10 nm e sono connesse da brevi filamenti di DNA linker, con
uno spessore di circa 2 nm.

Gli istoni svolgono due ruoli:

• Ruolo strutturale: Hanno la capacità di impacchettare e condensare il DNA facendo si che una molecola lunga
2 metri venga raggruppata in un ammasso di cromatina del diametro di appena 5 nm.
• Ruolo funzionale: Giocano un ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica operata mediante
modifiche della composizione chimica degli istoni stessi.

LIVELLI SUPERIORI DELLA STRUTTURA DELLA CROMATINA

All’interno della cellula, comunque, la cromatina non esiste in questo stato relativamente disteso a “collana di perle”.
Quando la cromatina è estratta dai nuclei e mantenuta ad una concentrazione ionica fisiologica, si può osservare una
fibra di circa 30 nm di spessore.
 I nucleosomi adiacenti nel DNA sono posizionati in due pile
differenti e interagiscono all’interno dell’elica grazie al proprio DNA
linker

Anse cromatiniche: un livello superiore di struttura della cromatina: le fibre di cromatina da 30 nm si organizzano in
una serie di ampie anse superavvolte, dette anche domini, che possono essere compattate in fibre più spesse (80 -100
nm).

Il cromosoma mitotico rappresenta l’ultimo stadio di compattamento della cromatina;

 Lo stato relativamente disperso della cromatina in una cellula in interfase
favorisce le attività tipiche dell’interfase, come la replicazione e la
trascrizione del DNA.

La cromatina di una cellula in mitosi, invece, è nella sua forma più

condensata, per facilitare la trasmissione del DNA a ciascuna cellula figlia.

ETEROCROMATINA

Alla fine della mitosi, la maggior parte della cromatina che compone i cromosomi mitotici altamente condensati torna
ad una condizione più distesa, propria dell’interfase. Circa il 10% della cromatina, tuttavia, rimane in una forma
condensata e compattata anche durante l’interfase. Questa cromatina condensata e più colorabile è localizzata alla
periferia del nucleo, spesso in prossimità della lamina nucleare. La cromatina che rimane condensata durante
l’interfase viene chiamata eterocromatina, per distinguerla dall’eucromatina, che invece ritorna ad uno stato disperso
e attivo.

• Eterocromatina: cromatina che rimane condensata durante l’interfase e che non sembra presentare attività
di trascrizione
• Eucromatina: cromatina che ritorna ad uno stato disperso e attivo, meno condensata, corrisponde a zone in
cui vi è un’intensa attività di trascrizione.

L’eterocromatina si divide in due classi.

L’eterocromatina costitutiva rimane nello stato condensato in tutti gli stadi del ciclo cellulare di tutte le cellule, e
rappresenta quindi DNA permanentemente silenziato.

L’eterocromatina facoltativa corrisponde invece a porzioni di cromatina che sono state specificamente inattivate
durante determinate fasi della vita di un organismo o in certi tipi di cellule differenziate (es. corpo di Barr, cromosoma
X).

CODICE ISTONICO E FORMAZIONE DELL’ETEROCROMA TINAMODEL LO SCHEMATICO DELLA PARTICELLA

CORE DEL NUCLEOSOMA CON LE SUE CODE ISTONICHE PROIETTATE VERSO L’ESTERNO.

Lo stato e l’attività di una determinata regione cromatinica dipendono da modificazioni specifiche, o da una
combinazione di modificazioni, sulle code degli istoni di quella regione.
modello schematico della particella core del nucleosoma con le sue code istoniche proiettate verso l’esterno.

Queste modificazioninfluenzano l’affinità

dell’istone per proteine leganti che
controllanl’attività trascrizionale della
cromatina, portando al concetto di codice
istonico.

• I residui modificati servono come sito d’ancoraggio per un gruppo specifico di proteine non istoniche che
quindi determina le proprietà e l’attività di un dato segmento di cromatina.
• I residui modificati alterano la modalità con cui le code istoniche dei nucleosomi vicini interagiscono tra di
loro e con il DNA al quale sono legati. Variazioni in questi tipi di interazioni possono portare a cambiamenti
dei livelli superiori di organizzazione della cromatina.

Esempi di proteine che si legano selettivamente ai

residui H3 e H4 modificati. Ciascuna delle proteine legate
possiede un’attività che altera la struttura e/o la funzione
della cromatina.

ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Oltre a mutazioni che alterano le informazioni contenute in un singolo gene, i cromosomi possono andare incontro ad
alterazioni più estese che avvengono per lo più durante la divisione cellulare.

Cause: Agenti che danneggiano il DNA (infezioni virali, raggi X o reagenti chimici reattivi) o fragilità di cromosomi
suscettibili a rotture (rare patologie ereditarie).

Conseguenze: Se l’aberrazione avviene in una cellula somatica (cioè non germinale), le conseguenze sono
generalmente minime, perché solo poche cellule del corpo risulteranno danneggiate. In rare occasioni, però, una
cellula somatica che porta una aberrazione cromosomica può trasformarsi in una cellula maligna, che può proliferare
dando origine ad un tumore. Le aberrazioni cromosomiche che avvengono durante la meiosi, in particolare come
risultato di un crossing over anomalo, possono essere trasmesse alla generazione successiva.

Se un cromosoma aberrante viene trasmesso con un gamete, tutte le cellule dell’embrione avranno l’aberrazione, e
ciò generalmente porta a conseguenze letali durante lo sviluppo. Ci sono diversi tipi di aberrazioni cromosomiche, tra
cui le seguenti:
 • Inversioni. Talvolta un cromosoma si rompe in due punti, e il segmento fra i punti di rottura
viene risaldato nel cromosoma con orientamento inverso.

Il crossing over fra un cromosoma normale (in viola) e uno contenente un’inversione (in arancione)
è generalmente accompagnato dalla formazione di un’ansa. I cromosomi che derivano da tale
crossing over contengono duplicazioni e delezioni.

• Traslocazioni. Quando un cromosoma o un segmento di esso si attacca ad un altro

cromosoma.

Micrografia di un corredo cromosomico umano in cui il

cromosoma 12 (in azzurro) ha scambiato dei pezzi con il
cromosoma 7 (in rosso). I cromosomi affetti sono stati resi
fluorescenti mediante ibridazione in situ con un gran numero di
frammenti di DNA specifici per ciascuno dei due cromosomi
coinvolti.

Come le inversioni, anche le traslocazioni che avvengono in una cellula somatica hanno
generalmente scarse conseguenze sulle funzioni di quella cellula o della sua progenie. Alcune traslocazioni però
aumentano la possibilità che una cellula diventi cancerosa.

Come le inversioni, le traslocazioni causano problemi durante la meiosi. Un cromos oma alterato dalla traslocazione ha
un contenuto genetico diverso dal suo omologo. Come risultato, i gameti prodotti dopo la meiosi conterranno copie
addizionali di certi geni o avranno geni mancanti. È stato dimostrato che le traslocazioni hanno un ruolo importante
nell’evoluzione, generando cambiamenti su
larga scala che potrebbero essere
fondamentali nell’originare discendenti
diversi partendo da un antenato comune. Un
tale tipo di incidente genetico probabilmente
è avvenuto durante la nostra storia evolutiva
recente.

• Delezioni. Una delezione avviene quando una porzione di un cromosoma è mancante. La mancanza di una
porzione di un cromosoma spesso determina la perdita di geni critici, causando conseguenze gravi anche se il
cromosoma omologo è normale (cromosoma 5sindrome “cri-du-chat”, cioè sindrome del pianto del gatto).
• Duplicazioni. Una duplicazione avviene quando una porzione di un cromosoma è ripetuta. Duplicazioni
cromosomiche più estese creano una condizione in cui una serie di geni è presente in tre copie anziché nelle
due copie normalmente presenti (una condizione chiamata trisomia parziale). Le attività cellulari sono molto
sensibili al numero di copie dei geni; perciò, copie addizionali possono avere notevoli effetti deleteri.

TELOMERI

Ciascuna delle due estremità del filamento di DNA contiene un insolito tratto di sequenze ripetute che, insieme ad un
gruppo di proteine specializzate, forma una specie di cappuccio, chiamato telomero.

Nell’uomo, i telomeri contengono la sequenza:

TTAGGG

AATCCC

ripetuta da 500 a 5000 volte circa. A differenza della maggior parte delle altre
sequenze ripetute, che variano considerevolmente da specie a specie, la sequenza
telomerica è praticamente uguale in tutti i vertebrati e sequenze simili sono state
riscontrate in molti altri organismi. Questa omologia fa ipotizzare che i telomeri
abbiano la stessa funzione in differenti organismi.

Noi ereditiamo telomeri dai nostri genitori.

I telomeri si accorciano con l’età.

1. Quando il DNA di un cromosoma viene replicato, le estremità 5′ dei filamenti di

nuova sintesi (in rosso) contengono un breve frammento di RNA (in verde), che serve
da innesco per la sintesi del DNA adiacente.
2. Una volta che tale RNA viene rimosso, l’estremità 5′ del DNA diventa più breve di
quella della generazione precedente.
3. Le estremità 5′ di ciascun cromosoma sono ulteriormente degradate da una
nucleasi, che aumenta la lunghezza de filamenti sporgenti.

Il filamento sporgente non rimane come estensione libera, ma invade la doppia elica,
come qui illustrato, spiazzando uno dei due filamenti e formando un’ansa. L’ansa è un
sito di legame per specifiche proteine che proteggono l’estremità dei cromosomi e
regolano la lunghezza dei telomeri.

Piuttosto che esistere come estremità a singolo filamento non protetta, il filamento sporgente è “ripiegato” sulla
porzione a doppio filamento del telomero formando un’ansa.

Si ritiene che questa conformazione protegga l’estremità telomerica del DNA.

Se le cellule non fossero in grado di replicare le estremità del proprio DNA, i cromosomi diventerebbero sempre più
corti ad ogni divisione cellulare.

La telomerasi, in grado di aggiungere unità ripetute all’estremità 3′ defilamento sporgente. Dopo che l’estremità 3′ del
filamento è stata allungata, una normale DNA polimerasi può utilizzare il segmento 3′ appena sintetizzato come
stampo per riportare l’estremità 5′ del filamento complementare alla sua lunghezza originaria.

La telomerasi è una trascrittasi inversa che sintetizza DNA usando un RNA come stampo. A differenza di altre
trascrittasi inverse, questo enzima contiene anche l’RNA che utilizza come stampo.
 Meccanismo di azione della telomerasi.

Questo enzima contiene una molecola di RNA complementare all’estremità del

filamento ricco di G che si estende oltre il filamento ricco di C.

1- L’RNA della telomerasi si lega all’estremità sporgente del filamento ricco di G

2- L’RNA della telomerasi serve da stampo per l’aggiunta di nucleotidi all’estremità

3′ del filamento

3- Dopo che è stato sintetizzato un segmento di DNA, la telomerasi si sposta sulla

nuova estremità del filamento in allungamento

4- l’RNA agisce da stampo per l’ulteriore incorporazione di nucleotidi

Il pezzo mancante nel filamento complementare verrà poi sintetizzato dall’apparato

di replicazione convenzionale formato da polimerasi αprimasi.

CENTROMERI

Il centromero dei cromosomi umani contiene una sequenza lunga 171 coppie di basi (chiamata DNA α -satellite) che è
organizzata in ripetizioni in tandem che si estendono per almeno 500 chilobasi. Questa regione di DNA si associa con
proteine specifiche che la rendono diversa dal resto del cromosoma.

Micrografia al microscopio elettronico a scansione di un cromosoma mitotico

Il centromero (C) contiene sequenze di DNA altamente

ripetuto (DNA satellite) e una struttura contenente proteine,
chiamata cinetocore, il cui ruolo è di servire da sito per
l’attacco dei microtubuli del fuso durante la mitosi e la
meiosi.

I cromosomi in base alla localizzazione dei loro centromeri possono essere:

A. Metacentrici
B. Submetacentrico
C. Subtelocentrico
D. Acrocentrici o telocentrici
 REGOLAZIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI

Una cellula batterica contiene mediamente una quantità di DNA tale da codificare circa 3000 polipeptidi, un terzo dei
quali è espresso in ogni dato momento. Una cellula umana, invece, possiede molto più DNA (6 miliardi di coppie di
basi), sufficiente per codificare diversi milioni di polipeptidi. Sebbene la maggior parte di questo DNA non contenga
informazioni per codificare proteine, si stima che una tipica cellula di mammifero sintetizzi circa 5000 differenti
polipeptidi in ogni momento.

Regolazione dell’espressione genica negli eucarioti.

1. Controllo a livello della trascrizione: determina quando e quanto spesso

un particolare gene può essere trascritto.

2. Controllo a livello della maturazione: determina la via attraverso la quale il

trascritto primario di RNA (pre-mRNA) diventa un RNA messaggero maturo
che può essere tradotto in un polipeptide.

3. Controllo a livello della traduzione: determina quando, quanto

frequentemente e per quanto tempo un particolare mRNA viene tradotto.

4. Controllo a livello post-traduzionale: regola l’attività e la stabilità delle

proteine.

RUOLO DEI FATTORI DI TRASCRIZIONE NELLA REGOLAZIONE DELL’ESPRESSION E GENICA

Il controllo trascrizionale è regolato dall’azione di un gran numero di proteine, chiamate fattori di trascrizione, che
possono essere:

1. fattori di trascrizione generali, che si legano alla parte centrale del promotore (core) in associazione con l’RNA
polimerasi

2. fattori di trascrizione specifici, che si legano ai vari siti regolativi di specifici geni e che possono agire sia come
attivatori trascrizionali, stimolando la trascrizione del gene adiacente, sia come repressori trascrizionali inibendone la
trascrizione.

Controllo combinatorio della trascrizione.

Il controllo della trascrizione genica è complesso, ed è

regolato dalla presenza di siti multipli di legame per i
fattori di trascrizione e dall’affinità di legame di tali fattori
per ciascuna sequenza.

La trascrizione del gene Oct4 richiede l’azione di molteplici fattori di trascrizione che si legano a monte dell’inizio
della trascrizione.

un singolo gene può essere controllato da molte e diverse regioni regolative sul DNA, in grado di legare una varietà di
differenti fattori di trascrizione. Un singolo fattore di trascrizione può legarsi a numerosi siti nel genoma, controllando
così l’espressione di una moltitudine di geni differenti.
STRUTTURA: I fattori di trascrizione contengono almeno due domini:

• un dominio di legame al DNA, che lega una specifica sequenza di basi del DNA
• un dominio di attivazione, la cui funzione è di attivare la trascrizione interagendo
con altre proteine
• molti fattori di trascrizione contengono una superficie che promuove il legame
della proteina con un’altra proteina con struttura identica o simile, così da
formare un dimero

I domini di legame al DNA possono essere raggruppati in diverse ampie classi i cui membri
possiedono strutture (motivi) simili che interagiscono con le sequenze del DNA. Fra i
motivi più comuni presenti nelle proteine eucariotiche che legano il DNA, vi sono:

• zinc finger (a dita di zinco), la classe più numerosa nei mammiferi. Nella maggior
parte dei casi, lo ione zinco di ciascun “dito” interagisce con due cisteine e due
istidine. Queste proteine hanno un certo numero di dita simili che si estendono all’interno di solchi maggiori
successivi nel DNA bersaglio.
• helix-loop-helix (elica-ansa-elica), caratterizzato da due segmenti a α-elica separati da un’ansa interposta. Il
dominio HLH è spesso preceduto da un tratto di amminoacidi fortemente basici, le cui catene laterali cariche
positivamente prendono contatto con il DNA e determinano la specificità di sequenza del fattore di
trascrizione. Le proteine contenenti questo motivo HLH basico (o bHLH) sono sempre presenti sotto forma di
dimeri.
• leucine zipper (a cerniera di leucine), deve il suo nome al fatto che i residui di leucina sono presenti ogni
sette amminoacidi lungo un tratto a α-elica.

SEQUENZE DI DNA COINVOLTE NEL CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE

Gene che codifica per la

fosfoenolpiruvato carbossichinasi
(PEPCK), uno degli enzimi chiave
della gluconeogenesi, la via
metabolica che converte il piruvato
in glucosio.

L’enzima viene sintetizzato nel

fegato quando i livelli di glucosio
sono bassi. Il livello di sintesi
dell’mRNA di PEPCK è controllato da
diversi fattori di trascrizione, incluso un buon numero di recettori per gli ormoni coinvolti nella regolazione del
metabolismo dei carboidrati. Le chiavi per comprendere la regolazione del gene PEPCK risiedono: (1) nel chiarimento
delle funzioni di numerose sequenze regolative del DNA che si trovano a monte del gene stesso, (2)
nell’identificazione dei fattori di trascrizione che legano queste sequenze e (3) nel chiarimento della via di
segnalazione che attiva il macchinario responsabile dell’espressione selettiva dei geni.

La sequenza regolativa più vicina presente a monte del gene PEPCK è la TATA box, che è la componente più
importante del promotore del gene (un promotore è una regione a monte di un gene che ne regola l’inizio della
trascrizione). La regione che si estende approssimativamente dal TATA box al sito di inizio della trascrizione è chiamata
parte fondamentale (o core) del promotore. Il core del promotore è il sito di assemblaggio del complesso di pre-inizio,
costituito dall’RNA polimerasi II e da una serie di fattori di trascrizione generali (GTF) necessari affinché un gene
eucariotico possa essere trascritto. Gli elementi del core del promotore e i GTF che si legano ad essi definiscono
l’esatto sito di inizio della trascrizione (o sito +1).
CAAT box e GC box, localizzate ancora più a monte del gene, sono spesso necessarie alla RNA polimerasi II per iniziare
la trascrizione del gene stesso. La CAAT e la GC box legano fattori di trascrizione presenti in molti tessuti ed
ampiamente coinvolti nell’espressione genica. La CAAT e la GC box sono due delle tante sequenze che regolano la
frequenza con cui la polimerasi trascrive il gene. La TATA box è all’interno del promotore core, generalmente 25 -30
basi dal sito di inizio della trascrizione. La CAAT e la GC box, se presenti, sono localizzate 100-150 coppie di basi a
monte del sito di inizio della trascrizione, in una regione detta promotore prossimale. All’interno di tale regione, le
singole sequenze riconosciute dalle proteine di legame al DNA sono chiamate elementi del promotore prossimale.

Lungo il filamento di DNA, lontano dai geni che devono essere trascritti, si
trovano siti particolari chiamati enhancer (o intensificatori) che
aumentano enormemente la frequenza di trascrizione.

Quando a questi siti si legano particolari proteine (attivatori) si ha un

ripiegamento del DNA e le proteine, prendendo contatto con i fattori di
trascrizionesi uniscono al promotore dando l'avvio alla trascrizione.

Al contrario, alle sequenze di DNA dette silencer (o silenziatori) si legano

proteine con funzione di repressori, che impediscono l'attacco dell'RNA
polimerasi al promotore. Gli attivatori e i repressori sono molto specifici per i diversi tipi di cellule e tessuti.

MATURAZIONE DELL'MRNA (SPLICING)

L'mRNA è suddiviso in sezioni, alcune delle quali sono effettivamente tradotte (esoni), mentre altre sono eliminate
(introni). Il processo di splicing consiste nel tagliare l'mRNA, eliminare gli
introni e saldare gli esoni e si realizza mediante un grosso complesso
enzimatico, lo spliceosoma, costituito da proteine e ribonucleoproteine
(snRNP), formate da RNA e proteine.

Alcune snRNP riconoscono le sequenze di confine in 5' tra esone e introne,

mentre altre catalizzano le reazioni utilizzando l'energia dell'ATP e infine si ha
la saldatura degli esoni, producendo l'mRNA maturo.

Durante la maturazione, le molecole di

pre-mRNA possono essere tagliate in
maniera differente, eliminando
selettivamente anche alcuni esoni, dando
origine a trascritti maturi diversi e quindi
anche a proteine differenti. Attraverso
questo splicing alternativo le cellule
producono versioni diverse di una proteina con un unico gene.
Il processo di maturazione prevede anche altre due operazioni:

• incappucciamento dell'estremità 5' con un nucleotide G

• taglio dell'estremità 3' accorciandola e aggiunta di una coda di circa 200 nucleotidi di adenina, detta poli A.

Il cappuccio e la coda, consentono il legame dell'mRNA al ribosoma, lo proteggono da un'eventuale degradazione da

enzimi idrolitici, ne facilitano il passaggio dal nucleo al citoplasma, migliorano la traducibilità e ne aumentano la
stabilità.

TRASPORTO DELL'MRNA

Il trasporto di mRNA in zone diverse della cellula è un altro punto di controllo. Negli eucarioti la trascrizione avviene
nel nucleo e la traduzione nel citoplasma.

L'mRNA può passare attraverso i pori dell'involucro nucleare solo dopo che è stato elaborato appropriatamente:
aggiunta di cappuccio e coda.

Controlli che ritardano queste modifiche ritardano il trasferimento di mRNA nel citoplasma e ritardano così la sua
traduzione. Inoltre, alcune proteine di trasporto discriminano tra mRNA non maturo o danneggiato e quello pronto
per la trascrizione, che è traghettato attraverso i pori nucleari.

REGOLAZIONE DELLA TRADUZIONE

L'mRNA maturo passa nel citoplasma per la traduzione. Non sempre, però, è trascritto immediatamente in proteine
perché intervengono diversi tipi di controllo.

• Proteine di regolazione (repressori traduzionali) che inibiscono temporaneamente la traduzione in base alla
presenza o meno dei prodotti nel citoplasma.
• Alcuni fattori possono competere con il ribosoma, perciò non può attaccarsi all'mRNA per avviare la
traduzione

Formazione di strutture secondarie nella regione 5' dell'mRNA impediscono

l'attacco del ribosoma.

L'mRNA che codifica per la ferritina è controllato

da una proteina legante l'RNA, nota come proteina regolatrice del ferro (IRP).

Quando i livelli di ferro nel citosol sono bassi e non è necessaria la ferritina, l'IRP si
lega in un sito specifico dell'mRNA (IRE), posto tra il 5'-cap e il primo codone d'inizio.
Questo legame produce un ripiegamento dell'mRNA che inibisce la traduzione.

Quando invece il ferro è abbondante, si lega direttamente all'IRP e le impedisce di

legarsi all’IRE; perciò, l'mRNA può essere tradotto e produrre ferritina.

Meccanismo di silenziamento genico

 MicroRNA (miRNA) e brevi RNA interferenti (siRNA), singoli filamenti di
circa 20 nucleotidi di RNA non codificante, mediante meccanismi chiamati
complessivamente RNA interference, possono legarsi a sequenze
complementari di mRNA bersaglio, provocandone la degradazione o
bloccandone temporaneamente la traduzione.

Terminata la traduzione, le molecole di mRNA che hanno esaurito la loro

funzione vengono degradate da specifici enzimi, come le ribonucleasi.

Nei procarioti l'mRNA è demolito pochi minuti dopo essere stato

sintetizzato, mentre negli eucarioti la durata è variabile: ore, giorni o per tutta la vita, come le proteine nella lente
dell'occhio umano. La velocità di degradazione rappresenta un fattore di regolazione e può essere ostacolata o
accelerata dal legame con specifiche proteine. Esistono due modi principali in cui il legame di una proteina potrebbe
influire sulla stabilità dell'mRNA. In primo luogo, può essere alterata direttamente la suscettibilità all'attacco di
ribonucleasi. In secondo luogo, la proteina può aiutare o ostacolare il legame con il ribosoma, modificando il tasso di
traduzione e influenzando indirettamente la stabilità dell'mRNA e ciò consente di mantenere un corretto quantitativ o
di prodotti.

MECCANISMI POST-TRADUZIONE

Le proteine derivanti dalla traduzione non sono sempre immediatamente

funzionanti. A volte sono necessarie delle modifiche nella struttura.

L'insulina diventa attiva solo dopo l'eliminazione di un segmento centrale

e la riunione dei due monconi (clivaggio). In altri casi si hanno delle
modifiche chimiche, aggiungendo o rimuovendo gruppi funzionali, come i
gruppi fosfato o formando ponti disolfuro.

Un altro meccanismo di controllo post traduzione è la demolizione

selettiva delle proteine in modo da adattarne la quantità in base alle esigenze ambientali.

Il proteasoma è un complesso proteico cilindrico che si occupa della degradazione dei

polipeptidi (sia nel nucleo che nel citoplasma). Quando una proteina deve essere degradata,
degli enzimi legano i peptidi di ubiquitina, che funziona da segnale. Riconosciuta dal
proteasoma, la proteina contrassegnata viene così scomposta in piccoli pezzi e l'ubiquitina è
rilasciata per essere riutilizzata.
REPLICAZIONE DEL DNA

il materiale genetico si duplica tramite la replicazione.

TRE MODELLI ALTERNATIVI PER LA REPLICAZIONE:

Ogni doppia elica figlia

riceve un filamento della
struttura parentale

I due filamenti originali rimangono insieme

(dopo essere serviti da stampo) e altrettanto
succede ai due filamenti neosintetizzati

I filamenti parentali vengono frammentati

e i nuovi filamenti sono sintetizzati in brevi
segmenti.

REPLICAZIONE BATTERICA
L'origine di replicazione sul cromosoma di E. coli è una sequenza specifica detta oriC, alla
quale si legano numerose proteine per dare inizio al processo di replicazione. Una volta
iniziata, la replicazione procede a partire dall’origine in entrambe le direzioni, è cioè
bidirezionale. I punti in cui la coppia di segmenti replicati si unisce ai segmenti non
replicati sono chiamati forcelle di replicazione. Ogni forcella di replicazione corrisponde ad
un punto in cui

1. la doppia elica parentale va incontro alla separazione dei filamenti

2. e i nucleotidi vengono incorporati nei filamenti complementari neosintetizzati.

Le due forcelle di replicazione si muovono in direzione opposta fino ad incontrarsi in un

punto del cerchio opposto all’origine, dove la replicazione termina. Le due nuove doppie
eliche si staccano l’una dall’altra e vanno a finire in due cellule diverse.

SROTOLAMENTO DELLA DOPPIA ELICA E SEPARAZIONE DEI FILAMENTI

Quando una molecola di DNA circolare si replica, il DNA a monte del macchinario replicativo diventa superavvolto e
accumula superavvolgimenti positivi. La cellula possiede topoisomerasi, come la DNA girasi di E. coli, che rimuovono i
superavvolgimenti positivi.

PROPRIETÀ DELLE DNA POLIMERASI

Tutte le DNA polimerasi - sia quelle eucariotiche sia quelle procariotiche - hanno due necessità fondamentali per poter
replicare il DNA:

• un filamento di DNA stampo da copiare

• filamento primer (o innesco) a cui attaccare i nucleotidi (Il filamento che fornisce all’enzima l’estremità 3′ OH
necessaria)

La DNA polimerasi è capace di sintetizzare DNA solo nella direzione da 5′ a 3′ (5′ → 3′).

REPLICAZIONE SEMIDISCONTINUA

La mancanza di attività di polimerizzazione in direzione 3′ → 5′ si spiega semplicemente: i

filamenti di DNA non possono essere sintetizzati in questa direzione. Vale a dire che entrambi i
filamenti neosintetizzati vengono assemblati in direzione 5′ → 3′.

Di conseguenza, i due filamenti di nuova sintesi crescono in direzioni opposte: uno nella stessa
direzione della forcella di replicazione e viene assemblato in modo continuo (filamento guida).
l’altro nella direzione opposta (filamento in ritardo o filamento lento). Si formano segmenti
(frammenti di Okazaki) che vengono successivamente uniti tra loro grazie ad un enzima (DNA
ligasi).

L’avvio si deve a un particolare tipo di RNA polimerasi,

chiamata primasi, che costruisce un piccolo primer
composto da RNA e non da DNA.

Anche il filamento guida, la cui sintesi incomincia all’origine della replicazione,

viene iniziato da una molecola di primasi. I corti RNA sintetizzati dalla primasi
all’estremità 5′ del filamento guida e all’estremità 5′ di ciascun frammento di
Okazaki servono come primer per la sintesi del DNA da parte della DNA
polimerasi. I primer di RNA vengono successivamente rimossi e gli intervalli che
si formano sul filamento vengono riempiti con DNA e poi saldati da parte della
DNA ligasi.
La replicazione richiede molto di più della semplice incorporazione dei nucleotidi. Lo srotolamento del duplex e la
separazione dei filamenti necessitano dell’intervento di due tipi di proteine che legano il DNA, una elicasi (o enzima
che srotola il DNA) e le proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB).

DNA elicasi si muove lungo il DNA, catalizzando lo

svolgimento ATP -dipendente del duplex. Quando il
DNA è srotolato, l’associazione delle proteine leganti il
DNA a singolo filamento (SSB) con il duplex denaturato
impedisce il riavvolgimento dei due filamenti. La
primasi associata all’elicasi sintetizza i primer di RNA
che iniziano la replicazione di ciascun frammento di
Okazaki. I primer di RNA, lunghi circa dieci nucleotidi,
vengono successivamente rimossi.

La replicazione del filamento guida e del filamento in ritardo in E. coli è svolta da due DNA polimerasi che lavorano
insieme come parte di un singolo complesso.

a) Le due molecole di DNA polimerasi III si

muovono insieme, anche se si spostano
verso le estremità opposte dei loro rispettivi
stampi. Ciò è possibile grazie al fatto che lo
stampo del filamento in ritardo assume una
forma ad ansa.
b) La polimerasi rilascia lo stampo del
filamento in ritardo quando incontra il
frammento di Okazaki sintetizzato in
precedenza.
c) La polimerasi coinvolta
nell’assemblaggio del frammento di Okazaki
precedente si lega nuovamente sullo
stampo del filamento in ritardo in una
posizione successiva e sintetizza il DNA a
partire dal primer di RNA #3 appena
prodotto dalla primasi.

REPLICAZIONE DEL DNA NELLE CELLULE EUCARIOTICHE

Le cellule eucariotiche replicano il loro genoma in piccole porzioni, chiamate repliconi.

Ciascun replicone possiede la propria origine di replicazione dalla quale si dipartono, in entrambe le direzioni, le
forcelle di replicazione.
La replicazione procede per un breve tratto in entrambe le direzioni a partire dall’origine. In questo modello, ogni
complesso MCM forma una DNA elicasi replicativa che srotola il DNA in direzioni opposte.

I due filamenti del duplex originale sono stati replicati, un ORC è presente a livello di entrambe le origini e le proteine
della replicazione, incluse le elicasi MCM, sono state allontanate dal DNA Nel lievito, le proteine MCM vengono
esportate dal nucleo e la replicazione non può ricominciare finché la cellula non è passata attraverso la mitosi.
Nel complesso, le attività che si verificano a livello delle forcelle di replicazione sono abbastanza simili,
indipendentemente dal tipo di genoma che viene replicato, sia esso virale, batterico, archeobatterico o eucariotico.

Rappresentazione schematica dei principali componenti della forcella di replicazione negli eucarioti

Come nei batteri, il DNA delle cellule eucariotiche viene sintetizzato in modo
semidiscontinuo, anche se i frammenti di Okazaki del filamento in ritardo sono
molto più piccoli rispetto ai batteri, con una lunghezza media di circa 150
nucleotidi.

Dalle cellule eucariotiche sono state isolate cinque polimerasi “classiche”,

denominate α, β, γ, δ, e ε RPA è una proteina trimerica che lega il DNA a
singolo filamento, la cui funzione è paragonabile alle proteine SSB utilizzate
durante la replicazione in E. coli

Una versione semplificata degli eventi che si verificano alla forcella di

replicazione, che illustra come le polimerasi replicative sugli stampi dei
filamenti guida e in ritard agiscono insieme come parte di un replisoma.

RIPARAZIONE DEL DNA

I sistemi di riparazione per escissione nucleotidica (NER) agiscono attraverso un meccanismo di taglio e riparazione
che rimuove grosse lesioni, come dimeri di pirimidina o nucleotidi ai quali si sono attaccati dei gruppi chimici.

Per la rimozione dei nucleotidi alterati generati da composti chimici reattivi derivanti dalla dieta o prodotti dal
metabolismo interviene un sistema di riparazione per escissione completamente diverso. Gli stadi di questo
meccanismo di riparazione negli eucarioti, chiamato riparazione per escissione di base (BER).

La BER inizia mediante una DNA glicosilasi che riconosce l’alterazione e rimuove la base attraverso la rottura del
legame glicosidico che unisce la base alla molecola di zucchero desossiribosio.
le cellule sono capaci di rimuovere le basi appaiate in modo errato, incorporate dalla DNA polimerasi e sfuggite al
meccanismo esonucleasico di correzione di bozze dell’enzima. Questo meccanismo è chiamato riparazione degli
appaiamenti errati (MMR).

Le cellule sono capaci di rimuovere le basi appaiate in modo errato, incorporate dalla DNA polimerasi e sfuggite al
meccanismo esonucleasico di correzione di bozze dell’enzima. Una coppia di basi appaiate in modo errato provoca
una distorsione nella geometria della doppia elica che può essere riconosciuta da un enzima di riparazione. Affinché
un appaiamento scorretto venga riparato dopo che la DNA polimerasi è passata oltre, è fondamentale che il sistema di
riparazione sia in grado di distinguere il filamento neosintetizzato, che contiene il nucleotide sbagliato, dal filamento
parentale che contiene il nucleotide corretto.

In E. coli, i due filamenti si possono distinguere per la presenza di residui di adenosina metilati sul filamento
parentale. Negli eucarioti sembra che il sistema MMR non utilizzi la metilazione del DNA e non è noto il meccanismo
utilizzato per identificare il filamento di nuova sintesi.

I raggi X, i raggi gamma e le particelle rilasciate da atomi radioattivi sono tutti definiti radiazioni ioni zzanti poiché
generano ioni quando passano attraverso la materia. Ogni minuto milioni di raggi gamma passano attraverso il nostro
corpo. Quando queste forme di radiazioni collidono con una fragile molecola di DNA, spesso generano rotture su
entrambi i filamenti della doppia elica. Le rotture a doppio filamento (DSB) possono essere generate anche da agenti
chimici, compresi quelli usati in chemioterapia antineoplastica, e dai radicali liberi generati dal normale metabolismo
cellulare.

La lesione viene individuata da una proteina eterodimerica a forma di

anello detta Ku, che si lega alle estremità rotte del DNA. La proteina
Ku legata al DNA recluta un’altra proteina, chiamata DNA-PKcs, che è
la subunità catalitica di una protein-chinasi DNAdipendente. La
presenza di queste tre subunità (due di Ku e la DNA-PKcs) consentono
di avvicinare le estremità rotte del DNA e di farle legare tra di loro
mediante la DNA ligasi IV, così da generare nuovamente il duplex di
DNA integro.

DIVISIONE CELLULARE

Con il termine divisione cellulare si intende quel processo che dà origine a nuove cellule a partire da altre cellule
viventi.

Può avvenire in due modi: come mitosi o come meiosi.

La crescita e la divisione sia delle cellule diploidi, sia di quelle aploidi avvengono grazie al ciclo cellulare mitotico.

Il ciclo cellulare si distingue in due fasi principali sulla base delle attività cellulari chiaramente visibili al microscopi o
ottico: la fase M e l’interfase.

La fase M include il processo di mitosi, durante il quale i cromosomi duplicati vengono separati in due nuclei distinti, e
la citocinesi, durante la quale l’intera cellula viene fisicamente divisa in due cellule figlie. L’interfase, il periodo tra le
divisioni cellulari, è il tempo in cui la cellula cresce ed è impegnata in diverse attività metaboliche. l’interfase si divide
in tre fasi:

• Fase G1, nella quale la cellula svolge la sua funzione e in alcuni casi cresce.
• Fase S, nella quale avviene la replicazione del DNA e la duplicazione dei
cromosomi.
• Fase G2, un breve intervallo nel ciclo cellulare, durante il quale la cellula
continua a crescere e si prepara alla mitosi.
Il fuso mitotico gioca un ruolo centrale sia nella mitosi sia nella citocinesi.

Il fuso mitotico è composto di microtubuli insieme alle loro proteine motrici e le sue attività dipendono dalla loro
capacità di modificare gli schemi di organizzazione durante il ciclo cellulare.

Il centrosoma è il principale delle cellule animali e di

molti protozoi.

Il centrosoma contiene una coppia di centrioli,

solitamente organizzati ad angolo retto l'uno rispetto
all'altro.

I microtubuli sono divisi in due gruppi:

I microtubuli del cinetocore, che collegano i poli del fuso mitotico ai cinetocori, i
complessi proteici che si formano in corrispondenza del centromero dei cromosomi
durante la prometafase.

I microtubuli non associati al cinetocore, che si estendono tra i due poli del fuso
senza connettersi ai cromosomi. Nella regione mediana (o equatoriale) del fuso, i
microtubuli non associati al cinetocore provenienti da un polo si sovrappongono a
quelli provenienti dal polo opposto.

REGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE MITOTICO

I controlli interni che regolano il ciclo cellulare sono modificati da molecole segnale che giungono dall'esterno delle
cellule in divisione. Negli animali, queste molecole segnale comprendono ormoni peptidici e proteine simili chiamati
fattori di crescita.

Molti dei fattori esterni si legano a recettori presenti sulla superficie cellulare, che rispondono al segnale innescando
reazioni interne alla cellula.

Queste reazioni spesso includono passaggi di fosforilazione che inibiscono o stimolano i complessi ciclina/Cdk.

L'effetto complessivo è quello di accelerare, rallentare o bloccare la progressione del ciclo cellulare in relazione al
particolare ormone o fattore di crescita ed alla via di segnalazione interna stimolata.

LA DIVISIONE CELLULARE NEI PROCARIOTI

LA MEIOSI

La meiosi porta alla riduzione del numero di cromosomi, cioè produce gameti che hanno la metà dei cromosomi
presenti nelle cellule somatiche di una specie.

Alla fecondazione i nuclei dell'uovo e dello spermatozoo si fondono e formano una cellula chiamata zigote, nella quale
viene ripristinato il numero diploide di cromosomi tipico della specie. Senza il dimezzamento del numero di
cromosomi che avviene con la meiosi, la fecondazione porterebbe al raddoppiamento del numero di cromosomi ad
ogni successiva generazione.

La meiosi e la fecondazione hanno anche la funzione di mescolare le informazioni genetiche e produrre nuove
combinazioni in modo che nessuno dei figli di una coppia sia geneticamente identico.

Nell'uomo e in altri animali la meiosi ha luogo negli organi riproduttivi primari, le gonadi.

La meiosi si basa sulle interazioni e sulla distribuzione delle coppie di cromosomi omologhi.

L'uomo ha normalmente 46 cromosomi nelle sue cellule, diploidi, che corrispondono a 22 coppie di cromosomi
omologhi e ad un paio di cromosomi sessuali.

La meiosi è caratterizzata da due divisioni cellulari precedute da

una sola duplicazione del DNA.
ERRORI DI SEGREGAZIONE CROMOSOMICA

Raramente la segregazione cromosomica va incontro ad errori. Quando ciò accade, entrambi i cromosomi omologhi di
una coppia possono collegarsi ai microtubuli del cinetocore provenienti dallo stesso polo del fuso meiotico.

Ne risulta una cosiddetta non-disgiunzione, nella quale il fuso non riesce a separare i cromosomi omologhi.

Di conseguenza, un polo riceve entrambi i cromosomi di una coppia di omologhi, mentre all'altro polo non giunge
alcun membro di quel cromosoma.

La non disgiunzione si può verificare anche durante la meiosi II. Lo zigote che riceve un cromosoma in più a causa della
non disgiunzione avrà pertanto tre copie di un cromosoma invece delle normali due. Nell'uomo la maggior parte di
questo tipo di zigoti non conclude lo sviluppo e quindi non origina un nuovo organismo. Un'eccezione è costituita dagli
zigoti che presentano tre copie del cromosoma 21 invece delle due normali copie; questi zigoti si sviluppano in
individui con la sindrome di Down.

ll rimescolamento degli alleli di un cromosoma dipende dall'appaiamento e dagli eventi di crossing-over che
avvengono tra i cromosomi omologhi.

I cromosomi con combinazioni di alleli parentali si chiamano cromosomi parentali

I cromosomi con nuove combinazioni di alleli non parentali si chiamano cromosomi ricombinanti.

Il crossing-over è un meccanismo di ricombinazione genetica che produce ricombinanti genetici, anche chiamati più
semplicemente ricombinanti.

La segregazione casuale dei cromosomi materni e paterni costituisce la seconda fonte principale di variabilità
genetica durante la meiosi
In seguito al crossing-over e all'assortimento indipendente, i gameti maschili e femminili prodotti dalla meiosi sono
tra loro geneticamente diversi.

L'unione dei due gameti alla fecondazione è un fenomeno del tutto casuale e questo amplifica ulteriormente la
variabilità prodotta dalla riproduzione sessuale.

L'unione casuale dei gameti maschile e femminile alla fecondazione produce ulteriore variabilità genetica tra gli
individui.
ESERCITAZIONE:

COLTURE CELLULARI

La capacità di far crescere cellule al di fuori di un organismo, cioè in coltura cellulare, si è dimostrata uno dei più
preziosi successi tecnici nell’intera storia della biologia.

Le ragioni di ciò sono molteplici e comprendono:

• la facilità con cui si possono ottenere cellule in grande quantità;

• il fatto che la maggior parte delle colture contenga un solo tipo di cellule;
• le numerose e differenti attività cellulari che possono essere studiate, tra cui l’endocitosi, il movimento
cellulare, la divisione cellulare, il traffico di membrana e la sintesi di macromolecole;
• la possibilità di studiare il differenziamento cellulare; il fatto che le colture cellulari risponderanno al
trattamento con farmaci, ormoni, fattori di crescita e altre sostanze attive.

Le cellule possono crescere:

- in sospensione: le cellule crescono e si moltiplicano in un mezzo fluido senza aderire (cellule di origine
emopoietica)
- aderenti: le cellule crescono aderendo alla superficie della piastra da coltura (cellule di tessuti solidi)

I TERRENI DI COLTURA

Rita Levi Montalcini, grazie ai suoi studi sul Nerve Growth Factor (NGF), costruì le basi per capire il ruolo dei fattori di
crescita nella crescita e nella differenziazione cellulare (1951-1952). Oggi i terreni di coltura sono ricchi di fattori di
crescita, generici o specifici a seconda del tipo cellulare.

Nel 1955 Harry Eagle compì studi sugli elementi nutritivi necessari al mantenimento di colture cellulari: dimostrò che il
siero è uno dei componenti essenziali per la crescita cellulare, poiché al suo interno sono compresi vari fattori di
crescita. Nel 1976, infatti, Gordon H. Sato, biologo americano, dimostrò che in assenza di siero le cellule hanno
bisogno di mezzi di coltura contenenti fattori di crescita e ormoni inseriti singolarmente.

Il terreno di coltura fornisce i metaboliti e i fattori di crescita necessari alla proliferazione cellulare:

• glucosio
• amminoacidi
• vitamine
• Sali minerali (Na, K, Ca, Mg etc.)
• Fattori di crescita, di adesione ed ormoni (SIERO)
• Antibiotici per prevenire contaminazioni batteriche

Per la crescita le cellule richiedono un valore di pH del terreno di coltura compreso tra
7.2 e 7.4 garantito da un sistema tampone fosfato-bicarbonato.

Per mantenere costante tale valore di pH si usano incubatori contenenti il 5% di CO2.

Queste apparecchiature consentono di mantenere una temperatura costante di 37°C.

Per prevenire le contaminazioni è necessario:

1. Utilizzare solo materiale sterile;

2. Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari;
3. Operare sempre sotto cappa a flusso laminare;
 4. Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro;
5. Controllare periodicamente i filtri della cappa;
6. Mantenere pulito l’incubatore.

CARATTERISTICHE DELLE COLTURE CELLULARI

• Coltura primaria: le cellule si ottengono dall’organismo stesso. La maggior parte delle colture primarie di cellule
animali si ottiene da embrioni, i cui tessuti si dissociano più facilmente in singole cellule di quelli degli adulti.
Queste cellule sono in grado di duplicarsi solo per un numero limitato di passaggi, poi vanno incontro a
senescenza. Le colture primarie solitamente si coltivano in laboratorio.
• Coltura secondaria: prelevare una fiala di cellule, precedentemente coltivate e congelate, da un contenitore di
azoto liquido, scongelare la fiala e trasferire le cellule nel terreno di coltura. La linea cellulare si ottiene da una
coltura primaria stabilizzata che ha subito il processo di immortalizzazione, mediante agenti chimici virali. Per le
linee cellulari si può attingere dalle Biobanche.

Es.

ANG II reduces nephrin expression: (è un vaso costruttore) quando viene

iperprodotto aumenta la pressione e questo si riflette a livello renale e ne
riduce la funzionalità in quanto agisce modificando la barriera di produzione
renale.

Questo esperimento ha dimostrato che l’angiotensina riduce la nefrina.

<- Un fibroblasto umano cresciuto su un substrato piano rivestito da fibronectina in una

coltura 2D assume una forma molto piatta con ampi lamellipodi. Le giunzioni contenenti
integrine appaiono bianche.

Lo stesso tipo cellulare cresciuto in una matrice ->

3D assume una morfologia non piatta ma fusiforme. La
matrice extracellulare di fibronectina è colorata in blu. La
barra equivale a una lunghezza di 10 μm.
 Le colture cellulari possono essere materiale di partenza per l’estrazione di aciudi
nucleidi e proteine.

Essitono diversi metodi per separarli : Il primo metodo è quello della

centrifugazione : separa gli organuli da cui sono costituiti le cellule.

La centrifugazione consente di separare gli orghanelli cellulari in base

alla dimensione e alla densità.

Possiamo ulteriormente frazionare i componenti cellulari per centrifugazione differenziale: (

si basa sul principio che, quando sono più dense del mezzo che le circonda, particelle di forma e grandezza diverse si
spostano verso il fondo di una provetta da centrifuga con differenti velocità, se sottoposte ad un campo centrifugo.)

Il pellet ricavato dalla precedente centrifugazione lo possiamo riusare per separare utlteriormente i componenti
aggiungendolo in un mezzo caratterizzato da un gradiente di densità continuio e crescente (es. saccarosio).

Il mezzo è composto da un gradiente di densità continuo con saccarosio ed i

vari organelli sedimentano finché non raggiungono il livello nella provetta
che ha la stessa loro densità, dove formano bande.

ISOLAMENTO, PURIFICAZIONE E FRAZIONAMENTO DELLE PROTEINE

Per ottenere informazioni sulla struttura o la funzione di una particolare proteina è necessario cercare di isolare e
purificare quella data proteina. Lo scopo è isolare la proteina di interesse dal totale delle proteine estratte dalla cellula
o dal tessuto.

I metodi per separare le proteine sfruttano le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

• Carica
• Dimensioni
• Solubilità
• Affinità di legame con altre molecole

CROMATOGRAFIA

Cromatografia è un termine usato per una ampia varietà di tecniche nelle quali una miscela di componenti disciolti è
frazionata facendola passare attraverso alcuni tipi di matrici porose.
Cromatografia a scambio ionico: sfrutta la carica delle proteine (la carica globale di una proteina è la sommatoria di
tutte le singole cariche degli amminoacidi che la compongono). Nella cromatografia esistono delle colonnine riempite
da resine che nella cromatografia a scambio ionico possono essere
caricate sia positivamente che negativamente). Le due resine a scambio
ionico più comunemente usate sono la dietilamminoetil (DEAE)-
cellulosa e la carbossimetil (CM)-cellulosa. La DEAE-cellulosa è carica
positivamente e perciò agisce legandosi a molecole cariche
negativamente; è uno scambiatore anionico. La CM-cellulosa è carica
negativamente ed agisce come uno scambiatore cationico. La resina è
impaccata in una colonna e la soluzione proteica può percolare
attraverso la colonna in un tampone la cui composizione promuove il
legame di alcune o di tutte le proteine alla resina. Le proteine legate alla
resina possono poi essere rimosse aumentando la forza ionica del
tampone oppure variando il suo pH, o in entrambi i modi.

Cromatografia per filtrazione su gel: prende in considerazione la dimensione e il peso della proteina. La filtrazione su
gel separa proteine (o acidi nucleici) soprattutto in base al peso molecolare (raggio idrodinamico). I granuli usati nel
gel filtrazione sono composti da polisaccaridi cross-legati fra loro (destrano o agarosio) di porosità differente, e ciò
permette alle proteine di diffondere dentro e fuori dei granuli.

nella separazione di tre proteine globulari con differente peso

molecolare, le proteine più grandi sono eluite prima di quelle più
piccole.

Cromatografia per affinità: sfrutta le proprietà strutturali particolari di una proteina, permettendo alla molecola di
essere rimossa da una soluzione in modo specifico, lasciando in soluzione tutte le altre molecole. Le proteine
interagiscono con componenti specifici: gli enzimi con i substrati, i recettori con i ligandi, gli anticorpi con gli antigeni e
così via.

Le molecole del recettore potranno essere rimosse dalla matrice cambiando la

composizione ionica e/o il pH del solvente nella colonna.

CARATTERIZZAZIONE DELLE PROTEINE PER ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE

Un’altra efficace tecnica ampiamente usata per separare le proteine è l’elettroforesi. L’elettroforesi dipende dalla
capacità di molecole cariche di migrare se poste in un campo elettrico. In questa tecnica le proteine sono guidate da
una corrente applicata attraverso un gel composto da una piccola molecola organica (acrilammide) che è
polimerizzata per formare un setaccio molecolare. Il gel può assumere la forma di una sottile piastra fra due lastre di
vetro o di un cilindro all’interno di un tubo di vetro.

Una volta che il gel si è polimerizzato, la piastra (o il tubo) viene sospesa tra due
compartimenti contenenti un tampone nel quale sono immersi elettrodi opposti. In un
gel a piastra, il campione contenente la proteina concentrata è stratificato in
scanalature (pozzetti) lungo la parte superiore del gel (fase 1). il campione proteico è
preparato in una soluzione contenente saccarosio o glicerolo, la cui densità previene il
mescolamento del campione con il tampone nel compartimento superiore. Viene poi
applicato un voltaggio tra i compartimenti del tampone e la corrente passa attraverso
la piastra, facendo muovere le proteine verso l’elettrodo di carica opposta (fase 2). Le
separazioni sono di solito effettuate usando tamponi alcalini, che caricano
negativamente le proteine e le fanno migrare verso l’anodo carico positivamente,
posto nella parte inferiore del gel. Dopo l’elettroforesi la piastra viene rimossa dalle
lastre di vetro e colorata (fase 3).

Il movimento relativo delle proteine attraverso un gel di poliacrilammide dipende dalla

densità di carica delle molecole. Maggiore è la densità di carica, maggiore è la forza
con cui la proteina viene trascinata attraverso il gel, e più rapida è la sua velocità di
migrazione.

Anche le dimensioni e la forma hanno un ruolo. La poliacrilammide forma un setaccio

molecolare a legami crociati, per cui più grande è la proteina, più essa viene rallentata
durante la sua migrazione. La forma è anch’essa un fattore che influenza la migrazione perché proteine globulari
compatte si muovono più rapidamente di proteine fibrose allungate, di massa molecolare paragonabile.

LASTRA AUTOGRAFICA

i numeri a fianco delle bande indicano i peis molecolari

l’intensità della banda è proporzionalòe alla quantità di proteina presente

RISULTATO
Elettroforesi bidimensionali su gel: tecnica che separa le proteine su due dimensioni, cioè in base a due proprietà
diverse delle molecole. le proteine vengono separate a seconda del loro punto isoelettrico mediante focalizzazione
isoelettrica in un gel cilindrico.

Quando il pH si abbassa, i gruppi carichi negativamente vengono

neutralizzati e i gruppi carichi positivamente crescono di numero. Il risultato
opposto si ottiene aumentando il pH. Esiste per ogni proteina un pH al quale
le cariche negative eguagliano le cariche positive. Questo pH è il punto
isoelettrico, al quale la proteina è neutra. Il punto isoelettrico della maggior
parte delle proteine è inferiore a pH [Link] la separazione, il gel viene
rimosso e posto in alto su una piastra di poliacrilammide saturata con SDS e
sottoposto a SDS-PAGE. Le proteine si muovono dentro il gel della piastra e
si separano a seconda del loro peso [Link] volta separate, le
proteine vengono rimosse dal gel e digerite in frammenti peptidici che
possono essere esaminati mediante spettrometria di [Link]ù di mille
proteine possono essere risolte con questa tecnica.

CARATTERIZZAZIONE DELLE PROTEINE PER SPETTROMETRIA

Uno dei metodi più semplici e più usati per determinare la quantità di proteine (o acidi nucleici) presenti in una data
soluzione è quello di misurare la quantità di luce di una specifica lunghezza d’onda assorbita dalla soluzione. Lo
strumento usato per questa misura è lo spettrofotometro. La quantità di luce che passa attraverso la soluzione senza
essere assorbita (cioè la luce trasmessa) viene misurata da fotocellule sull’altro lato della cuvetta. Dei venti
amminoacidi che fanno parte delle proteine, due – la tirosina e la fenilalanina – assorbono la luce nell’ultravioletto,
avendo entrambi un’assorbanza massima a circa 280 nm. Così, se le proteine studiate hanno una percentuale tipica di
questi amminoacidi, l’assorbanza della soluzione a questa lunghezza d’onda fornisce una misura sensibile della
concentrazione proteica. In alternativa, si possono usare vari saggi chimici, come la tecnica di Lowry o del biureto, in
cui la proteina in soluzione viene utilizzata in una reazione che produce una sostanza colorata, la cui concentrazione è
proporzionale a quella della proteina.

FRAZIONAMENTO DEGLI ACIDI NUCLEICI

Ciascun metodo di frazionamento deve sfruttare le differenze tra membri di una miscela per operare la separazione.
Le molecole di acido nucleico possono differire una dall’altra nella dimensione totale, nella composizione in basi, nella
topologia e nella sequenza nucleotidica.

SEPARAZIONE DEI DNA CON ELETTROFORESI SU GEL

Piccole molecole di DNA o di RNA composte da poche centinaia di nucleotidi o meno vengono separate in genere
mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide. Molecole più grosse hanno problemi a farsi strada attraverso il
reticolo di poliacrilammide e sono in genere frazionate su gel di agarosio, che ha una porosità maggiore. L’agarosio è
un polisaccaride estratto da alghe marine; viene dissolto in un tampone bollente, versato in uno stampo e poi lasciato
gelificare semplicemente abbassando la temperatura. La separazione delle molecole di DNA più grandi di circa 25 kb è
generalmente effettuata mediante l’elettroforesi detta pulsed-field, in cui la direzione del campo elettrico nel gel
viene cambiata periodicamente. Questo effetto spinge le molecole di
DNA a riorientarsi durante la migrazione.

Dopo l’elettroforesi i frammenti di DNA nel gel sono visualizzati

immergendo il gel in una soluzione di colorante, quale il bromuro
d’etidio. Quest’ultimo si intercala nella doppia elica e fa sì che le bande
di DNA appaiano fluorescenti se osservate sotto luce ultravioletta.
 La sensibilità dell’elettroforesi su gel è così grande che molecole di
RNA o DNA che differiscono anche per un solo nucleotide possono
essere separate l’una dall’altra con questa tecnica, caratteristica
questa che ha dato luogo ad un metodo di fondamentale
importanza per sequenziare il DNA.

Poiché la velocità di migrazione nel gel è influenzata anche dalla

forma della molecola, l’elettroforesi può essere utilizzata per
separare molecole con conformazioni differenti, come forme
circolari o lineari, superavvolte o rilassate.

IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

L’ibridazione degli acidi nucleici comprende una varietà di tecniche correlate, basate sull’osservazione che due
molecole di acido nucleico a singolo filamento con sequenza di basi complementare formeranno un ibrido a doppio
filamento.

Determinazione della localizzazione di frammenti specifici di DNA in un gel elettroforetico per mezzo del Southern
blot:
Frammenti di DNA frazionati sono denaturati e trasferiti (blottati) su una membrana di nitrocellulosa, che viene
incubata con sonde di DNA (o RNA) marcate radioattivamente (o fluorescenti), e la localizzazione degli ibridi
molecolari è rilevata tramite autoradiografia (o per microscopia se le sonde sono marcate con molecole fluorescenti).
Durante il blotting l’azione di forze capillari spinge il tampone di trasferimento a risalire verso fogli di carta da filtro.
Mentre il tampone attraversa il gel, i frammenti di DNA vengono trascinati verso la superficie della membrana
adagiata sul gel.

Le sonde di DNA possono essere marcate in vari modi. Una sonda radioattiva incorpora un isotopo radioattivo (come
32P) in uno o più siti nella molecola. Le sonde possono essere marcate anche con fluorofori e rilevate mediante
fluorescenza. Un altro marcatore usato comunemente è la biotina, una piccola molecola organica che può legarsi
covalentemente allo scheletro del DNA. La biotina è rilevata mediante la proteina avidina (o streptavidina), che si lega
strettamente ad essa. L’avidina stessa deve essere marcata per essere rilevata con un fluoroforo.

TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

sono molecole contenenti sequenze di DNA derivanti da fonti diverse.

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE: Durante gli anni ’70 del secolo scorso fu osservato che i batteri contenevano
nucleasi capaci di riconoscere brevi sequenze nucleotidiche nel DNA duplex e tagliare il DNA in siti specifici su
entrambi i filamenti del duplex. Questi enzimi sono detti endonucleasi di restrizione di tipo II o semplicemente enzimi
di restrizione.

Da varie centinaia di organismi sono stati isolati enzimi che, insieme, riconoscono più di 100 differenti sequenze
nucleotidiche. Le sequenze riconosciute dalla maggior parte di questi enzimi sono lunghe da quattro a sei nucleotidi e
sono caratterizzate da un particolare tipo di simmetria interna.

La scoperta e la purificazione degli enzimi di restrizione sono state fondamentali per gli avanzamenti ottenuti dai
biologi molecolari in anni recenti. Poiché una particolare sequenza di quattro-sei nucleotidi è presente abbastanza
frequentemente, ogni DNA è suscettibile alla frammentazione ad opera di questi enzimi.

L’uso degli enzimi di restrizione permette di scindere il DNA del genoma umano, o di qualsias i altro organismo, in un
set definito di frammenti specifici.
 Una volta che il DNA di un particolare individuo è stato digerito da uno di
questi enzimi, i frammenti generati possono essere separati in base alla
lunghezza mediante gel elettroforesi.

Enzimi differenti tagliano la stessa preparazione di DNA in set differenti di

frammenti, ed i siti entro il genoma a livello dei quali i vari enzimi tagliano
possono essere identificati ed ordinati in una mappa di restrizione.

FORMAZIONE DI UNA MOLEOCLA DI DNA RICOMBINANTE

una preparazione di DNA plasmidico batterico è trattata con un enzima di

restrizione che fa un unico taglio in ciascun plasmide batterico.

Questo stesso enzima di restrizione è utilizzato per frammentare una

preparazione di DNA genomico umano in piccoli frammenti.

Poiché sono stati trattati con lo stesso enzima di restrizione, i frammenti di

DNA plasmidico e quelli di DNA umano hanno estremità adesive.

Quando queste due popolazioni di frammenti sono incubate insieme, le due

molecole di DNA si legano non covalentemente l’una all’altra e sono poi
saldate covalentemente dalla DNA ligasi, formando una molecola di DNA
ricombinante.

CLONAGGIO DEL DNA

Il clonaggio del DNA è una tecnica largamente usata per produrre grandi quantità di uno specifico segmento di DNA. Il
segmento di DNA da clonare viene per prima cosa legato ad un DNA vettore, che è un veicolo per trasportare un DNA
estraneo in una cellula ospite adatta, come il batterio E. coli. i. Il vettore contiene sequenze che gli permettono di
essere replicato all’interno della cellula ospite. I vettori possono essere o vettori batterici o vettori virali.
Il DNA è estratto dalle cellule umane, frammentato con EcoR1 e i frammenti sono inseriti in una popolazione di
plasmidi batterici. Sono disponibili tecniche che impediscono la formazione di plasmidi senza inserto di DNA estraneo.
Una volta che una cellula batterica ha assunto un plasmide ricombinante dal mezzo, essa dà luogo ad una colonia di
cellule contenenti molecole di DNA ricombinante. In questo esempio, la maggior parte dei batteri contiene DNA
eucariotico di funzione sconosciuta (?), uno contiene una porzione di DNA che codifica RNA ribosomale ed un altro
DNA codificante l’insulina.

CLONAGGIO DI DNA EUCARIOTICI IN GHENOMI FAGICI

Un altro vettore di clonaggio frequentemente utilizzato è il batteriofago lambda.

 Il genoma di lambda è una molecola lineare di DNA a doppio filamento
lungo approssimativamente 50 kb. Il ceppo modificato usato nella maggior
parte degli esperimenti di clonaggio contiene due siti di taglio per l’enzima
EcoR1, che frammenta il genoma in tre grandi segmenti. Per fortuna, le
informazioni essenziali per l’infezione e la lisi cellulare sono contenute nei
due segmenti più esterni, cosicché il frammento centrale, del quale si può
fare a meno, può essere rimpiazzato da un pezzo di DNA di circa 25 kb. Le
molecole di DNA ricombinante possono essere impacchettate nelle teste
del fago in vitro e queste particelle di fago ingegnerizzate geneticamente
possono essere usate per infettare batteri ospiti. (Le molecole di DNA
fagico senza inserti sono troppo corte per essere impacchettate.) Una
volta entrato nei batteri, il segmento di DNA eucariotico viene amplificato
insieme al DNA virale e poi impacchettato in una nuova generazione di
particelle virali, che sono rilasciate quando la cellula viene lisata. Le
particelle rilasciate infettano nuove cellule e presto diventa visibile nel sito
dell’infezione una macchia trasparente (o placca) nello strato batterico.
Ogni placca contiene milioni di particelle del fago, ciascuna delle quali
trasporta una singola copia dello stesso frammento di DNA eucariotico.

Con il clonaggio del DNA il numero di molecole di DNA ricombinante

aumenta in proporzione al numero di cellule batteriche (o progenie virale)
che si sono formate. Da un singolo plasmide ricombinante o un solo
genoma virale all’interno di un’unica cellula batterica si possono formare
milioni di copie del DNA in un breve periodo di tempo. Una volta che il
DNA è stato amplificato a sufficienza, il DNA ricombinante può essere
purificato e usato in altre procedure. Oltre a fornire un sistema per
l’amplificazione di una particolare sequenza di DNA, il clonaggio può
essere anche usato come tecnica per isolare, in forma pura, ogni specifico
frammento di DNA da una popolazione grande ed eterogenea di molecole
di DNA.

AMPLIFIOCAZIONE ENZIMATICA DEL DNA CON LA PCR

Nel 1983 è stata ideata da Kary Mullis della Cetus Corporation una nuova tecnica, nota come reazione a catena della
polimerasi (PCR, polymerase chain reaction), che è diventata di vasto uso per amplificare uno specifico frammento di
DNA senza bisogno di cellule batteriche.
PROCESSO DI PCR

la tecnica sfrutta una DNA polimerasi resistente al calore,

la cui attività non è alterata quando la temperatura è
innalzata per separare i due filamenti della doppia elica.
Con ogni ciclo di duplicazione, i filamenti vengono
separati, i primer si appaiono con le estremità 3’ della
regione selezionata e la polimerasi copia il segmento
interposto.

APPLICAZIONE DELLA PCR

1. Amplificazione del DNA per clonaggio o analisi

2. Individuazione di specifiche sequenze di DNA
3. Confronto tra le molecole di DNA
4. Quantificazione di RNA o DNA

SEQUENZIAMENTO DNA

Intorno al 1970, era stata determinata la sequenza amminoacidica di una lunga lista di proteine, ma praticamente non
era stato fatto nessun progresso nel sequenziamento dei nucleotidi del DNA. Intorno al 1977, si ottenne la sequenza
nucleotidica completa di un intero genoma virale. Nel 2001, fu pubblicato il primo draft del genoma umano –
equivalente a circa 3 miliardi di coppie di basi – il prodotto di anni di lavoro di centinaia di scienziati. La chiave iniziale
è rappresentata dallo sviluppo di approcci per la determinazione della sequenza di frammenti di DNA. Ciò si è reso
possibile grazie alla scoperta degli enzimi di restrizione e all’avvento delle tecniche di clonaggio, quindi dei mezzi
necessari per preparare un definito frammento di DNA in quantità sufficienti per le analisi biochimiche.ù
 • Le fasi alla base del sequenziamento di un piccolo frammento ipotetico mediante la
tecnica di Sanger-Coulson (dei didesossi), o sequenziamento ciclico come descritto nel
testo

• Le corsie del gel in cui le molecole di DNA sono state separate: il colore della banda
è determinato dall’identità del didesossinucleotide all’estremità 3′ del filamento di
DNA.

Precursore modificato, chiamato didesossiribonucleoside trifosfato, o ddNTP. Ciascun ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP o
ddTTP) è stato modificato mediante l’aggiunta di un differente colorante fluorescente alla sua estremità 3′.

I didesossiribonucleotidi sono privi di un gruppo ossidrilico in ambedue le posizioni 2′ e 3′. Quando uno di questi
nucleotidi viene incorporato all’estremità del filamento in crescita, la mancanza dell’OH in 3′ impedisce alla polimerasi
di aggiungere un altro nucleotide, causando così l’interruzione della sintesi del filamento stesso.

Quando la fase di allungamento del filamento è terminata, la temperatura viene alzata nuovamente per denaturare le
nuove molecole di DNA a doppio filamento. Il ciclo di ibridazione, sintesi e denaturazione viene ripetuto molte volte,
generando un’ampia popolazione di filamenti di DNA che includono molecole in cui un ddNTP è stato incorporato in
ogni posizione. Quando tutti i cicli sono completati, i prodotti di reazione sono separati per elettroforesi su gel capillari
molto sottili.

L’elettroforesi ad alta risoluzione è capace di separare frammenti che

differiscono anche di un solo nucleotide di lunghezza.

Poiché ciascun ddNTP era stato marcato con un particolare colorante

fluorescente, il colore della banda (letto da un rilevatore laser
automatizzato) rivela l’identità del nucleotide terminale su ciascuna
molecola.

L’ordine dei colori nel gel, quindi, corrisponde alla sequenza di basi
complementare della molecola stampo.

LIBRERIE DI DNA
Il clonaggio del DNA è spesso usato per la produzione delle librerie di DNA, raccolte dei vari frammenti di DNA di un
organismo. Si possono creare due tipi diversi di librerie di DNA: librerie genomiche e librerie di cDNA.