Corso di Istologia, Anatomia e

Funzioni degli organismi animali

Prof. Monica Colitti

a.a. 2025-26 9CFU Biotecnologie

6 CFU ASA

1
 L’organismo animale/umano è costruito in
base a un’organizzazione gerarchica che
cellula comprende livelli di complessità crescente.
Organelli
cellulari

cellula apparato apparato

cellula
tessuto organismo

cellula cellula apparato apparato

tessuto tessuto organo organo

organo apparato

tessuto tessuto organo organo

2
3
 Unità di misura
Lunghezza
1cm =1/100m = 10-2m
1mm =1/1000m = 10-3m
1micron (µm) = 1/1000mm = 10-3mm= 10-6m
1 nanometro (nm) = 10-9m
1 angstrom (Å) = 1/10nm = 10-10m

Massa
1kg =1000gr = 103ml
1gr =1/1000kg = 10-3kg
1milligrammo (mg) =1/1000gr = 10-3g = 10-6kg
1microgrammo (µg) = 1/1000mg = 10-3mg
1 nanogrammo (ng) = 1/1000 mg = 10-3 mg
Volume
1litro =1000ml = 103ml
1ml =1/1000m = 10-3l = 1cm3
1microlitro (µl) = 10-3ml = 10-6l

1 ml di acqua pesa 1mg

4
La maggior parte delle cellule ha un diametro inferiore a 100 μm (0.1mm). Questo valore è
inferiore al limite di risoluzione del nostro occhio (0.2mm).
Anche nel caso delle cellule più grandi non siamo in grado di distinguere alcun dettaglio,
poiché gli organelli interni hanno dimensioni dell’ordine del micrometro

0.2mm=200µm 5
6
 Il microscopio deve quindi rispondere a tre requisiti:

Le cellule sono troppo piccole per essere distinte ad occhio nudo. Ciò dipende
da:

• dimensioni delle cellule (cellule eucariote 10-100µm, cellule procariote 1-

5µm) il microscopio deve produrre una immagine ingrandita del
campione

• potere di risoluzione (capacità di vedere due oggetti come distinti) il

microscopio deve garantire una buona separazione dei dettagli
dell’immagine

• contrasto dell’oggetto da visualizzare: la maggior parte delle cellule sono

troppo trasparenti per essere distinte dallo sfondo il microscopio
deve rendere i dettagli visibili all’occhio o alla fotocamera

7
 Il limite di risoluzione dei microscopi
Il limite di risoluzione di un microscopio, cioè la minima distanza alla
quale due punti possono essere visti come separati può essere
calcolato con la formula:
formula di ABBE R=  AN= nsenα
AN
Dove  è la lunghezza d’onda della sorgente di luce utilizzata, AN è l’indice di rifrazione
del mezzo interposto fra lente e preparato e  è il semiangolo del cono luminoso entrante.
AN (apertura numerica) è un numero adimensionale e corrisponde all’angolo di
accettazione della luce.
R= distanza tra due punti risolti; risoluzione

8
= 0.2µm

9
Potere di risoluzione !
Il potere di risoluzione è la distanza minima entro la quale due oggetti
risultano separati.

…quindi…..come possiamo migliorare (ovvero diminuire R) il

limite di risoluzione?

R= 
AN
• diminuendo  ( è 400-700 nm per la luce visibile, 200-400 nm per
la luce UV, e solo 0,04 nm per elettroni accellerati a 100 kV)

• aumentando il prodotto nsen (apertura numerica, NA) per

esempio interponendo fra obiettivo e campione un olio con un indice
di rifrazione più elevato di quello dell’aria (1,518): NA è tipicamente
0,65 per un obiettivo a secco (NA basso) e 1,25-1,6 per un obiettivo
ad immersione (NA elevato).
10
Il microscopio ottico ha un limite di risoluzione di circa 0.2μm, (mille volte
superiore a quello del nostro occhio). Quindi un ingrandimento utile di circa
1000X permette quindi di riconoscere la forma delle cellule e di individuarne
alcuni dei dettagli più grandi (es. il nucleo).
Potremmo costruire un microscopio ottico più potente, per poter osservare i
dettagli più piccoli?
Possiamo certamente costruire un microscopio da 2000 ingrandimenti o molto di più, ma i
risultati non sarebbero migliori di quelli di un microscopio da 1000 ingrandimenti il limite
reale è dato dal potere di risoluzione (0.2 μm).

Dettaglio della stessa cellula a

Un globulo bianco a circa
circa 5000 ingrandimenti
1000 ingrandimenti

Aumentando l’ingrandimento oltre i 1000 x non

aumentano i dettagli, cioè non aumenta
l’informazione 11
Questo è quello che
succede quando si
ingrandisce
indefinitamente
un’immagine.
Aumentare a piacimento la
risoluzione di un’immagine
già acquisita è possibile
solo nei film americani...
 Nei microscopi ottici la fonte di illuminazione è una radiazione con lunghezza
d’onda relativamente lunga (visibile 400-700 nm o ultravioletta nei
microscopi a fluorescenza 400-320nm). Questo limita il potere di risoluzione
che è direttamente proporzionale alla lunghezza d’onda (e inversamente
proporzionale all’indice di rifrazione e all’apertura numerica dell’obiettivo).

Nei microscopi elettronici, che utilizzano elettroni, la lunghezza d’onda va da

0.1 a 0.005Å e quindi più piccola decine di migliaia di volte rispetto a quella
della luce visibile, pertanto il loro potere di risoluzione è dell’ordine dei nm.

16
17
18
 Anatomia di un microscopio ottico
tubo

oculari

Revolver
portaobiettivi
stativo
Tavolino
portaoggetto

condensatore
illuminazione

Regolazione
micro e diaframma
macrometrica base

19
Regolazione macrometrica e micrometrica: consente di
impostare la nitidezza delle immagini.
Illuminazione: vengono utilizzate lampade fluorescenti,
LED e lampade alogene che sono le più adatte. I tubi
fluorescenti e i LED evitano il riscaldamento del preparato
in caso di osservazione prolungato.

Microscopio ad inversione

20
 Il valore messo in evidenza
nella figura, in questo caso
1.40 rappresenta l’ apertura
numerica, un parametro
indicativo del potere di
risoluzione dell’obiettivo,
quindi della sua qualità ottica.

Plan= planare cioè produce immagine corretta per le aberrazioni di curvatura

Apo= apocromatica produce immagine corretta per aberrazioni cromatiche
= il tubo porta-oculare per cui è progettato questo obiettivo può essere
all’infinito
Ad esempio, gli obiettivi della figura danno una immagine piana del campione
(PLAN), hanno un potere di ingrandimento da 20 a 60x (20x, 40x, 60x) e sono
corretti “all’infinito”(∞). Devono inoltre essere usati con vetrini coprioggetto di 0,17
mm di spessore (∞/0,17).

21
STEREOMICROSCOPIO

22
Microscopio in Campo scuro (Dark Field, DF)
Il campo scuro è una tecnica di contrasto ottico che
rende visibili le strutture anche non colorate nelle
cellule di campioni biologici. Le strutture nella cellula
o le caratteristiche del materiale diffondono la luce
che interagisce con esse, mentre le aree uniformi
permettono alla luce di passare senza diffondersi.
Quando si utilizza la microscopia in campo scuro, le
strutture cellulari o le caratteristiche del materiale
appaiono più luminose e lo sfondo uniforme della
cellula o del materiale appare più scuro.
Risultano quindi chiari solo gli oggetti
che diffondono, mentre il fondo risulta
scuro.

23
Microscopio a contrasto di fase
Il contrasto di fase è una tecnica di contrasto ottico che rende visibili le strutture non colorate
nelle cellule di campioni biologici. Le differenze nella densità ottica tra le strutture
presenti nella cellula creano alterazioni nella luce che interagisce con esse, e
provocano uno spostamento di fase. Questo fenomeno è alla base del contrasto di fase. Di
conseguenza, le strutture più densamente ottiche, appaiono più scure di quelle meno dense.
Il contrasto di fase è l'ideale per oggetti sottili non
colorati, come ad esempio cellule di colture in vitro
perché esistono differenze molto piccole di indice
di rifrazione tra le cellule e la soluzione acquosa
(A) che le circonda e nelle cellule stesse tra il
citoplasma (B) ed il nucleo (C).
Dal momento che maggiore è l'indice di rifrazione
di un mezzo, tanto minore è la velocità della luce
nel mezzo stesso, un'onda luminosa che
attraversa un nucleo di una cellula è in ritardo
rispetto alle onde luminose che attraversano
l'acqua circostante. L'ammontare di questo
"ritardo" viene detto differenza di fase.

24
Fluorescenza e Microscopio a fluorescenza
La fluorescenza è la proprietà che hanno alcune sostanze di assorbire la luce a
una particolare lunghezza d’onda (400-320nm) e di rilasciarla ad una lunghezza
d’onda superiore, ma ad energia inferiore rispetto a quella assorbita. La
fluorescenza si dice primaria nel caso di sostanze naturalmente fluorescenti (ad
esempio la cellulosa); è detta secondaria quando la fluorescenza è indotta da
fluorocromi legati al campione in esame.
Le sezioni sono illuminate da luce UV, in modo che l’emissione sia nella parte
visibile dello spettro. Vi saranno quindi dei filtri speciali che selezionano i raggi
delle diverse lunghezze d’onda emessi dai fluorocromi.

25
I fluorocromi assorbono fotoni (eccitazione) a una certa lunghezza d’onda e la
rilasciano a una lunghezza d’onda più lunga (emissione).

Ad es. la fluoresceina (verde) viene eccitata a 494nm ed emette a 518nm che

corrisponde allo spettro visibile del verde (500-570nm).
26
Microscopio confocale
Il Microscopio confocale a scansione laser è in grado di analizzare i vari campioni biologici
per strati, impiegando luce laser. Focalizza selettivamente un piano per volta nello spessore
dell’oggetto e poi ricostruisce elettronicamente l’immagine finale mettendo insieme tutte
le altre consentendo un’immagine tridimensionale del campione. Il vantaggio dell'imaging
confocale è un contrasto notevolmente aumentato grazie alla rimozione dei segnali di
fluorescenza fuori fuoco.

Fornisce immagini fluorescenti in un unico piano

focale esplorando in successione zone diverse
del preparato. Le immagini vengono acquisite da
una videocamera e riversate su uno schermo di
computer consentendo la ricostruzione di
27
tridimensionale del preparato in esame.
28
 Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
Nel microscopio elettronico a trasmissione gli
elettroni generati da un tubo catodico, sotto
vuoto spinto, vengono convogliati da un primo
campo magnetico (condensatore) sul
campione. Gli elettroni emessi che lo
attraversano vengono raccolti da un secondo
campo magnetico (obiettivo) e inviati ad un
ulteriore campo magnetico (proiettivo) ed
infine proiettati su una schermo fluorescente e/o
su una lastra fotografica, dove si possono
osservare zone chiare, corrispondenti a parti
del campione attraversate dagli elettroni
(zone elettron-chiare) e zone scure,
corrispondenti a zone opache agli elettroni
(zone elettron-dense). E’ necessario ‘colorare’ le
sezioni con osmio o oro per aumentare potere
di diffrazione.

Applicando la formula di Abbe (P.R= λ/2n sena), con una apertura numerica teorica prossima a 1, il potere di
risoluzione del microscopio elettronico sarebbe di P.R. (teorico) ≈ 0,02 nm. In pratica, a causa delle distorsioni
causate dai campi magnetici, il P.R. (effettivo) è di 0,2 nm.
Gli elettroni emessi dal filamento e accelerati dalla differenza di potenziale tra
anodo e catodo sostituiscono i raggi luminosi; le lenti magnetiche sostituiscono le
29
lenti ottiche
30
31
Microscopio elettronico a
scansione (SEM)
E’ principalmente impiegato per lo studio
topografico della superficie dei campioni
in esame.
Tale microscopio utilizza un sottile raggio
di elettroni primari (circa 7 nm) che
tramite l’unità di scansione esplora il
campione, in precedenza fissato e
rivestito da un sottile strato di metalli
pesanti (oro, oro-palladio). La superficie
del campione eccitata dal fascio di
elettroni primari emette elettroni
secondari (e Raggi X), i quali tramite il
rilevatore raggiungono l’elaboratore di
immagine. L’unità di scansione sincronizza
la scansione sul campione e sul monitor
dell’elaboratore; pertanto l’immagine finale
riproduce la struttura della superficie
esplorata con effetto tridimensionale ad
una risoluzione di solito di 20 nm.

32
33
Microscopio Risoluzione Ingrandimento Profondità di
campo
Luce (ottico) 0.2m 10 - 1500x 2 m
SEM 20nm 2 - 100.000x 1000 m

TEM 0.2nm 20 – 200.000x 800 m

34
35
36
 La superficie aumenta con il quadrato della dimensione lineare (se immagini, per
semplicità, una cellula cubica, la cosa appare evidente 6*l2), mentre il volume aumenta
con il cubo della dimensione lineare (l3). Pertanto, se la dimensione lineare raddoppia,
la superficie aumenta molto meno del volume, quindi il rapporto
superficie/volume diminuisce notevolmente con l'aumentare della dimensione lineare
della cellula.

Quindi all’aumentare della grandezza delle cellule, la superficie cellulare

aumenta molto meno rispetto al volume

Questo è il motivo per cui non è possibile che esistano cellule troppo grandi e, da un
punto di vista evolutivo, organismi unicellulari complessi formati da un’unica cellula molto
grande (tipicamente i ciliati) hanno avuto meno successo degli organismi pluricellulari,
che sono riusciti ad aumentare la propria complessità aumentando il numero di cellule,
37
ma diminuendo le dimensioni delle singole cellule.
 Nota importante sui diritti d'autore

Molte delle figure delle lezioni sono tratte da libri di testo e quindi
soggetti alle leggi sul diritto d'autore.
Poiché le fonti cui ho attinto sono varie e alcune non rintracciabili
(immagini scaricate ad esempio da Internet), le stesse fonti non
sono state citate, anche se per lo più vengono dai testi e dagli Editori
menzionati nell'apposita sezione.
E' proibito per legge diffondere il presente materiale.
E' tuttavia possibile aprirli on-line e consultarli, nel qual caso questa
operazione e' assimilabile ad una consultazione di testi in biblioteca e
quindi lecita dal punto di vista legale. Per aprire i files (in formato
pdf) e' possibile utilizzare il software gratuito Acrobat Reader® che
si può scaricare dal sito [Link]
38