Judith Pamella (1130117003)

Maria Trykurniati Maju (1130117005)

Era Meijaya Guna (1130117007)
Yuli Kumala Dewi (1130117008)
Rekayasa genetika atau rekombinan DNA
adalah kumpulan teknik-teknik eksperimental
memungkinkan peneliti untuk mengisolasi,
mengidentifikasi, dan melipatgandakan suatu
fragmen dari materi genetika (DNA) dalam
bentuk murninya. Yang disebut terakhir bisa
berupa pengklonan dan pemindahan gen-gen
menjandi sifat-sifat ekonomis penting pada
tanaman, maupun pemanfaatan klon-klon
DNA sebagai masker (penanda) di dalam
membantu meningkatkan efisiensi seleksi
dalam program pemulihan tanaman.
 Keunggulan rekayasa genetika adalah mampu
memindahkan materi genetika dari sumber yang
sangat beragam dengan ketepatan tinggi dan
terkontrol dalam waktu yang lebih singkat. Melalui
proses rekayasa genetika ini, telah berhasil
dikembangkan berbagai organisme maupun produk
yang menguntungkan bagi kehidupan manusia.
Teknologi khusus yang digunakan dalam rekayasa
genetika meliputi teknologi DNA Rekombinan yaitu
pembentukan kombinasi materi genetik yang baru
dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu
vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi
dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel
organisme lain yang berperan sebagai sel inang.
 Manfaat Rekayasa Genetika
 Untuk mengurangi biaya dan meningkatkan
penyediaan sejumlah besar bahan yang
sekarang di gunakan di dalam pengobatan,
pertanian dan industri.
 Untuk menggembangkan tanaman–tanaman
pertanian yang bersifat unggul namun secara
praktis.
 Untuk menukar gen dari satu organisme
kepada organisme lainnya, menginduksi sel
untuk membuat bahan-bahan yang
sebelumnya tidak pernah dibuat.
 Prinsip dan Teknik Dasar Kloning DNA
Dasar dari pengembangan teknologi DNA
Rekombinan adalah ditemukannya
mekanisme seksual pada bakteri yang telah
dibuktikan pada tahun 1946. Konsekuensi
dari mekanisme seksual adalah:
1. Menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-
gen yang berasal dari dua sel yang berbeda.
[Link] pertukaran DNA atau gen dari satu
sel ke sel yang lain. Mekanisme seksual ini
tidak bersifat reproduktif atau tidak
menghasilkan keturunan.
 Transfer DNA atau perpindahan DNA ke
dalam bakteri dapat melalui tiga cara, yaitu
konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA
yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya
dapat berintegrasi dengan DNA atau
kromosom bakteri sehingga terbentuk
kromosom rekombinan.
1. Konjugasi
Merupakan perpindahan DNA dari satu sel
(sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel
resepien) melalui kontak fisik antara kedua sel.
Sel donor memasukkan sebagian DNA-nya ke
dalam sel resepien. Transfer DNA ini melalui
pili seks yang dimiliki oleh sel donor. Sel
resepien tidak memiliki pili seks. DNA dari sel
resepien berpindah ke sel resipien secara
replikatif sehingga setelah proses ini selesai,
sel jantan tidak kehilangan DNA. Ke dua sel
tidak mengalami peningkatan jumlah sel dan
tidak dihasilkan sel anak. Oleh karena itu,
proses konjugasi disebut juga sebagai proses
atau mekanisme seksual yang tidak
reproduktif.
2. Transformasi
Merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari
lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar
bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau
fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri yang lain atau
organisme yang lain. Masuknya DNA dari lingkungan ke
dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Pada
tahun 1928 ditemukan strain bakteri yang tidak virulen
dapat berubah sifatnya menjadi virulen disebabkan adanya
strain yang tidak virulen dicampur dengan sel-sel bakteri
strain virulen yang telah dimatikan. Tahun 1944 ditemukan
bahwa perubahan sifat atau transformasi dari bakteri yang
tidak virulen menjadi virulen disebabkan oleh adanya DNA
dari sel bakteri strain virulen yang masuk ke dalam bakteri
strain yang tidak virulen.
3. Transduksi
Adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel
lainnya melalui perantaraan bakteriofage. Beberapa jenis
virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-virus yang
inangnya adalah bakteri sering disebut bakteriofag atau fage.
Ketika virus menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya
ke dalam sel bakteri. DNA tersebut kemudian akan bereplikasi
di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom
baketri. DNA fage yang dikemas ketika membentuk partikel
fage baru akan membawa sebagian DNA bakteri yang menjadi
inangnya. Selanjutnya jika fage tersebut menginfeksi bakteri
yang lain, maka fage akan memasukkan DNAnya yang sebagian
mengandung DNA sel inang sebelumnya. Jadi, secara alami
fage memindahkan DNA dari satu sle bakteri ke bakteri yang
lain.
 Unsur-unsur yang esensial diperlukan dalam
kloning DNA adalah:
[Link] retraksi (enzim pemotong DNA)
[Link] vektor (pembawa)
[Link] ligase yang berfungsi menyambung rantai DNA
Adapun proses-proses dasar dalam kloning DNA
meliputi :
1. Pemotongan DNA (DNA organisme yang diteliti dan DNA
vektor)
2. Penyambungan potongan-potongan (fragmen) DNA
organisme dengan DNA vektor menggunakan enzim ligase
3. Transformasi rekombinan DNA (vektor + DNA sisipan) ke
dalam sel bakteri Eschericia coli.
4. Seleksi (screening) untuk mendapatkan klon DNA yang
diinginkan.
 Perangkat Teknologi DNA Rekombinan
Adapun perangkat yang digunakan dalam
teknik DNA rekombinan diantaranya enzim
restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase
untuk menyambung DNA, vektor untuk
menyambung dan mengklonkan gen di dalam
sel hidup dimana vektor yang sering
digunakan diantarnya plasmid dan
bakteriofag, pustaka genom untuk
menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah
diklonkan, serta enzim transkripsi balik
untuk membuat DNA berdasarkan RNA
(cDNA).
Enzim Restriksi
Enzim restriksi merupakan enzim yang
memotong molekul DNA. Karena enzim ini
memotong di bagian dalam molekul DNA,
maka enzim ini juga dinamakan
endonuklease restriksi. Enzim ini memotong
(menghidrolisis) DNA pada rangka gula-fosfat
tepatnya pada ikatan fosfodiester. Enzim
restriksi akan mengenali dan memotong DNA
hanya pada urutan nukleotida tertentu,
biasanya sepanjang 4 hingga 6 pasang basa.
 Enzim restriksi memiliki beberapa karakteristik,
diantaranya:
a. Enzim restriksi mengenali urutan nukleotida spesifik.
b. Enzim restriksi memotong ikatan fosfodiester diantara basa
spesifik, satu di setiap helai DNA.
c. Hasil dari masing-masing reaksi tersebut yakni dua buah
fragmen DNA untai ganda.
d. Enzim restriksi tidak membeda-bedakan antara DNA yang
berasal dari organisme yang berbeda.
e. Sebagian besar enzim restriksi akan memotong DNA yang
mengandung urutan pengenalan mereka, tidak
mempermasalahkan sumber DNA tersebut.
f. Enzim restriksi merupakan bagian alami dari sistem pertahanan
bakteri.
g. Enzim retriksi disebut juga endonuklease. Enzim-enzim ini
memotong rantai ganda DNA pada tempat-tempat tertentu.
Cara kerja enzim restriksi adalah dengan mengenal sekuens
(urutan basa) tertentu pada DNA, kemudian baru melakukan
pemotongan.
 Enzim DNA Ligase
DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis
pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat
dan 3’-hidroksil pada DNA saat terjadinya replikasi DNA,
rekombinasi dan kerusakan. Sacara biologis, DNA ligase
diperlukan untuk menggabungkan fragmen okazaki saat
proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA
yang baru disintesis serta berperan dalam proses reparasi
DNA. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna
baik di dalam sel maupun di luar sel. Untuk penggunaan di
luar sel , penggabungan dengan enzim restriksi telah
membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA
rekombinan. Enzim restriksi diibaratkan sebagai gunting
yang memungkinkan untuk memotong DNA di tempat yang
spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang
menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi
DNA yang fungsional.
 Vektor
Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar
sel, para ilmuwan dalam bioteknologi harus bisa membuat suatu
tempat yang keadaannya stabil dan cocok dengan tempat DNA
yang dimanipulasi. Vektor disini bisa diartikan sebagai alat yang
membawa DNA ke dalam sel induk barunya. Agar suatu metode
dalam rekayasa genetika berhasil maka di dalam vektor DNA hasil
rekombinan hanya membawa DNA rekombinan yang digabungkan
dengan DNA vektor melalui enzim ligase. Namun di dalam vektor,
DNA rekombinan tidak termutasi lagi membentuk DNA dengan
sifat baru. Adapun contoh dari vektor yang terdapat di alam
adalah plasmid dan virus atau bacteriophage.
1. Plasmid adalah molekul DNA yang terpisah dan dapat bereplikasi
secara independen dari DNA kromosom. Di dalam satu sel bakteri,
dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang
sangat bervariasi namun semua plasmid tidak mengkodekan
fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut. Umumnya,
plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat
bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga
bila lingkungan kembali normal, DNA plasmid dapat dibuang.
2. Bacteriophage salah satu vektor yang banyak digunakan dalam
teknologi DNA rekombinan adalah bacteriophage atau faga
yaitu virus yang menginfeksi bakteri. Seperti halnya virus, fage
harus menginfeksi bakteri yang menjadi inangnya. Setelah
jumlahnya mencukupi, fage akan melisis sel inang dan dapat
menghasilkan banyak fage untuk setiap sel bakteri yang
mengalami lisis. Oleh karena itu jumlah fage menjadi sangat
besar bila yang mengalami lisis adalah kumpulan bakteri
(koloni). Oleh karena itu vektor yang berupa bacteriophage
sangat menguntungkan jika DNA yang disisipkan ingin
diperbanyak dalam jumlah besar. Kontruksi pustaka genom juga
banyak menggunakan fage sebagai vektornya. Selain
kemampuan membawa DNA sisipan lebih besar dari plasmid,
penyimpanan fage relatif lebih mudah dibandingkan dengan
bakteri. Penggunaan fage sebagai vektor juga menguntungkan
dalam proses penapisan untuk mengisolasi suatu gen atau DNA,
karena rasio copy DNA atau gen target terhadap genom total
fage jauh lebih tinggi daripada rasio copy DNA terhadap genom
total bakteri bilamana menggunakan plasmid sebagai
vektornua.
 Enzim Transkriptase Balik
Enzim transkriptase-balik adalah enzim yang secara
alami digunakan oleh Retrovirus untuk membuat copy DNA
berdasarkan RNA-nya. Enzim transkriptase balik ditemukan
oleh Howard Temin dan David Baltimore secara terpisah
pada tahun 1970 tidak lama setelah penemuan enzim
restriksi. Enzim transkriptase balik ini kemudian digunakan
untuk mengkonstruksi copy DNA yang disebut cDNA
(complementary DNA) dengan menggunakan mRNA sebagai
cetakannya. Tujuan mengkonversi mRNA menjadi cDNA
adalah karena DNA sifatnya lebih stabil dari pada RNA.
Setelah dikonversi, untai cDNA tersebut dapat digunakan
untuk PCR, sebagai probe untuk analisis ekspresi dan untuk
perbanyakan/ cloning sekuen mRNA. Jika seorang peneliti
ingin mengekspresikan suatu protein spesifik dalam sel
yang tidak lazim memproduksi protein tersebut, satu cara
sederhana adalah dengan mentransfer cDNA yang
mengkode protein tersebut ke sel resipien.
 Pustaka Genom
Pustaka genom merupakan sekumpulan sekuens
(urutan) DNA dari suatu organisme yang masing-masing
telah diklon ke dalam vektor tertentu untuk memudahkan
pemurnian, penyimpanan, dan analisisnya. Pada dasarnya
terdapat dua macam perpustakaan gen yang dapat
dikonstruksi, bergantung kepada sumber DNA digunakan.
Jika DNA yang digunakan adalah DNA genomik/kromosom,
maka perpustakaan yang dihasilkan disebut perpustakaan
genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakan
merupakan hasil transkripsi balik suatu populasi mRNA
seperti yang umum dijumpai pada eukariot, maka
perpustakaan yang diperoleh dinamakan perpustakaan
cDNA.
 Proses dan Teknik Dasar Kloning DNA
Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu
produk yang diinginkan melalui teknologi DNA
rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu.
Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA
genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan
molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan
berbagai ukuran, penyisipan fragmen DNA ke dalam
vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan,
transformasi sel inang menggunakan molekul DNA
rekombinan, pengklonaan vektor pembawa DNA
rekombinan, dan identifikasi klon sel yang membawa
gen yang diinginkan. Bakteri merupakan sel inang
yang paling umum digunakan untuk mengklonaan gen,
terutama karena mudahnya DNA dapat diisolasi dari
dan dimasukkan kembali ke dalam sel tersebut.
Kultur bakteri juga tumbuh cepat dan secara cepat
mereplikasi setiap gen asing yang dibawanya.
1. Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan mempersiapkan dua jenis DNA
yaitu plasmid bakteri yang akan digunakan sebagai vektor
dan DNA yang mengandung gen yang diinginkan. Plasmid
yang dipilih merupakan plasmid yang mengandung amp-R
(gen pengkode sifat resisten terhadap antibiotik
amphisilin) dan lac Z (pengkode enzim β-galaktosidase).
Kemudian dilakukan perusakan dan atau pembuangan
dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara
mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh
maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim.
2. Pemotongan Molekul DNA
Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan
molekul DNA, baik genomik maupun plasmid.
Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat
ditemukannya enzim restriksi dan modifikasi DNA pada
bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau
bakteriofag l (faga temperat).
3. Ligasi Molekul–molekul DNA
Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor
menggunakan enzim restriksi harus
menghasilkan ujung-ujung potongan yang
kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA
genomik nantinya harus dapat disambungkan
(diligasi) dengan DNA vektor yang sudah
berbentuk linier.
4. Transformasi Sel Inang
Tahap berikutnya setelah ligasi adalah
analisis terhadap hasil pemotongan DNA
genomik dan DNA vektor serta analisis hasil
ligasi molekul-molekul DNA tersebut
menggunakan teknik elektroforesis.
5. Pengklonaan Sel dan Gen Asing
Bakteri hasil transformasi ditempatkan pada medium
nutrient padat yang mengandung amphisilin dan gula
yang disebut X-gal. Amphisilin dalam medium yang
akan memastikan bahwa hanya bakteri yang
mengandung plasmid yang dapat tumbuh karena
adanya resistensi dari amp-R. Sedangkan X-gal akan
memudahkan identifikasi koloni bakteri yang
mengandung gen asing yang disisipkan.
6. Identifikasi Klon Sel yang Membawa Gen yang
Diinginkan
Setelah tumbuh membentuk koloni, bakteri yang
mengandung DNA rekombinan diidentifikasi
menggunakan metode hibridisasi asam nukleat.
Dalam pengujian hibridisasi DNA, DNA dari virus atau
sel akan didenaturasi dengan larutan basa sehingga
kedua untai DNA-nya terpisah.
 Dampak dari Penerapan Rekayasa Genetika
1. Aspek Sosial
 Aspek agama
 Aspek etika dan estetika
2. Aspek Ekonomi
3. Aspek Kesehatan
 Potensi toksisitas bahan pangan
 Potensi menimbulkan penyakit/gangguan kesehatan
4. Aspek Lingkungan
 Potensi erosi plasma nutfah
 Potensi pergeseran gen
 Potensi pergeseran ekologi
 Potensi terbentuknya barrier species
 Potensi mudah diserang penyakit