Jurnal Farmasi Indonesia Vol. 3 No.
4 Juli 2007: 168 – 175 168
EFEK SITOTOKSIK DAN ANTIPROLIFERATIF
EKSTRAK KLOROFORM BUAH MAHKOTA DEWA
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D
Nunuk Aries Nurulita dan Agus Siswanto
Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto
ABSTRACT
The study on anticancer activity of P. macrocarpa fruit extract had been done. This study was
aimed to know cytotoxic and antiproliferative activity of P. macrocarpa Chloroform extract to
T47D cell. Cytotoxic and antiproliferative assay of it was done by MTT method. The doubling
time and AgNORs staining were used to identify proliferative inhibition of it. Apoptosis of T47D
phenomenon wa identified by doubling time method with ethidium bromide-acridyne orange.
The result showed than LC50 of P. macrocarpa fruit extract was 103,03 μg/ml. it has
antiproliferative effect and prolong doubling time. It also induced apoptosis of T47D cell.
Keywords : Phaleria macrocarpa, T47D, cytotoxic, antiproliferative
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian mengenai efek antikanker ekstrak buah mahkota dewa terhadap sel
kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik dan antiproliferasi
ekstrak kloroform P. macrocarpa pada sel T47D. Uji sitotoksik dan antiproliferatif ekstrak
kloroform buah mahkota dewa dilakukan dengan metode MTT. Untuk melihat penghambatan
proliferasinya dilakukan dengan metode doubling time dan pengecatan AgNORs. Fenomena
apoptosis sel T47D yang diberi perlakuan ekstrak kloroform P. macrocarpa dilihat dengan
metode double stainning dengan etidium bromida-akridin oranye. Hasil penelitian menunjukkan
nilai LC50 sebesar 103,03 μg/ml. ekstrak ini mempunyai efek antiproliferasi dan mampu
memperpanjang waktu doubling time. Pengamatan apoptosis dengan double staining
menggunakan etidium bromidaakridin oranye, menunjukkan dapat memacu apoptosis sel T47D.
Kata kunci : Mahkota dewa, Phaleria macrocarpa, T47D, sitotoksik, antiproliferatif
PENDAHULUAN
Kanker payudara dan leher rahim merupakan dua macam kanker yang
frekuensi kejadiannya paling tinggi diantara kanker-kanker jenis lain yang sering
menyerang wanita. Hal ini tidak terjadi di suatu tempat saja, namun hampir seluruh
dunia. Penelitian di Amerika menyatakan bahwa satu daridelapan wanita Amerika
terserang kanker payudara dan 30 % dari penderita mengalami kematian (1).
Di Indonesia, prevalensi kanker menduduki peringkat ke-2 setelah kanker leher rahim
dan merupakan penyebab kematian utama bagi kaum wanita (2).
Pengatasan kanker umumnya didasarkan pada upaya pengangkatan jaringan atau dengan
mematikan sel kanker tersebut serta meminimalkan efek samping yang tidak diinginkan terhadap
sel normal. Operasi atau pembedahan merupakan salah satu cara untuk mengangkat jaringan
kanker. Pengatasan ini harus diimbangi dengan kemoterapi atau penyinaran dengan sinar X
untuk mengatasi kemungkinan sel telah mengalami metastasis dan untuk menghambat proliferasi
sel kanker yang mungkin masih tertinggal (1). Pada umumnya, kemoterapi dan penyinaran yang
dilakukan pasca operasi tetap mengalami kesulitan jika sel kanker telah mengalami metastasis
yang luas. Disamping itu, biasanya penderita kurang dapat bertahan dengan efek samping yang
timbul dari pengobatan yang diberikan. Mempertimbangkan kondisi tersebut maka perlu
diupayakan pengatasan kanker dengan menghambat atau mematikan pertumbuhan sel kanker
secara selektif, disertai upaya meminimalkan efek samping.
Beberapa penelitian melaporkan bahwa bahan-bahan dari tanaman ternyata memiliki
potensi sebagai regulator negatif onkogen dan regulator positif gen tumor suppressor, sehingga
berpotensi sebagai antikanker. Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl) secara
empiris sudah dikenal oleh masyarakat sebagai tanaman obat yang secara turun temurun sudah
digunakan sebagai antiinflamasi dan obat penyakit kanker.
Novetiana (3) dan Sumarningsih (4) telah meneliti mengenai toksisitas ekstrak kloroform
buah dan biji P. macrocarpa terhadap Artemia salina. Ekstrak kloroform buah [Link]
juga telah diketahui dapat menghambat neovaskularisasi (angiogenesis) pada Corio Alantois
Membrane (CAM), sebagai model angiogenesis pada sel kanker (5). Hasil penelitian tersebut
menunjukkan bahwa tanaman tersebut mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai
antikanker melalui beberapa kemungkinan mekanisme. Sampai sejauh ini belum pernah
dilakukan yang mengungkap potensi antikanker ekstrak kloroform buah P. macrocarpa terhadap
sel kanker payudara
Mekanisme pembentukan kanker yang sangat komplek menjadikan penelitian penemuan
obat kanker menjadi sesuatu yang sangat penting dan rumit. Sampai saat ini belum ditemukan
obat yang mampu membunuh sel kanker secara keseluruhan, tetapi masih terbatas pada
penghambatan proses pembentukan kanker.
Target terapi awal dari agen-agen antikanker adalah membunuh sel-sel kanker secara
spesifik sekaligus menghambat proliferasinya. Telah banyak calon obat antikanker yang
didasarkan pada target tersebut dan hingga kini masih menjalani berbagi tingkat pengujian
preklinik maupun klinik. Namun dari semua itu hanya sedikit saja yang bisa direkomendasikan
hasilnya untuk pengobatan formal.
Pada beberapa penelitian menunjukkan bahwa Mahkota dewa mempunyai potensi untuk
dikembangkan sebagai antikanker melalui beberapa kemungkinan mekanisme. Penelitian ini
dirancang untuk mengetahui [Link] mempunyai aktivitas antikanker terhadap sel
kanker payudara T47D melalui efek sitotosik dan penghambatan proliferasi sel, sehingga dapat
menghambat perkembangan kanker.
METODOLOGI PENELITIAN
Uji sitotoksik
Suspensi sel dipipet dan dimasukkan kedalam sumuran, inkubasikan bersama sampel
pada berbagai kadar selama 24 jam. Masing-masing sumuran ditambah 100 μl MTT 5 mg/ml
dalam RPMI. Kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C. Sel yang hidup akan
bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Reaksi dengan MTT dihentikan dengan reagen
stopper, diinkubasi semalam. Serapan dibaca menggunakan ELISA reader pada l 550 nm.
Pengamatan kinetika proliferasi sel dengan uji doubling time
Sel dengan jumlah tertentu ditumbuhkan dalam plate 96 sumuran diinkubasikan selama
24 jam, kemudian ditambahkan larutan sampel dalam medium dengan kadar di bawah IC50 dari
uji sitotoksisitas. Sampling dilakukan pada jam ke 12, 24, 48, dan 72. Sel yang hidup akan
bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Reaksi dengan MTT dihentikan dengan reagen
stoper, lalu inkubasikan semalam pada suhu kamar. Serapan dibaca menggunakan ELISA reader
pada panjang gelombang 550 nm.
Pengecatan AgNOR
Sel (kepadatan 1,5 X 104 sel/sumuran) ditanam pada coverslips dalam plate 24 sampai 50
% konfluen. Medium diambil dan sel pada coverslips difiksasi dengan etanol absolut selama 30
menit. Setelah itu, sel pada coverslips diinkubasi dalam larutan pewarna AgNOR selama 45
menit pada suhu kamar di kamar gelap. Larutan pewarna AgNOR merupakan campuran 1 bagian
gelatin 0,5 % dalam asam formiat 1 % dengan 2 bagian larutan perak nitrat 45 %. Selanjutnya,
sediaan dicuci dengan akuades dan direhidrasi secara bertahap dengan etanol. Cover slip yang
memuat sel diangkat, diletakan diatas objek glass dengan diberi mounting. Sediaan
dibersihkandengan xylen.
Analisis
Uji sitotoksisitas: Data yang diperoleh dari uji sitotoksik dihitung dengan menggunakan rumus:
% viable cells = (abs p-abs med)/(abs k-abs m) x 100% abs p : absorbansi perlakuan, abs k : sel
kontrol, abs m : absorbansi medium
Kemudian dilanjutkan analisis statistic dengan uji korelasi untuk menentukan persamaan garis
regresi dan menentukan nilai IC50.
Uji pengamatan kinetika proliferasi: Data doubling time dianalisis statistic dengan:
a. Uji korelasi waktu pengamatan versus absorbansi untuk menentukan persamaan garis regresi.
b. Uji t untuk menentukan signifikansi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Sitotoksik Ekstrak Kloroform terhadap Sel T47D
Penelitian ini dimulai dengan uji sitotoksik, dengan tujuan untuk menentukan parameter
ketoksikan yaitu LC 50 yang menunjukkan potensi ketoksikan ekstrak kloroform mahkota dewa.
LC50 menunjukkan kadar senyawa uji yang mampu menghambat cell viability sebesar 50%.
nilai LC50 juga digunakan sebagai patokan untuk menentukan konsentrasi senyawa uji dalam uji
doubling time. Persentasi Sel Hidup Dan Nilai Probit Sel T T47D yangdiinduksi E2 10-8 M
dengan perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak mahkota dewa disajikan dalam Tabel 1.
Tabel 1
Persentasi Sel Hidup Dan Nilai Probit Sel T T47D yang diinduksi E2 10-8 M dengan
perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak mahkota dewa
Kadar (ug/ml) Log Kadar % Kematian C. sappan Kematian Kontrol
%
5 0,69897 - 1,12 - 1,09
10 1 5,88 2,29
25 1,39794 25,09 2,76
50 1,69897 36,56 2,9
100 2 40,67 3,37
250 2,39794 70,6 3,77
500 2,69897 80,66 3,64
Y = 41,701 X – 33,943 LC = 103,03 ug/ml R = 0,9786
Gambar 1 menunjukkan profil pertumbuhan sel T47D yang yangdiberi perlakuan
berbagai konsentrasi ekstrak mahkota dewa. Efek sitotoksik terhadap sel T47D berbanding lurus
dengan konsentrasi senyawa uji. Semakin besar konsentrasi senyawa uji, semakin kecil
persentasi sel T47D yang hidup. Hal ini menunjukkan bahwa efek sitotoksik ekstrak mahkota
dewa bersifat dose dependent.
Nilai LC50 ekstrak kloroform buah mahkota dewa pada penelitian ini sebesar 103,03
g/ml didapat dengan melihat efek sitotoksik terhadap sel ini selama 24 jam. Hal ini memberikan
harapan besar pengobatan kanker payudara ER-positif (diwakili sel T47D) sehingga perlu
dilakukan uji lebih lanjut berupa uji doubling time untuk melihat lebih jauh pengaruh ekstrak
kloroform buah mahkota dewa terhadap sel T47D.
Efek Penghambatan Proliferasi PGV-0 dan Kurkumin pada Sel T47D
Cell cycle progression merupakan parameter utama dalam mengukur sifat proliferatif suatu sel
kanker (6-8). Senyawa yang dapat menunda waktu penggandaan sel, diduga dapat menghambat
gengen atau protein yang meregulasi daur sel.
Gambar 1. Efek perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak kloroform buah mahkota dewa
terhadap sel T47D
Penghambatan cell cycle progression dilakukan dengan uji doubling time. Analisis
pengamatan kinetika proliferasi sel T47D akibat pengaruh perlakuan senyawa uji dilakukan
dengan membuat plot grafik waktu vs absorbansi (Gambar 2). Hambatan proliferasi sel dilihat
dari nilai slope pada kurva atau dihitung dengan cara ekstrapolasi (9). Slope yang lebih kecil
menunjukkan perpanjangan doubling time.
Pada Gambar 2 dapat dilihat bahwa ekstrak kloroform buah mahkota dewa dengan
konsentrasi 100 mg/ml dapat menghambat laju proliferasi sampai jam ke 48. Ini diduga karena
ekstrak ini dapat mempengaruhi gen dan protein yang meregulasi daur sel serta dapat
menghambat cell cycle progression.
Gambar 2. Kinetika proliferasi sel kanker payudara T47D yang diberi perlakuan ektrak
mahkota dewa 100 ug/ml dibandingkan dengan control
Untuk mendukung data penghambatan proliferasi sel dapat diperoleh dengan melakukan
pengecatan AgNORs. Target dari pengecatan AgNOR adalah Nucleolar Organizer Regions
(NORs), merupakan loop DNA pada tangan pendek 5 kromosom akrosentrik (13,14, 15, 21, dan
22) yang berhubungan dengan gen-gen RNA ribosomal dan protein lain terkait. Protein tersebut
antara lain RNA polymerase I, C23 (nucleolin), dan B23 (numatrin), yang akan tampak dengan
pengecatan argyrophilic, kemudian disebut dengan AgNOR. AgNOR tampak sebagai bintik-
bintik hitam di dalam nukleoli (Gambar 3).
Banyaknya titik hitam tersebut menunjukkan adanya korelasi dengan tingkat proliferasi
sel. Untuk mengetahui tingkat proliferasi sel, dilakukan penghitungan rata-rata mAgNOR yaitu
perbandingan antara jumlah bintik hitam yang terdapat dalam nukleoli dengan jumlah sel.
Foto mikroskopis pengecatan AgNOR memperlihatkan sel T47D kontrol memiliki bintik
AgNOR lebih banyak dibandingkan dengan sel yang diberi perlakuan ekstrak kloroform buah
mahkota dewa. Data ini menunjukkan kemampuan menekan proliferasi sel T47D, yang dapat
memperkuat data doubling time. Hal ini didukung oleh hasil perhitungan mAgNOR yang
menunjukkan bahwa jumlah rata-rata titik hitam (NORs) sel T47D control yang diinduksi E2
sebanyak 3,98. Sedangkan pada yang diberi perlakuan ekstrak mahkota dewa sebanyak 1,72.
Data-data sitotoksik dan doubling time yang telah dipaparkan di muka menunjukkan
adanya fenomena kematian sel dan penghambatan cell cycle progression. Perlakuan senyawa uji
tidak menghentikan daur sel hanya kemungkinan besar terjadi proses cell cycle delay atau
penundaan daur sel yang disebabkan adanya perubahan pada regulator daur sel. Kematian sel
akibat perlakuan senyawa uji dapat melalui mekanisme cell cycle arrest dahulu baru mengalami
apoptosis atau langsung mengalami apoptosis. Untuk mengetahui lebih jelas mekanisme
penghambatan proliferasi sel T47D dan mekanisme kematian sel oleh ekstrak kloroform
mahkota dewa maka dilakukan pengecatan doublestainning DNA menggunakan etidium
bromida-akridin oranye.
Gambar 3. Foto Mikroskopis pada Pengecatan AgNOR Sel T47D kontrol dan dengan
perlakuan ekstrak kloroform mahkota dewa 100 mg/ml A. kontrol, B. Ekstrak kloroform
mahkota dewa
Stimulasi Apoptosis Pada Sel T47D Karena Perlakuan Ekstrak Kloroform Mahkota Dewa
Pengecatan dengan etidium bromida atau akridin oranye secara terpisah kurang
memberikan hasil yang memuaskan karena fenomena apoptosis kurang jelas terlihat. Oleh
karena itu, pada penelitian ini digunakan double stainning dengan etidium bromida-akridin
oranye untuk mengamati apoptosis. Teknik pewarnaan dengan metode ini dapat menghasilkan
gambar yang kontras sehingga fenomena apoptosis akan lebih mudah diamati.
Etidium bromida dan akridin oranye mengikat DNA dengan cara berinterkalasi pada
DNA. Kedua senyawa ini dapat berflouresensi dengan baik. Ethidium bromide berflouresensi
merah dan akridin orange berflouresensi hijau. Sel yang sudah mati karena apoptosis, DNAnya
juga akan berikatan dengan keduanya. Pengamatan morfologi sel dapat dilihat adanya fenomena
apoptosis pada sel T47D.
Gambar 4. Foto Mikroskopis pada Pengecatan etidium bromida-akridin oranye Sel T47D
kontrol dan dengan perlakuan ekstrak kloroform mahkota dewa 100 mg/ml. A. kontrol, B.
Ekstrak kloroform mahkota dewa Tanda panah menunjukkan fenomena apoptosis
Hasil double stainning sel T47D kontrol dan perlakuan ekstrak kloroform konsentrasi
100 mg/ml ditunjukkan pada Gambar 25. Pada kontrol DNA masih utuh, tidak terfragmentasi
yang tampak sebagai spot hijau terang berbentuk lonjong, serta tidak tampak adanya fenomena
kematian/apoptosis. Mekanisme apoptosis ditandai dengan kromatin yang mengalami
fragmentasi (King, 2000) dan akhirnya meninggalkan kepingan badan apoptosis (apoptotic body)
(8), yang berwarna merah. Fenomena apoptosis pada sel dengan perlakuan ekstrak tampak pada
hasil double staining, sel berwarna mera dan terdapat kepingan apoptotic body.
Ekstrak kloroform mahkota dewa memiliki kemampuan menghambat proliferasi sel
T47D. Mekanismenya kemungkinan melalui penghambatan signal transduksi melalui
penghambatan signal proliferasi, atau melalui penghambatan cell cycle progression dengan
menghambat protein-protein regulator positif daur sel : CycD, Cdk4/6, Myc. Ekstrak ini
kemungkinan dapat memacu tumour suppressor p53 dan memodulasi protein-protein regulator
apoptosis yaitu Bcl-2, Bax, NOXA, PUMA, dan sebagainya. Untuk dapat memastikan
mekanisme aksi mahkota dewa sebagai antikanker maka perlu dilakukan penelitian sampai pada
aras molekuler.
KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian ini adalah :
1. Ekstrak kloroform buah mahkota dewa mempunyai potensi sitotoksik yang cukup tinggi,
dengan LC 50 = 103,03 mg/ml.
2. Ekstrak kloroform buah mahkota dewa mempunyai kemampuan menghambat proliferasi sel
T47D yang cukup baik.
3. Ekstrak kloroform buah mahkota dewa dapat memacu terjadinya proses apoptosis pada sel
T47D.
DAFTAR PUSTAKA
1. King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd Edition, School of Biological Sciences,
University of Surrey, Pearson Education, Harlow-England- London-New York, p.228-
231, 263-264
2. Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo, R. 2002. Cancer in Indonesia, Present and Future.,
Jpn J Clin Oncol., 32 (Supplement 1): S17-S21.
3. Novetiana, M., 2002, Uji toksisitas buah phaleria macrocarpa terhadap Artemia salina
Leach dan profil Kromatografi Lapis Tipis ekstrak aktif, Skripsi, Fakultas Farmasi,
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
4. Sumarningsih, P., 2002, Uji toksisitas biji Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl. Terhadap
Artemia salina Leach dan profil Kromatografi Lapis Tipis ekstrak aktif, Skripsi, Fakultas
Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
5. Nurulita, N.A. dan Astuti, I.Y., 2004, Efek antikanker ekstrak kloroform buah mahkota
dewa (Phaleria macrocarpa) melalui penghambatan angiogenesis
6. Brem, S., MD, 1999, Angiogenesis and Cancer Control : From Concept to Therapeutic
Trial, Moffitt CancerCenter & Research Institute
([Link]
7. Meiyanto, E., 2002, Biologi Molekuler, Buku Ajar, Proyek QUE Fakultas Farmasi,
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
8. Meiyanto, E., 1999, Kurkumin Sebagai Obat Antikanker, Menelusuri Mekanisme
Aksinya, Majalah Farmasi Indonesia, 104(4), 224-236.
9. Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D., Keesey, J., and Manzow, S., 2000, Cell
death apoptosis and necrosis, Rosche DiagnosticCorporation