PENGARUH PENGGUNAAN ENZIM SELULASE

TERHADAP RENDEMEN DAN KARAKTERISTIK

BIOETANOL DARI LIMBAH PADAT INDUSTRI
SIRUP JERUK KALAMANSI YANG DIFERMENTASI
MENGGUNAKAN Saccharomyces cereviciae

SKRIPSI

Oleh:
Ria Ropiani
NPM. E1G017065

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

JURUSAN TEKNOLOGI PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BENGKULU
2021
 RINGKASAN

PENGARUH PENGGUNAAN ENZIM SELULASE TERHADAP RENDEMEN DAN

KARAKTERISTIK BIOETANOL DARI LIMBAH PADAT INDUSTRI SIRUP
JERUK KALAMANSI YANG DIFERMENTASI MENGGUNAKAN Saccharomyces
cereviciae (Ria Ropiani, dibawah bimbingan Marniza dan Syafnil. 2021. 65 halaman)

Kebutuhan akan bahan bakar seperti minyak bumi pada masa sekarang ini
mengalami peningkatan seiring dengan bertambahnya jumlah penduduk di setiap tahunnya.
Pengembangan sumber energi alternatif seperti bioetanol sangat diperlukan. Bioetanol dapat
diproduksi dari biomassa berlignoselulosa. Salah satu biomassa berlignolselulosa yang
berpotensi menjadi bahan baku pembuatan bioetanol adalah limbah padat industri sirup jeruk
kalamansi. Sebelum difermentasi, selulosa yang terkandung dalam limbah padat industri
sirup jeruk kalamansi harus dikonversi terlebih dahulu menjadi glukosa dengan melakukan
hidrolisis enzimatik. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan pengaruh penambahan
enzim selulase terhadap rendemen dan karakteristik bioetanol, serta menentukan konsentrasi
enzim selulase yang tepat untuk memperoleh rendemen dan kadar etanol tertinggi.
Bahan baku utama pada penelitian ini adalah limbah padat industri sirup jeruk
kalamansi berupa kulit dan pulp. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak
Kelompok (RAK). Setiap 1000 ml sampel yang terdiri 500 g limbah padat jeruk kalamansi
dihidrolisis menggunakan enzim selulase pada konsentrasi berbeda (0,5%, 0,7% , 0,9% , 1%,
dan 1,2%) pada suhu 50oC. Masing-masing perlakuan dilakukan 3 kali ulangan sehingga
diperoleh 15 unit percoban. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan Saccharomyces
cereviciae selama 5 hari. Parameter yang diamati adalah rendemen destilat, kadar etanol pada
15oC, keasaman (sebagai asam asetat), dan sisa penguapan maksimum. Data dianalisis dengan
menggunakan ANOVA (Analisis of Varian).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan enzim selulase konsentrasi berbeda
berpengaruh nyata terhadap rendemen destilat dan keasaman (sebagai asam asetat) namun
berpengaruh tidak nyata terhadap kadar bioetanol dan sisa penguapan maksimum. Rendemen
destilat mengalami peningkatan pada konsentrasi enzim selulase 0,5% sampai konsentrasi
1% sebesar 12,467% menjadi 20,8% namun mengalami penurunan pada konsentrasi enzim
selulase 1,2% sebesar 11,467%. Kadar bioetanol tertinggi diperoleh dari konsentrasi enzim
selulase 1,2% sebesar 12,389% dengan keasaman terendah yang diperoleh adalah 53 mg/L
dan sisa penguapan maksimum terendah adalah 0,167 mg/L.

(Program Studi Teknologi Industri Pertanian, Jurusan Teknologi Pertanian, Fakultas

Pertanian, Universitas Bengkulu)
 SUMMARY

EFFECT OF THE USE CELLULASE ENZYME ON THE YIELD AND

CHARACTERISTICS OF BIOETHANOL FROM SOLID WASTE OF THE
KALAMANSI ORANGE SYRUP INDUSTRY FERMENTED USING Saccharomyces
cereviciae (Ria Ropiani, under the guidance of Marniza and Syafnil. 2021. 65 pages)

The need for fuels such as petroleum at this time has increased along with the increase
in population every year. The development of alternative energy sources such as bioethanol is
urgently needed. Bioethanol can be produced from lignocellulosic biomass. One of the
lignocellulosic biomass that has the potential to be used as raw material for bioethanol
production is the solid waste of the Kalamansi orange syrup industry. Before being fermented,
the cellulose contained in the solid waste of the Kalamansi orange syrup industry must first be
converted to glucose by enzymatic hydrolysis. This study aims to determine the effect of the
addition of cellulase enzymes on the yield and characteristics of bioethanol. It also determine
the right concentration of cellulase enzyme to obtain the highest yield and ethanol content in
the manufacture of bioethanol.
The main raw material in this research is the solid waste of the kalamansi orange syrup
industry in the form of pulp and the peel. The design used was a Randomized Block Design
(RAK). Each 1000 ml of sample consisting 500 g of kalamansi orange solid waste was
hydrolyzed using cellulase enzyme at different concentrations (0.5%, 0.7%, 0.9%, 1%, and
1.2%) at a temperature of 50oC. Each treatment was repeated 3 times to obtain 15
experimental units. Fermentation was carried out using Saccharomyces cereviciae for 5 days.
Parameters observed were distillate yield, ethanol content at 15oC, acidity (as acetic acid), and
maximum residual evaporation. The data were analyzed using ANOVA.
The results showed that the addition of cellulase enzyme with different concentrations
had a significant effect on the yield of destilation and acidity (as acetic acid) but had no
significant effect on the bioethanol content and maximum residual evaporation. The yield of
destilation increased at 0.5% cellulase enzyme concentration to 1% concentration of 12.467%
to 20.8% but decreased to 1.2% cellulase enzyme concentration of 11.467%. The highest
bioethanol content was obtained from the cellulase enzyme concentration of 1.2%, which was
12.389%, with the lowest acidity obtained was 53 mg/L and the lowest maximum residual
evaporation was 0.167 mg/L.

(Agroindustrial Technology Study Program, Department of Agricultural Technology,

Faculty of Agriculture, University of Bengkulu)
 MOTTO DAN PERSEMBAHAN

Motto:
“Seberat apapun hidup yang kamu lalui, bersyukurlah dan teruslah berjuang. Ketika
hidupmu penuh perjuangan, kamu akan lebih menghargai hidup”

“Sesungguhnya bersama kesulitan, pasti ada kemudahan” (Q.S. Asy-Syarh:6)

Persembahan:
Alhamdulillah puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT karna berkat rahmat
dan hidayah-Nya, selalu melimpahkan nikmat kesehatan, kebahagiaan, kesempatan, dan
kekuatan di setiap langkah sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik.
Skripsi ini penulis persembahkan kepada:
1. Kedua orang tua yang penulis cintai, Bapak Suparjo dan Ibu Kasirah, yang selalu
memberikan kasih sayang, semangat, dukungan, serta doa yang tiada henti. Terima
kasih untuk semuanya.
2. Kakak dan mbak serta keluarga besar yang penulis cintai yang telah memberikan kasih
sayang, doa, dukungan dan motivasi, selalu siap membantu dikala sedang dibutuhkan.
3. Bapak Malin dan Ibu Irma selaku orang tua angkat, yang telah memberikan doa,
semangat dan dukungan untuk terus berjuang dalam menempuh pendidikan ini.
4. Dosen pembimbing utama Ir. Marniza, [Link] dan dosen pembimbing pendamping, Drs.
Syafnil, M. Si.
5. Staff dosen dan karyawan Jurusan Teknologi Pertanian.
6. Teruntuk sahabat dan teman-teman seperjuangan TIP 2017.
7. Almamater kebanggaan Universitas Bengkulu.
 UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis menyadari akan keterbatasan ilmu dan kemampuan dalam menyelesaikan

skripsi ini. Dalam penyelesaian skripsi ini tidak terlepas dari bantuan, doa dan dukungan dari
berbagai pihak. Oleh karena ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini dengan baik.
2. Kedua orang tua tercinta bapak Suparjo dan Ibu Kasirah yang telah memberikan kasih
sayangnya, semangat, dukungan, doa-doa terbaik tiada hentinya serta rela berkorban
demi kesuksesan penulis.
3. Saudara laki-laki dan saudara perempuan penulis, mbak Wasitoh, mbak Supriyati, Kak
Rohib, Kak Waryono, Mbak Siti „Aisyah, Mbak Nur „Ainah, dan Mbak Rohana dan
keluarga besar yang selalu memberikan nasihat, semangat, dukungan dan doa yang
tiada hentinya.
4. Bapak Malin dan Ibu Irma serta keluarga besar RM. Bungo Tanjung yang telah
memberikan dukungan dan doa kepada penulis selama perkuliahan.
5. Ibu Ir. Marniza, [Link]. selaku pembimbing utama sekaligus pembimbing akademik
yang telah meluangkan waktunya membimbing dengan ikhlas dan sabar selama
perkuliahan, selalu memberikan motivasi, semangat, nasihat, dan perhatiannya kepada
penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
6. Bapak Drs. Syafnil, [Link]. dan Ibu Tuti Tutuarima, [Link]., [Link]. selaku pembimbing
pendamping yang telah meluangkan waktunya membimbing dengan ikhlas dan sabar,
memberikan semangat, nasihat, motivasi, dan perhatiannya kepada penulis dalam
menulis skripsi ini.
7. Bapak Prof. Dr. Ir. Yuwana, [Link] dan Ibu Dra. Devi Silsia, [Link]. selaku dosen
penguji skripsi yang telah membantu mengarahkan, memberikan kritikan, saran, dan
masukan dalam menulis skripsi ini.
8. Seluruh dosen Jurusan Teknologi Pertanian yang telah mendidik dan memberikan
ilmu pengetahuan selama perkuliahan dan penyelesaian skripsi ini.
9. Ketua dan Staf Laboratorium Teknologi Pertanian yang telah banyak membantu
memfasilitasi selama proses penelitian.
10. Karyawan Jurusan Teknologi Pertanian yang telah membantu, memberikan informasi,
dan memberikan arahan.
11. Sahabat until jannah, Yola Denita Damayanti, Wiwit Purwaningsih, Linda Juitasari,
Friska Anjar Wati, Indah Ismaya, Muhammad Zufrizal, Ivan Reynaldi, dan Aji
 Saputra yang telah menjadi sahabat yang baik, memberikan semangat dan motivasi
kepada penulis.
12. Sahabat semangat belajar, Dwi Puspa Cahayuningtyas, Eliza Ragista, Khairini Annida
Saffiq, Agung Prabowo, Davo Starky Araska Selian, Dendi Heryanto, Febby
Muhammad Iqbal, Feri Abdi, Fikri Isnandri, Hendri Fadly Lubis, Rayendra
Agustian, dan Pebri Budiarmawan yang telah memberikan semangat, motivasi, dan
dukungan yang telah banyak membantu selama perkuliahan dan penelitian sehingga
penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
13. Teman-teman seperjuangan TIP 2017 yang tidak bisa disebutkan satu persatu yang
telah membantu selama perkuliahan dan memberikan semangat dalam menyelesaikan
skripsi ini.
14. Saudari Winda Nuraini, Novita Liza Okta, Sinta Monica, Iza Friasti Horipa, Liana
Oktaviani, Reni Suryani, Febi Putri Wardani, Febrizany Sanjung M. F., dan masih
banyak lagi yang merupakan teman dekat dan telah memberikan semangat dan
dukungan kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
15. Teman-teman dari LD Force yang tidak bisa disebutkan satu persatu telah memberikan
semangat dan motivasi kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
16. Semua pihak yang telah membantu selama perkuliahan yang tidak bisa disebutkan satu
persatu.
 RIWAYAT HIDUP

Penulis skripsi ini bernama lengkap Ria Ropiani, dilahirkan di Sumber

Rejo, 24 November 1997. Penulis merupakan putri bungsu dari pasangan
Bapak Suparjo dan Ibu Kasirah. Penulis mengawali jenjang pendidikan
di SD Negeri 9 Kerkap (2004-2010). Penulis melanjutkan pendidikan di
SMP Negeri 4 Arga Makmur (2010-2013) kemudian melanjutkan ke
SMA Negeri 1 Hulu Palik (2013-2016). Penulis melanjutkan kuliah di
Universitas Bengkulu S-1 program studi Teknologi Industri Pertanian
(TIP) melalui jalur SBMPTN pada tahun 2017. Penulis aktif dalam organisasi kampus yaitu
sebagai anggota Himpunan Mahasiswa Teknologi Industri Pertanian (HIMATIN), anggota
pengurus Keputrian UKM Muslim Generation Club (MGC) FP UNIB 2018, anggota
pengurus Study Qur‟an Terpadu (SQT) UKM MGC FP UNIB 2019. Penulis juga aktif dalam
organisasi eksternal kampus yaitu menjadi bendahara departemen Community Service
Management (CSM) LD Force 2021.
Penulis pernah menjadi ko-assisten praktikum pada mata kuliah Pendidikan Agama
Islam, Kimia, dan Biokimia. Penulis melaksanakan Praktek Kerja (PK) di PT. Sarana Mandiri
Mukti, Kabupaten Kepahiang, Bengkulu pada bulan Oktober 2021. Penulis melaksanakan
Kuliah Kerja Nyata (KKN) periode 91 di Desa Sumber Rejo, Kecamatan Hulu Palik,
Kabupaten Bengkulu Utara, Bengkulu. Penulis melaksanakan penelitian di Laboratorium
Teknologi Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas Bengkulu pada bulan Maret-Juni 2021 di
bawah bimbingan Ibu Ir. Marniza, [Link] selaku pembimbing utama dan Bapak Drs. Syafnil,
[Link] selaku pembimbing pendamping.
 KATA PENGANTAR

Alhamdulillaahirobbil‟aalamiin. Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang

Maha Esa yang telah memberikan rahmat, taufik, dan karuniaNya sehingga penulis dapat
meyelesaikan seluruh rangkaian penelitian dan penyusunan Skripsi yang berjudul “Pengaruh
Penggunaan Enzim Selulase Terhadap Rendemen dan Karakteristik Bioetanol dari Limbah
Padat Industri Sirup Jeruk Kalamansi yang Difermentasi Menggunakan Saccharomyces
cereviciae” meskipun banyak kekurangan di dalamnya. Skripsi ini dibuat sebagai salah satu
syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Program Studi Teknologi
Industri Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Bengkulu.
Dalam penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bimbingan, doa, dan dukungan dari
berbagai puhak. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Ir. Marniza, [Link]. selaku
pembimbing utama sekaligus pembimbing akademik yang selalu memberikan dukungan,
masukan dan bimbingan dalam penyusunan skripsi. Kepada Ibu Tuti Tutuarima, [Link]., [Link].
dan Bapak Drs. Syafnil, [Link]. selaku dosen pembimbing pendamping yang telah memberi
masukan dan membimbing dalam penyusunan skripsi. Serta kepada semua pihak yang telah
membantu dan memberikan semangat dalam penyelesaian skripsi ini.
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa di dalam skripsi ini terdapat kekurangan dan
jauh dari kata sempurna. Oleh sebab itu, penulis berharap adanya kritik, saran dan usulan
untuk perbaikan di masa yang akan datang mengingat tidak ada sesuatu yang sempurna
tanpa saran yang membangun. Semoga skripsi ini bermanfaat dan dapat menjadi bahan
pembelajaran bagi penulis sendiri maupun pembaca. Akhir kata penulis mengucapkan terima
kasih.

Bengkulu, September 2021

Ria Ropiani
NPM. E1G017065

xii
 DAFTAR ISI

Halaman
KATA PENGANTAR .................................................................................................... xii
DAFTAR ISI .................................................................................................................. xiii
DAFTAR TABEL .......................................................................................................... xv
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................. xvii
I. PENDAHULUAN ................................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ...................................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................. 3
1.3 Tujuan ................................................................................................................... 3
1.4 Batasan Masalah ................................................................................................... 3
1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................................ 4
II. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................................... 5
2.1 Jeruk Kalamansi .................................................................................................... 5
2.1.1 Limbah Industri Sirup Jeruk Kalamansi......................................................... 6
2.2 Bioetanol ............................................................................................................... 6
2.3 Hidrolisis ............................................................................................................... 8
2.4 Enzim Selulase dan Aplikasi pada Hidrolisis Selulosa ........................................ 9
2.3.1 Faktor-Faktor yang Memengaruhi Kinerja Enzim Selulase ........................... 10
2.4 Fermentasi ............................................................................................................. 11
2.4.1 Faktor-Faktor yang Memengaruhi Fermentasi............................................... 12
2.5 Saccharomyces cereviciae .................................................................................... 13
III. METODE PENELITIAN ........................................................................................ 15
3.1 Waktu dan Tempat ................................................................................................ 15
3.2 Alat dan Bahan Penelitian..................................................................................... 15
3.2.1 Alat Penelitian ................................................................................................ 15
3.2.2 Bahan Penelitian ............................................................................................. 15
3.3 Rancangan Penelitian ............................................................................................ 15
3.4 Tahapan Penelitian ................................................................................................ 16
3.4.1 Pembuatan Wadah Fermentor ........................................................................ 16
3.4.2 Persiapan Bahan Baku .................................................................................... 16
3.4.3 Hidrolisis Menggunakan Enzim ..................................................................... 17
3.4.4 Fermentasi ...................................................................................................... 17
3.4.5 Destilasi .......................................................................................................... 17
3.5 Parameter Pengamatan .......................................................................................... 18
3.5.1 Rendemen Destilat ......................................................................................... 18
3.5.2 Kadar Etanol Destilat ..................................................................................... 18
3.5.3 Keasaman (Sebagai Asam Asetat) ................................................................. 19
3.5.4 Sisa Penguapan Maksimum ........................................................................... 19
3.6 Analisis Data ......................................................................................................... 19
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 20
3.1 Rendemen Destilat ................................................................................................ 20
3.2 Kadar Etanol Destilat ............................................................................................ 22
3.3 Keasaman (Sebagai Asam Asetat) ........................................................................ 24
3.4 Sisa Penguapan Maksimum .................................................................................. 26
xiii
V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................................... 28
5.1 Kesimpulan ........................................................................................................... 28
5.2 Saran ..................................................................................................................... 28
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................... 29
LAMPIRAN ................................................................................................................... 34

xiv
 DAFTAR TABEL

Tabel Halaman
1. SNI 3565:2009 Etanol Nabati ................................................................................. 8
2. Perlakuan Penelitian ................................................................................................ 15
3. Pengacakan Urutan Pelaksanaan Penelitian ............................................................ 16

xv
 DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman
1. Buah jeruk kalamansi .............................................................................................. 5
2. Wadah Fermentor .................................................................................................... 16
3. Penghancuran Limbah Padat Jeruk Kalamansi ....................................................... 17
4. Proses Destilasi ........................................................................................................ 18
5. Pengaruh Penambahan Enzim Selulase terhadap Rendemen Destilat .................... 20
6. Pengaruh Penambahan Enzim Selulase terhadap Kadar Etanol Destilat ................ 22
7. Pengaruh Penambahan Enzim Selulase terhadap Keasaman Destilat ..................... 25
8. Pengaruh Penambahan Enzim Selulase terhadap Sisa Penguapan Maksimum....... 27

xvi
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman
1. Diagram alir pembuatan bioetanol .......................................................................... 34
2. Data penelitian rendemen destilat ........................................................................... 35
3. Data penelitian kadar etanol destilat........................................................................ 36
4. Data penelitian keasaman (sebagai asam asetat) destilat ........................................ 37
5. Data penelitian sisa penguapan maksimum ............................................................. 38
6. Data analisis rendemen destilat ............................................................................... 39
7. Data analisis kadar etanol destilat ........................................................................... 40
8. Data analisis keasaman (sebagai asam asetat) destilat ............................................ 41
9. Data analisis sisa penguapan maksimum ................................................................ 42
10. Tabel Alkoholometrik ............................................................................................. 43
11. Syarat mutu etanol nabati ........................................................................................ 46
12. Dokumen penelitian................................................................................................. 47

xvii
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kebutuhan terhadap bahan bakar berupa minyak bumi di masa sekarang ini semakin
meningkat seiring dengan pertumbuhan populasi penduduk yang selalu bertambah di setiap
tahunnya. Bahan bakar minyak bumi tersebut merupakan bahan bakar yang tidak dapat
diperbaharui yang berasal dari energi fosil yang ketersediaannya sudah semakin berkurang.
Pada tahun 2025, diperkirakan Indonesia sudah tidak bisa lagi mendapatkan cadangan energi
yang cukup (Fuadi dan Harismah, 2017). Menurut Menteri ESDM dalam siaran PERS
Nomor [Link]/04/SJI/2021 menyatakan bahwa cadangan minyak bumi di Indonesia akan
tersedia hingga 9,5 tahun mendatang dan cadangan minyak bumi nasional sebesar 4,17 miliar
barel (Pribadi, 2021). Oleh karena itu pengembangan sumber energi alternatif sangat
diperlukan guna mengatasi hal tersebut. Salah satu sumber energi alternatif tersebut adalah
bioetanol.
Bioetanol dapat diproduksi dari bahan yang mengandung gula, pati, dan bahan yang
mengandung selulosa. Bahan yang mengandung gula dan pati cukup mudah untuk dikonversi
menjadi bioetanol, sedangkan untuk bahan yang mengandung selulosa lebih sulit. Meskipun
lebih sulit dikonversi menjadi bioetanol, limbah lignoselulosa tersedia sangat melimpah,
mudah didapat, murah, dan belum dimanfaatkan secara optimal, sehingga lebih berpotensi
sebagai bahan baku produksi energi terbarukan di masa mendatang (Gunam dkk., 2011).
Bahan yang mengandung gula (tebu dan molase) dan bahan yang mengandung pati (jagung
dan singkong) dapat digunakan sebagai bahan baku pembuatan bioetanol. Namun, jika bahan
tersebut digunakan sebagai bahan baku bioetanol, maka akan terjadi persaingan bahan pangan
sehingga harga bahan pangan menjadi naik. Oleh karena itu, pembuatan bioetanol diarahkan
kepada pengembangan bioetanol yang terbuat dari biomassa berlignoselulosa. Sumber
biomassa berlignoselulosa antara lain limbah perkebunan (tandan kosong kelapa sawit
(TKKS), bagase, kulit buah kakao/ kopi), limbah kayu dan kehutanan (sisa gergajian, limbah
sludge pabrik kertas dll), limbah pertanian (jerami, tongkol jagung, onggok dll), dan sampah
organik (Loebis dkk., 2015).
Salah satu limbah industri pertanian yang melimpah dan dapat digunakan sebagai
bahan baku pembuatan bioetanol adalah limbah jeruk kalamansi. Jeruk kalamansi merupakan
salah satu komoditas yang banyak tumbuh di daerah Bengkulu. Pada umumnya, jeruk
kalamansi ini dikonsumsi dengan cara diolah terlebih dahulu menjadi minuman segar atau
sirup. Dalam satu kali pengolahan sebanyak 100 kg jeruk kalamansi, menyisakan limbah
padat berupa kulit jeruk sebesar 40 kg, 20 liter hasil samping cairan 1 dan 10 liter hasil
1
samping cairan 2 (Dewi dkk., 2016). Limbah padat industri jeruk kalamansi ini belum
dimanfaatkan secara optimal. Komposisi utama (%) dari kulit jeruk adalah pektin (23,02 ±
2,12), lignin (7,52 ± 0,59), selulosa (37,08 ± 3,1) dan hemiselulosa (11,04 ± 1,05) (Marin et
al., 2005). Sama halnya dengan kulit jeruk pada umumnya, kulit jeruk kalamansi juga
mengandung selulosa. Kandungan selulosa yang tinggi pada kulit jeruk ini dapat digunakan
sebagai bahan baku pembuatan bioetanol.
Selulosa merupakan polisakarida yang mengandung zat-zat gula. Selulosa dapat
digunakan sebagai bahan baku pembuatan bioetanol. Namun selulosa perlu dikonversi
terlebih dahulu menjadi glukosa untuk bisa dijadikan bioetanol. Konversi selulosa menjadi
glukosa dapat dilakukan dengan melakukan hidrolisis kimiawi atau enzimatis (Nugrahini
dkk., 2016). Hidrolisis merupakan proses penguraian suatu zat yang kompleks (polisakarida)
menjadi monomer gula penyusunnya (Seftian dkk., 2012). Tujuannya adalah untuk
menghilangkan ikatan hemiselulosa dan lignin pada suatu bahan sehingga memudahkan
dalam proses fermentasi. Proses hidrolisis dapat dilakukan dengan beberapa cara diantaranya
hidrolisis kimia (asam) dan hidrolisis enzimatik. Hidrolisis asam merupakan proses
pemecahan molekul kompleks dengan menggunakan asam seperti asam klorida dan asam
sulfat (Fuadi dkk., 2015). Asam sulfat encer pada pH 2,0 yang digunakan untuk hidrolisis
limbah kulit jeruk sangat dianjurkan karena konsumsi asam lebih rendah dan mampu
menghancurkan fruktosa (Grohmann et al., 1995). Akan tetapi, kelemahan dari hidrolisis
asam adalah membutuhkan energi yang besar, suhu tinggi, dan bahan kimia yang dapat
mencemari lingkungan (Hidayat, 2013).
Hidrolisis enzimatik yaitu proses hidrolisis dengan bantuan enzim sebagai katalisnya
seperti enzim selulase atau yang lainnya (Fuadi dkk., 2015). Kelebihan dari hidrolisis
enzimatik dibandingkan hidrolisis asam adalah tidak terjadi degradasi gula hasil hidrolisis,
berpotensi memberikan hasil yang tinggi, dan biaya pemeliharaan peralatan relatif rendah
karena tidak ada bahan yang korosi (Taherzadeh and Karimi, 2007). Selain itu, kelebihan
hidrolisis enzimatik adalah dapat dilakukan pada suhu yang rendah (Komarayati dkk., 2011)
dan dapat dilakukan pada kondisi proses yang ringan serta lebih ramah lingkungan (Fuadi
dkk., 2015). Pembuatan bioetanol dengan bahan baku kulit jeruk bali menghasilkan kadar
etanol optimum sebesar 40,298% pada penambahan enzim sebanyak 9% dari 100 ml sampel.
Kadar etanol tersebut diperoleh densitas sebesar 0,95048 g/ml (Ciptasari, 2015). Penelitian
Seftian dkk., (2012), membuat bioetanol yang berasal dari limbah kulit pisang menggunakan
enzim selulase menunjukkan hasil terbaik adalah pada saat penambahan jumlah enzim 9 ml
dan waktu fermentasi 5 hari, dengan kadar etanol yang dihasilkan 13,1154 %.

2
 Pada perlakukan yang menggunakan metode Simultaneous Saccharificatian And
Fermentation (SSF), bahan baku yang digunakan berupa tongkol jagung menghasilkan kadar
bioetanol tertinggi yaitu sebesar 8% dengan variasi waktu fermentasi 72 jam dan konsentrasi
enzim 11% (Khaira dkk, 2015).
Penelitian Nasution dkk (2020) membuat bioetanol menggunakan limbah padat berupa
kulit jeruk kalamansi yang difermentasi menggunakan Saccharomyces cereviciae dengan
lama waktu fermentasi 3 sampai 7 hari menghasilkan rendemen 28% dan kadar etanol yang
cukup rendah yakni 3,7% sampai 11%. Hal ini dapat dikarenakan Saccharomyces cereviciae
tidak mampu mengubah selulosa menjadi glukosa sehingga perlu diubah dahulu dengan
melakukan hidrolisis enzimatik menggunakan enzim selulase. Faktor lain yang
mempengaruhi perolehan rendemen adalah konsentrasi substrat, kondisi lingkungan pada saat
fermentasi, lama fermantasi, serta konsentrasi starter (Syauqiah, 2015). Berdasarkan hal
tersebut, maka dilakukanlah penelitian mengenai pengaruh penambahan enzim selulase
terhadap rendemen dan karakteristik bioetanol dari limbah padat industri jeruk kalamansi.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana pengaruh penambahan enzim selulase terhadap rendemen dan karakteristik
bioetanol?
2. Berapakah konsentrasi enzim selulase yang tepat untuk memperoleh kadar etanol
tertinggi pada pembuatan bioetanol?

1.3 Tujuan
1. Menentukan pengaruh penambahan enzim selulase terhadap rendemen dan
karakteristik bioetanol.
2. Menentukan konsentrasi enzim selulase yang tepat untuk memperoleh kadar etanol
tertinggi pada pembuatan bioetanol.

1.4 Batasan Masalah

1. Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini berupa limbah padat sirup jeruk
kalamansi yang diperoleh dari industri rumah tangga sirup jeruk kalamansi yang ada
di kota Bengkulu.
2. Limbah padat industri jeruk kalamansi digunakan 17 jam setelah proses pemerasan.
3. Enzim selulase yang digunakan didapatkan dari toko online.
4. Proses fermentasi dengan Saccharomyces cereviciae menggunakan fermipan.

3
1.5 Manfaat Penelitian
1. Memberikan wawasan mengenai pemanfaatan limbah padat industri jeruk kalamansi
untuk diolah menjadi bioetanol.
2. Mengetahui hubungan penggunaan enzim yang berbeda konsentrasi dalam proses
pembuatan bioetanol.

4
 II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jeruk Kalamansi

Salah satu produk pertanian yang ada di Kampung Melayu Kota Bengkulu dengan
hasil yang melimpah adalah jeruk kalamansi. Banyak industri-industri kecil yang ada di kota
Bengkulu mengambil kesempatan dengan mengolahnya menjadi suatu produk seperti sirup.
Sirup jeruk kalamansi merupakan produk olahan berupa sirup yang terbuat dari jeruk
kalamansi dengan rasa yang khas. Sirup jeruk kalamansi menjadi salah satu produk olahan
khas Bengkulu yang banyak dicari karena memiliki rasa manis asam khas kalamansi (Hidayat
dkk., 2018).
Pohon jeruk kalamansi (Citrus microcarpa) adalah tanaman dalam keluarga Rutaceae
yang berkembang dan populer di seluruh Asia Tenggara, terutama Filipina. Pada tahun 2011,
jeruk kalamansi dicanangkan sebagai model perdana dari program OVOP (One Village One
Product) di kota Bengkulu. Jeruk kalamansi ini merupakan tanaman yang mudah
dibudidayakan dan memiliki banyak kelebihan jika dibandingkan dengan jeruk lainnya seperti
tingginya kandungan vitamin c, kalsiumnya lebih seimbang serta masa panen jeruk kalamansi
tergolong pendek yaitu 6 bulan sejak masa tanam sehingga jeruk kalamansi ini diangkat
masuk program OVOP. Salah satu lokasi pembudidayaan jeruk kalamansi adalah LPP Baptis
yang merupakan sebuah yayasan swasta yang bergerak di bidang pengembangan dan
penelitian tanaman (Widiastuti, 2012).
Jeruk kalamansi merupakan jenis jeruk yang berukuran kecil, berbentuk bulat yang
berdiameter 25-35 mm. Aroma buah jeruk kalamansi sangat khas, memiliki rasa yang sangat
asam dan tidak bisa langsung dimakan sehingga perlu diolah terlebih dahulu. Pengolahan
jeruk kalamansi selama ini hanya menjadi sirup dan minuman sari buah yang berguna untuk
minuman oleh-oleh khas Bengkulu (Ikhsan dkk., 2018). Buah jeruk kalamansi dapat dilihat
pada Gambar 1.

Gambar 1. Buah jeruk kalamansi

5
2.1.1 Limbah Industri Sirup Jeruk Kalamansi
Industri pengolahan sirup jeruk kalamansi sudah tentu menghasilkan limbah (residu).
Limbah yang dihasilkan dapat berupa kulit jeruk yang berasal dari jeruk yang diperas (diambil
airnya), dan berupa serat kasar (ampas) yang berasal dari hasil pemisahan air perasan. Ampas
yang berupa serat kasar bercampur minyak ini diperoleh dari hasil dekantasi air perasan jeruk
yang telah didiamkan selama 1-2 jam. Selama ini, pelaku industri membuang limbah berupa
kulit jeruk dan ampas perasan jeruk ke lingkungan sekitar pengolahan yang hanya
dikumpulkan begitu saja dan tidak dimanfaatkan (Maryanti dkk., 2017). Kulit jeruk
mengandung komponen aktif yang bermanfaat diantaranya senyawa fenol, flavonoid, lignin,
dan lain-lain (Tutuarima dkk., 2018).
Pengolahan jeruk kalamansi sebagai bahan baku pembuatan sirup atau minuman sari
buah menjadi salah satu potensi ekonomi kreatif dari industri rumahan. Teknologi yang
digunakan dalam pengolahan jeruk kalamansi masih tergolong sederhana. Hasil produksi
sirup kalamansi dijual hanya di sebatas pasar lokal sebagai oleh-oleh minuman khas Kota
Bengkulu. Selain menghasilkan sari buah, pengolahan jeruk kalamansi juga menghasilkan
limbah, baik itu limbah padat maupun limbah cair seperti kulit jeruk, pulp, biji, dan cairan
hasil pengendapan. Menurut Dewi dkk. (2016), dalam satu kali pengolahan sebanyak 100 kg
jeruk kalamansi, menyisakan limbah padat berupa kulit jeruk sebesar 40 kg, 20 liter hasil
samping cairan 1 dan 10 liter hasil samping cairan 2. Pada umumnya, industri pengolahan
jeruk kalamansi di Kota Bengkulu belum memanfaatkan limbah hasil pengolahan untuk
diolah menjadi produk yang memiliki nilai jual tinggi. Seperti halnya tanamanan jeruk
lainnya, jeruk kalamansi memiliki aroma segar yang banyak disukai dan jeruk kalamansi ini
terdeteksi mengandung minyak atsiri (Dewi dkk., 2016). Minyak atsiri jeruk kalamansi yang
dominan adalah senyawa limonene (Tutuarima, 2020). Selain mengandung minyak atsiri,
limbah kulit jeruk juga mengandung selulosa yang cukup besar. Selulosa ini akan diubah
menjadi gula dan dapat diolah menjadi bioetanol.

2.2 Bioetanol
Bioetanol dapat dihasilkan dari tanaman yang banyak mengandung senyawa pati dan
selulosa dengan menggunakan bantuan dari aktivitas ragi. Rumus molekul etanol adalah
C2H5OH, sedang rumus empirisnya C2H6O atau rumus bangunnya CH3-CH2-OH. Bioetanol
merupakan bagian dari kelompok metil (CH3-) yang terangkai pada kelompok metilen (-CH2-)
dan terangkai dengan kelompok hidroksil (-OH). Secara umum akronim dari bioetanol adalah
EtOH (Ethyl-(OH)) (Setiawati dkk., 2013).

6
 Bioetanol merupakan etanol atau etil alkohol (C2H5OH) dari hasil fermentasi glukosa
(C6H12O6) yang berasal dari bahan baku nabati (Samah et al., 2011). Etanol diproduksi
dengan cara fermentasi menggunakan bahan baku hayati. Etanol atau Etil Alcohol (lebih
dikenal dengan alkohol, dengan rumus kimia C2H5OH) adalah cairan tak berwarna dengan
karakteristik antara lain mudah menguap, mudah terbakar, larut dalam air, tidak karsinogenik
dan jika terjadi pencemaran tidak memberikan dampak lingkungan yang signifikan (Seftian
dkk., 2012). Menurut John et al. (2017), produksi bioetanol yang berasal dari biomassa
berlignoselulosa dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu perlakuan pendahuluan, hidrolisis,
dan fermentasi. Pada dua proses pertama ditujukan untuk pengubahan substrat menjadi gula,
sedangkan proses ketiga dimaksudkan untuk mengubah gula menjadi etanol.
Tidak ada perbedaan antara etanol biasa dengan bioetanol, yang membedakannya
hanyalah bahan baku pembuatan dan proses pembuatannya. Etanol adalah sejenis cairan yang
mudah menguap, mudah terbakar, tak berwarna, dan merupakan alkohol yang paling sering
digunakan dalam kehidupan sehari-hari. Etanol seringkali dijadikan bahan tambahan bensin
sehingga menjadi biofuel. Produksi etanol dunia untuk bahan bakar transportasi meningkat 3
kali lipat dalam kurun waktu 7 tahun, dari 17 miliar liter pada tahun 2000 menjadi 52 miliar
liter pada tahun 2007. Dari tahun 2007 ke 2008, komposisi etanol pada bahan bakar bensin di
dunia telah meningkat dari 3,7% menjadi 5,4% (Wusnah, 2019).
Proses pembuatan bioetanol dilakukan sesuai dengan jenis bahan baku yang
digunakan. Bahan baku yang mengandung gula akan difermentasi langsung menjadi alkohol.
Sedangkan bahan baku yang mengandung lignoselulosa harus melalui beberapa tahapan untuk
menghasilkan etanol. Tahapan pembuatan bioetanol pada bahan berlignoselulosa secara
umum adalah perlakukan pendahuluan (pretreatment)yang bertujuan untuk delignifikasi dan
dekristalisasi, hidrolisis yaitu proses pemecahan polisakarida menjadi monomer gula yang
dapat dilakukan secara kimia ataupun enzimatis, fermentasi gula menjadi etanol yang
dilakukan dengan bantuan mikroorganisme, dan pemurnian etanol hasil fermentasi untuk
memperoleh etanol kualitas bahan bakar melalui proses destilasi atau dehidrasi (Sudiyani dkk,
2019).
Penelitian yang dilakukan oleh Nasution dkk (2020), menyatakan bahwa kadar etanol
pada proses fermentasi limbah padat industri sirup kalamansi semakin meningkat seiring
dengan lamanya fermentasi dari 3,7% menjadi 11 %. Hal ini diduga jumlah mikroba semakin
meningkat dengan lamanya fermentasi. Menurut Sutanto dkk (2013), semakin lama
fermentasi berlangsung maka kebutuhan akan jumlah mikroba dalam proses tersebut juga
akan semakin bertambah, sehingga dengan semakin meningkatnya jumlah mikroba maka

7
semakin banyak pula karbohidrat yang terurai menjadi alkohol, sehingga alkohol yang
dihasilkan juga semakin banyak.
Bioetanol bersifat multi-guna karena dicampur dengan bensin pada komposisi
berapapun memberikan dampak yang positif. Kelebihan-kelebihan bioetanol dibandingkan
bensin: 1) Bioetanol aman digunakan sebagai bahan bakar, titik nyala etanol tiga kali lebih
tinggi dibandingkan bensin. 2) Emisi hidrokarbon lebih sedikit. Sedangkan kekurangan-
kekurangan bioetanol dibandingkan bensin: 1) Pada saat mesin dingin lebih sulit melakukan
starter bila menggunakan bioetanol. 2) Bioetanol bereaksi dengan logam seperti magnesium
dan aluminium (Setiawati dkk., 2013).
Syarat mutu bioetanol nabati berdasarkan SNI 3565:2009 dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. SNI 3565:2009 Etanol Nabati
No Uraian Persyaratan mutu
Satuan Mutu I Mutu II Mutu III
1 Kadar etanol pada 15 °C % v/v Min. 96,3 Min. 96,1 Min. 95,0
% b/b Min. 94,4 Min. 94,1 Min. 92,5
2 Bahan yang dapat Menit Min. 30 Min. 15 -
o
dioksidasikan, pada 15 C
( waktu uji permanganat )
3 Minyak fusel mg/L Maks. 4 Maks. 15 -
4 Aldehid (sebagai mg/L Maks. 4 Maks. 10 -
asetaldehid)
5 Keasaman (sebagai asam mg/L Maks. 20 Maks. 30 Maks. 60
asetat)
6 Sisa Penguapan mg/L Maks. 25 Maks. 25 Maks. 50
Maksimum
7 Metanol mg/L Maks. 10 Maks. 30 Maks. 100
Sumber: BSN (2009)

2.3 Hidrolisis
Hidrolisis merupakan reaksi kimia dengan menggunakan air (H2O) yang memecah
molekul menjadi dua bagian. Tujuannya adalah untuk mengkonversi polisakarida menjadi
monomer-monomer sederhana. Bagian molekul yang satu memiliki ion hidrogen (H+)
sedangkan bagian molekul yang lain memilki ion hidroksil (OH-) (Osvaldo dkk., 2012). Pada
proses hidrolisis di dalam biomassa lignoselulosa terjadi pemecahan polisakarida, yaitu
selulosa dan hemiselulosa menjadi monomer gula penyusunnya. Hidrolisis selulosa secara
8
sempurna akan menghasilkan glukosa sedangkan hemiselulosa menghasilkan beberapa
monomer gula pentose (C5) dan heksose (C6). Pada umumnya, hidrolisis yang digunakan
dalam pembuatan bioetanol dari bahan baku biomassa ada dua macam, yaitu hidrolisis
enzimatis dan hidrolisis kimia (asam) (Fachry dkk., 2013).
Perlakuan hidrolisis asam pada limbah kulit jeruk pertama kali dilakukan oleh
Grohmann et al., (1995). Hidrolisis asam yang dilakukan pada kulit jeruk menghasikan
larutan yang kaya akan pektin dan residu glukan, yang menunjukkan kerentanan tinggi
terhadap hidrolisis enzimatik. Pada perlakukan hidrolisis dengan asam sulfat encer
menunjukkan laju reaksi tinggi serta penguraian selulosa dapat tercapai (Grohmann et al.,
1995 dalam John et al., 2017). Faktor –faktor yang mempengaruhi hidrolisis kulit jeruk
menggunakan asam encer yaitu konsentrasi asam, fraksi padatan total, suhu, dan waktu
hidrolisis (Talebnia et al., 2008).
Hidrolisis enzimatik merupakan proses penguraian polisakarida dengan menggunakan
enzim. Proses hidrolisis enzimatik dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu hidrolisis dan
fermentasi terpisah (SHF) dan sakarifikasi dan fermentasi simultan (SSF). Pada metode SHF,
hidrolisis dan fermentasi dilakukan pada tempat yang berbeda pada kondisi yang optimal,
sedangkan metode SSF yaitu menggabungkan proses hidrolisis dan fermentasi pada tempat
yang sama(Talebnia, 2008). Hidrolisis enzimatik merupakan metode yang paling disukai pada
produksi bioetanol dari limbah jeruk. Hidrolisis enzimatik umumnya dilakukan dalam kondisi
yang ringan, yaitu retensi lama waktu dan tekanan yang rendah (Binod et al., 2010). Selain
itu, kandungan lignin dalam kulit jeruk juga lebih sedikit dibandingkan dengan biomassa
lignoselulosa lainnya sehingga hambatan aksesibilitas enzim tidak terlalu berpengaruh, baik
itu glukosa maupun selobiosa yang juga merupakan penghambat dari enzim selulase (Knauf
dan Moniruzzaman, 2004).

2.4 Enzim Selulase dan Aplikasi pada Hidrolisis Selulosa

Enzim merupakan benda tidak hidup yang diproduksi oleh sel hidup, berfungsi
sebagai katalisator atau mempercepat reaksi. Sebagai katalis, enzim tidak ikut bereaksi
(Susanti dan Febriana, 2017). Enzim yang dapat digunakan dalam proses hidrolisis enzimatis
diantaranya amilase, protease, pektinase, dan selulase. Setiap enzim memiliki peranan yang
berbeda-beda. Enzim amilase membantu dalam memecah amilum menjadi gula sederhana
seperti glukosa dan maltosa, enzim protease memecah protein menjadi molekul yang lebih
sederhana, enzim pektinase membantu dalam proses degradasi pektin dan enzim selulase
membantu memecah selulosa menjadi gula sederhana. Setiap enzim memiliki pH optimum
yang khas. Enzim protease seperti pepsin bekerja pada kisaran pH yang rendah, karena enzim
9
ini terdapat dalam cairan lambung dimana kondisi pH optimumnya adalah 2 (Pratama dkk.,
2013).
Selulosa mengandung sekitar 50%-90% bagian berkristal dan sisanya bagian amorf.
Ikatan 1,4-ꞵ-glukosida pada serat selulosa dapat dipecah menjadi monomer glukosa dengan
cara hidrolisis asam atau enzimatis (Razie dkk., 2011). Pemanfaatan limbah berlignoselulosa
dengan menggunakan jasa mikroorganisme dapat menghasilkan enzim ekstraseluler yang
mampu mendegradasi bahan berlignoselulosa menjadi fraksi penyusunnya. Enzim selulase
adalah enzim yang bisa mengurai selulosa menjadi glukosa, setelah diurai bisa
difermentasikan menjadi etanol. Enzim selulase yang dapat merombak bahan berlignoselulosa
berupa jerami atau serat (Seftian dkk., 2012).
Pada substrat Avicel, yaitu substrat selulosa yang berbentuk kristalin, menunjukkan
adanya aktivitas enzim ekso-1,4-ꞵ-glukanase, yang memotong ujung rantai oligosakarida
menjadi selobiosa, yaitu dua molekul glukosa yang berikatan secara ꞵ-1,4-glikosidik. Enzim
endo-1,4-ꞵ-glukanase, ekso-1,4-ꞵ-glukanase, dan ꞵ-glukosidase dalam mendegradasi selulosa
menjadi glukosa, aktivitasnya dilakukan secara sinergis. Setelah enzim endo-1,4-ꞵ-glukanase
memotong bagian amorphous, barulah ekso-1,4-ꞵ-glukanase memotong bagian ujung rantai
selulosa kristalin menjadi gula pereduksi. Setelah itu, gula pereduksi diikat oleh larutan DNS
(asam dinitrosalisilat) dengan menghasilkan warna jingga (Meryandini dkk., 2009).
Kendala yang sering terjadi dalam mendegradasi selulosa menjadi glukosa adalah
terhambatnya kerja enzim selulase karena pada kondisi alami, selulosa berikatan kuat dengan
hemiselulosa dan lignin. Hemiselulosa dan lignin membungkus dan mengikat selulosa secara
fisik, sehingga menghambat enzim selulase mendegradasi selulosa. Oleh karena itu,
peningkatan lus permukaan dan pengocokann pada saat inkubasi substratenzim, diharapkan
mampu memperbesar kontak antara enzim selulase dan komponen selulosa sehingga dapat
meningkatkan aktifitas enzim selulase (Putri dan Wardani, 2018).
Penelitian yang dilakukan oleh Ciptasari (2015) menunjukkan bahwa etanol dapat
dihasilkan dari limbah kulit jeruk bali melalui proses hidrolisis enzimatik menggunakan
enzim selulase, fermentasi dengan yeast (Saccharomyses cerevisiae), menghasilkan kadar
etanol destilat tertinggi sebesar 40,298%. Hal ini menyatakan bahwa semakin banyak katalis
enzim yang ditambahkan maka semakin tinggi konsentrasi gula dan semakin besar kadar
etanol yang terbentuk pada waktu yang sama.

2.3.1 Faktor-Faktor yang Memengaruhi Kinerja Enzim Selulase

Aktivitas enzim dapat diperngaruhi oleh pH. Hal itu karena pH mudah memengaruhi
sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino. Perubahan pH atau pH yang tidak sesuai akan

10
 menyebabkan berubahnya daerah katalik dan konformasi enzim (Meryandini dkk., 2009).
Putri dan Wardani (2018) melaporkan bahwa aktivitas enzim selulase dipengaruhi oleh pH
disebabkan karena gugus amino dan gugus karboksil pada enzim mudah dipengaruhi oleh
perubahan pH. pH yang tidak optimum menyebabkan enzim kehilangan aktivitsanya. pH
optimum enzim selulase dari isolat TO4 dan TO5 adalah pH 5.
Selain pH, dalam reaksi enzimatik, suhu memiliki peranan yang cukup penting. Pada
saat suhu bertambah hingga mencapai suhu optimum, kecepatan reaksi enzim meningkat
karena energi kinetik bertambah. Bertambahnya energi kinetik akan mempercepat gerak
vibrasi, rotasi, dan translasi baik substrat maupun enzim. Hal ini akan memperbesar peluang
enzim dan substrat bereaksi. Jika suhu dinaikkan melebihi batas optimum, maka
kemungkinan denaturasi protein enzim dapat terjadi sehingga konformasi enzim berubah
dan menghambat gugus reaktif (Meryandini dkk., 2009). Enzim selulase memiliki suhu
optimum 50oC (Putri dan Wadani, 2018).
Faktor lain yang dapat mempengaruhi kinerja enzim adalah luas permukaan bahan.
Handoko dkk., (2012) menyatakan bahwa pretreatment fisik pada buah bintaro dapat
memecah lapisan pelindung lignin dan memperluas permukaan. Jika luas permukaan bahan
diperbesar, maka akan memudahkan kontak antara substrat buah bintaro dengan enzim
selulase. Hal tersebut membuat enzim selulase lebih efektif mengubah selulosa menjadi
glukosa. Selain itu, semakin tinggi konsentrasi enzim yang digunakan dapat memberikan
hasil yang lebih baik. Penelitian Nugrahini dkk., (2016) menyatakan bahwa glukosa yang
dihasilkan lebih banyak pada konsentrasi enzim selulase 1% dibandingkan dengan
konsentrasi 0,5%.

2.4 Fermentasi
Istilah fermentasi pada awalnya merupakan proses pengubahan zat gula pada suatu
bahan menjadi etanol. Namun, definisi mengenai fermentasi menjadi semakin luas seiring
dengan berkembangnya teknologi menjadi sebuah proses yang melibatkan mikroorganisme
untuk menghasilkan suatu produk (Seftian dkk., 2012). Fermentasi adalah proses
perubahan kimia yang terjadi karena adanya aktivitas dari mikroorganisme dengan memecah
glukosa untuk pertumbuhan dan metabolisme yang menghasilkan energi. Proses fermentasi
yang terjadi pada pembentukan etanol adalah fermentasi anaerob atau tanpa oksigen (Minarni,
2013). Secara garis besar, proses fermentasi dapat dibagi menjadi empat kategori berdasarkan
tujuan produk yang akan dihasilkan yaitu proses fermentasi yang bertujuan untuk
memproduksi biomassa mikrobia, proses fermentasi yang bertujuan untuk memproduksi
enzim mikrobia, proses fermentasi yang bertujuan untuk menghasilkan senyawa-senyawa
11
metabilot primer atau sekunder, dan fermentasi yang bertujuan untuk memodifikasi senyawa
kimia (proses transformasi) (Bachruddin, 2014).
Pada proses produksi bioetanol, kadar bioetanol dipengaruhi oleh waktu fermentasi.
Semakin lama waktu fermentasi, maka semakin tinggi kadar bioetanol yang dihasilkan.
Tingginya kadar bioetanol yang dikandung oleh substrat akan berpengaruh buruk bagi
pertumbuhan Saccharomyces cereviciae yaitu terhambatnya pertumbuhan mikroba tersebut
pada kadar alkohol 2,5%. Hal ini dikarenakan tidak semua jenis mikroba dapat bertahan pada
kadar etanol 2,5% dan hanya Saccharomyces cereviciae srtain tertentu yang dapat bertahan
pada kadar etanol 2,5%-5%. Oleh sebab itu, penentuan waktu fermentasi harus sesuai untuk
proses fermentasi bioetanol agar jumlah kadar etanol yang dihasilkan tinggi, pH yang rendah,
dan produksi gas tinggi namun tidak mengganggu pertumbuhan Saccharomyces cereviciae
(Salsabila dkk., 2013).
Ragi Saccaromyces cereviciae dapat bertahan pada kondisi pH dan suhu yang sesuai
selama proses fermentasi. Penelitian yang dilakukan Salsabila dkk (2013) menggunakan pH 6
pada saat fermentasi sebab pada pH 6 Saccharomyces cereviciae dapat tumbuh dengan baik.
Konsumsi gula oleh Saccharomyces cereviciae dapat terjadi selama proses fermentasi
sehingga diduga terjadi penurunan kadar gula sesuai dengan bertambahnya waktu fermentasi.
Semakin lama waktu fermentasi, semakin sedikit ketersediaan substrat dan nutrisi yang
diperlukan mikroba sehingga aktivitas ragi Saccharomyces cereviciae menjadi menurun.
Penurunan aktivitas ragi dapat berpengaruh terhadap jumlah asam organik yang terbentuk
sebagai hasil samping dalam pembuatan bioetanol (Salsabila dkk., 2013).

2.4.1 Faktor-Faktor yang Memengaruhi Fermentasi

Selama proses fermentasi, hal-hal yang perlu diperhatikan adalah konsentrasi gula,
keasaman, ada atau tidaknya oksigen, dan suhu. Suhu yang baik untuk proses fermentasi
adalah berkisar antara 25-30oC. Derajat keasaman (pH) optimum untuk proses fermentasi
sama dengan pH optimum untuk proses pertumbuhan khamir yaitu pH 4,0-5,0 (Nasrun dkk.,
2015).
Beberapa faktor yang mempengaruhi proses fermentasi adalah sebagai berkut:
1. Jenis Mikroorganisme
Pemilihan mikroorganisme pada umumnya tergantung pada jenis substrat, kebutuhan
pertumbuhan dan produk fermentasi yang diharapkan. Mikroorganiasme yang digunakan
dalam industri digolongkan menjadi bakteri, khamir dan kapang (Nurhadianty dkk, 2018).
Pemilihan sel khamir didasarkan pada jenis karbohidrat yang digunakan, sebagai medium
untuk memproduksi alkohol dari pati dan gula digunakan Saccharomyces cereviciae.
12
2. Nutrisi
Mikroorganisme membutuhkan nutrisi yang digunakan untuk pertumbuhannya.
Nutrisi untuk pertumbuhan mikroorganisme dibagi menjadi tiga yaitu makronutrisi (karbon
dan nitrogen), mikronutrisi (fosfor, sulfur, kalsium, besi, natrium, dan magnesium, serta
trace-element (kobalt, mangan, besi, nikel, dan seng) (Nurhadianty dkk., 2018).

3. Media
Media fermentasi berguna untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroorganisme sehingga diperoleh produk yang diinginkan. Media fermentasi harus
memenuhi seluruh kebutuhan nutrisi mikroorganisme dan memenuhi tujuan teknis dari
proses fermentasi (Nurhadianty dkk., 2018).

2.5 Saccharomyces cereviciae

Pada proses produksi bioetanol, kriteria pemilihan khamir adalah mempunyai laju
fermentasi dan laju pertumbuhan cepat, perolehan bioetanol banyak, tahan terhadap
konsentrasi bioetanol dan glikosa tinggi, tahan terhadap konsentrasi garam tinggi, pH
optimum fermentasi rendah, serta temperatur optimum fermentasi sekitar 25-30oC (Nasrun
dkk, 2015). Ragi atau khamir merupakan jenis mikroba yang termasuk golongan jamur
Ascomycotina, terdiri dari satu sel, dan tidak membentuk hifa. Reproduksi ragi atau khamir
ini dengan membentuk tunas (budding). Saccharomyces adalah genus dalam kerajaan jamur
yang mencakup banyak jenis ragi. Saccharomyces berasal dari bahasa Latin yang berarti gula
jamur. Jenis dari Saccharomyces yang dianggap sangat penting dalam menghasilkan produk
makanan cukup banyak. Salah satu contohnya adalah Saccharomyces cerevisiae, yang banyak
digunakan dalam pembuatan anggur, roti, dan bir. Jenis lain dari ragi Saccharomyces ini
termasuk Saccharomyces bayanus, digunakan dalam pembuatan anggur, dan Saccharomyces
boulardii, digunakan dalam obat-obatan (Bahri dkk., 2018).
Dalam pembuatan bioetanol pada penelitian kali ini, mikroba yang digunakan adalah
Saccharomyces cereviciae. Kelebihan Saccharomyces cereviciae dibandingkan dengan
mikroba yang lain adalah lebih mudah beradaptasi dengan lingkungan,
lebih tahan terhadap kadar alkohol tinggi, dan lebih mudah didapat (Azizah dkk., 2012).
Menurut Bahri dkk (2018), mikroba Saccharomyces cereviciae dapat memproduksi alkohol
dalam jumlah besar dan mempunyai toleransi pada kadar alkohol yang tinggi (12-18 % abv),
tahan terhadap kadar gula yang tinggi dan tetap aktif melakukan fermentasi pada suhu 4 oC-32
o
C.

13
 Untuk meningkatkan produksi bioetanol, penggunaan mikroba Saccharomyces
cereviciae dalam bentuk ragi banyak digunakan karena dalam pertumbuhan Saccharomyces
cereviciae tersebut tidak membutuhkan sinar matahari. Selain itu, penggunaan Saccharomyces
cerevisiae dalam bentuk ragi cukup praktis dan dapat langsung digunakan sebagai inokulum
pada kultivasi etanol sehingga tidak perlu mempersiapkan inokulum secara khusus (Purwanto,
2012).

14
 III. METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Pertanian, Fakultas
Pertanian, Universitas Bengkulu pada bulan Maret 2021 sampai dengan Juni 2021.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
3.2.1 Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah pisau, talenan, timbangan (Kern
440-35 N), baskom, blender (Phillips), autoclave (GEA YX-24 LDJ), lem lilin, plastik,
karet, gelas ukur 100 ml dan 1000 ml (IWAKI CTE-33), botol ukuran 600 ml dan 1500 ml,
selang berdiameter 6 mm, labu ukur, heating mantel (M Toro MS-EAM), kondensor, cawan
100 ml, erlenmeyer (Pyrex), alumunium foil, piknometer (IWAKI), termometer, pH meter,
oven (memert UN 110), desikator, statif dan klem, inkubator, peralatan destilasi, dan buret.
3.2.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah limbah padat industri sirup jeruk
kalamansi berupa kulit dan pulp, yeast Saccharomyces cerevisiae berasal dari fermipan,
enzim selulase (Viscozyme cassava CL), aquades, urea, NaOH 0,1 N, dan fenolftalein.
3.3 Rancangan Penelitian
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak
Kelompok (RAK) menggunakan 1 faktor yaitu konsentrasi enzim selulase (0,5%, 0,7%,
0,9%, 1%, dan 1,2%) per 1000 ml sampel. Pengelompokan yang dilakukan pada penelitian ini
berdasarkan dengan ulangan perlakuan. Tujuannya adalah untuk melihat pengaruh dari bahan
baku yang digunakan karena penggunaan bahan baku berasal dari industri yang tidak sama.
Perlakuan ini dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan sehingga diperoleh 15 unit percobaan.
Perlakuan penelitian dapat dilihat pada Tabel 2, sedangkan pengacakan urutan penelitian
dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 2. Perlakuan Penelitian
Perlakuan Ulangan (U)
(S) U1 U2 U3
0,5% (S1) S1U1 S1U2 S1U3
0,7% (S2) S2U1 S2U2 S2U3
0,9% (S3) S3U1 S3U2 S3U3
1% (S4) S4U1 S4U2 S4U3
1,2% (S5) S5U1 S5U2 S5U3

15
Tabel 3. Tabel Pengacakan Urutan Pelaksanaan Penelitian
Kode Sampel Kode Sampel Kode Sampel
(Ulangan Kelompok) (Ulangan Kelompok) (Ulangan Kelompok)
S4U1(1) S2U2(6) S5U3(11)
S3U1(2) S4U2(7) S1U3(12)
S1U1(3) S3U2(8) S3U3(13)
S5U1(4) S1U2(9) S2U3(14)
S2U1(5) S5U2(10) S4U3(15)

3.4 Tahapan Penelitian

3.4.1 Pembuatan Wadah Fermentor
Wadah untuk fermentasi dibuat dengan cara botol ukuran 600 ml dan 1500 ml
dibersihkan sampai bersih. Botol ukuran 600 ml digunakan sebagai wadah aquades
sebanyak 400 ml, sedangkan botol ukuran 1500 ml dijadikan wadah fermentasi. Kemudian
lubangi bagian tutup botol. Setelah dilubangi, kedua tutup botol dihubungkan dengan
menggunakan selang diameter 6 mm lalu direkatkan dengan menggunakan lem. Hal tersebut
dilakukan untuk mencegah keluar masuknya udara pada proses fermentasi secara anaerob.
Wadah untuk fermentasi dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Wadah fermentor

3.4.2 Persiapan Bahan Baku

Proses persiapan bahan baku dilakukan dengan menimbang limbah padat jeruk
kalamansi berupa kulit dan pulp sebanyak 500 gram/sampel kemudian potong kecil-kecil
limbah padat jeruk kalamansi tersebut. Setelah itu sampel dihancurkan dengan blender
dengan penambahan 500 ml aquades hingga sampel menjadi bubur. Penghancuran limbah
padat jeruk kalamansi dapat dilihat pada Gambar 3.

16
 Gambar 3. Penghancuran limbah padat jeruk kalamansi

3.4.3 Hidrolisis Menggunakan Enzim

Hidrolisis enzimatik dilakukan dengan memasukkan bubur limbah padat jeruk
kalamansi ke dalam erlenmeyer sebanyak 1000 ml lalu mengatur pH 4-5 dengan
menggunakan NaOH 0,1 N sesuai kebutuhan dari jenis mikroba Saccharomyces cerevisiae.
Kemudian bubur dipanaskan dengan menggunakan autoclave pada suhu 100oC selama 30
menit. Bubur limbah padat jeruk kalamansi dibiarkan sampai dingin. Setelah dingin, enzim
selulase ditambahkan ke dalam bubur limbah padat jeruk kalamansi sebanyak 0,5%, 0,7% ,
0,9% , 1%, dan 1,2% (sesuai perlakuan) lalu ditutup rapat dengan plastik dan karet. Bubur
limbah padat jeruk kalamansi diinkubasikan dengan menggunakan inkubator selama 9 jam
(Ciptasari, 2015).

3.4.4 Fermentasi
Yeast Saccharomyces cerevisiae yang berasal dari fermipan ditambahkan sebanyak 8
gram dan 1 gram urea ke dalam bubur limbah padat jeruk kalamansi yang telah dihidrolisis.
Kemudian diaduk sampai homogen. Urea berfungsi sebagai sumber nitrogen untuk
membantu pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae. Setelah itu, bubur dimasukkan ke dalam
wadah fermentasi. Bubur limbah padat jeruk kalamansi yang telah tercampur dengan
Saccharomyces cerevisiae difermentasi selama 5 hari. Setelah fermentasi dilakukan,
larutan dipisahkan dari residu sehingga diperoleh filtrat (Ciptasari, 2015).

3.4.5 Destilasi
Proses destilasi pada penelitian ini dilakukan satu kali destilasi untuk menghasilkan
bioetanol. Proses destilasi dilakukan dengan mempersiapkan 1 set peralatan destilasi,
kemudian filtrat dimasukkan ke dalam alat destilasi. Destilasi filtrat dilakukan pada suhu 78-
90oC selama tujuh jam. Selanjutnya destilat yang dihasilkan diukur dan disimpan di dalam
botol yang tertutup rapat (Ciptasari, 2015). Proses destilasi dapat dilihat pada Gambar 4.

17
 Gambar 4. Proses destilasi

3.5 Parameter Pengamatan

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah rendemen destilat, kadar etanol
pada 15oC, keasaman (sebagai asam asetat), serta sisa penguapan maksimum.

3.5.1 Rendemen Destilat

Rendemen destilat diperoleh dari volume hasil akhir yang didapatkan dari destilasi
hasil fermentasi limbah padat industri sirup jeruk kalamansi dibagi dengan volume bahan
awal.
Rumus rendemen destilat adalah:
( ) x 100

3.5.2 Kadar Etanol Destilat

Kadar etanol dapat ditentukan berdasarkan pada berat jenisnya. Berat jenis dihitung
berdasarkan pada SNI 3565:2009 (BSN, 2009) yaitu dengan memasukkan piknometer
bersih berisi air suling yang sudah diketahui beratnya ke dalam penangas air yang sudah
ditutup pada temperatur 15oC . Tutup piknometer kemudian dibuka setelah 30 menit lalu
menepatkan volume piknometer sampai tanda batas. Titik air yang menempel pada dinding
di atas tanda batas dikeringkan dengan menggunakan tissu lalu menutupnya kembali.
Setelah itu, piknometer dikeluarkan dari penangas air, membiarkan pada temperatur ruang
selama 15 menit lalu menimbang piknometer dalam kondisi tertutup. Berat piknometer isi
H2O dikurangi berat piknometer kosong merupakan hasil berat H2O. Sedangkan untuk
menghitung berat etanol yaitu dengan melakukan perlakuan yang sama seperti pada H2O.
Berat etanol adalah berat piknometer isi etanol dikurangi berat piknometer kosong. Berat
jenis dihitung dengan rumus:

Berat jenis pada 15oC =

18
 Dari berat jenis tersebut dapat ditentukan kadar etanol pada 15 ºC dengan melihat pada tabel
alkohol metrik hubungan berat jenis pada berbagai temperatur terhadap kadar etanol. Tabel
alkohol metrik dapat dilihat pada lampiran 10.

3.5.3 Keasaman (Sebagai Asam Asetat)

Penentuan keasaman (sebagai asam asetat) dihitung berdasarkan SNI 3565:2009 yaitu
reaksi titrasi asam basa antara asam asetat dengan natrium hidroksida. Prosedur yang
dilakukan yaitu dengan memasukkan 20 ml larutan contoh ke dalam Erlenmeyer bertutup,
menambahkan 20 ml air suling bebas CO2 (air suling yang telah dididihkan). Memasukkan
larutan indikator fenolftalein sebanyak 0,1 ml. Kemudian mentitrasi dengan larutan standar
NaOH 0,01 N sampai warna berubah menjadi merah muda (BSN, 2009). Keasaman dihitung
dengan rumus:

( )

Keterangan: V = Volume titran(ml)

N = Normalitas titran (ek/l)
60 = Berat equivalen asam asetat

3.5.4 Sisa Penguapan Maksimum

Prinsip dasar pengujian sisa penguapan maksimum adalah dengan menguapkan
etanol (dan senyawa-senyawa yang mudah menguap lainnya) di atas penangas air,
sedangkan senyawa yang tidak mudah menguap setelah dikeringkan akan tertinggal dalam
cawan sehingga dapat ditimbang. Prosedur yang dilakukan untuk menghitung sisa
penguapan maksimum adalah menimbang cawan penguap kosong yang bersih dan kering
(a). Memasukkan 100 mL contoh ke dalam cawan penguap yang telah diketahui beratnya,
menguapkan di atas penangas air sampai kering. Selanjutnya cawan dikeringkan dalam
oven pengering pada suhu 105 °C sampai berat tetap. mendinginkan dalam desikator
sebelum ditimbang. Cawan ditimbang kembali (b) (SNI 3565:2009). Sisa penguapan
maksimum dihitung dengan rumus:

( ) ( )

3.6 Analisis Data

Data diolah dengan menggunakan Analisys of Variance (ANOVA) satu arah pada taraf
5%, bila terdapat pengaruh nyata maka dilakukan uji lanjut dengan Duncan’s Multiple Range
Test (DMRT).
19
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Rendemen Destilat

Tujuan perhitungan terhadap rendemen adalah untuk menentukan jumlah destilat
yang dihasilkan dalam satu kali fermentasi per jumlah bahan baku yang digunakan.
Rendemen yang dihasilkan pada pembuatan bioetanol dari limbah padat industri sirup jeruk
kalamansi dengan penambahan enzim selulase pada konsentrasi 0,5%, 0,7%, 0,9% 1%, dan
1,2% dapat dilihat pada Gambar 5.
25
20b,c 20,8c
20
Rendemen (%)

12,467a 13,267a,b
15 11,467a

10

0
0,50% 0,70% 0,90% 1% 1,20%
Konsentrasi Enzim

Gambar 5. Pengaruh penambahan enzim selulase terhadap rendemen destilat

Hasil uji ANOVA dengan taraf signifikansi 5% pada pembuatan bioetanol dari limbah
padat industri sirup jeruk kalamansi menunjukkan penambahan enzim selulase berpengaruh
nyata terhadap rendemen destilat yang dihasilkan dengan taraf signifikansi 0,042 lebih kecil
dari 0,05. Penggunaan bahan baku tidak memberikan pengaruh terhadap rendemen yang
dihasilkan dengan taraf signifikansi 0,190. Hasil uji DMRT menunjukkan bahwa rendemen
destilat pada penambahan enzim selulase konsentrasi 0,5% berbeda nyata dengan
penambahan enzim selulase konsentrasi 0,9% dan 1% akan tetapi berbeda tidak nyata dengan
penambahan enzim selulase konsentrasi 0,7% dan 1,2%. Rendemen destilat pada konsentrasi
enzim selulase 0,7% berbeda nyata dengan penambahan enzim konsentrasi 1% namun
berbeda tidak nyata dengan penambahan enzim pada konsentrasi 0,5%, 0,9 dan 1,2%.
Rendemen destilat pada penambahan enzim selulase konsentrasi 0,9% berbeda nyata dengan
penambahan enzim konsentrasi 0,5% dan 1,2% namun tidak berbeda nyata dengan
penambahan enzim selulase konsentrasi 0,7% dan 1%. Rendemen destilat pada penambahan
enzim selulase konsentrasi 1% berbeda nyata dengan penambahan enzim selulase konsentrasi
0,5%, 0,7%, dan 1,2% namun tidak berbeda nyata dengan penambahan enzim konsentrasi
0,9%. Selanjutnya rendemen destilat penambahan enzim selulase konsentrasi 1,2% berbeda

20
nyata dengan penambahan enzim selulase konsentrasi 0,9% dan 1% namun berbeda tidak
nyata dengan penambahan enzim konsentrasi 0,5% dan 0,7%.
Secara teori, bertambahnya konsentrasi enzim maka akan banyak selulosa yang
dikonversi menjadi glukosa. Glukosa ini akan dikonversi menjadi etanol oleh Saccharomyces
cerevisiae. Menurut Syauqiah (2015), faktor yang mempengaruhi perolehan rendemen adalah
konsentrasi substrat, kondisi lingkungan pada saat fermentasi, lama fermentasi, serta
konsentrasi starter. Arif dkk (2017) melaporkan bahwa konsentrasi enzim yang semakin
tinggi dapat meningkatkan rendemen alkohol. Pada Gambar 5, dapat dilihat bahwa rendemen
destilat yang dihasilkan pada pembuatan bioetanol dari limbah padat industri sirup jeruk
kalamansi dengan penambahan enzim selulase menunjukkan peningkatan rendemen yang
dihasilkan seiring dengan meningkatnya konsentrasi enzim selulase dari konsentrasi 0,5%
sampai konsentrasi 1%, namun terjadi penurunan hasil rendemen destilat pada penambahan
enzim 1,2%. Suhu fermentasi pada penelitian ini menggunakan suhu ruang yakni antara 26oC-
30oC. Syauqiah (2015) mengatakan jika suhu lingkungan mengalami perubahan, maka akan
mempengaruhi pertumbuhan dan kinerja dari yeast Saccharomyces cereviciae untuk
mengkonversi senyawa gula menjadi bioetanol, sehingga akan menganggu proses fermentasi
dan mempengaruhi jumlah etanol yang dihasilkan.
Faktor lain yang menyebabkan penurunan rendemen diduga adalah proses destilasi
yang tidak optimal. Pada saat proses destilasi suhu dan waktu destilasi dapat mempengaruhi
perolehan rendemen bioetanol. Suhu destilasi yang digunakan pada penelitian ini antara 78oC-
90oC dengan waktu destilasi selama 7 jam. Suhu yang tinggi dan waktu destilasi yang lama
dapat meningkatkan rendemen destilasi, sedangkan suhu destilasi yang rendah dapat
menghasilkan rendemen yang rendah pula. Marjoni (2014) mengatakan bahwa meningkatnya
nilai rendemen seiring dengan peningkatan suhu dan waktu destilasi. Peningkatan suhu dan
waktu destilasi menyebabkan cairan dapat diuapkan. Uap yang diperoleh terkondensasi
menjadi etanol pada labu penampung destilat. Selain dipengaruhi oleh suhu dan waktu
destilasi, perolehan rendemen juga dapat dipengaruhi oleh proses, bahan baku, dan alat
destilasi yang digunakan (Marjoni, 2014). Pada penelitian yang dilakukan menggunakan alat
destilasi yang berbeda untuk masing-masing perlakuan. Hal ini diduga dapat dapat
mempengaruhi rendemen yang dihasilkan.
Rendemen destilat yang dihasilkan diduga berupa cairan yang masih bercampur antara
air dengan etanol. Rendemen hasil destilasi tertinggi dihasilkan pada penambahan enzim
selulase konsentrasi 1% yaitu sebesar 20,8% sedangkan perolehan rendemen hasil destilasi
terendah dihasilkan pada penambahan enzim selulase konsentrasi 1,2% yaitu sebesar
11,467%. Perolehan rendemen destilat ini dapat dikatakan masih rendah dibandingan dengan
21
penelitian yang dilakukan Nasution dkk (2020) yang memperoleh rendemen hingga mencapai
28% dengan lama fermentasi selama 5 hari. Hal ini diduga tidak semua glukosa yang
terkonversi diubah menjadi bioetanol.

3.2 Kadar Etanol Destilat

Etanol atau Etil Alcohol (lebih dikenal dengan alkohol, dengan rumus kimia C2H5OH)
adalah cairan tak berwarna dengan karakteristik antara lain mudah menguap, mudah terbakar,
larut dalam air, tidak karsinogenik dan jika terjadi pencemaran tidak memberikan dampak
lingkungan yang signifikan (Seftian dkk, 2012). Pengujian kadar etanol dilakukan dengan
metode berat jenis. Perolehan kadar etanol pada suhu 15oC dari hasil fermentasi limbah padat
sirup jeruk kalamansi dengan penambahan enzim selulase dengan konsentrasi berbeda dapat
dilihat pada Gambar 6.
14 12,389
12 10,942
9,779
Kadar Etanol (%)

10
8 6,885
5,273
6
4
2
0
0,50% 0,70% 0,90% 1% 1,20%
Konsentrasi Enzim

Gambar 6. Pengaruh penambahan enzim selulse terhadap kadar etanol

Hasil uji ANOVA nilai Fhitung dalam pengujian kadar etanol pada suhu 15oC ,
peningkatan enzim selulase 0,5%, 0,7%, 0,9%, 1%,dan 1,2% memberikan pengaruh tidak
nyata terhadap kadar etanol yang dihasilkan dengan taraf signifikansi 0,303 lebih besar dari
0,05. Pengelompokan bahan baku juga tidak memberikan pengaruh terhadap kadar etanol
yang dihasilkan dengan signifikansi 0,183. Sebelum dilakukan proses fermentasi, limbah
padat jeruk kalamansi dihidrolisis terlebih dahulu menggunakan enzim selulase pada suhu
50oC. Enzim merupakan jenis protein yang berfungsi sebagai katalis dalam proses hidrolisis.
Enzim bekerja secara spesifik, karena strukturnya hanya bisa mengkatalis satu jenis reaksi
kimia dari substrat seperti hidrolisis, oksidasi dan reduksi (Herawati dkk, 2021). Pada proses
hidrolisis ini terjadi perombakan selulosa oleh enzim selulase menjadi glukosa dan glukosa
inilah yang akan diubah menjadi bioetanol melalui proses fermentasi. Tinggi rendahnya
glukosa dapat mempengaruhi bioetanol yang dihasilkan (Arif dkk., 2017). Semakin banyak
22
selulosa yang terkonversi menjadi glukosa diduga akan semakin banyak etanol yang
terbentuk.
Muin dkk (2015) mengatakan, dalam proses fementasi, waktu fermentasi akan
berjalan lambat apabila konsentrasi enzimnya terlalu sedikit. Sedangkan bila konsentrasi
enzimnya terlalu tinggi dapat menyebabkan terlalu banyak alkohol yang terkonversi pada
awal proses dan banyak glukosa yang belum terkonversi menjadi alkohol. Pada Gambar 6
dapat dilihat bahwa penambahan enzim selulase dengan konsentrasi berbeda menghasilkan
kadar etanol yang berbeda pula. Pada konsentrasi 0,5%, 0,7%, 1% dan 1,2%, kadar etanol
mengalami peningkatan namun mengalami penurunan pada konsentrasi 0,9%. Seftian dkk
(2012) mengatakan bahwa semakin besar volume enzim bertambah maka kadar etanol yang
dihasilkan juga semakin besar. Penelitian yang dilakukan Muin dkk (2015) mengatakan kadar
bioetanol mengalami peningkatan pada konsentrasi enzim 4 gram, 6 gram, dan 8 gram tetapi
mengalami penurunan pada konsentrasi enzim10 gram dan 12 gram. Selama proses hidrolisis,
enzim selulase mampu mengkonversi selulosa menjadi gula sederhana (glukosa). Oleh karena
itu, peningkatan kadar etanol dapat dikarenakan konsentrasi enzim selulase yang tinggi
mampu merombak selulosa menjadi glukosa lebih banyak dibandingkan dengan konsentrasi
enzim selulase yang sedikit sehingga kadar etanol yang dihasilkan lebih tinggi. Selain itu,
kadar etanol juga dipengaruhi oleh substrat, inokulum, dan waktu fermentasi (Amalia dkk,
2014). Substrat yang digunakan berupa limbah padat jeruk kalamansi yang telah dikecilkan
ukurannya kemudian dihidrolisis menggunakan enzim selulase. Ukuran substrat yang lebih
kecil dapat memperluas permukaan sehingga memudahkan Saccharomyces cereviciae dalam
merombak glukosa menjadi etanol. Sedangkan untuk proses fermentasi dilakukan selama 5
hari menghasilkan kadar bioetanol hingga 12,389%.
Pengujian terhadap kadar etanol hasil fermentasi limbah padat industri jeruk
kalamansi yang dihidrolisis dengan enzim selulase menghasilkan kadar etanol tertinggi pada
penggunaan enzim selulase konsentrasi 1,2% sebesar 12,389% v/v sedangkan konsentrasi
terendah pada penggunaan enzim selulase konsentrasi 0,9% sebesar 5,273% v/v. Menurut
Nasrun dkk (2015), kondisi lingkungan dapat mempengaruhi proses fermentasi seperti suhu
dan keasaman. Suhu yang baik untuk fermentasi berkisar antara 25oC-30oC sedangkan kadar
keasaman optimum yaitu pH 4,0-5,0. Arifwan dkk (2016) mengatakan rendahnya kadar
bioetanol dapat disebabkan karena adanya kontaminan seperti bakteri asam laktat dan bakteri
asam asetat yang bisa menjadi inhibitor selama proses fermentasi. Selain itu, proses destilasi
juga mempengaruhi perolehan kadar etanol. Proses destilasi pada penelitian ini dilakukan satu
kali destilasi dengan menggunakan alat destilasi sederhana dan berbeda-beda untuk setiap
perlakuan. Titik uap etanol adalah 78-80oC sehingga apabila menggunakan suhu yang lebih
23
tinggi pada saat destilasi maka air akan ikut menguap bersama dengan etanol sehingga
kadarnya menjadi rendah.
Faktor lain yang menyebabkan rendahnya kadar bioetanol pada konsentrasi enzim
selulase 0,9% diduga karena proses hidrolisis yang kurang optimal. Hal ini didukung oleh
penelitian Herawati dkk (2021) mengenai pembuatan bioetanol dengan hidrolisis
menggunakan enzim glukoamilase yang menyatakan kadar bioetanol yang dihasilkan
cenderung lebih tinggi pada konsentrasi enzim yang yang tinggi pula, kadar bioetanol
cenderung tetap setelah mencapai nilai optimum. Namun pada konsentrasi enzim
glukoamilase 0,8 ml terjadi penurunan kadar bioetanol yang disebabkan karena proses
hidrolisis yang belum sempurna. Pada penelitian yang dilakukan proses hidrolisis
menggunakan enzim selulase. Pencampuran enzim dilakukan secara manual dengan cara
diaduk menggunakan batang pengaduk. Hal ini diduga menyebabkan enzim tercampur dengan
bahan secara tidak merata sehingga saat proses hidrolisis tidak berlangsung sempurna.
Anggriani dkk (2020) mengatakan pada jumlah ragi yang digunakan sebanyak 5%, terjadi
penurunan kadar etanol pada konsentrasi enzim 50 unit jika dibandingkan dengan penggunaan
enzim 30 unit. Hal ini dimungkinkan karena tidak semua enzim yang dimasukkan kontak
dengan sampel. Dari penelitian yang telah dilakukan, semua kadar etanol yang dihasilkan
tidak masuk dalam syarat SNI 3565:2009 karena syarat mutu kadar etanol pada suhu 15oC
mutu 3 yaitu minimal 95% v/v, akan tetapi kadar etanol yang dihasilkan tertinggi adalah
12,389% v/v dengan satu kali destilasi. Perolehan kadar bioetanol ini lebih tinggi dari
penelitian Yumas dan Rosniati (2014) yang memperoleh kadar etanol tertinggi sebesar 5,93%
pada fermentasi 5 hari dengan konsentrasi yeast S. cereviceae 9% berbahan baku pulp kakao.
Akan tetapi perolehan kadar etanol sedikit lebih rendah dari penelitian Seftian dkk (2012)
yang memperoleh kadar etanol tertinggi sebesar 13,1154% dari kulit pisang yang dihidrolisis
dengan enzim selulase sebanyak 6% dari 150 ml bahan baku yang digunakan pada fermentasi
5 hari.

3.3 Keasaman (Sebagai Asam Asetat)

Pengujian terhadap keasaman bioetanol adalah untuk melihat seberapa banyak kadar
asam yang terkandung dalam bietanol selama proses fermentasi. Keasaman etanol yang
dihasilkan pada pembuatan bioetanol dari limbah padat industri sirup jeruk kalamansi dengan
penambahan enzim selulase pada konsentrasi 0,5%, 0,7%, 0,9% 1%, dan 1,2% dapat dilihat
pada Gambar 7.
Hasil uji ANOVA pada penambahan enzim selulase konsentrasi 0,5%, 0,7%, 9%, 1%
dan 1,2% berpengaruh nyata terhadap keasaman (sebagai asam asetat) bioetanol yang
24
dihasilkan dari fermentasi limbah padat industri sirup jeruk kalamansi dengan taraf
signifikansi 0,021 lebih kecil dari 0,05. Penggunaan bahan baku juga memberikan pengaruh
terhadap keasaman (sebagai asam asetat) dengan taraf signifikansi 0,01. Hasil uji DMRT
menunjukkan penambahan enzim selulase konsentrasi 0,5% berbeda nyata dengan
penambahan enzim selulase konsentrasi 1% dan 1,2% namun tidak berbeda nyata dengan
penambahan enzim selulase konsentrasi 0,7% dan 0,9%. Penambahan enzim selulase
konsentrasi 0,7% dan 0,9% tidak berbeda nyata dengan semua perlakuan. Penambahan enzim
selulase konsentrasi 1% berbeda nyata dengan penambahan enzim selulase konsentrasi 0,5%
akan tetapi berbeda tidak nyata dengan penambahan enzim konsentrasi 0,7%, 0,9%, dan
1,2%. Penambahan enzim selulase konsentrasi 1,2% berbeda nyata dengan penambahan
enzim selulase konsentrasi 0,5% namun berbeda tidak nyata dengan penambahan enzim
selulase konsentrasi 0,7%, 0,9%, dan 1%.

100 94b
75a,b 75a,b
Keasaman (mg/L)

80
60a
53a
60

40

20

0
0,50% 0,70% 0,90% 1% 1,20%
Konsentrasi Enzim

Gambar 7. Pengaruh penambahan enzim selulase terhadap keasaman

Penggunaan enzim selulase dengan konsentrasi berbeda berdasarkan pada Gambar 7

menghasilkan kadar keasaman bioetanol yang bervariasi. Kadar asam etanol mengalami
penurunan seiring dengan bertambahnya konsentrasi enzim selulase. Hal ini dapat disebabkan
semakin banyak enzim selulase yang digunakan, kadar gula hasil perombakan selulosa
menjadi glukosa yang dihasilkan meningkat yang digunakan sebagai nutrisi Saccharomyces
cereviciae selama proses fermentasi berlangsung. Hal ini menyebabkan semakin banyak
etanol yang dihasilkan dan semakin sedikit kadar keasaman etanol. Sebaliknya, semakin
sedikit konsentrasi enzim selulase, maka sedikit juga kadar gula yang dihasilkan dari
perombakan selulosa menjadi glukosa sehingga nutrisi yang dibutuhkan Saccharomyces
cereviciae selama proses fermentasi semakin berkurang. Perolehan kadar keasaman yang
semakin rendah yang terkandung dalam bioetanol menunjukkan hasilnya semakin baik. Muin

25
dkk (2015) mengatakan selama proses fermentasi, selain menghasilkan bioetanol juga
menghasilkan asam asetat sebagai produk sampingnya. Pembentukan asam asetat meningkat
terjadi karena penggunaan etanol sebagai sumber energi bagi Saccharomyces cerevisiae saat
proses fermentasi berlangsung (Rakhmadani, 2011). Menurut Syauqiah (2015), terbentuknya
kadar keasaman dapat disebabkan oleh kontaminasi bakteri asam asetat dan terjadinya
oksidasi bioetanol pada saat pembuatan maupun selama penyimpanan sehingga akan
terkonversinya bioetanol menjadi asam asetat.
Hasil uji keasaman pada bioetanol dari limbah padat jeruk kalamansi yang dihidrolisis
dengan enzim selulase konsentrasi 0,5%, 0,7%, 0,9%, 1%, dan 1,2% berturut-turut adalah 94
mg/L, 75 mg/L, 75mg/L, 60 mg/L, dan 53 mg/L. Dari hasil uji kadar asam tersebut,
penggunaan enzim konsentrasi 1% dan 1,2% dengan kadar asam 60 mg/L, dan 53 mg/L yang
masuk dalam syarat SNI 3565:2009 mutu 3 yaitu kadar keasaman maksimal 60 mg/L. Pada
penelitian yang dilakukan, kadar keasaman bioetanol menunjukkan nilai yang cukup tinggi
hingga melewati batas syarat mutu SNI. Hal ini dapat disebabkan karena aktivitas ragi
Saccharomyces cereviciae mulai menurun dan bioetanol yang dihaasikan mengalami oksidasi.
Menurut Salsabila dkk (2013), konsumsi gula oleh Saccharomyces cereviciae dapat terjadi
selama proses fermentasi sehingga diduga terjadi penurunan kadar gula seiringi dengan
bertambahnya waktu fermentasi. Semakin lama waktu fermentasi, semakin sedikit
ketersediaan substrat dan nutrisi yang diperlukan mikroba sehingga aktivitas ragi
Saccharomyces cereviciae menjadi menurun. Penurunan aktivitas ragi dapat berpengaruh
terhadap jumlah asam organik yang terbentuk sebagai hasil samping dalam pembuatan
bioetanol.

3.4 Sisa Penguapan Maksimum

Pengujian terhadap sisa penguapan maksimum bioetanol dimaksudkan untuk melihat
senyawa yang tidak menguap yang tercampur dalam bioetanol. Sisa penguapan maksimum
yang dihasilkan pada pembuatan bioetanol dari limbah padat industri sirup jeruk kalamansi
dengan penambahan enzim selulase pada konsentrasi 0,5%, 0,7%, 0,9% 1%, dan 1,2% dapat
dilihat pada Gambar 8.
Hasil uji ANOVA pada penambahan enzim selulase dengan konsentrasi 0,5%, 0,7%,
0,9%, 1% dan 1,2% menunjukkan pengaruh tidak nyata terhadap sisa penguapan maksimum.
Taraf signifikansi pada pengujian sisa penguapan maksimum 0,527 lebih besar dari 0,05.
Pengelompokan bahan baku juga tidak memberikan pengaruh nyata terhadap sisa penguapan
maksimum dengan taraf signifikansi 0,64. Sisa penguapan maksimum berpengaruh tidak
nyata dapat disebabkan karena jumlah senyawa yang tidak dapat menguap yang terkandung
26
dalam bioetanol dari limbah padat jeruk kalamansi tidak jauh berbeda atau hampir tidak
mengandung senyawa yang tidak menguap
0,8
0,667
Sisa Penguapan Maksimum
0,7
0,6 0,533
0,5
(mg/L)

0,4
0,3 0,2 0,167 0,167
0,2
0,1
0
0,50% 0,70% 0,90% 1% 1,20%
Konsentrasi Enzim

Gambar 8. Pengaruh penambahan enzim selulase terhadap sisa penguapan maksimum

Perlakuan penambahan enzim selulase dengan konsentrasi berbeda pada pembuatan

bioetanol dari limbah padat jeruk kalamansi berdasarkan Gambar 8 dapat menurunkan sisa
penguapan maksimum. Semakin banyak konsentrasi enzim yang ditambahkan, maka semakin
sedikit senyawa yang tidak menguap pada bioetanol. Hal ini menunjukkan hasil yang baik,
semakin sedikit jumlah senyawa yang tidak dapat menguap yang terkandung dalam bioetanol,
menandakan bioetanol yang dihasilkan semakin bagus. Sisa penguapan maksimum bioetanol
tertinggi pada penambahan konsentrasi enzim selulase 0,5% sebesar 0,67 mg/L sedangkan
sisa penguapan terendah dihasilkan pada penambahan konsentrasi enzim selulase1% dan
1,2% sebesar 0,167 mg/L. Hasil pengujian sisa penguapan maksimum bioetanol dari limbah
padat industri sirup jeruk kalamansi dengan penambahan enzim selulase masuk ke dalam
syarat SNI 3565:2009 dengan konsentrasi enzim selulase yang ditambahkan sebesar 0,5%,
0,7%, 9%, 1% dan 1,2% menghasilkan sisa penguapan maksimum berturut-turut 0,67 mg/L,
0,533 mg/L, 0,2 mg/L, 0,167 mg/L, dan 0,167 mg/L dan semua hasil pengujian sisa
penguapan maksimum masuk dalam kategori mutu 1 dengan nilai sisa penguapan maksimal
25 mg/L.

27
 V. KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
1. Konsentrasi enzim selulase berpengaruh nyata terhadap rendemen destilat dan kadar
keasaman (sebagai asam asetat) namun berpengaruh tidak nyata terhadap kadar etanol
dan sisa penguapan maksimum. Rendemen destilat mengalami peningkatan pada
konsentrasi enzim selulase 0,5% sampai konsentrasi 1% sebesar 12,467% menjadi 20,8%
namun mengalami penurunan pada konsentrasi enzim selulase 1,2% sebesar 11,467%.
Kadar bioetanol tetinggi diperoleh dari konsentrasi enzim selulase 1,2% sebesar
12,389%. Keasaman terendah yang diperoleh adalah 53 mg/L dan sisa penguapan
maksimum terendah adalah 0,167 mg/L.
2. Kadar etanol tertinggi diperoleh pada penambahan konsentrasi enzim selulase 1,2% yaitu
sebesar 12,389%.

5.2 Saran
1. Proses destilasi sebaiknya menggunakan alat yang sama untuk meminimalisir kesalalahan
dari alat yang digunakan.
2. Kadar bioetanol yang dihasilkan dari limbah padat jeruk kalamansi yang dihidrolisis
dengan enzim selulase masih rendah sehingga perlu adanya destilasi bertingkat untuk
meningkatkan kadar bioetanol.

28
 DAFTAR PUSTAKA

Amalia, Y., S. R. Muria, dan Chairul. 2014. Pembuatan Bioetanol dari Limbah Padat Sagu
Menggunakan Enzim Selulase dan Yeast Saccharomyces Cerevisiae dengan Proses
Simultaneous Sacharificatian and Fermentation (SSF) dengan Variasi Konsentrasi
Substrat dan Volume Inokulum. Jurnal Online Mahasiswa Fakultas Teknik Universitas
Riau. 1(1):1-8.
Anggriani, D., U. Kalsum, N. Nurjannah. 2020. Pengaruh Konsentrasi Enzim Silanase dan
Saccharomyces Cerevisiae dalam Pembuatan Bioethanol dari Limbah Kulit Singkong
dengan Proses Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan. Journal of Chemical Process
Engineering. 5(2): 44-49.
Arif, A. B., A. Budiyanto, W. Diyono, dan N. Richana. 2017. Optimasi Waktu Fermentasi
Produksi Bioetanol dari Dedak Sorghum Manis (Sorghum Bicolor L) Melalui Proses
Enzimatis. Jurnal Penelitian Pascapanen Pertanian. 14(2) : 67 – 78.
Arifwan, Erwin, dan R. Kartika. 2016. Pembuatan Bioetanol dari Singkong Karet (Manihot
Glaziovii Muell) dengan Hidrolisis Enzimatik dan Difermentasi menggunakan
Saccharomyces cerevisiae. Jurnal Atomik. 1(1) : 10-12.
Azizah N., A. N. Al-Baarri, dan S. Mulyani . 2012. Pengaruh Lama Fermentasi
Terhadap Kadar Alkohol, Ph, dan Produksi Gas Pada Proses Fermentasi
Bioetanol Dari Whey dengan Substitusi Kulit Nanas. Jurnal Aplikasi Teknologi
Pangan. 1(2):72-77.
Bachruddin, Z. 2014. Teknologi Fermentasi pada Industri Peternakan. Gadjah Mada
University Press. Yogyakarta. 143 hal.
Bahri S., A. Aji , dan F. Yani . 2018. Pembuatan Bioetanol dari Kulit Pisang Kepok dengan
Cara Fermentasi menggunakan Ragi Roti. Jurnal Teknologi Kimia Unimal. 7(2):
85-100.
Binod, P., R. Sindhu, R. R. Singhania, S. Vikram, L. Devi, S. Nagalakshmii, N. Kurien, R. K.
Sukumaran, and A. Pandey. 2010. Bioethanol production from rice straw: An
overview. Bioresource Technology Elsevier. 101 (13):4767–4774.
BPS. (2017). Statistik Minyak dan Gas Bumi 2016. Direktorat Jenderal Minyak dan Gas
Bumi Kementerian Energi dan Sumber Daya Mineral. Jakarta.
BSN. 2009. Standar Nasional Indonesia (SNI). SNI 3565:2009. Etanol Nabati. Dewan
Standarisasi Indonesia. Jakarta.

29
Ciptasari, R. 2015. Pembuatan Etanol Dari Limbah Kulit Jeruk Bali : Hidrolisis
Menggunakan Selulase dan Fermentasi Dengan Yeast. Skripsi. Fakultas Teknik.
Universitas Negeri Semarang. Semarang.
Dewi K. H., S. Mujiharjo, dan A. P. Utama. 2016. Potensi Pengolahan Hasil Samping Sirup
Kalamansi Menuju “Zero Waste”. Jurnal Agroindustri. 6 (1): 8 – 17.
Fachry, A. R., P. Astuti, T. G. Puspitasari. 2013. Pembuatan Bioetanol dari Limbah Tongkol
Jagung dengan Variasi Konsentrasi Asam Klorida dan Waktu [Link]
Teknik Kimia. 1(19): 60-69.
Fuadi, A. M., Harismah, K., dan Setiawan, A. 2015. Pengaruh Suhu dan pH terhadap
Banyaknya Yield (Kadar Glukosa) yang Dihasilkan pada Proses Hidrolisis
Enzimatis dari Limbah Kertas. Simposium Nasional RAPI XIV. 179-185.
Fuadi, A. M., dan K. Harismah. 2017. Perbandingan Efektifitas Pembuatan Glukosa Dari
Kertas Bekas Secara Hidrolisis Asam dan Enzim. Jurnal Teknologi Bahan Alam.
1(1):6-11.
Grohmann,K., R. G. Cameron, and B. S. Buslig. 1995. Fractionation and pretreatment of
orange peel by dilute acid hydrolysis. Bioresource Technology. 54(2):129-141.
Gunam I. B. W., N. M. Wartini, A. A. M. D. Anggreni, dan P. M. Suparyana. 2011.
Delignifikasi Ampas Tebu Dengan Larutan Natrium Hidroksida Sebelum Proses
Sakaraifikasi Secara Enzimatis Menggunakan Enzim Selulase Kasar Dari
Aspergillus Niger Fnu 6018. Jurnal Teknologi Indonesia, 34 (edisi khusus):24-32.
Handoko, T., G. Suhandjaja, H. Muljana. 2012. Hidrolisis Serat Selulosa dalam Buah Bintaro
sebagai Sumber Bahan Baku Bioetanol. Jurnal Teknik Kimia Indonesia. 11(1):26-33.
Herawati, N., H. Juniar, R. W. Setiana. 2021. Pembuatan Bioetanol dari Pati Ubi Talas
(Colocasia L. Schoot) dengan Proses Hidrolisis. Distilasi. 6(1): 7-17.
Hidayat, L., I. Darmatama, Y. Dany, dan Djamilah. 2018. Analisis Teknis dan Finansial
Produksi Sirup Kalamansi: Studi Kasus pada Industri Rumah Tangga “Segar Asri”
Kampung Melayu di Kota Bengkulu. Jurnal Agroindustri. 8(1):11-25.
Hidayat, M. R. 2013. Teknologi Pretreatment Bahan Lignoselulosa dalam Proses Produksi
Bioetanol. Biopropal Industri. 4(1):33-48.
Ikhsan M. A. R., Y. Rosalina, dan L. Susanti. 2018. Pengaruh Penambahan Asam Sitrat
Dan Jenis Kemasan Terhadap Perubahan Mutu Sari Buah Jeruk Kalamansi Selama
Penyimpanan Pada Suhu Ruang. Jurnal Agroindustri. 8(2): 139-149.
John I., K. Muthukumar, dan A. Arunagiri. 2017. A review on the potential of citrus waste for
D-Limonene, pectin, and bioethanol production. International Journal Of Green
Energy 14(7) : 599–612.
30
Khaira Z. F., E. Yenie, dan S. R. Muria. 2015. Pembuatan Bioetanol dari Limbah Tongkol
Jagung Menggunakan Proses Simultaneous Sacharificatian And Fermentation (SSF)
dengan Variasi Konsentrasi Enzim dan Waktu Fermentasi. JOM FTEKNIK. 2(2):1-
8.
Knauf, M., and M. Moniruzzaman. 2004. Lignocellulosic biomass processing: A perspective.
International Sugar Journal 106 (1263): 147–150.
Komarayati, S., I. Winarni, dan Djarwanto. 2011. Pembuatan Bioetanol dari Empulur Sagu
(Metroxylon spp.) dengan Menggunakan Enzim. Jurnal Penelitian Hasil Hutan. 29(1)
: 20-32.
Loebis E. H., Y. R. Meutia, L. Junaidi, dan R. Alamsyah. 2015. Proses Delignifikasi Limbah
Pasar untuk Produksi Bioetanol. Warta IHP/. 32(2) : 68-74.
Marin, F. R., C. S. Rivas, O. B. Gracia, J. Castillo, dan J. A. P. Alvarez . 2005. By Products
From Different Citrus Processes As A Source Of Customized Functional Fibres.
Jurnal Food Chemistry. 100(2007) : 736-741.
Marjoni, M. R. 2014. Pemurnian Etanol Hasil Fermentasi Kulit Umbi Singkong (Manihot
Utilissima Pohl) dari Limbah Industri Kerupuk Sanjai di Kota Bukittinggi
Berdasarkan Suhu dan Waktu Destilasi. Pharmaҫiana. 4(2) : 193-200.
Maryanti, E., D. Fitriani, dan F. Sani. 2017. Diversifikasi Residu Olahan Home Industry Sirup
Jeruk Kalamansi di Kabupaten Bengkulu Tengah. Jurnal Dharma Raflesia. (1) :47-
54.
Meryandini, A., W. Widosari, B. Maranatha, T. C. Sunarti, N. Rachmania, dan H. Satria.
2009. Isolasi Bakteri Selulotik dan Karakterisasi Enzimnya. Makara, Sains. 13(1) :
33-38.
Minarni, N. 2013. Pembuatan Bioetanol dari Glukosa dengan Hasil Hidrolisis Biji Durian
(Durio zibethinus) dengan Bantuan Saccharomyces cerevisiae. Skripsi. Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya. Malang.
Muin, R., I. Hakim, A. Febriansyah. 2015. Pengaruh Waktu Fermentasi dan Konsentrasi
Enzim Terhadap Kadar Bioetanol dalam Proses Fermentasi Nasi Aking Sebagai
Substrat Organik. Jurnal Teknik Kimia. 21(3):59-69.
Nasrun, Jalaluddin, dan Mahfuddhah. 2015. Pengaruh Jumlah Ragi dan Waktu Fermentasi
terhadap Kadar Bioetanol yang Dihasilkan dari Fermentasi Kulit Pepaya. Jurnal
Teknologi Kimia Unimal. 4(2): 1-10.
Nasution, F. A., M. Marniza, dan T. Tutuarima. 2020. Kajian Awal Produksi Bioetanol dari
Limbah Padat Industri Sirup Jeruk Kalamansi. Seminar Nasional Agroindustri. 10
November 2020, Padang, Indonesia. 268-272.
31
Ni‟mah, L. 2014. Study Kinetika Peruraian Partikel Pada Pemanfaatan Limbah Ampas Tahu
dan Kotoran Sapi Sebagai Material Pembuatan Biogas. Jurnal INFO – TEKNIK.
15(1) : 45-60.
Nugrahini, F. P., Sitompul, H., dan Putra, D. R. 2016. Pengaruh Waktu dan Konsentrasi
Enzim Selulase pada Proses Hidrolisis Tandan Kosong Kelapa Sawit menjadi
Glukosa. Analit: Analytical and Environmental Chemistry. 1(1):8-16.
Nurhadianty, V., C. Cahyani, W. O. C. Nirwana, dan L. K. Dewi. 2018. Pengantar Teknologi
Fermentasi Skala Industri. UB Press. Malang. 123 hal.
Osvaldo, Z. S., P. Putra, M. Faizal. 2012. Pengaruh Konsentrasi Asam dan Waktu pada
Proses Hidrolisis dan Fermentasi Pembuatan Bioetanol dari Alang-Alang. Jurnal
Teknik Kimia. 2(18):52-62.
Pratama, A. P., M. Anggraeni, J. Isbeanny LFH, M. Amin, R. Amelia, dan A. R. Jannah.
2012. Pengaruh Suhu dan pH Terhadap Aktifitas Enzim. Jurnal Kimia Indonesia.
1(1):22-27.
Pribadi, A. 2021. Menteri ESDM: Cadangan Minyak Indonesia Tersedia Untuk 9,5 Tahun
dan Cadangan Gas 19,9 Tahun. Siaran PERS No. [Link]/04/SJI/2021.
Kementrian Energi dan Sumber Daya Mineral. Jakarta.
Purwanto, A. 2012. Pembuatan Bioetanol Dari Tepung Biji Nangka Dengan Proses
Sakarifikasi Fermentasi Fungi Aspergillus niger Dilanjutkan Dengan Fermentasi
Yeast Saccharomyces cereviceae. Tugas Akhir. Program Diploma Fakultas Teknik,
Universitas Diponegoro. Semarang.
Putri, R. A. C. dan A. K. Wardani. 2018. Isolasi dan Karakterisasi Parsial Enzim Selulase
Bakteri Selulolitik Hasil Isolasi dari Limbah Padat Tapioka (Onggok). Agroindustrial
Technology Journal. 02(02) : 98-106.
Rakhmadani, H. A., 2011. Studi Pemanfaatan Limbah Makanan Sebagai Bahan Penghasil
Etanol untuk Biofuel Melalui Proses Hidrolisis pada Kecepatan Pengadukan dan
Waktu Fermentasi yang Berbeda. Thesis. Universitas Diponegoro:Semarang.
Razie, F., A. Iswandi, A. Sutandi, L. Gunarto, dan Sugiyanta. 2011. Aktivitas Enzim Selulase
Mikroba yang Diisolasi dari Jerami Padi di Persawahan Pasang Surut di Kalimantan
Selatan. J. Tanah Lingk. 13(2) : 43-48.
Salsabila, U., D. Mardiana, dan E. Indahyanti. 2013. Kinetika Reaksi Fermentasi Glukosa
Hasil Hidrolisis Pati Biji Durian Menjadi Etanol. Student Journal, 2(1) : 331-337.
Samah, O., S. Sias. Y. Hua. and N. Hussin. 2011. Production of Ethanol from Cocoa Pod
Hydrolysate. Jurnal. Science ITB. 43(2) : 87-94.

32
Seftian, D., F. Antonius, dan M. Faizal. 2012. Pembuatan Etanol Dari Kulit Pisang
Menggunakan Metode Hidrolisis Enzimatik Dan Fermentasi. Jurnal Teknik Kimia.
1(18).
Setyawati D. R., A. R. Sinaga, dan T. K. Dewi. 2013. Proses Pembuatan Bioetanol Dari
Kulit Pisang Kepok. Jurnal Teknik Kimia. 1(19):9-15.
Sudiyani, Y., S. Aiman, dan D. Mansur. 2019. Perkembangan Bioetanol G2: Teknologi dan
Perspektif. LIPI Press. Jakarta. 354 Hal.
Susanti, R. dan F. Fibriana. 2017. Teknologi Enzim. ANDI. Yogyakarta. 210 hal.
Sutanto, R., H. Jaya, dan A. Mulyanto. 2013. Analisa Pengaruh Lama Fermentasi dan
Temperature Destilasi Terhadap Sifat Fisik (Specific Gravity dan Nilai Kalor)
Bioetanol Berbahan Baku Nanas (Ananas comosus). Jurnal Dinamika Teknik
Mesin. 3(2) : 34- 46.
Syauqiah, I. 2015. Pengaruh Waktu Fermentasi dan Persentase Starter Pada Nira Aren
(Arenga pinnata) terhadap Bioetano yang Dihasilkan. Info Teknik. 16(2):217-226.
Taherzadeh, M. J. dan K. Karimi. 2007. Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from
lignocellulosic materials: a review. BioResources. 2: 707–738.
Talebnia, F. 2008. Ethanol Production from Cellulosic Biomass by Encapsulated
Saccharomyces cereviciae. Thesis. Chemical and Biological Engineering.
Talebnia, F., M. Pourbafrani, M. Lundin, and M. J. Taherzadeh. 2008. Optimization Study of
Citrus Wastes Saccharification by Dilute Acid Hydrolysis. Bioresource. 3(1):108-
122.
Tutuarima, T., K. H. Dewi, dan N. Sambela. 2018. Proses Maserasi Hasil samping Industri
Sirup Jerik Kalamansi (Citrofortunella microcarpa). Jurnal Ilmiah Teknologi
Pertanian Agrotechno. 3(2):259-364.
Widiastuti, W. 2012. Analisis Branding Sirup Jeruk Kalamansi Produk Koperasi Kultura
Kalamansi [Link]: Bengkulu di Mata Kita. PT Swara UNIB. Bengkulu, pp.
165-189.
Wusnah, S. Bahri, dan D. Hartono. 2019. Proses Pembuatan Bioetanol dari Kulit Pisang
Kepok (Musa acuminata B.C) secara Fermentasi. Jurnal Teknologi Kimia Unimal.
8(1) : 48–56.
Yumas, M. dan Rosniati. 2014. Pengaruh Konsentrasi Starter dan Lama Fermentasi Pulp
Kakao Terhadap Konsentrasi Etanol. BIOPROPAL INDUSTRI. 5(1) : 13-22.

33
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Diagram alir pembuatan bioetanol

Limbah padat jeruk

kalamansi

Pengecilan ukuran Akuades

Bubur limbah padat jeruk kalamansi

Pengaturan pH 4-5 NaOH 0,1

N

Pensterilan menggunakan autoclave

selama 30 menit

Pendinginan

Penambahan enzim selulase 0,5%,

0,7%, 0,9%, 1%, 1,2%

Hidrolisis suhu 50oC selama 9 jam

Urea 1 Saccharomyces
Fermentasi selama 5 hari
g cerevicise 8 g

Hasil fermentasi bubur kalamansi

Penyaringan Biomassa

Destilasi

Etanol

34
Lampiran 2. Data penelitian rendemen destilat
No Kode Sampel Jumlah Destilat (ml) Rendemen (%)
1 S1U1 76 15,2
2 S1U2 45 9
3 S1U3 66 13,2
4 S2U1 87 17,4
5 S2U2 44 8,8
6 S2U3 68 13,6
7 S3U1 133 26,6
8 S3U2 79 15,8
9 S3U3 88 17,6
10 S4U1 111 22,2
11 S4U2 100 20
12 S4U3 101 20,2
13 S5U1 74 14,8
14 S5U2 30 6
15 S5U3 68 13,6

35
Lampiran 3. Data penelitian kadar etanol
No Kode Sampel Densitas Kadar Etanol (%)
1 S1U1 0,98766 9,083
2 S1U2 0,99019 7
3 S1U3 0,99339 4,571
4 S2U1 0,97809 17,8
5 S2U2 0,99154 6
6 S2U3 0,99209 5,538
7 S3U1 0,99217 5,462
8 S3U2 0,99369 4,357
9 S3U3 0,99153 6
10 S4U1 0,98102 15
11 S4U2 0,99222 5,462
12 S4U3 0,98387 12,364
13 S5U1 0,98582 10,667
14 S5U2 0,98893 8
15 S5U3 0,97744 18,5

36
Lampiran 4. Data penelitian keasaman (sebagai asam asetat)
No Kode Sampel Volume Titran (ml) Keasaman
1 S1U1 3 90
2 S1U2 3,6 108
3 S1U3 2,8 84
4 S2U1 1,5 45
5 S2U2 3,5 105
6 S2U3 2,5 75
7 S3U1 2,5 75
8 S3U2 3 90
9 S3U3 2 60
10 S4U1 1,7 51
11 S4U2 2,8 84
12 S4U3 1,5 45
13 S5U1 1,8 54
14 S5U2 2 60
15 S5U3 1,5 45

37
Lampiran 5. Data penelitian sisa penguapan maksimum
No Kode Sampel Berat Cawan Berat Cawan (b-a) Sisa Penguapan
Awal (a) Akhir (b)
1 S1U1 66,32 66,33 0,01 0,1
2 S1U2 66,32 66,46 0,14 1,4
3 S1U3 68,72 68,73 0,01 0,1
4 S2U1 58,32 58,33 0,01 0,1
5 S2U2 59,5 59,68 0,18 1,8
6 S2U3 59,5 59,51 0,01 0,1
7 S3U1 59,5 59,51 0,01 0,1
8 S3U2 58,32 58,34 0,02 0,2
9 S3U3 58,32 58,35 0,03 0,3
10 S4U1 68,72 68,73 0,01 0,1
11 S4U2 68,72 68,74 0,02 0,2
12 S4U3 66,32 66,34 0,02 0,2
13 S5U1 65,84 65,85 0,01 0,1
14 S5U2 65,84 65,87 0,03 0,3
15 S5U3 65,84 65,85 0,01 0,1

38
Lampiran 6. Data Analisis Rendemen

Levene's Test of Equality of Error Variancesa

Dependent Variable: Rendemen
F df1 df2 Sig.
. 14 0 .
Tests the null hypothesis that the error variance of
the dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + Perlakuan + Kelompok

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Rendemen
Type III Sum
Source of Squares df Mean Square F Sig.
Corrected
29486.400a 6 4914.400 3.448 .055
Model
Intercept 365040.000 1 365040.000 256.132 .000
Perlakuan 23624.000 4 5906.000 4.144 .042
Kelompok 5862.400 2 2931.200 2.057 .190
Error 11401.600 8 1425.200
Total 405928.000 15
Corrected Total 40888.000 14
a. R Squared = ,721 (Adjusted R Squared = ,512)

Homogeneous Subsets
Rendemen
a,b
Duncan
Subset
Perlakuan N 1 2 3
S5 3 114.6667
S1 3 124.6667
S2 3 132.6667 132.6667
S3 3 200.0000 200.0000
S4 3 208.0000
Sig. .590 .060 .802
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 1425,200.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
b. Alpha = ,05.

39
Lampiran 7. Data Analisis Kadar Etanol

Levene's Test of Equality of Error Variancesa

Dependent Variable: Kadar Etanol
F df1 df2 Sig.
. 14 0 .
Tests the null hypothesis that the error variance of the
dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + Perlakuan + Kelompok

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Kadar Etanol
Type III Sum
Source of Squares df Mean Square F Sig.
Corrected
177.463a 6 29.577 1.672 .245
Model
Intercept 1229.515 1 1229.515 69.523 .000
Perlakuan 102.645 4 25.661 1.451 .303
Kelompok 74.818 2 37.409 2.115 .183
Error 141.480 8 17.685
Total 1548.458 15
Corrected Total 318.943 14
a. R Squared = .556 (Adjusted R Squared = .224)

Homogeneous Subsets
Kadar Etanol
a,b
Duncan
Subset
Perlakuan N 1
S3 3 5.27300
S1 3 6.88467
S2 3 9.77933
S4 3 10.94200
S5 3 12.38900
Sig. .091
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 17.685.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
b. Alpha = ,05.

40
Lampiran 8. Analisis data Keasaman (Sebagai Asam Asetat)

Levene's Test of Equality of Error Variancesa

Dependent Variable: Keasaman (Sebagai Asam Asetat)
F df1 df2 Sig.
. 14 0 .
Tests the null hypothesis that the error variance of the
dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + Perlakuan + Kelompok

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Keasaman (Sebagai Asam Asetat)
Type III Sum
Source of Squares df Mean Square F Sig.
Corrected
5449.200a 6 908.200 6.462 .010
Model
Intercept 76469.400 1 76469.400 544.073 .000
Perlakuan 3015.600 4 753.900 5.364 .021
Kelompok 2433.600 2 1216.800 8.657 .010
Error 1124.400 8 140.550
Total 83043.000 15
Corrected Total 6573.600 14
a. R Squared = ,829 (Adjusted R Squared = ,701)

Homogeneous Subsets
Keasaman (Sebagai Asam Asetat)
a,b
Duncan
Subset
Perlakuan N 1 2
S5 3 53.0000
S4 3 60.0000
S2 3 75.0000 75.0000
S3 3 75.0000 75.0000
S1 3 94.0000
Sig. .065 .096
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 140,550.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
b. Alpha = ,05.

41
Lampiran 9. Data Analisis Sisa Penguapan Maksimum

Levene's Test of Equality of Error Variancesa

Dependent Variable: SisaPenguapan Maksimum
F df1 df2 Sig.
. 14 0 .
Tests the null hypothesis that the error variance of
the dependent variable is equal across groups.
a. Design: Intercept + Perlakuan + Kelompok

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: SisaPenguapan Maksimum
Type III Sum
Source of Squares df Mean Square F Sig.
Corrected
221.600a 6 36.933 1.892 .198
Model
Intercept 180.267 1 180.267 9.237 .016
Perlakuan 67.067 4 16.767 .859 .527
Kelompok 154.533 2 77.267 3.959 .064
Error 156.133 8 19.517
Total 558.000 15
Corrected Total 377.733 14
a. R Squared = ,587 (Adjusted R Squared = ,277)

Homogeneous Subsets
SisaPenguapan Maksimum
a,b
Duncan
Subset
Perlakuan N 1
S4 3 1.667
S5 3 1.667
S3 3 2.000
S2 3 5.333
S1 3 6.667
Sig. .232
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 19,517.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
b. Alpha = ,05.

42
Lampiran 10. Tabel Alkoholometrik

43
44
45
Lampiran 11. Syarat mutu etanol nabati (SNI 3565:2009)
No Uraian Persyaratan mutu
Satuan Mutu I Mutu II Mutu III
1 Kadar etanol pada 15 °C % v/v Min. 96,3 Min. 96,1 Min. 95,0
% b/b Min. 94,4 Min. 94,1 Min. 92,5
2 Bahan yang dapat Menit Min. 30 Min. 15 -
dioksidasikan, pada 15o C
( waktu uji permanganat )
3 Minyak fusel mg/L Maks. 4 Maks. 15 -
4 Aldehid (sebagai mg/L Maks. 4 Maks. 10 -
asetaldehid)
5 Keasaman (sebagai asam mg/L Maks. 20 Maks. 30 Maks. 60
asetat)
6 Sisa Penguapan mg/L Maks. 25 Maks. 25 Maks. 50
Maksimum
7 Metanol mg/L Maks. 10 Maks. 30 Maks. 100

46
Lampiran 12. Dokumen penelitian

a. Penimbangan bahan baku b. Pengecilan ukuran bahan

c. Bubur limbah padat jeruk kalamansi d. Sterilisasi bubur limbah kalamansi

e. Penambahan enzim selulase f. Proses hidrolisis

47
g. Penambahan ragi Saccharomyces h. proses fermentasi
cereviciae

i. Filtrat hasil fermentasi j. Proses destilasi

k. Etanol hasil destilasi l. Pengujian densitas etanol

48
m. Pengujian kadar keasaman n. Pengujian sisa penguapan
maksimum

49