Nama : Prasasti Rahma Sumunar

NIM : P07134222015
Prodi : ST TLM
Semester :2

SAMPEL UNTUK BIOMOL

Isolasi DNA Tanaman

Isolasi DNA merupakan tahapan pekerjaan awal yang harus dilakukan
dalam berbagai pekerjaan analisis DNA. DNA merupakan suatu bahan genetik
yang berfungsi untuk mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk
melakukan proses metabolisme
Komponen DNA terdiri dari :
 Basa Nitrogen
Adenin (Adenine/A), Guanin (Guanine/G), Sitosin (Cytosine/C) dan
Timin (Thymine/T)
 Gula Pentosa
D-2-deoksiribosa
 Gugus fosfat
Tahapan isolasi DNA terdiri dari :
 Lisis (pemecahan dinding sel)
 Ekstraksi DNA
 Presipitasi DNA
Proses isolasi DNA diawali dengan pemecahan secara mekanik dan
kimiawi dinding sel. Alat dan bahan yang dibutuhkan adalah :
 Tabung reaksi  Pisau  Detergent
 Beaker glass  Vortex  Aquadest
 Timbangan  Blender  Garam
 Gelas aqua  Spatula  Ethanol absolut
 Pipet tetes  Buah  Kertas saring
 Langkah kerja yang dilakukan dalam isolasi DNA tanaman meliputi :
1. Buah dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil
2. Kemudian ditimbang sampai berat 100g
3. Diambil 100 g buah dan 100 ml aquades, kemudian diblender hingga halus
4. Masing - masing buah yang telah diblender dan dimasukkan ke dalam 3
tabung reaksi yang berbeda sebanyak 4 ml
5. Larutkan detergent ke dalam 60 ml aquades
6. Larutan detergen dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi jus buah
7. Tambahkan 1 spatula garam dapur ke dalam masingmasing tabung reaksi,
aduk hingga larut
8. Campurkan kemudian disaring sebanyak 2x dengan kertas saring
9. Lalu tambahkan ethanol absolut sebanyak 5 mL ke dalam masing-masing
campuran
10. Larutan kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex

Isolasi DNA CTAB

Prinsip dasar isolasi DNA ini adalah :
1. Penghancuran (lisis) dinding sel dan membran sel menggunakan detergen
untuk membebaskan DNA
2. Degradasi protein menggunakan protease (protease untuk mendegradasi
protein)
3. Presipitasi DNA menggunakan alkohol (etanol dan isopropanol) dan garam
(misalnya NA-asetat)
4. Pelaruttan DNA dengan air atau buffer TE (Tris-EDTA) pH 8

Isolasi Plasmid
Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel yang disebut
sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA kromosomal,
bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal, yaitu plasmid. Bentuk plasmid
adalah sirkuler double helix berukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Plasmid
mengandung gen yang tidak diperlukan untuk kelangsungan hidup bakteri.
 Berdasarkan jumlahnya, plasmid dalam sel bakteri dibedakan menjadi
Low copy number plasmid (satu sel hannya mengandung satu atau beberapa
plasmid) dan High copy number (satu sel bakteri mengandung banyak hingga
ribuan plasmid). Beberapa macam bentuk plasmid yaitu :
 Linear
(DNA berbentuk rantai panjang tidak berujung)

 Supercoiled
(DNA plasmid berbentuk sirkular dengan bentuk rantai yang terpilin)

 Nicked open circular

(rantai DNA terpotong pada salah satu sisi saja)

 Relaxed circular
(kedua ujung DNA menyatu membentuk sirkuler)
 Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini disebut dengan
proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20 µg. Inti dari
isolasi plasmid bakteri ini adalah menghancurkan membran sel sehingga semua
organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal dan DNA
ekstrakromosomal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid ini, perlu dilakukan
pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya.

Penentuan Kualitas DNA

DNA tanaman yang sudah diisolasi harus terlebih daahulu dihitung
konsentrasinya maupun dicek kualitasnya sebelum dapat digunakan dalam
proses selanjutnya. Dalam proses isolasi DNA, kualitas DNA yang dihasilkan
akan sangat tergantung dari kondisi materi tanaman yang dipergunakan. Tujuan
dari perhitungan konsentrasi dan cek kualitas DNA adalah untuk menjamin
bahwa jika ada kegagalan dalam proses selanjutnya (misal PCR) bukanlah
akibat rendahnya kuantitas atau kualitas DNA.
Penghitungan kuantitas (konsentrasi) DNA dapat dilakukan dengan
metode spektrofotometri dengan mengamati tinggi cahaya UV yang diserap.
Makin tinggi cahaya yang diserap maka makin tinggi konsentrasi DNA
Penentuan kualitas DNA dapat dilakukan menggunakan perhitungan rasio
absorbansi pada A260 dan A280 dengan nilai maksimal rasio A260:A280
adalah 2 atau juga dengan melihat pita DNA melalui proses elektroforesis, pita
DNA genom normal akan tampak sebagai pendar tak putus pada gel agarosa.

Preparasi PCR
Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik molekuler
yang dapat memperbanyak sekuen DNA spesifik menjadi jutaan salinan secara
in vitro. Melalui teknik ini maka akan didapatkan nukleotida beberapa kali
lipat dari jumlah nukleotida yang diamplifikasi. Salah satu kunci keberhasilan
dari teknik ini adalah cara mengamplifikasi urutan DNA target dan
meminimalkan amplifikasi DNA non target serta pada penggunaan suhu yang
tepat pada berbagai tahap yang dilakukan. Tahapan proses PCR meliputi :
 Denaturasi (95°C selama 10 menit)
Pada tahap denaturasi akan terjadi proses pemisahan DNA dari untai ganda
(double strand) menjadi DNA untai tunggal (single strand).
 Annealing (95°C selama 15 detik)
Pada tahap annealing akan terjadi proses penempelan primer pada DNA
target yang akan diamplifikasi.
 Elongasi (60°C selama 45 detik)
Dilakukan pengulangan siklus sebanyak 40 kali.
Real time PCR merupakan teknik yang digunakan untuk menggandakan
DNA target dari suatu organisme yang dilakukan untuk tujuan mengetahui
kuantitas DNA target, melihat kuantitasnya secara relatif, ekspresi gen
(kuantifikasi mRNA), deteksi keberadaan DNA target, menentukan jenis SNP
(Single Nucleotide Polimorfism), menentukan kurva Tm (Melting Curve), dan
melakukan skrining High Resolution Melting (HRM).
Bentuk aplikasi dari Realtime PCR adalah :
1. Analisa Kuantitatif
Analisa kuantitatif ini membutuhkan kurva standard dengan konsentrasi
yang dipersiapkan dengan cara membuat pengenceran secara serial
2. Genotyping SNP
Pada Genotyping SNP ini dibutuhkan primer Forward dan reverse dengan
2 probe yang masing-masing akan menempel pada DNA target tipe liar dan
mutan.
3. High Resolution Melting
Digunakan untuk melakukan skrining DNA target yang mempunyai lebih
dari satu SNP atau untuk melihat % metilasi dari DNA target.
4. Melting Curve
Digunakan untuk mengetahui titik Tm (⁰C) dari amplikon yang terbentuk.
Alat dan bahan yang dibutuhkan dalam preparasi PCR adalah :
 PCR microtube  DNA genom hasil isolasi
 Mesin qPCR  qPCR kit
  Micropipette dan tip  SYBR Green I (DNA-binding dye probe
 Vortex  Fluorescence primer
 Sentrifuse  -ddH₂O (DNAse free water)
Cara kerja dalam preparasi PCR adalah sebagai berikut :
1. Menyiapkan PCR Master Mix (dilakukan di dalam es)
2. PCR master mix terdiri atas: DNA polimerase, buffer, dNTPs, SYBR Green
I/probe
3. Vortex dahulu semu reagen yang akan digunakan agar larutan homogen
4. Siapkan sampel DNA hasil ekstraksi menggunakan kit yang tersedia
5. Masukkan masing-masing 23 ul larutan mix pada setiap PCR tube yang
akan digunakan
6. Tambahkan masing-masing 2 pl ddH-O (kontrol negatif), control positf, dan
s it, dan sampel DNA yang akan diuji pada PCR tube yang sudah berisi 23
µl larutan mix
7. Tutup well menggunakan sealing plastic untuk PCR tube, lalu spin down
untuk menurunkan larutan di bawah tube
8. Masukkan PCR tube ke dalam mesin real-time PR. lalu atur penamaan
sampel dan semua parameter yang dibutuhkan
9. Atur program PCR seperti tabel pada slide selanjutnya
10. Setelah proses PCR selesai, dapat langsung dianalisis data

Isolasi RNA
Isolasi adalah prosedur yang digunakan untuk memisahkan suatu bagian
lain dengan tujuan tertentu. Isolasi RNA meseenger (mRNA) adalah prosedur
yang digunakan untuk memisahkan RNA dari zat lain sehingga dihasilkan
RNA murni.
Isolasi RNA terdiri dari 3 tahap yaitu :
1. Ekstrasi
Prinsip : Meliliskan membrane sel untuk mengekspos RNA
Reagen : Deterjen
Hasil : Pemisahan dari DNA, lipid, protein, karbohidrat
2. Presipitasi
Prinsip : Untuk melihat RNA yang sering tidak terlihat sebelum sentrifugasi
Reagen : Isopropanol,Etanol, Absolut, Sodium Asetat
Hasil : RNA diendapkan
3. Pemurnian
Prinsip : Menghilangkan kandungan garam yang masih bersisa
Reagen : Etanol
Hasil : Tingkat kemurnian RNA berbanding lurus dengan nilai absorbansi
Metode dari isolasi RNA diantaranya adalah sebagai berikut :
1. Guanidin tiosianat
Prinsip : Melisiskan membrane sel dan membuat RNA larut didalam larutan
yang mengandung GT
Reagen : Guanidin tiosianat
Sumber sampel : Jaringan dan kultur Sel
2. Modifikasi GT
Prinsip : Mensintesis cDNA full length dan reaksi RT-PCR
Reagen : Guanidin tiosianat
Sumber sampel : Jaringan dan kultur Sel
3. Krematografi
Prinsip : Mengisolasi RNA Poli (A)+ dari RNA total dengan purifikasi
Reagen : Selulosa oligo (dT)
Sumber sampel : Jaringan dan kultur Sel
4. Trizol
Prinsip : Menghilangkan molukel DNA besar, tetapi tidak DNA plasmid
Reagen : Reagen trizol
Sumber sampel : Jaringan dan kultur Sel
5. Kit isolasi
Prinsip : Melilisikan membrane sel untuk mendapatkan RNA dengan cara
konvensional
Reagen : Kit RNA ekstraksi, Qiagen, Etanol
Sumber sampel : Virus
Daftar Pustaka
Holil, K. 2014. Buku Petunjuk Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekuler.
Malang : UIN Malang.
Jannah M, dkk. 2021. Metode Biologi Molekuler. Bandung: Penerbit Widina
Bhakti Persada.
Maftuchah, dkk. 2014. Teknik Analisis Biologi Molekuler. Yogyakarta :
Penerbit Deepublish.
Nurhayati B, Darmawati S. 2017. Biologi Sel dan Molekuler. Jakarta :
Pusdiknakes.