Nurul Hidayati / 202010220311009 / TP-4A

BAB IV

ANALISIS KAPASITAS ANTIOKSIDAN METODE DPPH & FRAP,

Pendahuluan

Kakao atau biasanya dikenal dengan sebutan coklat merupakan tumbuhan berwujud pohon
yang berasal dari hutan-hutan tropis di Amerika Tengah dan Amerika selatan bagian Utara (Jusmiati,
et al. 2015). Kakao sudah banyak tersebar di daerah-daerah tropis dan sub tropis di dunia. Indonesia
merupakan negara ketiga tertinggi didunia sebagai produsen kakao setelah pantai gading (Yuliani,
2020). Dengan begitu Indonesia memproduksi buah kakao cukup melimpah yaitu sebesar 270.000
ton pertahun (Prasetya, et. al 2020). Buah kakao memiliki persentase terbesar dari total massa
kakao segar yaitu sekitar 67%. Buah kako terdiri dari 75,52% kulit buah, 2,20 % plasenta dan 22,28%
biji. Kakao mulai berproduksi pada umur 18 bulan (1,5 tahun). Pada buah kakao kulitnya
mengandung kaya akan protein, serat dan komponen bioaktif. Komponen bioaktif tersebut termasuk
dalam senyawa polifenol yang bermanfaat sebagai antioksidan. Kakao yang biasa dimanfaat yaitu
bagian bijinya. Biji kakao biasanya dikeringkan dengan cara, setelah pemetikan dilakukan sortasi
untuk memilih mana kakao yang memiliki kualitas bagus dan tidak. Setelah itu dilakukan pemecahan,
fermentasi, perendaman dan juga pencucian biji kakao, setelah biji kakao bersih dilanjutkan dengan
proses pengeringan, penguletan, lalu dilanjutkan dengan proses pengemasan dan penyimpanan.
Pengolahan biji kakao lebih lanjut untuk memperoleh kualitas biji yang baik yaitu dilakukan
fermentasi, dilakukan secara spontan dan supaya warna khas pada kakao bisa terbentuk, selain itu
fermentasi juga bisa bermanfaat untuk mengurangi rasa pahit akibat kandungan polifenol dan
theobromine teroksida. Mutu biji kakao Indonesia semestinya dibangun dengan memerhatikan
Standar Nasional Indonesia, yaitu SNI 2323-2008. Mengacu pada SNI 2323-2008, biji kakao
didefinisikan sebagai biji tanaman kakao (Theobroma cacao L.) yang berasal dari biji kakao mulia
atau biji kakao lindak yang telah melalui proses pemeraman, dicuci maupun tanpa dicuci,
dikeringkan dan dibersihkan (Munarso. 2016). Biji kakao tersebut biasanya dimanfaat untuk
memproduksi bubuk cokelat.

 Kandungan zat gizi (makro dan mikro) serta fitokimia yang terdapat dalam Cocoa
bean.
 Manfaat kesehatan yang telah diketahui dari fitokimia cocoa bean dari penelitian-
penelitian sebelumya. Fitokimia dapat difokuskan ke senyawa fenolik.
 Faktor2 terkait penanganan / pengolahan pascapanen yang mempengaruhi jenis dan
kadar senyawa fenolik dalam cocoa nibs dan cocoa powder

Tujuan dari praktikum ini yaitu untuk memperoleh informasi tentang kadar total fenol dan
total flavonoid serta aktivitas antioksidan pada cocoa nibs dan cocoa powder dan juga mengevaluasi
hubungan antara aktivitas antioksidan dengan kadar total fenol dan total flavonoid pada cocoa nibs
dan cocoa powder.

Material dan Metode

 Analisis kapasitas Antioksidan
Dalam praktikum tentang analisis kadar antioksidan bahan yang digunakan yaitu cocoa nibs
dan cocoa powder, DPPH, etanol, aseton, buffer asetat (Na asetat + asam asetat glasial) 300
mM (pH 3,6) dalam HCL 40 mM, 2,4,6-tripydyl-s-triazine 10 mM, HCL 40 mM dan FeCl3
6H2O 60 mM. Sedangkan alat yang digunakan adalah pipet mikro, pipet ukur, kertas
whatman no.1, sentrifus, vortex, homogenizer, orbital shaker, spektrofotometer UV-VIS dan
corong buchner.

 Analisis Kadar Total Fenol

Dalam praktikum analisis fenol bahan yang digunakan yaitu ekstrak etanol cocoa, follin
ciocalteau, Na2CO3 7%, larutan standar asam galat konsentrasi 250 mg/L (untuk
pengenceran 50-250 mg/L). Sedangkan alat yang digunakan adalah piet mikro, pipet ukur,
vortex, spektrofotometer UV-VIS.
 Analisis Kadar Total Flavonoid
Bahan yang digunakan dalam praktikum analisis total flavonoid adalah ekstrak etanol cocoa,
etanol 96%, AlCl3 6H2O (10%), NaNO2 (5%), NaOH (1N) dan larutan standar kuersetin (20
μg/ml, 60 μg/ml, 80 μg/ml, dan 100 μg/ml). Sedangkan alat yang digunakan adalah pipet
mikro, pipet ukur, labu ukur, vortex dan spektrofotometer UV-VIS.
 Metode
1. Persiapan sampel yaitu cocoa nibs yang telah digiling dan cocoa powder dimaserasi
dengan etanol 70% salama 2 jam pada suhu 50°C diatas orbital shaker (sampel :
etanol = 1 ; 25), selanjutnya campuran disaring menggunakan kertas whatman no.1
melalui corong bucher
2. Penentuan kadar total fenol
 Ekstrak etanol cocoa sebanyak 0,5 mL dicampur dengan 0,5 mL akuades
 Sebanyak 500 μL reagen Folin-Ciocalteau ditambahkan ke dalam larutan
ekstrak
 Setelah 3 menit, untuk menetralkan reaksi antara folin dan larutan ekstrak,
ditambahkan 1 mL natrium karbonat / Na2CO3 (20%, w/v)
 Tambahkan akuades hingga volume akhir campuran mencapai 10 mL
 Campuran dihomogenkan dan didiamkan selama 60 menit di tempat gelap
pada suhu ruang (tabung reaksi yang sudah dibungkus alufo).
 Absorbansi campuran diukur pada Panjang gelombang 765 nm dengan
spektrofotometer UV-VIS
  Penentuan kadar total ffenol dilakukan dengan melakukan ploting nilai
absorbansi pada kurva standar galat. Kadar total fenol dinyatakan dalam mL
ekivalen asam galat / gram berat kering cocoa (mg GAE / g)
3. Penetuan kadar total flavonoid
 Sebanyak 1 mL ekstrak etanol cocoa dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL
yang telah berisikan 4 mL akuades
 NaNO2 (5%) sebanyak 0,3 mL ditambahkan ke dalam labu takar
 Campuran didiamkan selama 5 menit pada suhu ruang
 Setelahnya 0,3 mL AlCl36H2O (10%) juga ditambahkan ke dalam campuran
dan didiamkan Kembali selama 6 menit pada suhu ruang
 NaOH (1M) sebanyak 2 mL ditambahkan ke dalam campuran
 Akuades ditambahkan ke dalam campuran hingga mencapai batas tera (10
mL) labu takar
 Absorbansi larutan (setelah warna pink muncul) diukur pada panjang
gelombang 510 nm dengan spektrofotometer UV-VIS
 Penentuan kadar total flavonoid dilakukan dengan melakukan ploting nilai
absorbansi pada kurva standar kuersetin. Kadar total flavonoid dinyatakan
dalam mL ekivalen kuersetin / gram berat kering cocoa (mg QE / g)
4. Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH
 Sebanyak 1 mL ekstrak cocoa dicampur dengan 5 mL larutan stok DPPH (0,1
mmol/L). larutan stok DPPH dibuat fresh menggunakan pelarut etanol 96%
 Campuran dikocok hingga menyati
 Campuran didiamkan selama 20 menit pada suhu 20° ditempat gelap
 Absorbansi campuran diukur pada Panjang gelombang 517nm dengan
Spektrofotometer UV-VIS
 Sebelumnya, absorbansi larutan fresh DPPH diukur terlebih dahulu. Akuades
dan vitacimin C digunakan sebagai blanko dan standar
 Nyatakan aktivitas antioksidan dalam bentuk persentase penghambat terhadap
radikal DPPH dengan perhitungan :
Aktivitas Penghambatan DPPH % = 1-[A sampel – A blanko] / A DPPh x
100%
 Nilai IC 50 dihitung dengan cara melakukan plotting antara % penghambatan
DPPH pada berbagai konsentrasi ekstrak
 5. Uji Aktivitas Antioksidan Merode FRAP
 Reagen FRAP disiapkan dengan cara mencampurkan 300 mM buffer asetat (pH
3.6) 10 mM larutan TPTZ dan 20 mM larutan FeCl3.6H2O dengan rasio 10:1
pada suhu 37°C
 Sebanyak 3 mL reagent FRAP dimasukkan ke dalam tabung uji
 Selanjutnya 100 μL sampel dan 300μL akuades ditambahkan ke dalam tabung
uji
 Campuran reagen FRAP, sampel dan akuades diinkubasi pada suhu 37°C
selama 4 menit
 Absorbansi campuran diukur pada Panjang gelombang 593 nm menggunakan
spektrofotometer UV-VIS
 Larutan standar yang digunakan adalah FeSO4.7H2O dengan series konsentrasi
dari 200-1000 μM
 Nilai konsentrasi sampel diperoleh dari perhitungan dengan cara memasukkan
nilai absorbansi ke dalam persamaan garis pada kurva standar
Hasil
a. Total Fenol dan Flavonoid
Tabel 1. Total Fenol dan Flavonoid

Parameter

Total Fenol Total Flavonoid

Sampel
(mg GAE / g ekstrak )
(mg QE / g ekstrak )

I II III Rata2 I II III Rata2

Cocoa nibs 0,419 0,396 0,370 6,612 0,508 9,494

65 75 5 125 2

Cocoa powder 0,562 0,575 1,284 6,675 8,081 63,39

4 9

Berikan narasi sekitar 3-5 kalimat untuk menjelaskan temuan penting dari Tabel 1 di
atas.

b. Aktivitas Antioksidan
Tabel 3. Aktivitas Antioksidan
 Metode

DPPH IC50 FRAP

Sampel (ppm)
(μM Fe2+ / g ekstrak )

I II III Rata2 I II III Rata2

Cocoa nibs 120,76 240,7 167,4 101,87 66,17 82,89

4860 1 721 907

Cocoa powder 381,29 368,2 402.9 108,70 97,69 107,3

373 291 620 720

Pembahasan
a. Membandingkan nilai Total Fenol dan Flavonoid, antara kedua jenis ekstrak etanol
cocoa beans. Memberikan penjelasan alasan perbedaan nilai tersebut
b. Membandingkan nilai Total Fenol dan Flavonoid, antara kedua jenis ekstrak etanol
cocoa beans dengan penelitian-penelitian sebelumnya tentang total fenol dan flavonoid
ekstrak cocoa beans
c. Membandingkan nilai IC50 DPPH dan hasil uji FRAP dari kedua jenis ekstrak etanol
cocoa beans dengan penelitian-penelitian sebelumnya tentang IC50 DPPH dan hasil uji
FRAP ekstrak cocoa beans
d. Menjelaskan hubungan antara hasil aktivitas antioksidan (DPPH& FRAP) dengan kadar
total fenol dan flavonoid pada ekstrak cocoa nibs dan powder
Kesimpulan
Memberikan jawaban dari tujuan praktikum secara garis besar.
Daftar Pustaka

Jusmiati, J., Rusli, R., & Rijai, L. (2015). Aktivitas antioksidan kulit buah kakao masak dan kulit buah
kako muda. Jurnal Sains dan Kesehatan, 1(1), 34-39.

Munarso, S. J. (2016). Penanganan pascapanen untuk peningkatan mutu dan daya saing komoditas
kakao. J Litbang Pertan, 35(3), 111-120.

Prasetya, I. W. G. A., Putra, G. G., & Wrasiati, L. P. (2020). Pengaruh jenis pelarut dan waktu
maserasi terhadap ekstrak kulit biji kakao (Theobroma cacao L.) sebagai sumber antioksidan. Jurnal
Rekayasa dan Manajemen Agroindustri ISSN, 2503, 488X.

Yuliani, F., & Gazali, F. (2020). Pemanfaatan Kulit Buah Kakao Sebagai Sumber Antioksidan
Alami. Ranah Research: Journal of Multidisciplinary Research and Development, 2(4), 119-124.

Lampiran
Fenolik

Y = 0,006x + 0,032

R2 = 0,9921

 Kelompok 1
 Nibs = 0,535
Y = 0,006x + 0,032
0,535 = 0,006x + 0,032

X =

= 83,83 ppm

Fenolik =

= 0,419 mg GAE/g

 Powder = 0,707
Y = 0,006x + 0,032
0,707 = 0,006x + 0,032

X =

= 112,5 ppm

Fenolik =

= 0,562 mg GAE/g

Flavonoid

Y = 0,0004x – 0,0036

R2 = 0,9896
  Kelompok 1
 Nibs = 0,208
Y = 0,0004x – 0,0036
0,208 = 0,0004x – 0,0036

X =

= 529 ppm

Flavonoid =

= 6,6125 mg QE/g

 Powder = 0,210
Y = 0,0004x – 0,0036

0,210 = 0,0004x – 0,0036

X =

= 534 ppm

Flavonoid =

= 6,675 mg QE/g

DATA PERHITUNGAN KELOMPOK 2

FENOLASAM GALAT
Kelompok 2
y = 0,006x + 0,032
R2 = 0,9921
Nibs : 0,388

Powder : 0,669

FRAP
Kelompok 2

R2 = 0,979
Nibs : 0,615

Powder : 0,892
FLAVONOID
Kelompok 2

R2 = 0,9896
Nibs : 0,680

Powder : 1,553

DPPH
Kelompok 2
Nibs

IC 50 

( Sangat Lemah )

Powder

IC 50 

( Sangat Lemah )
Flavonoid

Kelompok 3

Nibs = 0,159

Powder = 0,255

Y = 0,0004 x – 0,0036

R2= 0,9896

 0,159 = 0,0004 x – 0,0036

X =

X = = 40,65 ppm

= = 0,508125 QE

 0,255 = 0,0004 x – 0,0036

X =

X = = 646,5 ppm

= = 8,081 QE
Fenol

Kelompok 3

Nibs = 0,508

Powder = 0,722

y= 0,006 x + 0,032

R2= 0,9921

Nibs

0,508 = 0,006 x + 0,032

X =

= = 79,33 ppm

= = 0,39665 GAE

Powder

0,722 = 0,006 x + 0,032

X =

= = 115 ppm

=
 = = 0,575 GAE

FRAP

Nibs = 0,545

Y = 0,0079 x – 0,0222

R2 = 0,979

0,545 =0,0079 x + 0,0222

X =

= 66,17721

Powder = 0,794

Y = 0,0079 x – 0,0222

R2 = 0,979

0,794 =0,0079 x + 0,0222

X =

= 97,69620

DPPH

Nibs

IC 50 y = 0,2335 x + 6,2148

50 = 0,2335 x + 6,2148

X= = 240,74860 ppm ( Sangat Lemah )

Powder

IC 50 y = 0,3211 x + 68,241

50 = 0,3211 x + 68,241

X= = 368,2373 ppm ( Sangat Lemah )