Pengertian Rekombinasi DNA

Rekombinasi DNA ( rDNA ) adalah suatu upaya meletakkan DNA

dari suatu organisme kedalam DNA bakteri dengan
menggabungkan dua atau lebih sekuens yang biasanya tidak akan
terjadi bersama-sama melalui penyambungan gen. Dalam hal
modifikasi genetik, itu diciptakan melalui pengenalan yang relevan
DNA ke dalam DNA organisme yang ada seperti plasmid dan
bakteri, untuk kode atau mengubah ciri yang berbeda dengan
tujuan tertentu seperti resistensi antibiotik. Ini berbeda dari
rekombinasi genetika dalam hal itu tidak terjadi melalui dalam sel,
tetapi di rekayasa. Sebuah protein rekombinan adalah suatu protein
yang dihasilkan dari DNA rekombinan.

Yang salah satu penggunaan pertama DNA rekombinan dalam

botani, banyak tanaman yang memiliki genom cukup beradaptasi
yang sehingga memungkinkan bagi mereka untuk siap
menggabungkan DNA dari spesies yang jauh terkait. Dengan
splicing gen baru, para ilmuwan telah mampu mengembangkan
tanaman yang tahan terhadap kondisi lingkungan yang ekstrim
termasuk kekeringan dan panas.

Pemahaman mendasar mengenai prinsip yang ada pada teknik-teknik rekayasa genetik penting
untuk dimiliki oleh mereka yang terkait dalam bidang tersebut. Prinsip dasar teknik-teknik
tersebut meliputi prinsip yang berhubungan dengan ekspresi gen, mulai dari transkripsi dari DNA
sampai dengan modifikasi protein. Selain itu, DNA rekombinan juga merupakan hal penting yang
perlu dipahami karena terkait dengan perpindahan materi genetik dan teknik kloning. Untuk
menganalisa DNA, seseorang perlu memahami ciri-ciri DNA seperti untai ganda, bermuatan
negatif karena gugus fosfat, sensitif terhadap perubahan pH dan banyak memiliki domain untuk
ikatan dengan molekul lain (DNA, RNA atau protein). Gen, yang merupakan unit pewaris sifat bagi
organism, biasanya dipindahkan dari satu individu ke individu lain melalui DNA rekombinasi yang
biasanya terjadi pada saat pembelahan sel pada siklus meiosis. Perpindahan materi genetik ini
biasanya memanfaatkan daerah yang homolog antar kromosom atau pada kromosom yang
sama. Mekanisme ini adalah untuk memastikan bahwa sifat dari induk betina dan jantan
tertransfer secara genetik. Kloning adalah pengkopian (proses perbanyakan) secara genetik
sehingga dihasilkan molekul-molekul yang identik. Teknik kloning memanfaatkan prinsip dari
DNA rekombinasi dengan menggunakan enzim-enzim yang bekerja saat itu. Enzim-enzim
tersebut meliputi enzim restriksi yang dapat memotong DNA, ligase yang menggabungkan DNA,
serta plasmid yang merupakan materi genetik untuk memperbanyak (mengklon) fragmen DNA
yang diinginkan. Untuk memperoleh materi genetik (DNA atau RNA), dilakukan ekstraksi.
Ekstraksi DNA dan RNA sedikit berbeda satu sama lain. RNA sebagai molekul yang lebih tidak
stabil dibandingkan DNA memerlukan penanganan yang lebih. Peralatan yang digunakan harus
bebas dari RNAse. Sedangkan ekstraksi DNA dapat dibagi menjadi dua: ekstraksi DNA total
(genom) dan ekstraksi DNA plasmid. Ekstraksi DNA plasmid biasanya menggunakan alkalin lisis
dengan memanfaatkan karakter plasmid yang kecil dibandingkan dengan kromosom. Dengan
bantuan NaOH, SDS dan potasium asetat, plasmid dapat terdenaturasi (menjadi untai tunggal)
dan kembali pada struktur alaminya, sedangkan kromosom yang sudah terdenaturasi akan sulit
untuk kembali beruntai ganda. Pengendapan nukleotida dapat dibantu oleh etanol atau 2-
propanol. Hasil dari ekstraksi nukleotida diverifikasi dengan beberapa cara seperti melihat
panjang gelombangnya, atau dengan elektroforesis agarosa yang kemudian divisiualisasi
dengan bahan seperti etidium bromida atau SYBR green. RNA yang mudah terdegradasi
memerlukan penanganan dengan alat dan bahan yang bebas dari RNAse dan/atau mengandung
RNAse inhibitor. Materi genetik untuk yang dimanfaatkan untuk kloning adalah fragmen DNA,
yang bisa juga merupakan gen itu sendiri. Kalau sumber materi adalah RNA, maka dilakukan
reverse transkripsi atau transkripsi balik dari RNA ke DNA. Pembuatan cDNA dari mRNA dapat
dilakukan dengan RT-PCR dengan primer oligo dT yang memanfaatkan poli A dari mRNA.
Plasmid yang sudah dimodifikasi dengan penambahan fragmen DNA disebut plasmid
rekombinan, yang dapat diketahui melalui teknik skrining dan seleksi dengan bantuan marker.
Analisis transkrip atau RNA merupakan pengkajian terhadap ekspresi gen, karena ekspresi gen
ditunjukkan oleh terbentuknya RNA. Ekstraksi RNA harus memperhatikan waktu setelah sampel
diambil, karena ekspresi gen mengalami perubahan yang sangat cepat. Sampel biasanya
dimasukkan ke dalam nitrogen cair untuk menghentikan perubahan ekspresi gen. Beberapa
metode yang memanfaatkan RNA antara lain microarray (pada genom secara keseluruhan, pada
gen-gen tertentu atau pada Single Nucleotide Polymorphism). Selain DNA dan RNA, protein yang
merupakan produk dari translasi RNA adalah komponen penting dalam memahami kerja sel.
Analisis protein merupakan analisis struktur/ konformasi yang melihat interaksinya dengan
molekul lain. Protein memiliki daerah yang berperan dalam memberikan fungsi dari protein
tersebut yang disebut domain dan juga memiliki subunit yang bisa bergabung untuk melakukan
aktivitasnya. Deteksi protein dilakukukan dengan menggunakan Western blotting, ELISA maupun
immunostrip yang semuanya memanfaatkan antibody yang dapat berinteraksi dengan protein
yang diuji. Analisis fungsi protein biasanya dilakukan dengan melihat perubahan struktur protein
dan membandingkan dengan hipotesa fungsinya. Karena fungsi protein terkait dengan
strukturnya. Untuk mengubah struktur protein, DNA yang mengkode protein dimutasi pada
daerah yang diduga paling berperan dalam struktur protein tersebut. Analisis kemudian
dilakukan dengan menggunakan substrat dari protein dan juga bahan-bahan untuk mendeteksi
fungsi protein terhadap substrat (seperti bahan yang bermuatan radioaktif). Pemahaman
mengenai teknik-teknik biologi molekuler ini dapat lebih diperdalam lagi pada buku-buku metode
penelitian yang membahas secara khusus teknik-teknik biologi molekuler (seperti buku “PCR
(THE BASICS (Garland Science) oleh M. J. McPherson dan S. G. Moller (Mar 30, 2006) yang
membahas mengenai teknik PCR dari bab pertama sampai terakhir), atau melalui situs-situs
yang memberikan informasi lengkap mengenai teknik-teknik tersebut (termasuk juga di
[Link] dan forum-forum diskusi ilmiah) dengan memanfaatkan fasilitas internet.
2. Prinsip, Metode, dan Teknik Isolasi DNA
 Posted in Tentang Sesuatu

Gambar 1. Persiapan isolasi DNA (dokumentasi pribadi)

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti
amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan
DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang
perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan
seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang
dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

Isolasi DNA tanaman, isolasi DNA buah, isolasi DNA bakteri, dan isolasi DNA hewan pada dasarnya memiliki
prinsip yang sama. Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada
dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa
teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit
yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi
DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi
DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan
teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki
kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang
relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel.
Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel
(Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik
seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan
menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan
menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan
detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki,
2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel
darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam
komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000). 
Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai
tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat
berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer,
1999). Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering
dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007).
Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl
harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel
sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi
minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang
karena kompleks CTAB-DNA bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan
kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi
polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah
untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C. Karena efektivitasnya
dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung
banyak polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas,
Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000). 
Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan
2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi
untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-
mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen
dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol
perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008). Polifenol juga dapat menghambat
reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi
hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al., 1997). Penggunaan 2-
mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker
dan Rapley, 2008). 
Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai 12. Larutan buffer
dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama
proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda
DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi
sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi
DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan
konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Surzycki 2000). 
Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid
(EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA
menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai
kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu
dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang
didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi
dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang
selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan Landesberg (2007)
menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan
bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus
setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada
fase organik (Gambar 1). Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran
fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga
terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian RNAse
(Birren, et al., 1997; Clark, 2010). 

Gambar 2. Asam nukleat berada pada lapisan air setelah disentrifugasi 

pada tahapan ekstraksi (Clark, 2010). klik gambar untuk memperbesar. 

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga mengandung
residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat
beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang
digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil
alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan
kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk
masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform – air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara
tersebut dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan
terpisah pada lapisan kloroform (Clark, 2010). 

Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air. Proses ini dapat
dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan
atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi
sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan
luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil
alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas
(20.000–50.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk menghilangkan kompleks CTAB dan
meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol
(Surzycki, 2000). 

Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui [Link] umumnya digunakan
etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase
aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan
sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk
menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. 

 Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat
dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan
dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini
meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar
dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga
isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan
molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan
menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. 

Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang
masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada
dalam bentuk presipitat [Link] saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam
tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA [Link] presipitasikembali dengan etanol atau
isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi
(Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang
dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam
yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol
sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah
presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003). 

Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol kemudian dibuang dan
pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA.
Penghilangan residu etanol dilakukan dengan cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki, 2000).
Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu
memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat pada asam nukleat
(Sambrook et al., 2001). 

Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer TE ke dalam tabung yang
berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC. Verkuil et al. (2008)
menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah
diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa
pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih
rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat
stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC. 
Gambar 3. Proses pufrifikasi DNA dengan menggunakan metode silika dan kolom kromatografi (a) proses
pengikatan DNA ke silika dengan bantuan perubahan konsentrasi garam, (b) DNA dielusi untuk memperoleh
DNA (Brown, 2010).
Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh beberapa perusahan
untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh
konsumen dan jenis sel yang akan digunakan. Berikut adalah bagan contoh isolasi DNA tanaman dengan
menggunakan Kit Nucleon Phytopure yang disajikan pada Gambar 3. 
 

Gambar 4. Bagan isolasi DNA dengan menggunakan kit phytopure. 

Sumber: [Link]
« UGM Teratas, Unila Peringkat 2 se-Sumatera

Serasa Kuliah Evolusi di Yale University »

Both comments and pings are currently closed

3. Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari

istilah bahasa Inggris: polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode
perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatiktanpa menggunakan organisme. Dengan
teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga
memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary
Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya
tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena
relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

Alat pengatur suhu reaksi yang biasanya digunakan pada teknik reaksi berantai polimerase

Prinsip kerjaSunting

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus sesuai
kebutuhan. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap kerja PCR dalam
satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini, ikatan hidrogen DNA terputus

(denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Tahap ini berlangsung pada suhu tinggi,
yaitu 94–96 °C. Biasanya, pada tahap awal PCR, tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5
menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA
tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang
komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini
bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau
primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA
polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu
76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan renaturasi,
beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat
berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang
dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial

Teknik qRT-PCR
Realtime Reverse Transcriptase PCR (rRT-PCR) adalah teknik yang dikembangkan untuk analisis terhadap
molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Sebelum teknik ini
dikembangkan, analisis terhadap mRNA biasanya dilakukan dengan metode hibridisasi in situ, northern blot, dot
blot, atau slot blot, analisis menggunakan S1 nuklease, atau dengan metode pengujian proteksi RNase (RNase
protection assay).
Metode hibridisasi in situ bersifat sangat sensitif sehingga dapat digunakan untuk analisis molekul mRNA yang
terdapat dalam jumlah sangat sedikit, tetapi teknik ini cukup sulit dilakukan. Metode-metode yang lain meskipun
lebih mudah dilakukan, namun tidak cukup sensitif. Oleh karena itu, kemudian dikembangkan teknik RT-PCR
untuk mengatasi kelemahan-kelemahan metode lain tersebut. Dikarenakan PCR tidak dapat dilakukan dengan
menggunakan RNA sebagai cetakan, maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik (reverse
transcriptase) terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary DNA). Molekul cDNA
tersebut kemudian digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR.
Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan
cloning dan analisis, maupun untuk diagnosis identifikasi agen infektif maupun penyakit genetik (PCR kualitatif),
sedangkan penggunaan RT-PCR secara kuantitatif diantaranya untuk menghitung jumlah mRNA dari suatu
genom misal: virus RNA genom. rRT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik (reverse transcriptase). Enzim
transcriptase balik adalah enzim DNA polimerase yang menggunakan molekul RNA sebagai cetakan untuk
menyintesis molekul DNA (cDNA) yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa enzim
transcriptase yang dapat digunakan antara lain mesophilic viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh
virus avian mioblastosis (AMV) maupun oleh virus Maloney murine leukemia (M-MuLV), dan Tth DNA polimerase.
RTase yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV bersifat sangat prosesif dan mampu menyintesis cDNA sampai
sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA polimerase mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 1-2 kb.
Berbeda dengan Tth DNA polimerase, enzim RTase AMV dan MuLV mempunyai aktivitas RNase H yang akan
menyebabkan terjadinya degradasi RNA dalam hybrid RNA: cDNA. Aktivitas semacam ini dapat merugikan jika
berkompetisi dengan proses sintesis DNA selama proses produksi untai pertama cDNA. Enzim RTase yang berasal
dari M-MuLV mempunyai aktivitas RNase H yang lebih rendah dibanding dengan yang berasal dari [Link] M-
MuLV mencapai titik maksimum pada suhu 370C, sedangkan enzim AMV pada suhu 420C dan Tth DNA polimerase
mencapai aktivitas maksimum pada suhu 60-700C. penggunaan enzim M-MuLV kurang menguntungkan jika RNA
yang digunakan sebagai cetakan mempunyai struktur sekunder yang ekstensif. Di lain pihak, penggunaan Tth
DNA polimerase kurang menguntungkan jika ditinjau dari kebutuhan enzim ini terhadap ion Mn, karena ion Mn
dapat mempengaruhi ketepatan (fidelity) sintesis DNA. Meskipun demikian enzim Tth DNA polimerase
mempunyai keunggulan kerena dapat digunakan untuk reaksi transkripsi balik sekaligus proses PCR dalam satu
langkah reaksi (one step PCR reaction).

Teknik ini biasanya digunakan dalam biologi molekuler untuk mendeteksi ekspresi RNA. Quantitative Reverse
Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) sering membuat bingung jika disamakan dengan real-time
polymerase chain reaction (qPCR) oleh para peneliti atau pelajar. Namun keduanya memiliki teknik yang
berbeda. Teknik qRT-PCR digunakan untuk melihat kualitas dari ekspresi gen melalui pembentukan
complementary DNA (cDNA) yang dibentuk dari RNA dan mengukur jumlah amplifikasi cDNA yang terbentuk.
Sedangkan qPCR digunakan untuk mengukur amplifikasi DNA yang dibentuk dari DNA template yang digunakan.
Teknik qRT-PCR biasanya digunakan untuk analisis ekspresi gen, mendeteksi penggandaan gen yang rendah,
validasi microarray, validasi knockdown gen dan penelitian yang berhubungan dengan RNAi dan miRNA. Dalam
qRT-PCR, RNA sebagai template pertama di ubah menjadi cDNA menggunakan reverse transcriptase.
One-step RT-PCR dan two-step RT-PCR
Kuantifikasi pada mRNA menggunakan RT-PCR dapat dicapai sebagai reaksi one-step atau two-step. Perbedaan
antara keduanya adalah dalam jumlah tabung yang digunakan dalam prosedur kerja. Dalam one-step dimulai
dari reaksi pembentukan cDNA untuk amplifikasi PCR yang akan terjadi dalam satu tabung. Sebaliknya dengan
two-step reaction memerlukan tabung yang terpisah antara reaksi penggunaan enzim reverse transcriptase untuk
pembentukan cDNA dan amplifikasi PCR. One-step dipakai dalam lingkungan yang tidak beragam. Tetapi RNA
template dalam one step lebih mudah terdegradasi dan tidak direkomendasikan ketika pengulangan assay dari
sampel yang sama. Selain itu one-step juga dilaporkan kurang akurat jika dibandingkan dengan pendekatan two-
step. Kelemahan dari two-step adalah frekuensi kontaminasi dalam penanganan sampel dimungkinkan lebih
sering terjadi.
One-step RT-PCR membutuhkan target mRNA (lebih dari 6 kb) dan menggunakan reverse transcriptase dan
kemudian melakukan amplifikasi PCR dalam satu tabung. Pastikan untuk menggunakan primer-urutan tertentu.
Pilih satu langkah RT-PCR kit, yang terdapat campuran reverse transcriptase dan PCR dengan Taq DNA
Polymerase dan proofreading polimerase. Siapkan campuran reaksi, yang akan mencakup dNTP, primer,
Template RNA, enzim dan larutan buffer yang diperlukan. Tambahkan campuran ke tabung reaksi kemudian
tambahkan RNA Template. Selanjutnya tempatkan tabung PCR di alat PCR untuk mulai bersepeda. Siklus
pertama adalah transkripsi terbalik untuk mensintesis cDNA. Siklus kedua adalah denaturasi awal. Selama siklus
ini tidak aktif reverse transcriptase. 40 sampai 50 siklus berikutnya adalah program amplifikasi, yang terdiri dari
tiga langkah: (1) denaturasi, (2) anealing (3) elongasi.
Two-step RT-PCR, seperti namanya, terjadi dalam dua langkah. Pertama transkripsi terbalik dan kemudian PCR.
Metode ini lebih sensitif daripada metode satu langkah. Kit juga berguna untuk dua langkah RT-PCR. Sama seperti
untuk satu-langkah, hanya menggunakan Utuh, RNA berkualitas tinggi untuk hasil terbaik. Primer untuk urutan
dua langkah tidak harus spesifik.

Tahapan utama dalam proses PCR

Secara umum proses PCR dibagi menjadi tiga tahap. Pertama adalah denaturasi, proses ini bertujuan untuk
membuka ikatan rangkap DNA. Seperti yang diketahui DNA mempunyai struktur double helix, sehingga untuk
memungkinkan terjadinya penempelan primer, maka ikatan rangkap (ikatan hidrogen) yang membangun
struktur tersebut harus diputuskan. Pemutusan ikatan tersebut dapat dilakukan pada suhu tinggi (biasanya di
atas 90oC). Kandungan Guanine dan Cytosine (G+C), yang merupakan pasangan basa nitrogen dengan ikatan
rangkap tiga dalam struktur double helix DNA, dapat menjadi pertimbangan menentukan suhu denaturasi. Makin
tinggi proporsi (G+C) mengakibatkan makin tingginya suhu yang dibutuhkan untuk denaturasi DNA.
Tahapan Kedua yang disebut dengan Annealing, yaitu penempelan primer kepada untai DNA yang telah
terdenaturasi. Penentuan suhu annealing menjadi demikian kritis, dalam artian harus tepat. Jika suhu terlalu
tinggi penempelan primer menjadi sangat lemah, sehingga bisa mengakibatkan produk yang dihasilkan sangat
sedikit. Sebaliknya jika suhu terlalu rendah, bisa mengakibatkan terjadinya penempelan yang tidak spesifik,
sehingga menghasilkan fragmen yang tidak diinginkan.
Adapun tahapan yang Ketiga adalah Extension, yaitu proses perpanjangan primer yang menempel pada templat
DNA dengan melibatkan DNA polimerase sebagai katalis. Dikarenakan pada tahap ini terjadi reaksi polimerisasi
yang dikatalisis enzim, maka suhu optimum dari enzim yang digunakan harus menjadi pertimbangan dalam
menentukan suhu extension.
Ketiga tahapan tersebut dapat terus berulang sesuai dengan jumlah siklus yang kita inginkan. Penentuan jumlah
siklus PCR tergantung kepada target jumlah copy molekul DNA yang ingin dihasilkan. Secara teoritis, jumlah
molekul DNA yang dihasilkan dari proses PCR adalah berbanding lurus secara eksponensial dengan jumlah siklus
PCR (2n, n= jumlah siklus). Sebagai gambaran, jika kita merancang 20-30 siklus, dan menggunakan enzim Taq
polymerase sebagai katalis, lebih dari satu juta copy molekul DNA dapat diperoleh dalam waktu 1,5-2,5 jam.
Keuntungan qRT-PCR dibanding dengan PCR tradisional. PCR tradisional diukur pada akhir amplifikasi (end
point), sedangkan qRT-PCR mengumpulkan data dalam setiap tahapan, Menjaga keaslian sekuens RNA dan
Dipakai untuk melihat ekpresi gen secara invitro

[Link] ini  macam-macam tipe metode PCR

dan modifikasi nya:
PCR Konvensional
Polymerase chain reaction (PCR) konvensional adalah proses di mana
tahap perbanyakan materi genetik dan tahap

deteksi produk dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi

dilakukan bila

tahap perbanyakan materi genetik telah selesai. Reaksi PCR konvensional

biasanya

menggunakan satu pasang primer oligonukleotida untuk mengamplifikasi

bagian tertentu dari genom agen infeksi serta dilakukan pada suatu tabung.
Primer PCR adalah
oligodeoksiribonukleotida pendek, atau oligomer yang dirancang untuk
melengkapi

urutan akhir sekuen dari amplikon target PCR dan digunakan untuk
mengawali sintesis

rantai DNA. Pada analisa konvensional ini, deteksi keberadaan DNA

dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan
dengan elektroforesis.

Real-Time PCR
Real-Time PCR merupakan suatu metode analisa yang dikembangkan dari
reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time
polymerase chain reaction atau q-PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk
mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah target  molekul  DNA  hasil 
amplifikasi  tersebut.  Prinsip utama Real-Time PCR yaitu menggunakan
biomarker berupa pewarna fluorescent untuk memberi pelabelan pada
oligonukleotida yang akan ditambahkan pada reaksi.

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-

PCR)
Teknik dasar yang digunakan dalam Reverse-Transcriptase PCR (RT-
PCR) adalah modifikasi dari PCR konvensional. Molekul RNA sebagai
template dikonvermasi menjadi DNA komplementer (cDNA) sebelum
diperbanyak (amplifikasi). Konversi RNA menjadi cDNA digenerasi
menggunakan enzim reverse transcriptase, sehingga dapat menjadi
template reaksi. Tipe ini biasa digunakan dalam metode penelitian
penyisipan gen, diagnosa penyakit yang berhubungan dengan virus RNA
dan kanker.

Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA
menggunakan

bantuan enzim DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer

untuk mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan Nested polymerase
chain reaction, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi, maka
kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer
yang kedua. Dengan demikian, metode ini sangat spesifik dalam
melakukan amplifikasi.

Multiplex-PCR
Jenis ini digunakan untuk mengamplifikasi banyak target fragmen DNA
dalam satu kali reaksi PCR. Kuncinya adalah penggunaan primer dalam
jumlah banyak yang telah dioptimasi berdasarkan suhu terbaik dari
masing-masing primer. Metode ini biasanya diaplikasikan dalam banyak
studi genotiping, mutasi, dan analisis polimorfisme, analisis STR (Short
Tandem Repeat) mikrosatelit, deteksi patogen dan GMO. Di laboratorium
dapat digunakan sebagai dasar membedakan terhadap jenis-jenis bakteri
penyebab penyakit yang sama.

PCR-ELISA
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam
nukleat yang meniru prinsip dari Enzyme Linked Immunosorbant Assay
(ELISA) yang terkait. Di dalam suatu pengujian hibridisasi hasil produk dari
PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode ini dapat
dilakukan pengukuran sekuen internal pada produk PCR.

Metode menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari Enzyme Linked
Immunosorbant Assay (ELISA) ini lebih dipilih karena lebih murah
dibandingkan metode Real Time.

Touchdown PCR
Sebuah  modifikasi yang  mencegah  amplifikasi  sekuens  nonspesifik
dengan mempermainkan suhu annealing.  Sebuah varian dari PCR yang
bertujuan untuk mengurangi  latar  belakang  spesifik  secara  bertahap 
menurunkan  suhu  annnealing selama proses berlangsung. Suhu anil
pada awal siklus biasanya beberapa derajat (3-5 ° C)  di  atas Tm  primer 
yang  digunakan,  sedangkan  pada  siklus  kemudian dilanjutkan dengan
beberapa derajat (3-5°C) di bawah Tm primer. Suhu tinggi memberikan
spesifisitas yang lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih
rendah memungkinkan amplifikasi lebih efisien dari produk tertentu yang
terbentuk selama siklus awal.

Jika Anda membutuhkan alat PCR, silahkan kunjugi [Link] Disini

kami jual alat pcr dan berbagai peralatan bioanalitika lainnya. Tunggu
apalagi, ayo kunjungi website kami.
6. .         Kloning  DNA Rekombinan
Kloning  DNA adalah memasukkan DNA asing ke dalam plasmid suatu sel bakteri. DNA yang
dimasukkan ini akan bereplikasi (memperbanyak diri) dan diturunkan pada sel anak pada waktu sel
tersebut membelah. Gen asing ini tetap melakukan fungsi seperti sel asalnya, walaupun berada
dalam sel bakteri. Pembentukan DNA rekombinan ini disebut juga rekayasa genetika. Perekayasaan
genetika terhadap satu sel dapat dilakukan dengan hanya menghilangkan, menyisipkan atau
menularkan satu atau beberapa pasang basa nukleotida penyusun molekul DNA tersebut.
Untuk kloning ini diperlukan plasmid dan enzim untuk memotong DNA, serta enzim untuk
menyambungkan gen yang disisipkan itu ke plasmid.

Beberapa jenis bakteri mempunyai sejumlah molekul DNA melingkar yang ukurannya kecil
sekali, hanya mengandung beberapa ribu pasang basa, selain mempunyai kromosom utama dengan
4 juta pasang basa. Kromosom mini ini dinamakan juga plasmid. Plasmid dapat bereplikasi secara
otonom. Plasmid ini merupakan elemen genetis yang tidak berhubungan dengan kromosom utama
dan mengandung gen-gen yang resisten terhadap antibiotik, antara lain yaitu antibiotik tetrasiklin
dan ampisilin). Keresistenan terhadap antibiotik memerlukan sejumlah enzim yang secara kimiawi
dapat menetralisir antibiotik tersebut.

Dengan menempatkan gen pada plasmid, masing-masing gen ada dalam salinan (copy)
sejumlah plasmid tertentu yang dinamakan episom. Plasmid ini mampu bergerak mendekati dan
menjauhi elemen kromosom utama. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid memiliki elemen-elemen
genetis yang bergerak, yang dilakukan melalui fusi secara bebas dari dua unit DNA replikasi
(replikon). Plasmid dapat diintegrasikan (dimasukkan) ke dalam kromosom bakteri dan dapat
dipindahkan dari satu sel bakteri ke bakteri yang lain melalui transformasi, jika kromosom sel-sel
tersebut merupakan pasangannya.

Transformasi adalah pemindahan satu sifat mikroba melalui bagian DNA tertentu dari
mikroba. Oleh karena DNA plasmid sangat kecil daripada fragmen DNA kromosom, maka dapat
dengan mudah dipisahkan dan dimurnikan. Di dalam laboratorium, jika plasmid dicampurkan
dengan bakteri, dengan adanya ion Ca++,DNA plasmid tersedot ke dalam sel bakteri, sehingga bakteri
mengandung plasmid yang tersedot tersebut. Sel bakteri mempunyai satu bentuk plasmid.
Kenyataannya bahwa enzim Eco Ri menghasilkan potongan ujung khusus yang kohesif yang
selanjutnya merupakan metode praktis untuk kloning fragmen DNA. Cara yang penting adalah
memasukkan suatu fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi Eco Ri ke dalam
plasmid hibrid yang dapat digunakan untuk mempengaruhi bakteri. Masing-masing sel bakteri
memperoleh satu sel plasmid rekombinan yang mengandung fragmen DNA asing yang dimasukkan.

Penggunaan antibiotik secara ekstensif dan penyalahgunaan antibiotik dalam pengobatan

manusia dan hewan ternak menyebabkan strain bakteri alami menjadi resisten terhadap
kebanyakan antibiotik yang bersifat umum. Biasanya keresistenan ini tergantung pada respon
(tanggapan) plasmid bakteri yang mempunyai enzim khusus yang dapat menguraikan antibiotik. Jika
digunakan plasmid yang resisten antibiotik bersama-sama dengan sel bakteri yang plasmidnya
sensitive terhadap antibiotik, dengan memasukkan plasmid resisten terhadap antibiotik yang
mengandung gen rekombinan, plasmid ini dapat dideteksi dengan mudah. Plasmid pbR 322 adalah
salah satu contoh plasmid yang mengandung gen resisten terhadap dua jenis antibiotik yaitu
ampisilin dan tetrasiklin. Selain itu tempat untuk enzim restriksi bekerja berada di antara gen-gen
yang resisten terhadap antibiotik tersebut (lihat Gambar 2). Dengan demikian, jika sepotong DNA
asing dikombinasikan ke dalam satu atau lebih gen resisten antibiotik, gen tersebut tidak akan aktif.
Hal ini berarti bahwa keberhasilan pemotongan DNA asing ke dalam satu gen resisten antibiotik
dengan mudah dideteksi. Potensi genetis untuk resisten tersebut dieleminir. Jika plasmid
dimasukkan ke dalam sel bakteri (hos), bakteri akan memperoleh keresistenan khusus yang kedua
karena gen tersebut masih utuh..

Plasmid yang membawa gen resisten antibiotik itu tersebar luas di alam dan plasmid
tersebut dimutasikan agar tidak dapat bergerak secara spontan dari satu sel ke sel yang lain. Dengan
menggunakan strain bakteri tertentu, percobaan dengan menggunakan plasmid yang resisten obat
sangat berguna tanpa menimbulkan resiko yang berarti. Plasmid yang pertama kali dipakai sebagai
vektor untuk rekombinan DNA adalah plasmid dari sel bakteriEscherichia coli. Plasmid
ragi Saccharomyces cerevisiae, dan plasmid bakteri Bacillus subtilis  dan virus saat ini juga digunakan
sebagai vektor untuk rekombinan DNA.

Dalam melakukan pengklonan suatu DNA asing atau DNA yang diinginkan atau DNA sasaran
harus memenuhi hal-hal sebagai berikut. DNA plasmid vektor harus dimurnikan dan dipotong
dengan enzim yang sesuai sehingga terbuka. DNA yang akan disisipkan ke molekul vektor untuk
membentuk rekombinan buatan harus dipotong dengan enzim yang sama. Reaksi pemotongan dan
penggabungan harus dipantau dengan menggunakan elektroforesis gel. Rekombinan buatan harus
ditransformasikan ke E. coli  atau ke vektor lainnya.

 Rekayasa genetik dengan menggunakan plasmid bakteri E. coli dapat dilakukan sebagai

berikut.

1. Menentukan gen yang diinginkan untuk disisipkan, misalnya gen pengkode hormone insulin dari
sel-sel pankreas manusia atau gen pengkode hormone pertumbuhan dari kelenjar pituitari.
Kromosom sel-sel pankreas dikeluarkan dengan memecah membran plasma. Membran plasma ini
dipecah dengan diberi kejutan listrik atau dengan pemberian zat kimia yaitu polietilen glikol atau
kalsium klorida (CaCl2), sehingga kromosom dapat keluar dari sel pankreas.

2. Kromosom yang diinginkan tadi dipotong dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease
untuk melepaskan bagian DNA yang diinginkan, kemudian memurnikan DNA tersebut. Elektroforesis
dapat juga digunakan untuk persiapan memurnikan fragmen DNA tertentu, selain digunakan untuk
menganalisis.
 3.  Mengektraksi plasmid dari sel bakteri. Plasmid dipisahkan dari sel dengan cara memecah dinding
sel bakteri. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan deterjen atau dengan enzim lisozim,
kemudian dilisis dengan natrium hidroksida (NaOH) dan larutan dedosil sulfat. DNA kromosom akan
menggumpal dan dinetralisir dengan natrium asetat. DNA plasmid ini akan menggumpal membentuk
jaring-jaring dan dengan mudah mengendap. Untuk memisahkan DNA ini dilakukan sentrifugasi.

4. Cairan yang mengandung plasmid ini dijenuhkan dengan pengendapan etanol. DNA plasmid yang
dimurnikan dengan filtrasi gel. Plasmid yang berbentuk lingkaran itu dipotong dengan enzim restriksi
endonuklease yaitu enzim yang sama digunakan untuk memotong DNA pankreas. Enzim ini
memecah ikatan fosfodiester pada molekul DNA. Endonuklease memecah asam nukleat pada posisi
internal, sedangkan enzim eksonuklase memecah molekul DNA dari ujung molekulnya.

5. Kemudian pemasangan gen pengkode yang diinginkan tadi ke dalam plasmid dengan
menggunakan enzim ligase yang fungsinya menggabungkan ikatan fosfodiester antara fragmen
ujung-ujung yang terpotong tadi. Proses penyambungan tersebut disebut ligasi. Karena enzim yang
digunakan untuk memotong DNA sel pankreas dan plasmid sama jenisnya, akan menghasilkan ujung-
ujung yang lengket yang sama strukturnya, sehingga penyambungannya akan menyatu sempurna.
Suhu optimum untuk ligasi adalah 37oC, tetapi ikatannya tidak stabil. Ligasi akan berhasil jika
dilakukan pada suhu 4o-150oC.

6.  Plasmid yang telah disisipi gen pengkode yang diinginkan itu dimasukkan ke dalam sel bakteri coli
dengan cara tranformasi. Transformasi dilakukan dengan memasukkan bakteri E. coli ke dalam
larutan CaCl2 sehingga terbentuk lubang-lubang sementara, sehingga plasmid dapat masuk ke dalam
sel bakteri. Diharapkan bakteri yang telah disisipi gen tersebut mewarisi sifat gen baru, sehingga
bakteri yang telah disisipi dengan gen pengkode insulin dapatm memproduksi insulin.

7. Langkah selanjutnya adalah mengembangbiakkan bakteri hasil rekayasa dalam tabung fermentasi
yang berisi medium untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri E. coli untuk memproduksi
insulin dalam jumlah yang banyak. Insulin yang terbentuk kemudian dipisahkan dari senyawa yang
lain.

Langkah pembuatan insulin dengan menggunakan plasmid bakteri yang dapat dilihat pada
Gambar 3 berikut.

2.      Kloning Kesehatan (Terapeutic Cloning)

Kloning terapeutik bagian dari terapi sel punca yang bertujuan untuk menghindari adanya
reaksi penolakan terhadap sistem imun pasien pada saat dilakukan terapi. Kloning terapeutik
dilakukan dengan sel induk, dimaksudkan untuk tujuan terapeutik (penyembuhan) dan riset medis,
bukan untuk menciptakan manusia baru. Hal ini dilakukan dengan menggunakan teknologi SCNT
(Somatic Cell Nuclear Transfer). Sel punca memiliki potensi yang sangat menjanjikan untuk terapi
 berbagai penyakit sehingga menimbulkan harapan baru untuk mengobatinya. Sampai saat ini, ada 3
golongan penyakit yang dapat diatasi dengan penggunaan sel punca, di antaranya adalah:

1. Penyakit autoimun,

2. Penyakit degeneratif, contoh stroke, Parkinson, Alzhimer.

3. Penyakit kanker, contoh leukemia.

Sel punca embrionik sangat plastis dan mudah dikembangkan menjadi berbagai macam
jaringan sel, seperti neuron, kardiomiosit, osteoblast, fibroblast, dan sebagainya. Oleh karena itu, sel
punca embrionik dapat digunakan untuk transplantasi jaringan yang rusak. Selain itu, sel punca
embrionik memiliki tingkat imunogenisitas yang rendah selama belum mengalami diferensiasi. Salah
satu cara untuk menghindari terjadinya graft versus host disease (GVHD) adalah dengan
menggunakan sel punca embrionik dengan sel somatik yang bersumber dari pasien itu sendiri
sehingga tidak akan ada penolakan lagi terhadap sistem imunnya. Dengan menggunakan teknologi
SCNT, sel punca embrionik yang dihasilkan akan identik dengan induknya (dalam hal ini adalah
pasien itu sendiri). Hal itu mengakibatkan tidak akan adanya reaksi penolakan terhadap sistem imun
pasien apabila dilakukan transplantasi.

Secara teoritis, teknik SCNT memiliki potensi besar dalam dunia kesehatan karena dapat
dipergunakan untuk transplantasi berbagai organ dan jaringan pada manusia. Secara singkat
tahapan untuk melakukan kloning terapeutik pada manusia (Gambar 2) Pertama mengambil biopsi
sel somatik dari tubuh pasien dan inti dari sel somatik tersebut ditransfer ke dalam sel telur donor
yang telah dikeluarkan intinya (unfertilized enucleated oocyte). Sel telur hasil manipulasi dikultur
sampai ke tahapan tertentu dan setelah mengalami berbagai proses akan didapatkan sel punca
embrionik. Sel punca embrionik ini diarahkan perkembangannya menjadi suatu jaringan atau organ
tertentu yang akan dapat digunakan untuk transplantasi jaringan atau organ dan tidak akan
mengalami rejeksi sistem imun pada pasien itu sendiri (immunologically compatible transplant).
Dengan menggunakan bantuan mikroskop, pergerakan sel telur ditahan dengan holding pipette.
Kemudian, DNA dari sel somatik pasien (yang berada di dalaminjection pipette) diintroduksikan ke
dalam sel telur enucleated. Sel telur hasil manipulasi dikultur secara in vitro menjadi blastosit selama
5-6 hari. Lalu,  inner cell mass diisolasi dan dikultur di cawan petri sehingga akan berkembang
menjadi sel punca embrionik yang memiliki profil imunologi yang sama dengan pasien.

3.      Kloning Reproduksi (Reproductive Cloning)

Kloning reproduktif pertama kali dilakukan oleh seorang Ilmuan Inggris, John Gurdon. Beliau
berhasil melakukan kloning pada katak. Kemudian para peneliti dengan antusias melakukan
percobaan lain pada mamalia. Sampai dengan tahun 1996 tepatnya 5 Juli, Ian Wilmut dan para
peneliti yang lain dari Roslin Institute di Edinburg (Skotlandia) berhasil menciptakan biri-biri yang
diberi nama Dolly, akan tetapi penelitian ini dikatakan belum berhasil karena Dolly yang seharusnya
dapat mencapai umur 11 tahun ternyata hanya dapat mencapai umur 6 tahun. Hasil penelitian ini,
menunjukkan bahwa Dolly mengalami penuaan dini, menderita penyakit radang sendi, dan infeksi
paru kronis.

Kloning reproduktif mengandung arti suatu teknologi yang digunakan untuk menghasilkan
individu baru atau teknologi yang digunakan untuk menghasilkan hewan yang sama dengan
menggunakan teknik SCNT. Genetika individu klon tidak seluruhnya memiliki kesamaan dengan sang
induk, persamaan genetika individu klon dengan induknya hanya terletak pada inti DNA donor yang
berada di kromosom. Individu klon juga memiliki material genetik lainnya yang berasal dari DNA
mitokondria di sitoplasma. Teknologi kloning reproduktif dapat digunakan untuk mencegah
terjadinya kepunahan hewan-hewan langka ataupun hewan-hewan sulit dikembangbiakkan. Namun,
laju keberhasilan teknologi ini sangatlah rendah seperti pada contoh yaitu Domba Dolly merupakan
contoh kloning reproduktif yang satu-satunya klon yang berhasil lahir setelah dilakukan 276 kali
percobaan.

Pada kloning reproduktif ini sel donor yang berupa sel somatik (2n) diintroduksikan
ke enucleated oocyte. Keberhasilan proses aktivasi embrio konstruksi secara kimiawi atau mekanik
mengakibatkan terjadinya proses pembelahan sampai ke tahap blastosit. Kemudian, embrio
dimplantasikan ke dalam rahim untuk dilahirkan secara normal. Berbeda pada kloning kesehatan
yang setelah embrio mencapai tahapan blastosit, embrio dikultur secara in vitro untuk
didiferensiasikan menjadi berbagai jenis sel untuk kegunaan terapeutik atau kesehatan.

Sampai saat ini, hewan klon yang berhasil diproduksi jumlahnya cukup banyak, di antaranya
adalah domba, sapi, kambing, kelinci, kucing, dan mencit. Sementara itu, tingkat keberhasilan
kloning masih rendah pada hewan anjing, ayam, kuda, dan primata. Masalah yang kerap kali timbul
dalam kloning reproduktif adalah biaya dan efisiensinya. Penelitian dalam kloning reproduktif
membutuhkan biaya yang sangat tinggi dan tingkat kegagalannya tinggi. Di samping tingkat
keberhasilan yang rendah, hewan klon cenderung mengalami masalah defisiensi sistem imun serta
sangat rentan terhadap infeksi, pertumbuhan tumor, dan kelainan-kelainan lainnya. Penyebab
timbulnya berbagai masalah di atas adalah adanya kesalahan saat pemrograman material
genetik(reprogramming) dari sel donor. Kesalahan pengkopian DNA dari sel donor atau yang lebih
dikenal dengan sebutan genomic imprinting  akan mengakibatkan terjadinya perkembangan embrio
yang abnormal. Berbagai contoh abnormalitas yang terjadi pada klon mencit adalah obesitas,
pembesaran plasenta (placentomegally),kematian pada usia dini. Parameter yang dijadikan sebagai
tolak ukur keberhasilan dalam SCNT adalah kemampuan sitoplasma pada sel telur untuk
mereprogram inti dari sel donor dan juga kemampuan sitoplasma untuk mencegah terjadinya
perubahan-perubahan secara epigenetik selama dalam perkembangannya. Dari semua penelitian
yang telah dipublikasikan, tercatat hanya sebagian kecil saja dari embrio hasil rekonstruksi
(menggunakan sel somatik dewasa atau fetal) yang berkembang menjadi individu muda yang sehat.
7. Sekuensing DNA atau pengurutan DNAadalah proses atau teknik penentuan
urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal
sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar
suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk
pembentukan tubuh makhluk hidup.[1] Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk
menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara
membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.
[2] Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan
seperti kedokteran,[3] bioteknologi, forensik,[4] dan antropologi.[5]
Teknik sekuensing DNA mulai dikembangkan pada tahun 1970-an dan telah menjadi
hal rutin dalam penelitian biologi molekular pada dekade berikutnya berkat dua
metode yang dikembangkan secara independen namun hampir bersamaan oleh
tim Walter Gilbert di Amerika Serikat dan tim Frederick Sanger di Inggris sehingga
kedua ilmuwan tersebut mendapatkan Penghargaan Nobel Kimia pada tahun 1980.[6]
[7] Selanjutnya, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan dan berhasil
diautomatisasi pada pertengahan 1980-an. Sejak tahun 1995, berbagai
proyek genomyang bertujuan menentukan sekuens keseluruhan DNA pada
banyak organismetelah diselesaikan, termasuk Proyek Genom Manusia. Sekuensing
DNA seluruh genom semakin terjangkau dan cepat dilakukan berkat pengembangan
sejumlah teknik sekuensing generasi berikutnya mulai tahun 2000-an.
Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi makhluk hidup untuk
melangsungkan hidup dan berkembang biak. Dengan demikian, penentuan sekuens
DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai mengapa dan
bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis.
Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA
dapat berguna dalam penelitian biologi manapun. Sebagai contoh, dalam ilmu
pengobatan sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis,
dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Demikian pula halnya, penelitian
pada agen penyebab penyakit (patogen) dapat membuka jalan bagi
pengobatan penyakit menular. Bioteknologi, yang dapat pula memanfaatkan
sekuensing DNA, merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi
menghasilkan banyak barang dan jasa berguna. Pengetahuan akan sekuens DNA
berguna untuk mengetahui sekuens asam amino yang disandikan oleh gen.[8]
Karena RNA dibentuk dengan transkripsi dari DNA, informasi yang dikandung RNA
juga terdapat di dalam DNA cetakannya sehingga sekuensing DNA cetakan tersebut
sudah cukup untuk membaca informasi pada RNA. Namun,
sekuensing RNA dibutuhkan khususnya pada eukariota, karena molekul RNA
eukariota tidak selalu sebanding dengan DNA cetakannya karena
pemotongan intronsetelah proses transkripsi.
Metode sekuensing DNA yang kini ada hanya dapat merunut sepotong pendek DNA
sekaligus. Contohnya, mesin sekuensing modern yang menggunakan metode Sanger
hanya dapat mencakup paling banyak sekitar 1000 pasang basa setiap
sekuensing [2]. Keterbatasan ini disebabkan oleh probabilitasterminasi rantai yang
menurun secara geometris seiring dengan bertambahnya panjang rantai, selain
keterbatasan fisik ukuran dan resolusi gel.
Sekuens DNA dengan ukuran jauh lebih besar kerap kali dibutuhkan. Sebagai
contoh, genombakteri sederhana dapat mengandung jutaan pasang basa,
sedangkan genom manusiaterdiri atas lebih dari 3 miliar pasang basa. Berbagai
strategi telah dikembangkan untuk sekuensing DNA skala besar, termasuk
strategi primer walking dan shotgun sequencing. Kedua strategi tersebut
melibatkan pembacaan banyak bagian DNA dengan metode Sanger dan selanjutnya
menyusun hasil pembacaan tersebut menjadi sekuens yang runut. Masing-masing
strategi memiliki kelemahan sendiri dalam hal kecepatan dan ketepatan; sebagai
contoh, metode shotgun sequencing merupakan metode yang paling praktis untuk
sekuensing genom ukuran besar, namun proses penyusunannya rumit dan rentan
kesalahan.
Data sekuens bermutu tinggi lebih mudah didapatkan bila DNA bersangkutan
dimurnikan dari pencemar yang mungkin terdapat pada sampel dan diamplifikasi.
Hal ini dapat dilakukan dengan metode reaksi berantai polimerase bila primer yang
dibutuhkan untuk mencakup seluruh daerah yang diinginkan cukup praktis dibuat.
Cara lainnya adalah dengan kloning DNA sampel menggunakan vektor bakteri, yaitu
memanfaatkan bakteri untuk "menumbuhkan" salinan DNA yang diinginkan
sebanyak beberapa ribu pasang basa sekaligus. Biasanya proyek-proyek sekuensing
DNA skala besar memiliki persediaan pustaka hasil kloning semacam itu.

8. Teknik Hibridisasi

Praktikum pemuliaan tanaman hibridisasi dilakukan di lahan percobaan di Jatikerto

beberapa minggu yang lalu. Kami berangkat sekitar jam 3 dari Kampus tercinta
Universitas Brawijaya tepatnya pada hari minggu. Perjalanan ke Jatikerto agak lama dan
sedikit membosankan.  Akhirnya sekitar jam setengah 5 kami kelas G sebanyak 40 anak
sampai juga di lokasi praktikum. Setelah beres-beres kamar dan sholat kami langsung
ke lahan untuk melakukan emaskulasi. Tahap pertama dalam hibridasi yaitu pemilihan
tetua, emaskulasi, penyerbukan dan labeling.  Emaskulasi adalah tahapan kedua dalam
hibridisasi setelah memilih tetua kita akan melakukan emaskulasi pada bunga betina.
Emaskulasi adalah proses menghilangkan organ jantan agar putik tidak terkontaminasi
polen dari organ jantan tersebut.

Pemilihan Tetua

Di praktikum pemuliaan kali ini kami akan menyilangkan tanaman ubi jalar (Ipomoea
batatas). . Kami menggunakan ubi jalar ungu sebagai tetua betina dan ubi jalar putih
sebagai tetua jantan.
 
 

Emaskulasi

Untuk melakukan emaskulasi alat yang diperlukan adalah gunting dan pinset. Sangat
diperlukan kehati-hatian saat memotong benang sari jangan sampai putik ikut terpotong.

 
Setelah emaskulasi jangan lupa di sungkup agar putik tersebut tidak terkontaminasi
polen dari bunga lain.

Setelah emaskulasi kami kembali ke ruangan untuk materi dan makan malam. Jam 11
kami tidur agar besog paginya dapat melakukan penyerbukan.

Penyerbukan

Jam 5 pagi kami kembali ke lahan untuk melakukan penyerbuka. Yang harus kami
lakukan adalah memilih tetua jantannya, yaitu bunga ubi jalar putih yang sudah matang
serbuk sarinya.

Ini adalah bunga putih sebagai tetua jantan.

 

Jatuhkan serbuk sari dari tetua jantan tadi ke atas kepala putik tetua betina. Lakukan
dengan cermat agar hibridasasinya berhasil

 
Pembungkusan bunga betina

Setelah melakukan penyerbukan jangan lupa untuk membungkus kembali tetua betina.

Labeling

Langkah terakhir adalah labeling. Yang perlu di cantumkan pada label adalah
nama/kode tetua, tanggal penyerbukan, dan kode persilangan.

 
 

9. Dalam biologi molekuler , restriksi panjang fragmen polimorfisme ( RFLP ) adalah

teknik yang memanfaatkan variasi dalam urutan DNA homolog , yang dikenal
sebagai polimorfisme , untuk membedakan individu, populasi, atau spesies atau untuk
menunjukkan lokasi gen dalam suatu urutan. Istilah mungkin mengacu pada polimorfisme itu
sendiri, seperti yang dideteksi melalui lokasi yang berbeda dari situs enzim restriksi , atau
pada teknik laboratorium terkait di mana perbedaan tersebut dapat
[Link] analisis RFLP , sampel DNA dicerna menjadi fragmen oleh satu atau
lebih enzim restriksi , dan fragmen restriksi yangdihasilkan kemudian dipisahkan
dengan elektroforesis gel sesuai ukurannya.
Meskipun sekarang sebagian besar sudah usang karena munculnya teknologi pengurutan
DNA yang murah, analisis RFLP adalah teknik pembuatan profil DNA pertama yang cukup
murah untuk diterapkan secara luas. Analisis RFLP adalah alat awal yang penting
dalam pemetaan genom , lokalisasi gen untuk kelainan genetik , penentuan risikopenyakit,
dan pengujian paternitas .
Analisis RFLP
Teknik dasar untuk mendeteksi RFLP melibatkan pemecahan sampel DNA dengan
penerapan enzim restriksi , yang dapat secara selektif membelah molekul DNA di mana
pun sekuens pendek dan spesifik dikenali dalam proses yang dikenal sebagai digesti
restriksi .Fragmen DNA yang dihasilkan oleh digest kemudian dipisahkan berdasarkan
panjangnya melalui proses yang dikenal sebagai elektroforesis gel agarosa dan dipindahkan
ke membran melalui prosedur Southern blot . Hibridisasi membran ke probe DNA berlabel
kemudian menentukan panjang fragmen yang melengkapi [Link] panjang
fragmen restriksi dikatakan terjadi ketika panjang fragmen yang terdeteksi bervariasi antar
individu, menunjukkan homologi sekuens yang tidak identik. Setiap panjang fragmen
dianggap sebagai alel , apakah itu benar-benar mengandung daerah pengkodean atau tidak,
dan dapat digunakan dalam analisis genetik selanjutnya.

Contoh
Ada dua mekanisme umum di mana ukuran fragmen restriksi tertentu dapat [Link]
skema pertama, segmen kecil genomdideteksi oleh probe DNA (garis yang lebih tebal). Pada
alel A , genom dibelah oleh enzim restriksi di tiga lokasi terdekat (segitiga), tetapi hanya
fragmen paling kanan yang akan terdeteksi oleh probe. Pada alel a , tapak restriksi 2 telah
hilang akibat mutasi , sehingga probe sekarang mendeteksi fragmen fusi yang lebih besar
yang berjalan dari lokasi 1 hingga 3. Diagram kedua menunjukkan bagaimana variasi ukuran
fragmen ini akan terlihat pada noda Selatan, dan bagaimana setiap alel (dua per individu)
mungkin diwarisi dalam anggota keluarga.
Pada skema ketiga, probe dan enzim restriksi dipilih untuk mendeteksi wilayah genom yang
mencakup segmen variable number tandem repeat (VNTR) (kotak dalam diagram
skematik). Dalam alel c , ada lima pengulangan di VNTR, dan probe mendeteksi fragmen
yang lebih panjang antara dua situs restriksi. Dalam alel d , hanya ada dua pengulangan di
VNTR, jadi probe mendeteksi fragmen yang lebih pendek antara dua situs restriksi yang
sama. Proses genetik lainnya, seperti penyisipan , penghapusan , translokasi, dan inversi ,
juga dapat menyebabkan polimorfisme. Tes RFLP membutuhkan sampel DNA yang jauh
lebih besar daripada tes short tandem repeat (STR).
Aplikasi
Analisis variasi RFLP dalam genom sebelumnya merupakan alat penting dalam pemetaan
genom dan analisis penyakit genetik. Jika peneliti pada awalnya mencoba untuk menentukan
lokasi kromosom dari gen penyakit tertentu, mereka akan menganalisis DNA anggota
keluarga yang terkena penyakit tersebut, dan mencari alel RFLP yang menunjukkan pola
pewarisan yang serupa dengan penyakit tersebut (lihat hubungan genetik ). Setelah gen
penyakit terlokalisasi, analisis RFLP pada keluarga lain dapat mengungkapkan siapa yang
berisiko terhadap penyakit tersebut, atau siapa yang kemungkinan besar
merupakan pembawa gen mutan. Uji RFLP digunakan dalam identifikasi dan diferensiasi
organisme dengan menganalisis pola unik dalam genom. Ini juga digunakan dalam
identifikasi tingkat rekombinasi di lokus antara situs pembatasan.
Analisis RFLP juga menjadi dasar untuk metode awal sidik jari genetik , berguna dalam
identifikasi sampel yang diambil dari TKP , dalam penentuan paternitas , dan dalam
karakterisasi keanekaragaman genetik atau pola pemuliaan pada populasi hewan.

10. Produksi protein adalah proses bioteknologimenghasilkan protein tertentu. Ini biasanya

dicapai dengan manipulasi ekspresi gendalam suatu organisme sehingga
ia mengekspresikan gen rekombinan dalam jumlah besar. Ini termasuk transkripsi DNA
rekombinan menjadi messenger RNA ( mRNA), terjemahan mRNA menjadi
rantai polipeptida , yang pada akhirnya dilipat menjadi protein fungsional dan
dapat ditargetkan ke lokasi subselular atau ekstraseluler tertentu. [1]

Dogma sentral yang menggambarkan transkripsi dari kode DNA menjadikode RNA menjadi protein pada

langkah kedua yang mencakup produksi protein.

Sistem produksi protein (dalam istilah lab juga disebut sebagai 'sistem ekspresi') digunakan
dalam ilmu kehidupan , bioteknologi , dan kedokteran . Penelitian biologi
molekuler menggunakan banyak protein dan enzim, banyak di antaranya berasal dari sistem
ekspresi; terutama DNA polimerase untuk PCR , reverse transcriptaseuntuk analisis
RNA, restriksi endonukleaseuntuk kloning, dan untuk membuat protein yang disaring
dalam penemuan obat sebagai target biologis atau sebagai obat potensial itu sendiri. Ada juga
aplikasi penting untuk sistem ekspresi dalam fermentasi industri , terutama
produksi biofarmasi seperti insulinmanusia untuk mengobati diabetes , dan untuk
memproduksi enzim .
Sistem produksi protein
Sistem produksi protein yang umum digunakan termasuk yang berasal
dari bakteri, [2] ragi , [3] [4] baculovirus / serangga , [5] sel mamalia , [6] [7] dan jamur
berserabut seperti Myceliophthora thermophila . [8] Ketika biofarmasi diproduksi dengan
salah satu sistem ini, pengotor terkait proses yang disebut protein sel inang juga tiba di
produk akhir dalam jumlah kecil. [9]
Sistem berbasis sel
Sistem ekspresi yang paling tua dan paling banyak digunakan adalah berbasis sel dan dapat
didefinisikan sebagai " kombinasi vektor ekspresi , DNA kloningnya, dan inang untuk vektor
yang menyediakan konteks untuk memungkinkan fungsi gen asing dalam sel inang, yang
adalah, menghasilkan protein pada tingkat tinggi ". [10] [11] Ekspresi berlebih adalah
tingkat ekspresi gen yang sangat tinggi dan abnormal yang menghasilkan fenotipe terkait-gen
yang diucapkan. [12] [13]
Ada banyak cara untuk memasukkan DNAasing ke sel untuk ekspresi, dan banyak sel inang
yang berbeda dapat digunakan untuk ekspresi - setiap sistem ekspresi memiliki kelebihan dan
kekurangan yang [Link] ekspresi biasanya dirujuk oleh inangdan sumber DNA atau
mekanisme pengiriman materi genetik. Misalnya, inang yang umum
adalah bakteri (seperti [Link] , B. subtilis ), ragi(seperti [Link] [4] ) atau garis
seleukariotik. Sumber DNA dan mekanisme pengiriman yang umum
adalah virus (seperti baculovirus , retrovirus , adenovirus ), plasmid, kromosom buatan ,
dan bakteriofag (seperti lambda ). Sistem ekspresi terbaik bergantung pada gen yang terlibat,
misalnya Saccharomyces cerevisiae sering lebih disukai untuk protein yang
memerlukan modifikasi pasca-translasi yang signifikan. Garis
sel serangga atau mamalia digunakan ketika diperlukan penyambungan mRNA yang mirip
dengan manusia. Meskipun demikian, ekspresi bakteri memiliki keuntungan karena mudah
menghasilkan protein dalam jumlah besar, yang diperlukan untuk kristalografi sinar-X atau
eksperimen resonansi magnetik inti untuk penentuan struktur.
Karena bakteri adalah prokariota , mereka tidak dilengkapi dengan mesin enzimatis lengkap
untuk menyelesaikan modifikasi pasca-translasi atau pelipatan molekul yang
diperlukan. Oleh karena itu, protein eukariotik multi-domain yang diekspresikan dalam
bakteri seringkali tidak berfungsi. Selain itu, banyak protein menjadi tidak larut sebagai
badan inklusi yang sulit untuk dipulihkan tanpa denaturants yang keras dan pelipatan kembali
protein yang rumit selanjutnya.
Untuk mengatasi masalah ini, sistem ekspresi yang menggunakan beberapa sel eukariotik
dikembangkan untuk aplikasi yang membutuhkan protein yang sesuai, atau lebih dekat
dengan organisme eukariotik: sel tumbuhan (yaitu tembakau), serangga atau mamalia (yaitu
sapi) ditransfeksi dengan gen dan dibiakkan dalam suspensi dan bahkan sebagai jaringan atau
organisme utuh, untuk menghasilkan protein terlipat penuh. Namun, sistem ekspresi in
vivo mamalia memiliki hasil yang rendah dan keterbatasan lainnya (memakan waktu,
toksisitas pada sel inang, ..). Untuk menggabungkan hasil tinggi / produktivitas dan fitur
protein terukur dari bakteri dan ragi, dan fitur epigenetik lanjutan dari sistem tanaman,
serangga dan mamalia, sistem produksi protein lain dikembangkan menggunakan eukariota
uniseluler (yaitu sel ' Leishmania ' non-patogenik).
Sistem bakteri
Escherichia coli
E. coli , salah satu inang paling populer untuk ekspresi gen buatan.

E. coli adalah salah satu host ekspresi yang paling banyak digunakan, dan DNA biasanya
dimasukkan ke dalam vektor ekspresi plasmid. Teknik untuk ekspresi berlebih pada E.
coliberkembang dengan baik dan bekerja dengan meningkatkan jumlah salinan gen atau
meningkatkan kekuatan pengikatan wilayah promotor sehingga membantu transkripsi.
Misalnya, sekuens DNA untuk protein yang diinginkan dapat diklon atau disubklonmenjadi
plasmid dengan nomor salinan tinggi yang mengandung promotor lac (sering kali LacUV5 ),
yang kemudian diubah menjadi bakteri E. coli . Penambahan IPTG (analog laktosa )
mengaktifkan promotor lac dan menyebabkan bakteri mengekspresikan protein yang
diinginkan.
Galur E. coli BL21 dan BL21 (DE3) adalah dua galur yang umum digunakan untuk produksi
protein. Sebagai anggota dari garis B, mereka kekurangan protease lon dan OmpT ,
melindungi protein yang dihasilkan dari degradasi. Profag DE3 yang ditemukan di BL21
(DE3) menyediakan T7 RNA polimerase(digerakkan oleh promotor LacUV5),
memungkinkan vektor dengan promotor T7 untuk digunakan sebagai gantinya. [14]
Corynebacterium
Spesies non-patogen dari Corynebacteriumgram positif digunakan untuk produksi komersial
berbagai asam amino. Spesies C. glutamicum banyak digunakan untuk
memproduksi glutamat dan lisin , [15]komponen makanan manusia, pakan ternak, dan produk
farmasi.
Ekspresi faktor pertumbuhan epidermalmanusia yang aktif secara fungsional telah dilakukan
di C. glutamicum , [16] sehingga menunjukkan potensi untuk produksi skala industri protein
manusia. Protein yang diekspresikan dapat ditargetkan untuk sekresi melalui jalur
sekretori umum (Sec) atau jalur translokasi arginin kembar (Tat). [17]
Tidak seperti bakteri gram negatif , Corynebacterium gram positif
kekurangan lipopolisakarida yang berfungsi sebagai endotoksin antigenik pada manusia.
Pseudomonas fluorescens
Bakteri non-patogen dan gram negatif, Pseudomonas fluorescens , digunakan untuk produksi
protein rekombinan tingkat tinggi;umumnya untuk pengembangan bio-terapeutik dan
vaksin. P. fluorescens adalah organisme serba guna secara metabolik, memungkinkan untuk
penyaringan throughput yang tinggi dan perkembangan cepat dari protein kompleks. P.
fluorescens paling terkenal karena kemampuannya yang cepat dan berhasil menghasilkan titer
tinggi dari protein aktif dan larut. [18]
Sistem eukariotik
Ragi
Sistem ekspresi yang menggunakan S. cerevisiae atau Pichia pastoris memungkinkan
produksi protein yang stabil dan bertahan lama yang diproses serupa dengan sel mamalia,
dengan hasil tinggi, dalam media protein yang ditentukan secara kimiawi.
Jamur berfilamen
Jamur berfilamen, terutama Aspergillus dan Trichoderma , tetapi juga baru-baru
ini Myceliophthora thermophila C1 [8] telah dikembangkan menjadi platform ekspresi untuk
penyaringan dan produksi enzim industri yang beragam. Sistem ekspresi C1 menunjukkan
morfologi viskositas rendah dalam kultur terendam, memungkinkan penggunaan media
pertumbuhan dan produksi yang kompleks.
Sel yang terinfeksi Baculovirus

Sel serangga yang terinfeksi Baculovirus [19] ( Sf9 , Sf21 , High Five strain) atau sel

mamalia [20] ( HeLa , HEK 293 ) memungkinkan produksi glikosilasi atau protein membran
yang tidak dapat diproduksi menggunakan sistem jamur atau bakteri. [19] Ini berguna untuk
produksi protein dalam jumlah [Link] tidak diekspresikan secara terus menerus karena
sel inang yang terinfeksi pada akhirnya melisis dan mati selama setiap siklus infeksi.[21]
Ekspresi sel serangga non-litik
Ekspresi sel serangga non-litik merupakan alternatif dari sistem ekspresi litik
baculovirus. Dalam ekspresi non-litik, vektor ditransfusikan secara transien atau stabil ke
dalam DNA kromosom sel serangga untuk ekspresi gen selanjutnya. [22] [23] Ini diikuti
dengan seleksi dan skrining klon rekombinan.[24] Sistem non-litik telah digunakan untuk
memberikan hasil protein yang lebih tinggi dan ekspresi gen rekombinan yang lebih cepat
dibandingkan dengan ekspresi sel yang terinfeksi baculovirus. [23] Garis sel yang digunakan
untuk sistem ini meliputi: Sf9 , Sf21dari sel Spodoptera frugiperda , Hi-5 dari
sel Trichoplusia ni , dan sel Schneider 2 dan selSchneider 3 dari sel Drosophila
melanogaster .[22] [24] Dengan sistem ini, sel tidak melisis dan beberapa mode kultivasi dapat
digunakan. [22]Selain itu, proses produksi protein dapat direproduksi. [22] [23] Sistem ini
memberikan produk yang homogen. [23] Kelemahan dari sistem ini adalah persyaratan
langkah penyaringan tambahan untuk memilih klon yang layak. [24]
Excavata
Sistem ekspresi Leishmania  tarentolae (tidak dapat menginfeksi mamalia) memungkinkan
produksi protein yang stabil dan langgeng dengan hasil tinggi, dalam media yang ditentukan
secara kimiawi. Protein yang dihasilkan menunjukkan modifikasi pasca-translasi eukariotik
sepenuhnya, termasuk pembentukan ikatan glikosilasi dan disulfida.[ butuh rujukan ]
Sistem mamalia
Sistem ekspresi mamalia yang paling umum adalah sel Chinese Hamster ovary (CHO) dan
Human embryonic ginjal (HEK). [25] [26] [27]
 Sel ovarium hamster cina [26]
 Limfoblstoid myeloma tikus (misalnya sel NS0) [25]
 Sepenuhnya Manusia
o Sel ginjal embrio manusia ( HEK-293 ) [26]
o Sel retina embrionik manusia (Crucell's Per.C6) [26]
o Sel amniosit manusia (Glycotope dan CEVEC)

Sistem tanpa sel

Produksi protein bebas sel dilakukan secara in vitro menggunakan RNA polimerase,
ribosom, tRNA, dan ribonukleotida yang [Link] ini dapat diproduksi dengan
ekstraksi dari sel atau dari sistem ekspresi berbasis [Link] tingkat ekspresi yang rendah
dan biaya sistem bebas sel yang tinggi, sistem berbasis sel lebih banyak digunakan. [