PROTOKOL

VALIDASI METODE ANALISA

PENETAPAN KADAR KLONAZEPAM dan PAROXETIN HIDROKLORIDA

DALAM TABLET DENGAN METODE RP-HPLC-PDA

NOMOR PVMA/VALKAL/484/21/03
REVISI 0
DITERBITKAN
VALIDASI
OLEH
NAMA PRODUK TABLET KLONAZEPAM-PAROXETIN
METODE RP-HPLC-PDA
TANGGAL TERBIT 30-03-2021

PT. MIF, Tbk.

SURABAYA
2021
 RIWAYAT PERUBAHAN DOKUMEN

No No. Protokol Lama No. Protokol Baru Isi Perubahan

1. PVMA/VALKAL/484/
- DOKUMEN BARU
21/03
 LEMBAR PENGESAHAN PROTOKOL

Protokol disiapkan oleh,

Nindya Pramesti Spesialis Validasi

Rebhika Lusiana Manager Validasi-

Kalibrasi

Ditinjau oleh,
Aprelita Nurelli Manager QC
Dwiana

Disetujui oleh,
Sulistyaningsih General Manager
QO
 I. TUJUAN
Memvalidasi penetapan kadar Klonazepam (CLP) dan Paroxetin hidroklorida (PAR)
dalam tablet untuk pengembangan di laboratorium PT. MIF, Tbk.

II. KUALIFIKASI BAHAN

SAMPEL BAKU KERJA BAKU KERJA
Nama Item Tablet Klonazepam (CLP) Paroxetin hidroklorida (PAR)

Nomor Item 484 - -

No. Batch / MAR032021 - -
No. Lot
Manufacture PT. MIF Tbk. Dr. Reddy’s Dr. Reddy’s Laboratories.
Laboratories. Hyderated, Hyderated, India
India
Expired - - -
Date

[Link] PERALATAN
Status kualifikasi instalasi, kualifikasi operasional, kualifikasi kinerja, dan atau kalibrasi
selanjutnya untuk tiap alat yang digunakan harus dituliskan dalam kertas kerja.

IV. FORMULA
-

V. PROSEDUR
A. METODE PEMERIKSAAN
Metode : HPLC
Zat aktif : Clonazepam (CLP) dan Paroxetine hydrocloride (PAR)
Volume Injek : 10 µl
Detektor : PDA panjang gelombang 254 nm
Fase Gerak : 15mM Ammonium acetate: methanol (40:60v/v)
Laju Alir : 1,2 mL/menit
Kolom : Agilent C18 reverse phase kolom (150 × 4.6mm, 5µ)
Suhu Kolom : temperatur ambient
Pelarut : Metanol

B. PEMBUATAN PLASEBO
Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 2 dari 8
 -

C. PEMBUATAN LARUTAN
1. Larutan Baku Induk
Timbang masing-masing Klonazepam (CLP) dan Paroxetin hidroklorida (PAR)
sejumlah 10,0 mg. Masukkan secara terpisah masing- masing ke dalam labu ukur
10 mL. Tambahkan metanol + 5 mL, vortex selama 5 menit. Tambahkan metanol
hingga tepat tanda dan homogenkan.

2. Larutan Sampel Induk

Timbang seksama masing- masing sebanyak 20 tablet dan dihaluskan sampai
menjadi serbuk. Timbang setara 12,5 mg Paroxetin hidroklorida (PAR) dan 0,5
mg Klonazepam (CLP). Masukkan labu ukur 5 mL, larutkan dalam metanol,
vortex selama 5 menit dan sesuaikan dengan volume hingga tepat tanda, didapat
konsentrasi 2,5 mg/mL Paroxetin hidroklorida (PAR) dan 0,1 mg/mL Klonazepam
(CLP). Saring dengan mikofilter 0,45 µm.

3. Larutan Sampel 100% (klonazepam 2 µg/mL dan Paroxetin hidroklorida 50

µg/mL)
Ambil 400 µL larutan sampel induk menggunakan mikropipet, masukkan dalam
labu 20,0 mL. Tambahkan aquadest hingga tepat tanda dan homogenkan.

4. Larutan Baku 100% (Klonazepam 2 µg/mL dan Paroxetin hidroklorida 50

µg/mL)
Ambil 20 µL larutan baku induk klonazepam menggunakan mikropipet,
masukkan dalam labu 10,0 mL. Ambil 500 µL larutan baku induk paroxetin
menggunakan mikropipet, masukkan dalam labu 10,0 mL yang sama. Tambahkan
aquadest hingga tepat tanda dan homogenkan.

5. Larutan Baku 100% Klonazepam (2 µg/mL)

Ambil 20 µL larutan baku induk, masukkan dalam labu 10 mL. Tambahkan
aquadest hingga tepat tanda dan homogenkan.

6. Larutan Baku 100% Paroxetine hidroklorida (50 µg/mL)

Ambil 500 µL larutan baku induk, masukkan dalam labu 10 mL. Tambahkan
aquadest hingga tepat tanda dan homogenkan.

D. PENETAPAN KESESUAIAN SISTEM (SYSTEM SUITABILITY)

1. Buat larutan baku induk 100%.
2. Injeksikan larutan baku standar campuran klonazepam- paroxetin dengan rentang
volume 10-50 µL pada kolom sebanyak 5 kali.
Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 3 dari 8
 3. Catat kromatogram respon puncak pada sistem kromatografi. Hitung %
simpangan baku relatif area, waktu retensi, tailing factor, dan plat teoretis.

E. PENETAPAN SPESIFITAS (SPECIFITY)

1. Buat pelarut, larutan fase gerak, larutan baku 100%, dan larutan sampel 100%
2. Injeksikan tiap larutan dan pelarut ke dalam sistem kromatografi.
3. Lakukan overlay kromatogram untuk melihat pengaruh pelarut. Hitung resolusi
bila ada puncak lain dalam analit yang yang berdekatan dengan puncak utama.
4. Hitung similarity index dengan cara ukur 3 titik pada peak yaitu bagian up slope,
apex, down slope.

F. PENETAPAN LINIERITAS
1. Buat seri larutan baku bertingkat dengan 5 konsentrasi yaitu 50%, 100%, 150%,
200%, dan 250% dengan cara memipet sejumlah volume dari larutan baku induk
sesuai dengan tabel berikut. Masukkan dalam labu 10,0 mL, kemudian tambahkan
metanol hingga tepat tanda.
Klonazepam:
Volume pemipetan Volume Kadar Larutan baku yang dihasilkan
larutan baku induk pengenceran
(µL) (mL) (%) (µg/mL)
10 10,0 50 1
20 10,0 100 2
30 10,0 150 3
40 10,0 200 4
50 10,0 250 5

Paroxetin hidroklorida:
Volume pemipetan Volume Kadar Larutan baku yang dihasilkan
larutan baku induk pengenceran
(µL) (mL) (%) (µg/mL)
250 10,0 50 25
500 10,0 100 50
750 10,0 150 75
1000 10,0 200 100
1250 10,0 250 125

Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 4 dari 8

 2. Injeksikan tiap larutan sebanyak 3x ke dalam sistem kromatografi.
3. Buat persamaan regresi linear dari absorban versus kadar dan hitung harga
koefisien korelasi (r).

G. PENETAPAN BATAS DETEKSI (LOD) DAN BATAS KUANTIFIKASI (LOQ)

1. LOD dan LOQ dihitung berdasarkan kurva kalibrasi.
2. dinyatakan sebagai LOD = (3,3 × Sd) / m; LOQ = (10 × Sd) / m
(Dimana, Sd adalah simpangan baku dari perpotongan sumbu y dan m adalah
slope atau kemiringan).

H. PENETAPAN AKURASI
1. Buat larutan sampel induk (klonazepam 2,5 mg/ml dan 0,1 mg/ml paroxetin),
baku induk klonazepam, dan baku induk paroxetin.
2. Buat serangkaian 3 larutan akurasi masing-masing mengandung 80%, 100%, dan
120% dengan mengambil sejumlah tertentu larutan baku induk klonazepam dan
baku induk paroxetin. Replikasi masing-masing level sebanyak 3 kali. (lihat tabel
dibawah)
Klonazepam dan Paroxetin hidroklorida:
Volume Volume Volume Volume
pemipetan pemipetan baku pemipetan pengenceran baku
%kadar induk PAR dan
sampel induk induk PAR baku induk
(µL) (µL) CLP ( µL ) CLP (mL)
80% 400 800 32 20
100% 400 1000 40 20
120% 400 1200 24 20

3. Larutkan dengan sebagian aquadest pada labu ukur 20,0 mL, divortex selama 5
menit.
4. Tambahkan pelarut hingga tepat tanda dan homogenkan.
5. Disaring dengan filter 0,45 µm, buang 1 mL filtrat pertama.
6. Injeksikan tiap larutan akurasi sebanyak 3x ke dalam sistem kromatografi.
7. Hitung persentase recovery yang diperoleh dengan membandingkan hasil analisa
dengan nilai sebenarnya.

Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 5 dari 8

 I. PENETAPAN PRESISI (RIPITABILITAS)
1. Buat larutan baku 100% yang berisi campuran antara klonazepam 2 µg/mL dan
paroxetin 50 µg/mL.
2. Replikasi sebanyak 6x.
3. Injeksikan tiap larutan ke dalam kolom kromatografi berdasarkan sistem
kromatografi, catat kromatogramnya dan ukur respon puncak utama.
4. Hitung kadar, standar deviasi dan relatif standar deviasi semua data.

J. PENETAPAN ROBUSTNESS (ROBUSTNESS)

1. Buat larutan baku 100%
2. Buat larutan sampel 100 %.
3. Buat variasi laju alir yaitu 1,0 mL/menit; 1,2 mL/menit; dan 1,4 mL/menit.
4. Buat variasi panjang gelombang yaitu 253 nm, 254 nm, 255 nm.
5. Injeksikan tiap larutan ke dalam sistem kromatografi. Catat kromatogram dan
ukur respon puncak utama.
6. Hitung kadar , tailing faktor, retention time, standar deviasi semua data.

K. STABILITAS LARUTAN
1. Buat larutan baku 100%
2. Buat larutan sampel 100%.
3. Injeksikan tiap larutan contoh ke dalam sistem kromatografi, catat
kromatogramnya dan ukur respon puncak utama.
4. Simpan larutan pada kulkas suhu 8 °C + 1°C
5. Setelah jam ke- 0 dan m 48 jam sejak sampel dilarutkan, injeksikan lagi tiap
larutan contoh kedalam sistem kromatografi. Catat kromatogramnya dan ukur
respon puncak utama.
6. Hitung kadar dan % relatif standar deviasi semua data.

VI. METODE EVALUASI

A. PERHITUNGAN KADAR
Kadar Au Ws Pu
X X X WS%
= As Wu Ps
Keterangan :
Au : Luas area kromatogram larutan uji
As : Luas area kromatogram larutan baku
Wu : Penimbangan larutan uji
Ws : Penimbangan larutan baku

Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 6 dari 8

 Pu : Pengenceran larutan uji
Ps : Pengenceran larutan baku
% WS : Konsentrasi baku kerja pada label

B. SISTEM SUITABILITY
Hitung simpangan baku relatif dari area dan waktu retensi, resolusi antar puncak,
tailing factor, pelat teoritis.

C. PENENTUAN SPECIVITY
Parameter selektifitas dinyatakan dengan nilai resolusi puncak yang berdekatan
dengan puncak analit. Bila puncak tunggal, maka diyakinkan tidak ada puncak lain
dalam kromatogram plasebo dan pelarut yang mengganggu puncak utama.

D. PENETAPAN LOD dan LOQ

Dinyatakan sebagai LOD = (3,3 × Sd) / m; LOQ = (10 × Sd) / m
(Dimana, Sd adalah simpangan baku dari perpotongan sumbu y dan m adalah slope
atau kemiringan dari kurva kalibrasi).

E. PENETAPAN LINIERITAS DAN RENTANG (RANGE)

Buat persamaan regresi dari seri larutan baku bertingkat dan hitung koefisien
korelasinya. Range ditentukan dari konsentrasi dimana linearitas, akurasi, dan
presisinya telah memenuhi syarat.
F. PENETAPAN AKURASI
Hitung persentase rekoveri yang diperoleh dengan perhitungan sebagai berikut :
Hasil Analisa
Rekoveri = x 100%
Nilai Sebenarnya

G. PENETAPAN PRESISI (RIPITABILITAS)

Hitung simpangan baku relatif (SBR) dari data kadar pada pemeriksaan
Simpangan baku
SBR = x 100%
Rata-rata

H. PENETAPAN ROBUSTNESS
Hitung simpangan baku relatif (SBR) dari semua data kadar pada pemeriksaan
robustness.

Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 7 dari 8

 I. STABILITAS LARUTAN
Hitung simpangan baku relatif (SBR) dari semua data kadar pada pemeriksaan
stabilitas larutan.

Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 8 dari 8

 VII. KRITERIA KEBERTERIMAAN
A. SISTEM SUITABILITY
Simpangan baku relatif (SBR) < 2,0 %
Tailing factor (T) < 2
Jumlah pelat teoritis (N) > 1000
Retention time (Rt) klonazepam 4,01 menit dan Rt paroxetin 5,42 menit

B. SPESIFITAS
Tidak ada puncak asing yang mengganggu puncak utama untuk puncak utama yang
berdekatan dengan puncak utama. Nilai similaritas atau peak purity index mendekati 1
atau ≥ 0,999

C. LINEARITAS & RENTANG

r ≥ 0,999
Nilai rentang diambil berdasarkan seri konsentrasi yang memenuhi persyaratan linier.

D. AKURASI
Persen rekoveri 98,0 – 102,0%
SBR ≤ 2,0%

E. PRESISI (RIPITABILITAS)
Kadar klonazepam dan paoxetin 98,0 – 102,0%
SBR ≤ 2,0%

F. PRESISI ANTARA (RUGGEDNESS)

SBR masing-masing data ≤ 2,0%
SBR semua data ≤ 2,0%

G. ROBUSTNESS
SBR ≤ 2,0%

H. STABILITAS LARUTAN
SBR ≤ 2,0%

VIII. DOKUMENTASI DAN LAPORAN

Semua catatan (data) pengujian dan kromatogram yang diperoleh selama studi validasi
harus dilampirkan. Semua perhitungan harus dilakukan sebelum penentuan dan analisis
statistika. Bandingkan dengan kriteria penerimaannya.
Laporan validasi metode analisis mencakup informasi mengenai tanggal studi dimulai dan
selesai, hasil pengamatan, masalah yang ditemui, kelengkapan informasi yang
dikumpulkan, rangkuman laporan validasi, hasil pengujian dan analisis statistik, hasil
evaluasi terhadap kriteria keberterimaan, dan informasi lain yang relevan dengan studi.

Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 9 dari 8

 IX. KESIMPULAN
Kesimpulan dibuat berdasarkan validasi metode analisa terhadap hasil individual dan
replikatnya. Dalam hal terjadi perubahan manufaktur bahan baku, maka diperlukan
verifikasi untuk membuktikan bahwa prosedur penetapan kadar yang diuji dalam laporan
ini masih valid. Revalidasi dilakukan setiap lima tahun jika tidak terdapat perubahan
formula.

X. DAFTAR PUSTAKA
The Indian Pharmacopoeia, Vol-2, Government of India, Delhi, 2014,1435 and 2439.
British pharmacopoeia, Vol1 &2, stationary office, London Medicines and Health care
products regulatory agency, 2014,506-508 and 587-588.
The United states Pharmacopoeia, USP 36, NF 31,Vol 5, 3052 &4695
Badan POM, 2012, Petunjuk Operasional Cara Pembuatan Obat Yang Baik, Jakarta.

Protokol Validasi Metode Analisa Halaman 10 dari 8