BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Pendahuluan
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, fasa gerak yang berupa cairan dan fasa
diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Maka semua jenis
kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-
padat, cair-cair, dan gas-cair. Pembahasan teknik kromatografi modern baru
lengkap bila membahas kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) (Christian,
2003).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau dikenal pula
dengan istilah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). HPLC merupakan
perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan dunia analisis bahan baku
maupun bahan pencemar. Fungsi utama HPLC pada dasarnya adalah
kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam suatu
sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya ditentukan oleh ketinggian
tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk
kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak terlalu tinggi
(Mulja, 1995).
HPLC merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola didunia
analisis saat ini. HPLC digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian
berbagai sampel dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri
makanan dan minuman, industri polimer dan berbagai bahan baku. HPLC lebih
banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika
HPLC ini dihubungkan dengan sebuah spektrometri massa (Mass Spectrometer)
atau MS, maka penggunaannya akan lebih memungkinkan dalam analisis
kuantitatif (Skoog et al., 1994).
HPLC dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG),
keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama
baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada HPLC zat-zat yang

1
tidak diderivatisasi masih dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada
pemanasan atau tidak menguap, HPLC adalah pilihan utama. Keunggulan metoda
ini dibanding metoda pemisahan lainnya terletak pada ketepatan analisis dan
kepekaan yang tinggi serta cocok untuk memisahka senyawa-senyawa nonvolatile
yang tidak tahan pada pemanasan (Watson, 1999). Peningkatan kecepatan dan
efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya yang
menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil
dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom konvensional, sehingga agar
fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi.
Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya
berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan
sistem kromatografinya (Gholib dan Rohman, 2007).

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah yang diambil
pada makalah ini adalah, bagaimana contoh-contoh pengaplikasian HPLC pada
penelitian-penelitian yang telah ada?

1.3. Tujuan Penulisan

1.4. Manfaat Penulisan

2
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengertian High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (HPLC) atau biasa juga disebut dengan
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang
tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
HPLC paling sering digunakan untuk :
1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-
asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
2. Menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses
sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.
HPLC merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan
senyawa melalui fase diam (stationary phase) dengan menggunakan fase gerak
(mobile phase) mengaliri semua ini. Senyawa dalam kolom akan keluar dari
kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan
interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak (Putra, 2002)
Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi
puncak. Kedua hal ini berguna untuk :
1. Analisis kualitatif digunakan informasi tR,
2. Analisis kuantitatif digunakan informasi luas
3. Area/tinggi puncak kromatogram

2.2. Prinsip Kerja High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

2.2.1. Prinsip Dasar
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah
memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi
(kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen
tersebut (kuantitatif). Untuk HPLC sendiri pemisahan didasarkan atas perbedaan

3
sifat kepolarannya. Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial
point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan
yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat
penting dalam keberhasilan proses analisa (Christian, 2003).
2.2.2. Prinsip Kerja
Suatu fase gerak cair dialirkan dengan bantuan pompa melalui kolom ke
dektektor. Sampe dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara injeksi. Di
dalam kolom terjadi pemisahan komponen cairan. Karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solut-solut terhadap fase diam, solut yang kurang kuat
interaksinya dengan fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu. Setiap
komponen yang keluar dari fase diam (kolom) dideteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak menyatakan jumlah kimponen,
sedangkan luas peak menyatak konsentrasi komponen dalam campuran (Cristian,
2003).

2.3. Jenis-Jenis High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jikafase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau faseterbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fasegeraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase
normal dan HPLC fase terbalik (Putra, 2002).
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan
pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanismesorpsi solut, dengan
jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi padat-cair
Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben
yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC)
adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam HPLC kolom dipadati atau dipak
dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis
37 -44 μ). Sebagian besar dari HPLC sekarang ini dibuat untuk mencapai
partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ . Teknik ini biasanya

4
 digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak
terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.
2. Kromatografi partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang
tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan
yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair
(LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada
kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu
pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak
dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut
kromatografi cair cair (LLC)
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan
lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia
dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi
fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat
menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari HPLC. Kromatografi
partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari
fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.
3. Kromatografi penukar ion
Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase
gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin
berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya
telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin
pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah
digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal
untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya
kation dan anion.
4. Kromatografi eksklusi
Pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat.
Pengepaknya merupakan suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang
sangat kecil yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan

5
 dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang. Molekul yang lebih besar,
tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
Kromatografi eksklusi disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel.
Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah
digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika,
glass) yang digunakan dalam HPLC. Dextran gel lunak tidak dapat menahan
kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis
polimer-polimer dan bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-
molekul kecil (Putra, 2002).

2.4. Instrumen High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Komponen utama dalam HPLC adalah juga komponen dalam
kromatografi lainnya yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa HPLC,
kolom, fase diam, detektor, dan perangkat komponen pendukung lainnya

Gambar 1. Instrumen HPLC (Baboo, 2016)

6
1. Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak dalam HPLC harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert.
Wadah ini dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan
terlebih dahulu harus dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak
ini akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan
sangat mengacaukan hasil analisis.
2. Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLCharus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan
tingkat kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat
HPLC (HPLC grade). Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan
gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat
dalam fase gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom
HPLC. Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya
merupakan campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi
analisis. Daya elusi dan resolusi HPLC ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel.
Secara umum ada 2 tipe fase gerak:
a. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang
tidak berubah selama percobaan kromatografi
b. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut
yang berubah selama masa kromatografi
Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan
(pelarut/larutan) serta kemungkinan gradiennya akan menghasilkan
kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-pemisahan campuran
kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi isokratik
akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien. Seringkali campuran
pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni, namun
pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-
coba tentu tidak mudah dilakukan.
Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak
dibedakan menjadi:

7
 a. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan
elusinya akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.
b. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya.
Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase
geraknya.
c. Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang
disusun berdasarkan kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam
pemilihan fase gerak.
Dalam HPLC dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan
adalah campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril.
Sedangkan dalam fase normal sering digunakan adalah campuran pelarut-
pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut
jenis-jenis alkohol.
3. Pompa
Pompa HPLC harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan
pompa dapat terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000
psi dan mamp mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk
keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:
a. Pompa dengan tekanan konstan
b. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum
digunakan.
4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya:
a. Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi
kolom konvensional. Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor
mempunyai kecepatan alir yang lebih lambat (10-100 ul/menit)
b. Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa

8
 c. Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih pekat,
sehingga cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil, seperti
sampel klinis.
5. Detektor
Detektor HPLC dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang
bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat
universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis
detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan
elektrokimia. Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:
a. Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible
b. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada
kadar yang sangat kecil
c. Stabil dalam pengoperasiannya
d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul
atau lebih kecil pada kolom mikrobar.
e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada
kisaran yang luas
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair
ini. Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang
umumnya didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada
dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum
didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut
akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks
bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan
menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat
dan direkam untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah

9
 sensitivitas; batasan pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang
umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut.
6. Perangkat Pendukung Lainnya
Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam HPLC dapat berupa
komputer, integrator, injektor dan rekorder (Lestari, 2014)

2.5. Kelebihan dan Kelemahan High Performance Liquid Chromatography

(HPLC)
Banyak analisa yang mengutamakan penggunaan HPLC dalam proses
kerja mereka, hal ini dikarenakan HPLC mempunyai beberapa kelebihan
dibanding metode Kromatografi lainnya, diantaranya :
1. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang
dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
2. Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa
diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan
rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang diinginkan.
3. Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-
macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi
jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti
Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga
digunakan dalam HPLC.
4. Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.

10
5. Ideal untuk molekul besar dan ion : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis
psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk
mengalissis zat – zat tersebut.
6. Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan
dalam HPLC tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen
sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat
dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat
dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.
Namun, terdapat pula beberapa kekurangan HPLC yang membuatnya
tidak efisien untuk digunakan, yaitu :
1. Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan
dengan spektrometer massa
2. Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan)
yang baik sulit diperoleh
3. Mahal
4. Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
5. Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan (Widyaratna, 2015)

11
 BAB III

PEMBAHASAN

3.1. Pemeriksaan Metabolit Sekunder pada Ekstrak Etanol Rimpang

Lempuyang Gajah (Zingiber zerumbet (L.) J.E. Smith) dengan HPLC
Pada sub-bab ini mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh
Widyaningrum (2012) yang memeriksa metabolisme sekunder pada ekstrak etanol
rimpang lempuyang gajah dari tiga lokasi berbeda yaitu B2P2TOOT
Tawangmangu, Merapi Farma Yogyakarta, dan Pasar Gede Surakarta dengan
HPLC. Metode yang dilakukan pertama kali adalah preparasi sampel yaitu
pembuatan ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah. Rimpang lempuyang gajah
disortasi secara basah selanjutnya dicuci sebanyak 3 kali dengan air mengalir.
Setelah itu dibiarkan 2 hari kemudian dirajang dan dikeringkan menggunakan
oven pada suhu 60°C hingga kering dan disortasi kering. Rimpang yang telah dik
eringkan diserbuk menggunakan blender. Ekstrak etanol rimpang lempuyang
gajah dibuat dengan cara maserasi menggunakan etanol 96% (1:10). Serbuk
kering rimpang lempuyang gajah sebanyak 500 g direndam dengan etanol 96%
sebanyak 5000 mL. Serbuk direndam sambil sekali-kali diaduk dan didiamkan
selama 24 jam. Maserat dipisahkan dan proses diulangi 2 kali dengan jenis dan
jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan
vacuum rotary evaporator. Hasil penguapan, diuapkan kembali menggunakan
water bath untuk memperoleh ekstrak yang kental.
Kemudian dilakukan analisis profil metabolit sekunder dengan HPLC
Sebanyak 100 mg ekstrak lempuyang gajah dilarutkan dalam 10 ml etanol,
kemudian disaring menggunakan filter dengan ukuran pori membran 0,22 µm.
Sebanyak 10 µl sampel diinjeksikan dalam fase terbalik HPLC dengan fase diam
silica C18 dan fase gerak campuran asetonitril:metanol:asam phospat 0,05%.
Elusi dilakukan secara isokratik dan gradien. Elusi secara isokratik dengan fase
gerak asetonitril:metanol:asam fosfat 0,05% (35:20:45). Elusi gradien dimulai dari
menit ke-0 perbandingan (25:25:50), menit ke -2 (30:30:40), menit ke-4

12
(35:20:45), menit ke -6 (50:10:40), menit ke-7 (35:10:55), menit ke-9 (50:10:40).
Kecepatan alir 1,0 ml/menit, Rt 15 menit. Peak dibaca pada panjang gelombang
254 nm. Tiap daerah dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Analisis data tiga
dimensi untuk mendapatkan λmax dari masing-masing peak .

Gambar 2. Optimasi fase gerak HPLC pada ekstrak etanol rimpang lempuyang
gajah (Widyaningrum, 2012)
Keterangan: Gambar A= optimasi elusi isokratik; B= optimasi elusi gradien
dengan komposisi tabel B; C= optimasi elusi gradien dengan komposisi tabel C;
D= optimasi elusi gradien dengan komposisi tabel D

13
 Hasil yang diperoleh (Gambar 2) yaitu Optimasi fase gerak HPLC
dilakukan untuk mendapatkan pemisahan yang optimal dari senyawa dalam
ekstrak. Elusi secara isokratik dengan fase gerak asetonitril:metanol:asam fosfat
0,05% (35:20:45) belum memberikan resolusi yang baik (Gambar 4 A). Elusi
gradien dilakukan untuk meningkatkan resolusi dan mempersingkat waktu retensi
dengan cara meningkatkan komposisi asetonitril karena kekuatan elusinya paling
tinggi di antara ketiga fase gerak tersebut. Peak pada Rt 7 belum memiliki resolusi
yang baik sehingga perbandingan asetonitril diturunkan setelah menit ke 7 agar
mendapatkan resolusi yang lebih baik. Komposisi perbandingan yang optimal
didapatkan pada gambar D dimana antar peak memiliki resolusi yang baik
(Gambar 4 D). Komposisi fase gerak yang diperoleh dari optimasi yaitu campuran
fase gerak antara asetonitril: metanol: asam fosfat 0,05% dengan elusi gradien
dimulai dari menit ke -0 perbandingan (25:25:50), menit ke -2 (30:30:40), menit
ke-4 (35:20:45), menit ke -6 (50:10:40), menit ke -7 (35:10:55), menit ke-9
(50:10:40) dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit, Rt 15 menit, dan volume injeksi
10 µl.
Ekstrak lempuyang gajah yang menunjukkan peak paling banyak
diperoleh dari rimpang asal Merapi Farma Yogyakarta (11 peak) kemudian Pasar
Gede Surakarta (10 peak) dan B2P2TOOT Tawangmangu (7 peak) (Gambar 3).

Gambar 3. Gambar 3. Pola kromatogram ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah

asal Merapi Farma Yogyakarta, Pasar gede Solo dan BP2T2OO T
Tawangmangu

14
Keterangan: peak yang dilingkari adalah peak yang selalu muncul pada ketiga
ekstrak

Peak karakteristik yang selalu muncul pada ketiga ekstrak sebanyak 6

peak pada waktu retensi 2,62; 3,26; 4,31; 8,14; 12,21 dan 13,25 menit. Setiap
ekstrak memiliki jumlah peak yang berbeda dengan % area yang berbeda pula
(Tabel 3). Keberadaan senyawa pada ketiga ekstrak etanol rimpang lempuyang
gajah bedasarkan prosentase areanya dibagi 2 yaitu senyawa mayor untuk
prosentase senyawa > 4% dan senyawa minor untuk senyawa yang memiliki
prosentase senyawa < 4%. Ekstrak asal Merapi Farma menunjukkan adanya 6
senyawa mayor sedangkan pada ekstrak asal Pasar Gede menunjukkan 9 peak
mayor serta pada ekstrak asal B2P2TOOT Tawangmangu menunjukkan 7 peak
mayor (gambar 3). Hal ini menunjukkan adanya variasi kandungan metabolit
sekunder dalam ekstrak etanol rimpang lempuyang gajah.
Setelah dilakukan analisis tiga dimensi, diperoleh data seperti yang tertera
pada tabel 1. Hasil penelitian menunjukkan adanya senyawa polar dan nonpolar
pada ketiga ekstrak lempuyang gajah. Hal ini menunjukkan variasi kandungan
metabolit sekunder.
Tabel 1. Hasil Kromatogram Ekstrak Etanol Rimpang Lempuyang Gajah
(Widyaningrum, 2012)

15
 DAFTAR PUSTAKA

Christian G.D. 2003 Analytical Chemistry Sixth. John Wiley & Sons Inc: New
York

Mulja, M. 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press: Surabaya

Sastrohamidjojo. 2005. Kromatografi. Universitas Gadjah Mada: Yogyakarta

Skoog, D.A., Holler, F.J., dan West, D.M. 1994. Analytical Chemistry. Six
Edition. Hardcourt Grace College: Florida

Underwood, A.L. 1996. Analisis Kimia Kuantitatif 554 Penerbit Erlangga:

Jakarta

Watson, D. G. 1999. Pharmaceutical Analysis. Churchill Livingstone: Edinburg

Gholib, I. dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar:

Yogyakarta.
Putra, Effendy. 2002. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi.
Makalah. Jurusan Farmasi. Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas
Sumatera Utara.
Baboo, P. 2016. How HPLC can Hel in Agriculture. Tersedia pada
[Link]
n_Agriculture. Diakses pada tanggal 17 April 2019)
Widyaratna. 2015. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Makalah. Jurusan
Farmasi. Universitas Darussalam Gontor, Ngawi
Lestari. 2014. Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskilen dalam Plasma Darah
secara In Votro dengan KCKT. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta
Widyaningrum. 2012. Penentuan Profil Metabolit Sekunder Ekstrak Etanol
Rimpang Lempuyang Gajah (Zingiber Zerumbet (L.) J.E. Smith) Dengan
KLT dan KCKT. Skripsi. Fakultas Farmasi. Universitas Muhammadiyah,
Surakarta

16