Disusun oleh : Sudiman

1. Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom juga merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode ini
memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang berupa campuran dengan berat
beberapa gram. Kelemahan metode ini adalah diperlukan eluen yang cukup besar, waktu elusi
untuk dapat menyelesaikan pemisahan sangat lama, deteksi hasil pemisahan tidak dapat langsung
dilakukan (masih memerlukan KLT). Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik
pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat
diletakkan pada ujung atas kolom. Eluen atau pelarut dialirkan secara kontinu ke dalam kolom.
Dengan adanya gravitasi atau karena bantuan tekanan, maka eluen/pelarut akan melewati kolom
dan proses pemisahan akan terjadi. Seperti pada umumya, eluen/pelarut akan digunakan dimulai
dari yang paling non polar dan dinaikkan secara gradien kepolarannya hingga pemisahan dapat
terjadi. Sama halnya pada KLT, pemisahan dapat terjadi karena adanya perbedaan afinitas
senyawa pada adsorben dan perbedaan kelarutan senyawa pada eluen/pelarut (Endarini, 2016).

Ketika sampel diletakkan di ujung kolom, seketika itu juga sudah terjadi peristiwa
adsorpsi oleh permukaan adsorben yang berbatasan dengan sampel. Eluen yang dialirkan secara
kontinu ke dalam kolom akan menyebabkan adanya peristiwa adsorbsi dan desorpsi senyawa-
senyawa pada sampel. Molekul-molekul senyawa akan dibawa ke bagian bawah kolom dengan
kecepatan yang bervariasi bergantung pada besarnya afinitas molekul tersebut pada adsorben dan
juga pada besarnya kelarutan molekul tersebut dalam eluen/pelarut. Cairan yang keluar dari
kolom ditampung dan dilakukan analisis menggunakan KLT untuk melihat hasil pemisahannya
(Endarini, 2016).

Pada kromatografi kolom, hal-hal yang paling berperan dalam kesuksesan pemisahan
adalah pemilihan adsorben dan eluen/pelarut, dimensi kolom yang digunakan serta kecepatan
elusi yang dilakukan (Endarini, 2016).

Adsorben yang umum digunakan selain SiO2 dan selulosa adalah alumina, yang tersedia
dalam bentuk asam, basa atau netral. Adsorben ini dianjurkan hanya dipakai untuk senyawa-
senyawa organik yang stabil. Pemilihan adsorben dan bentuknya (asam, basa atau netral) sangat
penting untuk menghindari reaksi yang dapat terjadi di dalam kolom yang tidak diinginkan
selama proses elusi berlangsung, misalnya alumina asam dapat menimbulkan reaksi dehidrasi
alkohol tersier dan bentuk basanya dapat mengakibatkan reaksi hidrolisis ester atau reaksi
kondensasi aldol pada aldehida. Adsorben lain yang umum dipakai adalah silika gel, yang
terutama digunakan untuk memisahkan senyawa organik yang tidak memiliki kestabilan yang
memadai untuk dipisahkan menggunakan alumina (Endarini, 2016).

Jumlah adsorben yang digunakan bergantung pada tingkat kesulitan pemisahan dan pada
jumlah sampel yang akan dipisahkan. Secara umum diperlukan 30-50 gram adsorben untuk tiap
gram sampel yang akan dipisahkan. Jumlah tersebut bisa mencapai 200 gram adsorben jika
pemisahan yang dilakukan cukup sulit. Dibutuhkan jumlah adsorben yang lebih sedikit untuk
memisahkan senyawa-senyawa yang perbedaan polaritasnya sangat besar (Endarini, 2016).

Eluen/pelarut yang digunakan, umumnya adalah campuran dua macam pelarut. Pada awal
elusi dimulai dengan eluen yang paling nonpolar yang akan membawa senyawasenyawa yang
kurang terikat pada adsorben (yang paling nonpolar). Sepanjang proses elusi, komposisi eluen
dapat divariasi dengan jalan menambahkan secara gradien pelarut yang lebih polar. Dengan
demikian, senyawa-senyawa juga hanya akan terelusi ke arah bawah kolom secara berurutan
berdasarkan kepolarannya. Adalah komposisi yang pertama dari eluen yang memiliki
kemampuan elusi terkuat. Oleh karena itu sepanjang elusi proporsi pelarut yang lebih polar
dinaikkan dengan jalan menambahkan pelarut yang lebih polar ke dalam pelarut yang kurang
polar secara eksponensial (Endarini, 2016).

Kolom yang digunakan untuk keperluan pemisahan ini, pada bagian bawahnya biasanya
dilengkapi dengan plat kaca masir (bisa juga digunakan glas wool atau kapas bebas lemak) baik
dalam bentuk fix ataupun mobile yang berguna untuk melewatkan eluen secara bebas tetapi yang
juga dapat menghambat keluarnya adsorben dari kolom. Buret dapat juga digunakan untuk
keperluan ini, dengan menambahkan kaca masir atau glass wool di bagian bawah buret. Jumlah
adsorben yang dimasukkan ke dalam kolom sedemikian rupa sehingga memenuhi tinggi kolom
10 kali diameter kolom, biasanya juga disisakan ruang kosong di atas adsorben tersebut kira-kira
10 cm untuk sampel dan pelarut (Endarini, 2016).

Kecepatan elusi sebaiknya dibuat konstan. Kecepatan tersebut harus cukup lambat
sehingga senyawa berada dalam keseimbangan antara fasa diam dan fasa gerak, sebaliknya jika
kecepatan elusi ini terlalu kecil, maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam eluen dan akan
menyebabkan pita makin lama makin lebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung
dengan baik. Kecepatan elusi yang besar dapat dilakukan jika yang akan dipisahkan adalah
campuran senyawa yang memiliki kepolaran yang sangat berbeda (Endarini, 2016).

Tahap yang paling sulit dalam kromatografi kolom adalah pengisian kolom dengan
adsorben. Pengisian tersebut harus sehomogen mungkin dan harus benar-benar bebas dari
gelembung udara. Permukaan adsorben juga harus benar-benar horisontal untuk menghindari
terjadinya cacat yang dapat terjadi selama proses elusi berjalan. Untuk itu yang pertama harus
diperhatikan adalah menempatkan kolom pada posisi yang benar-benar vertical (Endarini, 2016).

2. Kromatografi Cair Vakum

Isolasi sembrenoid lebih lanjut dengan kromatografi cair vakum, semuanya memakai
silika gel 60 (63-200 µm, Merck), dilakukan oleh kelompok yang sama (Coll dkk. 1977b,
Bowden dkk. 1978) sebelum uraian rinci mengenai cara ini dipublikasikan (Targett dkk. 1979).
Targett memperkenalkan modifikasi cara ini untuk mencegah pembentukan saluran artinya
sistem dirancang untuk bekerja pada kondisi vakum terus menerus. Akan tetapi, kromatografi
cair vakum untuk fraksinasi ekstrak tumbuhan secara kasar berhasil baik tanpa modifikasi ini
(Pelletier dkk. 1985) dan dengan demikian alat dipertahankan sesederhana mungkin. Cara asli
Coll dkk. (1977a) menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek, sedangkan
Target dkk. (1979) menggunakan kolom yang lebih panjang untuk meningkatkan daya pisah
(Hostettmann, 1986).

Kolom kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT 10–40 um)
dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut
yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom
dihisap sampai kering dan sekarang siap dipakai. Cuplikan, dilarutkan dalam pelarut yang cocok,
dimasukkan langsung pada bagian atas kolom atau pada lapisan prapenjerap (tanah diatomae,
celite, dsb.) dan dihisap perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom,
dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah
lalu kepolaran ditingkatkan perlahan - lahan , kolom dihisan sampai kering pada setiap
pengumpulan fraksi . Oleh karena itu kromatografi cair vakum menggunakan tekanan rendah
untuk meningkatkan laju aliran fase gerak . Berbeda dengan metode yang menggunakan tekanan
pada bagian atas kolom untuk meningkatkan laju aliran , mengotak - atik kolom ( mengubah
pelarut dsb . ) mudah karena kepala kolom berada dalam tekanan atmosfer Kelompok Targett
menguji sistem kromatografi cair vakum memakai 1 g campuran d - fenkon ( 9 ) dan d - kamfor (
Targett dkk . 1979 ) . Pemisahan dilakukan pada 50 g silika gel ( 10 - 40 um , kolom 140 x 32
mm ) dengan pengelusi eter petroleumetil asetat 99 : 1 . Pemisahan garis alas dicapai dalam
waktu 2 jam (Hostettmann, 1986).

Alkaloid dapat dipisahkan dengan mudah dan cepat dengan cara kromatografi cair vakum
( Pelletier dkk . 1985 ) . Misalnya , campuran alkaloid ( 1 g ) dari fraksi pH 9 dan pH 12 ekstrak
Aconitum columbianum ( Ranunculaceae ) dikromatografi cair vakum pada aluminium oksida
60 - 65 g ( H basa , mutu KLT , Merck ) , Elusi dengan toluena - kloroform 1 : 4 menghasilkan
talatizamina ( 11 ) 265 mg dan elusi dengan kloroform - metanol 19 : 1 menghasilkan
kamakonina ( 12 ) 247 mg ( Pelletier dkk . 1985 ) (Hostettmann, 1986).

Campuran yang berasal dari sintesis alkaloid dapat dipisahkan pula dengan berhasil baik
dengan kromatografi cair vakum ( Pelletier dkk . 1985 ) . Pelletier menyatakan bahwa cara ini
bukan saja memerlukan pelarut sedikit tetapi juga lebih baik daripada kromatografi kilat dan
kromatografi kolom kering ( Pelletier dkk . 1985 ) . Diterpenoid dari rumput laut coklat Dictyota
dentata dipisahkan dari ekstrak diklorometana - metanol 2 : 1 dengan kromatografi cair vakum
memakai silika gel mutu KLT ( Alvarado dan Gerwick 1985 ) . Senyawa yang sudah dikenal
pakidiktiol A dielusi dengan pentana diklorometana 55 : 45 , diikuti oleh senyawa baru diktiol H
( 13 ) ketika dielusi dengan diklorometanaetil asetat 9 : 1 . Kemudian diterpena lain yang sudah
dikenal dielusi secara murni dengan diklorometana - etil asetat 85 : 15 dan 80 : 20 . Pemurnian
akhir senyawa 13 dilakukan dengan KCKT preparatif (Hostettmann, 1986).
 Daftar Pustaka

Endarini, L. H. (2016). Farmakognosi dan Fitokimia. Jakarta: Pusdik SDM Kesehatan. Halaman
161-167.

Hostettmann, M., dkk. (1986). Cara Kromatografi Preparatif. Bandung: Penerbit ITB. Halaman
33-35.