Analisis Matriks Biologi dengan

TLC - Densitometry
 Pendahuluan
• TLC (thin layer chromatography) dan HPTLC (high performance thin layer chromatography)
digunakan dalam analisis kandungan senyawa
• Digunakan dalam bidang biomedis untuk identifikasi kadar dari analit dalam matriks biologi.
Analit tersebut adalah :
 Asam Amino
 Protein
 Karbohidrat
 Lipid
 Asam Empedu
 Obat-obatan
 Vitamin
 Porfirin
• TLC scanner yang digunakan dalam teknik kromatografi lebih dikenal sebagai Densitometer
 Sejarah KLT/TLC
• Metode ini dirintis tahun 1938 oleh Izmailov dan Schraiber, kemudian tahun 1958
dikembangkan oleh Stahl
• Instrumen scanning densitometri menggunakan pengukuran absorbansi atau fluoresensi
dengan mode refleksi atau transmisi, yang pertama kali muncul pada pertengahan tahun
1960. Awalnya dilaporkan oleh MSJ Dallas dkk. (Dallas et al. 1964) dan K. Genest (Genest
1965).
• Sejak saat itu, densitometri telah mengalami perubahan terus menerus, terutama dengan
pengenalan teknologi baru seperti kamera video solid-state dan pengolahan gambar
(Belchamber dan Brinkworth pada tahun 1988).
• S. Levi dan Reisfeld adalah tokoh yang mengangkat metode densitometrik ke tingkat analisis
kuantitatif ultramikro. Keduanya berhasil meneliti testosteron dalam cairan biologis pada
rentang kadar 1–250 ng, LSD pada kadar 2–150 ng, dan kolesterol 4–150 ng dengan
pengukuran pendaran pada noda (kromatogram) KLT
 TLC – Densitometry : Pengertian
• Kromatografi lapis tipis ( Thin Layer Cromatography ) adalah adalah salah
satu analisa kualitatif dari suatu sampel yang akan di deteksi dengan
memisahkan komponen-komponen sample berdasarkan kepolaran

• Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan

interaksi radioelektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada
KLT

• Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar
(flouresensi)
 TLC – Densitometry : Kelebihan
• Kemurnian dan kadar tinggi dari senyawa contoh tidak diperlukan. Pada
HPLC, pengotor akan membahayakan kolom dan mempengaruhi
pemisahannya
• TLC relatif tidak mahal dan mudah dikerjakan
• Bisa dilakukan pemisahan dan penentuan kuantitatif secara paralel dalam
satu waktu
• Memungkinkan dengan volume sampel yang besar. Memungkinkan
mengkromatografi beberapa cuplikan sekaligus, sehingga waktu yang
dibutuhkan untuk jumlah sampel yang banyak dapat lebih singkat
• Memonitor proses suatu reaksi
• Jumlah cuplikan dan pelarut yang digunakan relatif kecil
 TLC – Densitometry : Kriteria

• Harus dapat terdeteksi pada kromatogram, dapat dilarutkan dan dapat

dielusi dengan fase gerak

• Tidak bersifat volatile, sehingga tidak menguap selama proses elusi dan
pengeringan plat KLT

• Harus stabil selama proses kromatografi (cahaya, udara atau pelarut yang
digunakan)
 Kondisi Kromatografi pada Aplikasi Biomedis (1)

• TLC merupakan metode pemisahan berdasarkan sifat fisikokimia, yang

pemisahan komponenennya terdistribusi diantara dua fase

• Fase diam (stationary phase) dengan luas permukaan besar dan Fase gerak
(mobile phase) yang akan melalui fase diam

• Kecepatan migrasi dari komponen partikulat pada fase diam berdasarkan

kemampuannya berikatan (afinitas)
 Kondisi Kromatografi pada Aplikasi Biomedis (2)

• Persentase publikasi TLC/HPTLC dalam bidang biomedical, 25 tahun

terakhir meliputi bahan-bahan tersebut
• Analisis TLC terutama lebih sering digunakan dalam analisis obat dan asam
amino
 Kondisi Kromatografi pada Aplikasi Biomedis (3)

• TLC secara skematik untuk pemisahan komponen berdasarkan retensi bahan

biomedical
 Tipe Analisis KLT
KLT digunakan secara luas untuk analisis larutan organik, terutama dalam bidang biokima,
farmasi, klinis, forensik

Analisis Kuantitatif – KLT -

Analisis Kualitatif – KLT Densitometri
• Pemisahan komponen dalam TLC • Analisis kuantitatif dengan KLT dapat
berdasarkan perbandingan laju migrasi dilakukan dengan mengukur bercak pada
(kemampuan berikatan/afinitas terhadap lempeng dengan menggunakan ukuran luas
fase gerak dan kepolaran) atau dengan teknik densitometri.

• Faktor retensi (Rf) merupakan nilai yang

digunakan untuk membandingkan
karakteristik dan kandungan dari berbagai
sampel
 Analisis Kualitatif
• Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu retensinya, atau
dilakukan penyarian dari bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji secara
spektroskopi.

• Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya dapat diuji.

 TLC untuk Identifikasi
• Umumnya parameter yang digunakan Rf
• Totolkan, jika ada senyawa pembanding
• Gunakan lebih dari satu sistem eluen/fase gerak
• Jika perlu gunakan fase diam yang berbeda
• Jika mungkin gunakan penampak bercak yang khas
• Dapat digunakan data Rf dari pustaka sebagai pembanding
• Dapat menggunakan KLT Scanner (densitometer) untuk melihat identitas
analit
• Jika perlu, dapat mengerok noda dan dilakukan identifikasi secara
fisikokimia
 TLC – Densitometry : Prinsip

• Prinsip penentuan dengan metode desintometri hampir sama dengan

metode spektrofotometri

• Penetuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area / luas noda pada
KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding dengan metode KCKT atau
KGC, sebab area noda kromatogram diukur pada posisi diam atau "zig-zag"
menyeluruh

• Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan

kadar yang sangat kecil yang yang merupakan hasil pemisahan dengan KLT
 Parameter Retensi

• Nilai faktor retensi adalah antara 0 (zat terlarut tetap pada awal) dan 1 (zat terlarut
bergerak dengan bagian depan fase gerak)
• Agar mendapatkan nilai-nilai RF yang tepat, keadaan di ruang chamber harus tetap
konstan
 Sistem Kromatografi

• Probabilitas untuk pemisahan sangat mampu ditingkatkan dengan

pemilihan yang tepat dari sistem kromatografi untuk analit tertentu. Hal
tersebut mengacu pada kedua fase diam dan fase gerak
• Jika fase diam berasal dari polaritas yang lebih tinggi daripada fase gerak,
sistem kromatografi disebut sistem fase normal (NP)
• Jika fase gerak berasal dari polaritas tinggi dibanding fase diamnya, sistem
ini disebut fase terbalik (RP)
• Pemisahan Representatif dalam bidang biomedis dapat saja di kedua
system, NP dan RP
Peralatan pada Analisis TLC (1)
 Peralatan pada Analisis TLC (2)
Kromatografi Lapis Tipis terdiri dari
o Plat : Kaca, Alumunium, Plastik
o Adsorben : Silika Gel, Alumina, Selulosa, dll

Macam-macam adsorben di pasaran

 SILIKA GEL: SiOH, SiO2 (Sifat polar)
 Silika gel G (mengandung pengikat gipsum CaSO4: 5-15% )
 Silika gel S (mengandung pengikat starch =pati)
 Silika gel GF254 (mengandung pengikat gipsum & indikator fluoresensi timah
cadmium sulfida/mangan timah silikat aktif, yang berfluoresensi pada 254 nm)
 Silika gel H/silika gel N (tanpa mengandung pengikat) biasanya untuk
kromatografi vakum
 Silika gel F254 (tanpa pengikat, tp mengandung indikator floresensi)
 Silika gel PF 254 & 366 (untuk pemisahan preparatif & mengandung indikator
floresensi)
• Alumina Al2O3
 Kurang polar dibanding silika gel
 Almunina basa, netral, asam
 Alumina G, F, H, P
 Fase Diam

• Pembuatan plat TLC (ketebalan lapisan> 2,0 mm) diperoleh dengan

menggunakan bubur silika, alumina, Kiese lguhr, dan selulosa atau
kombinasi mereka dalam proporsi yang berbeda di piring kaca (20 x 20, 10
x 20 atau 5 x 10 cm) dengan bantuan alat penyebaran lapisan.

• Piring Precoated HPTLC juga telah digunakan.

• Ukuran partikel sebagian besar sorben yang tersedia secara komersial

adalah sekitar 20-50 μm untuk TLC dan 5-15 μm untuk HPTLC.
 Mekanisme KLT pada Fase Diam Silika/Alumina

• Adsorbsi senyawa pada adsorben/penjerap/fase diam

• Kompetisi fase gerak & solut untuk berikatan dengan fase diam, dimana
solut lepas dari permukaan fase diam => desorbsi

• Senyawa dielusi oleh eluen/pengembang/fase gerak

 Fase Gerak
• Selain memilih fase diam (TLC plate), memilih eluen pengembang kromatografi
lapis tipis (KLT) juga merupakan faktor yang berpengaruh besar, karena hanya
beberapa kasus solvent pengembang yang hanya terdiri dari satu komponen saja
• Pada umumnya campuran larutan pengembang KLT (solvent system) bisa sampai
enam komponen dengan perbandingan tertentu
• Dalam pelaksanaannya, yang paling sulit dilakukan adalah bagaimana memilih
solvent system/fase gerak yang cocok agar komponen senyawa terpisah baik
• Cara memilih fase gerak KLT bisa dilakukan sendiri dengan orientasi dari beberapa
komponen pelarut dan perbandingan. Namun demikian untuk mendapat hasil
yang memuaskan juga butuh waktu lama
• Optimasi fase gerak KLT dengan mengambil dari literatur
 Larutan/Eluen KLT (Fase Gerak)
Fungsi campuran eluen
Syarat eluen KLT pengembang KLT :

• Kemurnian yang memadai • Melarutkan campuran bahan

• Stabilitas yang memadai • Mengangkut bahan untuk dipisahkan pada
• Viskositas rendah lapisan fase diam (sorben)
• Partisi/pemisahan linier • Memberikan nilai hrf senyawa yang
• Tekanan uap sedang terpisah
• Daya toksik yang serendah mungkin • Memberikan selektivitas yang memadai
untuk campuran bahan untuk dipisahkan.
 Development Techniques
Conventional TLC HP-TLC
• Ukuran partikel 20 µm • Ukuran partikel 5µm
• Fase gerak bergerak sejauh 10-15cm • Fase gerak bergerak jauh 3-6cm
• Pengembangan fase gerak dilakukan • Pengembangan fase gerak dilakukan
dari bawah ke atas dari bawah ke atas
• Hanya sebagian kecil plat tercelup • Hanya sebagian kecil plat tercelup
pada fase gerak mula-mula pada fase gerak mula-mula
• Dilakukan pada chamber yang sudah • Dilakukan pada chamber yang sudah
dijenuhkan dengan uap dari fase dijenuhkan dengan uap dari fase
gerak gerak
 Development Techniques
Two dimensional keuntungan
development

Sampel ditotolkan di
salah satu sudut plat
Resolusi tinggi
• Dapat digunakan untuk
Dielusi pada fase
memisahkan 150-300 senyawa
gerak I
Kapasitas spot tinggi
Plat diputar 90˚ • Seluruh bagian plat digunakan

Variasi kombinasi fase gerak

Dielusi pada fase
gerak II
 Development Techniques
Overpressurized Development keuntungan
Fase gerak dipompakan ke Waktu pemisahan lebih
dalam fase diam singkat

Berada dalam suatu sistem

tertutup Laju alir fase gerak konstan
dan dapat diatur
Laju alir dapat dikontrol
Hasil kromatografi dapat
Resolusi maksimum pada flow dijadikan acuan lansung
rate yg sama untuk HPLC
 Development Techniques
Thin Layer Rod/Stick
Multiple development Chromatography

Sampel dan fase

diam dielusi pada
Fase diam
fase gerak I ditempatkan di
sebuah tube kaca
Berguna dalam
pemisahan
Plat dikeringkan
komponen dengan
nilai Rf < 0.5

Biasa digunakan
Dielusi pada fase
gerak II
Plat dikeringkan untuk identifikasi
 Development Techniques
Circular and Anticircular keuntungan

Fase diam
ditempatkan pada Jumlah sampel yang
penyangga
berbentuk lingkaran dapat dielusi.

Sampel ditotolkan di
sisi dalam lingkaran Hemat waktu

Fase gerak dialirkan

dari tengah lingkaran
ke arah luar
Hemat fase gerak
Perlengkapan TLC/KLT (1)

Gambar chamber yang

digunakan Lempeng
 Perlengkapan TLC/KLT (2)

Automatic development chamber (ADC 2) for Horizontal developing chamber for separations in the
programmable development with a normal or normal and sandwich tank configuration with a saturated
sandwich chamber configuration (Camag). or unsaturated vapor phase (Camag). This chamber also
allows development from both edges to the center
simultaneously to increase sample throughput.
 Perlengkapan TLC/KLT (3)

Automated multiple development chamber A rotation planar chromatograph (Chromatron) for the
(AMD 2) for programmable incremental preparative fractionation of reaction mixtures and natural
multiple development with a decreasing products. The separation layer is typically cast on the
solvent strength gradient (Camag). specially designed rotor before the start of the separation
(Harris Research).
 Perlakuan pada Chamber
• Chamber harus dijenuhkan terlebih dulu selama lebih kurang 30 menit dengan
bantuan kertas saring

• Penguapan dari fase gerak dari permukaan lempeng, dalam chamber yang tidak
jenuh akan menghasilkan Rf yang lebih besar, reproducibility hasil keterulangan Rf
tak bagus dan permukaan fase gerak akan konkap

• Fase gerak yang tidak mau campur dengan sempurna akan menghasilkan chamber
yang tidak jenuh
Perlengkapan HPTLC (1)
 Perlengkapan HPTLC (2)

ViewPix flatbed scanner (Biostep) The TLC visualize for recording thin-layer separations by image
analysis (Camag)

The RITA (Raytest), left, and AR-200 (Eckert & Ziegler Radiopharma),
Bioluminizer for effects-directed detection using right,radiochromatography scanners using a gas filled proportional
luminescent bacteria on thin- layer chromatography detector. Proportional detectors can be used for the detection of all
plates to detect toxic compounds (Camag). radioisotopes
 Perlengkapan HPTLC (3)

The Nanomat 4 contact transfer applicator

Linomat 5 semi-automatic spray-on sample
using disposable glass capillary dosimeters
applicator (Camag).
(Camag).
 Perlengkapan HPTLC (4)

The Autospotter, a semi-automated contact ATS 4 automatic sample applicator for contact
transfer spotter (Analtech) transfer and spray-on sample application
(Camag).
 Perlengkapan HPTLC (5)

TLC–MS interface for the in situ elution of

separated zones on thin-layer plates and their
transport to a mass spectrometer for analysis
Analytic Lissy-TLC pipetting robot sample (Camag)
applicator (Zinsser)
 Lempeng/Plat HPTLC

• Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi) atau KLTKT

(kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif
(butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk analisis kuantitatif

• Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat digunakan densitometer baik

menggunakan pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan pelacak
sinar ultraviolet, sinar tampak maupun sinar fluoresensi.
 Cara Ekstraksi
Bercak pada lempeng
Lapisan yang diambil
yang dilihat dibawah sinar kemudian diambil lapisan
dimasukkan ke dalam
UV diberi tanda (lingkari) tipis bersama bercaknya
gelas piala,
dengan ujung pensil,

ditambah pelarut yang Disaring Kedalam labu

sesuai (etanol/ diaduk, dan setelah larut, takar, volume sampai
kloroform), tepat tanda ( 10,0 ml).

Karena pengenceran
Larutan yang didapat diuji
merupakan faktor penting
Larutan siap diuji dengan dengan spektrofotometer
untuk perhitungan kadar
alat spektrofotometer pada panjang gelombang
senyawa yang diuji secara
serapan maksimumnya
kuantitatif segala caranya
 Kurva Hubungan Serapan & Kadar (1)

Persamaan Kubelka-Munk
• Korelasi kadar analit yang dirajah terhadap area kromatogram tidak
merupakan garis lurus
• Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan intensitas semula (I0) jatuh
pada permukaan lapisan tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan
tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut akan:
 direfleksikan (Is)
 diserap oleh analit lapisan tipis (I)
 diteruskan (It).

I  I0  I S  It
 Kurva Hubungan Serapan & Kadar (2)

• Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan

lapis tipis (E), yang dinyatakan sebagai :
IS  I  E

• Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai.

Selanjutnya akan didapat :
I0  I  IS
I 0  I  I  E  I  E   I

• Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka
akan berlaku hukum Lambert Beer seperti pada spektrofotometri

I t  I 0  e  kx
 Kurva Hubungan Serapan & Kadar (3)

E = koefisien permukaan lapis tipis

I t  I 0  e  kt
Hukum Lambeert Beer  I t  I 0  e  kx
• x = tebal medium lapis tipis
• k = koefisien absorbsi
• e-kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik yang melewati medium 
“Optical Density”

Parameter S (koefisien Penghamburan)

 Kurva Hubungan Serapan & Kadar (4)

• I = radiasi elektromagnetik yang arahnya tegak lurus menuju permukaan lapis tipis
• j = radiasi elektromagnetik yang arahnya meninggalkan permukaan lapis tipis
• S = faktor hamburan untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis
• K = faktor penyerapan/absorpsi untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis
• X = tebal lapisan untuk tiap satu satuan tebal lapis tipis

• Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-densitometri dikenal parameter :

 K (koefisien absorbsi)
 S (koefisien penghamburan)
• Karena adanya parameter S inilah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk
medium lapis tipis yang dihamburkan oleh partikel-partikel fase diam
 Parameter S (koef. Penghamburan)

• Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke medium lapis tipis

• Sx adalah koefisien penghamburan yang nilainya berbeda untuk tiap plat
• Sx berkisar antara 0–10

 S  K   I  S j
dl

dx
 S  K   I  S j
dl

dx
 Pernyataan Kubelkan - Munk
I  R  2
 E
C
2R S

E = absorbsi radiasi elektromagnetik oleh analit pada pelat KLT

C = kadar analit
R = cahaya terpantul pada permukaan lempang

• Korelasi area analit dengan kadar dinyatakan sebagai kurva parabola :

A 2  f C 
log A  f log C 
 Cara Scanning Pengujian Kuantitatif

A. Cara Memanjang
Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga bercak hanya dideteksi
sepanjang garis tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnya
baik bila bercak berbentuk bulat semetris

B. Sistem Zig-Zag
Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu Y tetapi berbelok -belok
sampai garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2 dan
X1-X2
 Pelacakan Bercak (1)
• Cara pelacakan bercak dengan TLC scanner :
 Model zig-zag (a)
 Model Lurus (b)

• Kelebihan penggunaan metode zig-zag lebih merata pengukurannya, apalagi delta

Y menggunakan jarak terkecil
• Kelemahannya waktu lebih lama, tetapi ketelitian pengukuran lebih terjamin
dibanding penggunaan metode pengamatan lurus
 Pelacakan Bercak (2)
• Besarnya bercak, dari X1 sampai X2 lebih besar dari garis tengah bercak agar semua bercak
teruji
• Delta Y, selisih garis kesatu dan kedua makin kecil makin rata pengukurannya, antara 0,001
sampai 0,1 mm, kode yang diberikan angka 1 sampai dengan 3
• Simbul Y tergantung dalam meletakkan lempeng terhadap arah scanning, (lihat panah) sesuai
garis Y, dan garis tegak lurus Y adalah garis X
• Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas
area (mikrovolt) yang tertera merupakan besaran puncak. Kadang-kadang prosentase yang
tertulis hanya merupakan kadar relatif dari puncak yang muncul (tergambar)
• Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak semitris akan kurang teliti sebab konsentrasi
terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak bercak
• Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan molekul senyawa untuk mengumpul ditengah
lebih banyak
lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan noda
pada KLT secara :

1. Absorpsi

2. Transmisi

3. Pantulan (refleksi) pendar fluor

4. Pemadaman pendar fluor

Bagan Alat Densitometer (1)
 Bagan Alat Densitometer (2)
• Lampu D2 (Deuterium) dipakai untuk pengukuran pada daerah ultra violet dan lampu tungstein pengukuran pada
daerah sinar tampak
• Lampu busur Hg bertekanan tinggi dipakai untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor
• Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau absorpsi dan retleksi pada panjang gelombang maksimal
Sumber Radiasi

• Monokromator dipakai monokromator kisi difraksi

Monokromator

• Detektor yang umum dipakai pada densitometer yaitu detector PMI' (Photo Multiplier Tube = Tabung
Penggandaan Foton)
• Photomultiflier tersebut dapat memperbesar tenaga beda potensial listrik sehingga mampu menggerakan
integrator
• Integrator dengan sistem mikrokomputer secara langsung dapat menghitung luas puncak atau tinggi puncak
Detektor secara otomatis. Selain itu mencatat nomer urut, kedudukan puncak pada ordinal Y atau waktu retensinya
Jalannya Sinar (Optik)
 Jalannya Sinar (Optik)
• TLC scanner dengan software CAT berfungsi untuk mengevaluasi hasil
densitometer dari plat KLT dan elektroforesis objek dengan kisaran spektra
190-800nm, scanning terjadi dengan proses refleksi atau transmisi
dibanding dengan absorbansi atau fluresensi yang memudahkan
pembilasan nitrogen untuk scanning dibawah 200nm
 Cara Kerja
diuji kedudukan
setiap bercak pada
Lempeng yang telah
sumbu(X,Y). agar lempeng ditempat kan
digunakan untuk Instrumen dihidupkan
sinar dapat tepat pada satu garis searah Y
pemisahan.
mengenai pusat
bercak

Panjang gelombang gerakan lempeng diatur

bila belum diketahui
diprogram agar terjadi sesuai kedudukan
dilakukan scanning lebih bercak diatur,
serapan secara bercak, menggunakan
dulu
maksimum, mikrokomputer

Letak sumbu Y dan X sumbu X tegak lurus p Dengan cara itu mereka
dari lempeng akan Y disesuaikan dengan atau merupakan akan mendekati
mempengaruhi hasil arah gerak eluen deretan penotolan kepastian/nilai yang
yang diperoleh sampel pada lempeng. sebenarnya
 Pendahuluan
• Gemifloxacin mesilat adalah antibiotik baru golongan fluorokuinolon yang
digunakan untuk infeksi pernafasan dan saluran kemih. Beberapa fluorokuinolon
terkadang diberikan bersamaan dg obat lain seperti teofilin, warfarin dan
omeprazol.

• Penelitian ini bertujuan mengembangkan dua metode kromatografi yaitu KLT

densitometri dan HPLC yg selektif, sensitive dengan LoQ yg baik dlm menentukan
kadar obat gemifloxacin mesilat pd plasma manusia jika diberikan bersamaan
dengan obat lain seperti teofilin, warfarin dan omeprazol.

• Penelitian ini meliputi Validasi Metode Analisa kedua metode (KLT dan HPLC) dg
parameter uji linearitas, Limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ),
recovery, selektivitas, akurasi dan presisi.

• Bahan: Plasma manusia

• Internal standar (IS): Ciprofloxacin

 prosedur
• Kondisi KLT:
Untuk pengembangan pelat, digunakan fase gerak campuran diklorometan, metanol dan amonia dg
rasio (7: 5,5: 3 v/v/v).
Scanning densitometri dilakukan pd 254 nm. Sampel difiltrasi dg filter 0,45 µm. fase diam berupa
pelat silika gel 60F254 dengan luas 20 cm x 20 cm, ketebalan 250 μm. Pelat dicuci terlebih dahulu dg
metanol dan diaktivasi pd suhu 600C selama 5 menit. Spot diteteskan dg jarak antar spot 1,5 cm dan
2 cm dari batas bawah pelat. Chamber gelas berukuran 25 cm x 25 cm disaturasi dg fase gerak
selama 45 menit dan panjang pengembangan pelat 180 mm.

• Kondisi HPLC:
Kolom X-terra LC-18-DB (25 cmx4,6mmx5μm). Suhu 250C.
Fase gerak: asetonitril: bufer K2HPO4 (10:90) yg ditambahkan 1% TEA. Detektor UV 254 nm.

• Preparasi sampel untuk KLT densitometri:

Dalam sebuah tube sentrifugasi, masukkan sejumlah aliquot 500 μl plasma darah yang dispike dg 50
μl ciprofloksasin (IS100 μg/mL) dan 450 μl campuran gemifloxacin, teofilin, warfarin dan omeprazol
berbagai konsentrasi.
Lakukan pengendapan protein dan ekstraksi dilakukan dg menggunakan 1 ml asetonitril. Sampel
kemudian disonikasi 10 menit lalu vortex 5 menit dan sentrifugasi 5000 rpm 15 menit. Lapisan
organik dipindahkan ke tube dan evaporasi hg kering suhu 400C. Residu dilarutkan dlm 0,05 mL
metanol dan sebanyak 20 µL diaplikasikan ke pelat KLT.
 Hasil
Validasi Metode Analisa
 Linearitas:
kedua metode menunjukkan kurva kalibrasi yg linear
dg nilai koefisien korelasi (r) > 0,999.
 Akurasi, presisi:
kedua metode menunjukkan nilai koefisien variasi
(%CV) kurang dari 15%.
 Sensitivitas (gemifloxacin, theophylline, warfarin
dan omeprazole):
 KLT  Nilai LLOQ 0.1, 0.5, 0.2 and 0.1 µg/mL
Nilai LOD 0.033, 0.15, 0.06 and 0.033 µg/mL
 HPLC  nilai LLOQ 0.05, 0.25, 0.1 dan 0.1 µg/mL
nilai LOD 0.0165, 0.0825, 0.033 dan 0.033
µg/mL
 Recovery: kedua metode menunjukkan %recovery
> 88%.
 Selektivitas (KLT)
• Selektivitas: kedua metode menunjukkan
sistem dapat memisahkan baik sampel
(gemifloxacin, teofilin, warfarin, omeprazol)
dan ofloxacin (internal standar) A

• KLT: Nilai Rf ciprofloxacin (IS), gemifloxacin, B

C D
E
teofilin, warfarin dan omeprazol yaitu 0.16 ±
0.051, 0.28 ± 0.042, 0.53 ± 0.037, 0.58 ±
0.022 dan 0.74 ± 0.031
Densitogram KLT blanko sampel plasma manusia Densitogram KLT sampel plasma manusia yg dispike
(A) gemifloxacin, (B) ciprofloxacin, (C) teofilin, (D) warfarin, (E) omeprazol
 Selektivitas (Hplc)

Kromatogram HPLC blanko sampel plasma manusia Kromatogram HPLC sampel plasma manusia yg dispike
(A) gemifloxacin, (B) ciprofloxacin, (C) teofilin, (D) warfarin, (E) omeprazol
 kesimpulan
• Hasil pengembangan metode analisis, baik KLT
densitometri maupun HPLC, menunjukkan
selektivitas dan sensitivas yang baik dalam
menganalisis kadar gemifloxacin mesilat pada
plasma manusia dg keberadaan obat-obatan
lain seperti teofilin, warfarin dan omeprazol
 menjadi alternatif metode analisis

• Dari sisi ekonomi, kedua metode tersbt lebih

ekonomis, mudah dan lebih cepat
• Uji skrining dan determinasi senyawa Kodein menggunakan TLC yg dihubungkan dg
spektofotodensitometri  identifikasi analit berdasarkan kesesuaian nilai hRfc terkoreksi
(hRfc) dan bentuk spektrum analit dg senyawa yg terdapat pd data library.
• hRfc diperkenalkan oleh Zeeuw dan dikembangkan oleh The International Association of
Forensic Toxicologist (TIAFT).
• Metode hRfc diinisiasi oleh adanya perubahan nilai Rf dan hRf senyawa yg sama krn bbrp
faktor jumlah analit yg ditotolkan pd plat, jarak elusi, tingkt kejenuhan bejana pengembang,
suhu analisis dan kelembaban.
• Kodein adlh alkaloid yg diperoleh dr opium, dpt ditemukan pd penggunaan heroin ilegal (3-
asetilkodein). Didlm tubuh, asetilkodein dimetabolisme mjd Kodein  marker kasus
penggunaan heroin.
 Cont...
• Bahan: sampel plasma manusia yg mngandung 2000 ng standar kodein dlm btk
base, fase diam Silika gel 60 F254, dg penyangga alumunium silika gel 60 F254
ukuran 10 cmx10 cm. Fase gerak: TAEA (toluen, aseton, etanol, amonia pekat 25%
• Larutan standar: morfin, kodein, kafein, papaverin, bromheksin dilarutkan dlm
metanol (konsentrasi masing2 200 ng/mL)

• Prosedur:
Plasma Pengenda
p protein
Supernatan
manusia Sentrifug di+ buffer Kocok dg Sentrifugasi
mgandg 1 mL 3000 rpm
asi 2000 Na shaker
2000 ng isopropan hg trbtk
rpm bikarbonat 30 menit
standar ol dua lapisan
5 menit pH 9,3 dan 3000 rpm
kodein klorofom

Fase
Dilarutkan
organik
dlm metanol
diuapkan
suhu
600C

Plat Al TLC
jarak antar spot 10 mm
 Hasil

Resolusi standar kodein, morfin, kafein,

papaverin dan bromheksin pada plat AL-TLC
Hasil uji in vitro pd plasma
manusia, diperoleh persen
recovery 77,13% dengan
nilai koefisien variasi 6,4%

Metode
TLC
spektrofoto
-
densitomet
ri dpt
digunakan
untuk uji
skrining
dan
determinas