A.

JUDUL :

KROMATOGRAFI KOLOM DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Isolasi Kurkumin Dari Kunyit (Curcuma Longa L)

B. TUJUAN :
Pada akhir percobaan mahasiswa harus dapat :
1. Melakukan dan menjelaskan teknik-teknik dasar kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis
2. Menjelaskan prinsip dasar kromatografi
3. Melakukan isolasi campuran senyawa sampai pemurniannya sampai
kromatografi kolom

C. DASAR TEORI

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya

dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponennya. Alat yang digunakan
terdiri atas komponennya. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan
fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke dalam kolom dari ujung satu
dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil).
Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang
ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam
(stasioner) (Takeuchi Yoshito, 2009).

Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung

beberapa rapa sifat fisiknyasifat fisika umum dari molekuli molekul. Sifat utama yang terlibat
langsung ialah: (1) kecendrungan molekul untuk melekat . Sifat utama yang terlibat langsung
ialah: (1) kecendrungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi
penyerapan), (2) kecendrungan molekul untuk melarut dalam cairan (klerutan), dan (3)
kecendrungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatisirian). Pada
sistem kromatografi, campuran yang akan dipisahkan ditempatkan dalam keadaan demikian
rupa sehingga kaomponen-komponennya harus menunjukkan dua dari ketiga sifat tersebut
(Gritter,1991:1).
 Komponen-komponen utama kromatografi adalah fasa stasioner dan fasa mobil dan
kromatogarfi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme
pemisahannya,seperti ditunjukkan pada table dibawah ini
Kriteria Nama
Kromatografi cair, kromatografi
Fase mobil gas kromatografi adsorpsi,
kromatografi partisi
Kromatografi pertukaran ion,
Mekanisme
kromatografi gel
Kromatografi kolom, kromatografi
Fase stasioner
lapis tipis, kromatografi kertas
(Takeuchi, Yoshito, 2009).
Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi
sepanjang kolom (atau, seperti dalam kromatografi kertas atau lapis tipis, ekivalen fisik
kolom), dan tentu saja dasar pemisaha terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk
larutan yang berbeda. Kita boleh menganggap laju perpindahan sebuah zat terlarut sebagia
hasil dari dua faktor, yang satu cendrung menggerakkan zat terlarut itu dan yang lain
menahannya. Dalam proses asli tswett, kecendrungan zat-zat terlarut untuk menyerap pada
fasa padat menahan pergerakan mereka, sementara kelarutannya dalam fasa cair bergerak
cendrung menggerakkan mereka. Perbedaan yang kecil antara dua zat terlarut dalam kekuatan
adsorpsi dan dalam inetraksinya dengan pelarut yang bergerak menajdi dasar pemisahan bila
molekul-molekul zat terlarut itu berulang kali menyebar di antara dua fasa itu ke seluruh
panjang kolom (Underwood, 2002:487).
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pada dasarnya sangat mirip dengan kromatografi
kertas, terutama pada cara melakukannya. Perbedaan nyata terlihat pada media pemisahnya,
yakni diguankannya lapisan tipis adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, aluminium
atau plastik sebagai pengganti kertas. Lapisan tipis adsorben ini pada proses pemisahan
berlaku sebagai fasa diam. (Soebagio, 2000:85).
Teknik KLT dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schaiber. Adsorbent
dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak
akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai
kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitive.
Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang
terpisahkan. (Khopkar, 2010: 164).
Kromatografi kolom adalah merupakan pilihan yang baik jika ingin memisahkan
campuran senyawa yang masih dalam bentuk ekstrak. Alasannya adalah lebih murah dan
tidak memakan waktu yang lama. Hasil dari pemisahan menggunakan kolom kromatografi
ini bisa berupa fraksi-fraksi yang masih berupa campuran, dan bisa juga menghasilkan
senyawa yang telah murni. Kadang kala hanya dengan menggunakan kolom kromatografi,
target pemisahan campuran telah berhasil dilakukan tapi akan mengalami kesulitan jika
campuran yang akan dipisahkan itu jumlahnya sedikit, karena ada kecenderungan campuran
tersebut akan tertinggal pada fase diam (Ismiarni, 2010).
Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan
adalah kapasitas yang mamadai untuk menerima sampel-sampel tanpa melamapaui fasa
diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang-
kurangnya sepuluh kali ukuran diameternya. Bahan pengemasnya, suatu adsorsben seperti
alumina atau mungkin suatu resin pertukaran ion, dimasukkan dalam bentuk suspense ke
dalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam di dalam hamparan basah dengan sedikit cairan
tetap berada di atas permukaannya. Keran dibuka, dan permukaan cairan dibiarkan turun
sampai mencapai puncak permukaan hamparan kemudian porsi kecil dari larutan sampel
dipipet dengan hati-hati ke atas puncak permukaan hamparan. Larutan efluen keluaran
dikumpulkan dalam sederatan fraksi volume yang tidak merepotkan. Larutan tersebut dapat
menetes jatuh ke dalam sebuah gelas beker atau tabung uji tiap kali telah terkumpul sejumlah
volume tertentu (Underwood, 2002:547).
D. Alat Dan Bahan
1. Alat
N0 Nama Alat Kategor Gambar Fungsi
. i
1. Labu Erlenmeyer 1 Sebagai wadah titrat pada
saat mlakukan titrasi

2. Gelas Kimia 1 Srbagai wadah untuk

melarutkan,mencampurka
n, dan memanaskan
larutan

3. Gelas Ukur 1 Sebagai wadah untuk

mengukur volume larutan

4. Kertas saring 1 Untuk menyaring destilat

antara residu dan filtrate

5. Corong 1 Untuk memisahkan

larutan dari wadah satu ke
wadah yang lain

6. Pipa kapiler 1 Untuk menentukan titik

leleh
7. Batang Pengaduk 1 Untuk mengaduk larutan
8. Spatula 1 Untuk mengambil bahan
kimia berupa padatan

9. Kaca Arloji 1 Sebagai wadah penguapan

10. Neraca Analitik 2 Untuk mengukur bahan

kimia baik berupa padatan
dan larutan

11. Penangas 2 Untuk memanaskan

larutan

12. Statif dan Klem 1 Sebagai penyangga dan

penjepit kondensor

13. Kondensor 1 Untuk mendinginkan air

yang mengalir

14. Labu Leher Tiga 1 Sebagai labu destilat

15. Pipet tetes 1 Untuk mengambil dan
meneteskan larutan dalam
skala kecil

16. Termometer 1 Untuk mengukur suhu

larutan

17. Stopwatch 1 Untuk menghitung waktu

18. Pinset 1 Untuk menjepit KLT pada

saat mentotolkannya ke
dalam campuran larutan

19. Plat KLT 1 Untuk menguji KLT

rumpang kunyit

20. Kolom 1 Untuk uji kromatografi

kolom

21. Cover Glass 1 Sebagai wadah plat KLT

 2. Bahan

No Nama Bahan Kategori Sifat Fisik Sifat Kimia

1. Rumpang Kunyit Umum
Kering
2. Diklorometana Khusus
3. Metanol Khusus
4. n-Heksana Khusus
5. Silika Gel Khusus
6. Aquadest Umum
E. PROSEDUR KERJA

1. Isolasi kurkumin dari kunyit

Rimpang Kunyit Diklorometana

- Menimbang sebanyak 20 gr - Mengukur sebanyak 50

ml

- Memasukkan kunyit 20 gr + 50 ml diklorometana

kedalam labu destilasi

- Merefluks selama 1 jam

- Menyaring

Filtrate Residu

- Memasukkan kedalam labu destilasi

- Menambahkan 20 ml n-heksana
- Mengaduk hingga homogen
- menyaring

Filtrate Residu
2. Uji kromatografi lapis tipis

Residu (ekstrak)
kunyit

- Mengambil sedikit residu (ekstrak kunyit) dan

meletakkan pada kaca arloji

- Menambahkan beberapa tetes methanol

- Menotolkan campuran ekstrak kunyit + methanol

pada plat KLT yang telah dipotong dan digaris
pada bagian tengan menggunakan pipa kapiler

- Mencelupkan plat KLT pada campuran CH2Cl :

MeOH (97 : 3 dan 99 : 1)

- Mendiamkan hingga noda kuning

- Melihat hasil noda yang terbentuk dibawah

lampu uv

- Menghitung nilai Rf

Nilai Rf
 F. HASIL PENGAMATAN
No Perlakuan Pengamatan
A Kromatografi Lapis Tipis
1. Menimbang 20 gr rimpang kunyit - 20 gr rimpang kunyit
2. Mengukur 50 ml diklorometana - dikloromrtana telah di ukur 50 ml
3. Memasukkan diklorometana ke dalam
labu destilasi
4. Memasukkan kunyit ke dalam labu - larutan berwarna jingga
destilasi yang berisi diklorometana
5. Merefluks larutan tersebut selama satu - larutan telah direfluks
jam
6. Menyaring larutan tersebut - filtrat berwarna kuning, dan residu
berwarna kuning kecoklatan
7. Melakukan destilasi sampai suhu 50°C - residu berwarna kuning kemerahan
8. Mencampurkan residu dengan 20 ml n- - ekstrak tidak larut, terbentuk endapan
heksan dan di aduk sampai merata berwarna kuning kemerahan
9. Menyaring campuran dengan kertas - filtrat berwarna kuning dan terpisah dari
saring endapan
10 Melarutkan endapan dengan metanol -lautan berwarna kuning
secukupnya
11 Mentotolkan warna dari larutan pada - terbentuk titik warna kuning pada salah satu
KLT yang telah di potong dan di garis garis
12 Mencelupkan KLT pada campuran - KLT mulai basah dan totolan membentuk
CHCl2 dan Me-OH pada perbandingan garis ke arah atas
99:1 dan 97:3 tepat pada garis yang di
beri totol
13 Mendiamkan hingga noda 97:3 kering
14 Menghitung nilai Rf - Rf = jarak noda / jarak pelarut
 Pada 99:1
0,5 / 4,6 = 0,1086

 Pada 97:3
2,6 / 3,2 = 0,8125
B Kromatografi Kolom
1. Menimbang 5 gr silica gel dengan - 5 gr silica gel
menggunakan neraca analitik
2. Melarutkan dengan n-heksan dalam - larutan silica gel + n-heksan
gelas kimia
3. Melakukan packing kolom sampai padat
4. Memasukkan kapas sebagai filter di
dalam kolom - kapas berada di dalam kolom
5. Memasukkan silica gel ke dalam kolom
bersama n-heksan
6. Membuka keran tetes pertetes hingga - butir silica gel bersama n-heksan di dalam
kolom padat, jika belum terus kolom
mengulangi dengan menambahkan
kembali dengan larutan yang keluar dari - silica gel berada dalam kolom menjadi
kran kertas pada waktu cukup lama
7. Mengambil endapan kunyit atau ektrak - kurkumin telah tercampur dengan silica gel
kurkumin (sisa percobaan KLT) dan
mencampurkan dengan silica gel
8. Memasukkan dua spatula campuran - kurkumin berada di atas silica gel
kurkumin dan silica gel ke dalam kolom
9. Menambahkan campuran CH2Cl2 dan - larutan pada kolom dari bening menjadi
Me-OH dengan perbandingan 97:3 kuning pudar
10. Menambahkan terus menerus campuran - silica gel yang berada di dalam kolom
berubah menjadi warna orange
11. Menampung larutan di dalam botol vial - larutan berubah warna menjadi bening
dan menambahkan terus menerus kembali
larutan CH2Cl2 dan Me-OH (97:3)
12. Mendiamkan larutan yang telah di - terbentuk padatan berupa kristal warna
tampung selama ± 2 hari orange pada dinding botol vial dan larutan
semakin sedikit sampai mengering
 G. PEMBAHASAN

Pada percobaan ini adalah percobaan tentang kromatografi dimana Kromatografi

adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya dengan bantuan
perbedaan sifat fisik masing-masing komponennya. Teknik yang digunakan adalah
kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom, dimana percobaan ini adalah
pengisolasian kurkumin dari kunyit.

 KLT

Pada teknik ini untuk pengisolasian kurkumin dari kunyit digunakan diklorometana.
Senyawa organik yang terkandung dalam kunyit cenderung bersifat non polar karena itu
diklorometana yang merupakan pelarut bersifat non polar digunakan. Interaksi antar molekul
non polar ini akan melarutkan senyawa yang terkandung dalam kunyit termasuk kurkumin.
Kemudian larutan kunyit + diklorometeana ini de refluks. Proses refluks bertujuan untuk
mengekstrak kurkumin. Suhu larutan ketika refluks jangan terlalu tinggi supaya semua
kurkumin dapat terekstrak sempurna. Selanjutnya di saring, Setelah penyaringan vakum
dilakukan distilasi pada penangas air. Distilasi ini bertujuan untuk menguapkan
diklorometana sehingga terbentuk residu kuning kemerahan. Lalu residu dicampurkan dengan
20 ml n-heksan Penambahan n-heksana bertujuan menjenuhkan larutan yang nantinya akan
memadatkan residu serta berfungsi untuk menggumpalkan campuran menjadi padat dan
memisahkan dari pelarut selanjutnya disaring menggunakan penyaringan vakum Penyaringan
dimaksudkan agar diperoleh kurkumin murni berupa padatan yang tertinggal (residu) pada
saringan vakum.

Selanjutnya adalah melakukan uji KLT yakni dengan menggunakan plat KLT yang
sudah di potong dan di garis caranya mentotolkan residu yang telah dilarutkan dengan
metanol menggunakan pipa kapiler pada plat KLT tepat di tengah garis , Lalu eluen yang di
gunakan sebagai pelarut adalah CHCl2 dan Me-OH dengan perbandingan 99:1 dan 97:3. Dari
hasil ini kami mendapatkan dua titik noda berwarna kuning. Data yang diperoleh dari KLT
preparatif adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf dapat
didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak
yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Pada percobaan komponen yang berada dalam
larutan yang diuji bergerak dengan eluen dan menimbulkan bercak warna. Pelarut dapat
mencapai bagian atas dari lempengan, sedangkan bercak akan timbul sebelum batas atas
lempengan. Pengukuran nilai Rf berlangsung sebagai berikut:
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Nilai Rf yang kami dapatkan dari percobaan ini adalah 0,10 pada perbandingan 99:1
sedangkan pada perbandingan 97:3 adalah sebesar 0,81. Menurut data pada literatur, Rf
kurkumin berada diantara 0,2-0,4, tergantung fasa gerak dan diam yang digunakannya. Dapat
di lihat dari perbandingan antara nilai Rf kurkumin berdasarkan literatur dengan nilai Rf yang
kami peroleh dari praktikum adalah berbeda.
 Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom berprinsip pada perbedaan kecepatan migrasi masing-masing
komponen untuk memisahkan senyawa-senyawa yang tercampur di dalamnya. Semua
kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan
fase gerak (berupa cairan atau gas). Fasa diam pada percobaan ini adalah silika gel (SiO
2) yang bersifat polar. Sifat polar ini dikarenakan adanya gugus hidroksil pada permukaan
silika gel sehingga bila senyawa polar dilewatkan, akan terikat dengan gugus hidroksil
tersebut dalam 2 cara yaitu ikatan hidrogen dan interaksi dipol-dipol. Fasa gerak dalam
percobaan ini yaitu CHCl2 dan Me-OH = 97 : 3 yang bersifat non-polar
Proses pembuatan kolom harus dilakukan dengan hati-hati. Terjadi beberapa kali
cracking atau kerusakan kolom dikarenakan eluen yang digunakan menguap dan membentuk
gelembung pada kolom. Pembalutan kapas atau kertas yang diberi aseton dapat
menghilangkan gelembung udara. Aseton yang menguap dengan menyerap energi panas dari
tabung menyebabkan kolom akan kehilangan energi dan mengalami penurunan suhu
sehingga gelembung udara akan naik ke permukaan. Selain itu, juga untuk memudahkan
proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. Di dalam kolom di masukkan kapasa hal
ini bertujuan sebagai filter di dalam kolom.
Lalu mengambil ekstrak kurkumin (sisa percobaan KLT) dan mencampurkan dengan
silica gel dan dimasukkan ke dalam kolom sebanyak dua spatula, selanjutnya memasukkan
larutan CHCl2 dan Me-OH dengan perbandingan 97:3 ini digunakan karena merupakan fraksi
dari percobaan KLT sebelumnya, ketika ke dalam kolom di aliri dengan larutan ini fasa di
dalam kolom berubah menjadi kuning pudar.
Lalu menampung larutan yang keluar ke dalam botol vial dari hasil tampungan
sebanyak 10 botol vial masing-masing warna larutan dalam botol adalah berbeda-beda, yakni
warna merah kecokelatan, orange, dan, kuning kehijauan.
Selanjutnya adalah mendiamkan larutan selama beberapa hari sampai larutan dalam
botol vial tersebut mengering karena megalami penguapan, larutan ini mudah menguap
karena semua pelarut yang digunakan bersifat mudah menguap, pada saat kering di dalam
botol vial pada dinding botol terdapat kristal kurkumin yang berupa kristal padatan berwarna
orange akan tetapi tidak semua botol vial ini menghasilkan kristal hanya ada beberapa botol
saja hal ini dikarenakan larutan yang tertampung dalam botol vial tidak hanya kurkumin saja
tetapi ada senyawa lain penyusun dari kunyit dan pemisahan yang terjadi tidak merata.
Kemungkinan hal ini disebabkan oleh perbedaan laju dari tiap komponen sehingga Ada yang
masih tertinggal dari komponen
Komponen yang berwarna merah kecokelatan adalah demetoksi kurkumin, komponen
berwarna orange adalah bis-demetoksi kurkumin dan komponen berwarna kuning kehijauan
adalah kurkumin. Bila diurutkan dari segi kepolaran, yang paling polar adalah demetoksi
kurkumin, kurkumin, dan bis-demetoksi kurkumin. Berarti pada saat percobaan terjadi ikatan
hidrogen dengan kurkumin sehingga interaksi lemah dan membentuk ikatan antara kurkumin
dengan silika gel.

H. KESIMPULAN
Dari hasil percobaan yang dilakukan dapat disimpulkaan bahwa proses pemisahan
senyawa kurkumin dari kunyit dilakukan secara kromatografi kolom dan kromatografi lapis
tipis yang pada prinsipnya sama yaitu pemisahan komponen-komponen dalam senyawa
karena adsorbsi suatu padatan penjerap sebagai fasa diamnya dan eluen sebagai fasa
geraknya. Komponen yang terpisahkan pada kromatografi kolom berupa fraksi sedangkan
pada kromatografi lapis tipis berupa noda atau spot
 DAFTAR PUSTAKA

Denikrisna. 2010. Kromatografi. denikrisna. [Link]/category/bakul/

kromatografi/. Diakses pada 5 April 2016.

Gritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung : ITB

Ismiarni. 2010. Kromatografi (Dasar). [Link]/search/label/

chromatography. Diakses pada 5 April 2016.

JR, Ray,Day dan Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam.
Jakarta: Erlangga

Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. Malang: Universitas Negeri Malang.

Takeuchi Yoshito. 03-01-2009. Kromatografi. Online. [Link]

[Link]/materi kimia/kimia dasar/pemurnian-material/kromatografi/ . Diakses
tanggal 5 April 2016.