Darah dapat dibuat preparat apus dengan metode supra vital yaitu suatu metode untuk

mendapatkan sediaan dari sel atau jaringan yang hidup. Sel-sel darah yang hidup
dapat mengisap zat-zat warna yang konsentrasinya sesuai dan akan berdifusi ke dalam
sel darah tersebut, selanjutnya zat warna akan mewarnai granula pada sel bernukleus
polimorf (Anonim, 2012).

Tujuan pemeriksaan sediaan apus darah tepi antara lain menilai berbagai unsur sel
darah tepi seperti eritosit, leukosit, dan trombosit dan mencari adanya parasit seperti
malaria, tripanasoma, microfilaria dan lain sebagainya. Sediaan apus yang dibuat dan
dipulas dengan baik merupakan syarat mutlak untuk mendapatkan hasil yang baik
(Arjatmo Tjokronegoro, 1996).

Dasar dari pewarnaan Romanowsky adalah penggunaan dua zat warna yang berbeda
yaitu Azur B (Trimetiltionion) yang bersifat basa dan eosin y (tetrabromoflurescein)
yang bersifat asam. Azur B akan mewarnai komponen sel yang bersifat asam seperti
kromatin. DNA dan RNA. Sedangkan eosin y akan mewarnai komponen sel yang
bersifat basa seperti granula eosinofil dan hemoglobin. Ikatan eosin y pada Azur B
yang bergenerasi dapat menimbulkan warna ungu, dan keadaan ini dikenal sebagai
efek Romanowsky giemsa efek ini sangat nyata pada DNA tetapi tidak pada RNA
sehingga menimbulkan kontras antara inti yang berwarna untuk sitoplasma yang
berwarna biru (Arjatmo Tjokronegoro, 1996).

Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari kapiler atau
vena, yang dihapuskan pada kaca obyek. Pada keadaan tertentu dapat pula digunakan
darah EDTA. (Arjatmo Tjokronegoro, 1996)

Kriteria preparat yang baik :

1. Lebar dan panjangnya tidak memenuhi seluruh kaca benda sehingga masih ada tempat
untuk pemberian label.
2. Secara granulapenebalannya nampak berangsur-angsur menipis dari kepala ke arah
ekor.
3. Ujung atau ekornya tidak berbentuk bendera robek.
4. Tidak berulang-ulang karena bekas lemak ada di atas kaca benda.
5. Tidak terputus-putus karena gerakan gesekan yang ragu-ragu.
6. Tidak terlalu tebal (karena sudut penggeseran yang sangat kecil) atau tidak terlalu
tipis (karena sudut penggeseran yang sangat besar).
7. Pewarnaan yang baik (Imam Budiwiyono 1995).

Jenis Apusan darah:

1. Sediaan darah tipis

Ciri-ciri sediaan apus darah tipis yaitu lebih sedikit membutuhkan darah untuk
pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tebal, morfologinya lebih jelas,
dan perubahan pada eritrosit dapat terlihat jelas.

1. Ciri-ciri sediaan apus darah tebal yaitu lebih banyak membutuhkan darah untuk
pemeriksaan dibandingkan dengan sediaan apus darah tipis, jumlah selnya lebih
banyak dalam satu lapang pandang, dan bentuknya tak sama seperti dalam sediaan
apus darah tipis (Imam Budiwiyono 1995).

4.2 Diferential Count (Hitung Jenis Leukosit)

Untuk melakukan hitung jenis leukosit, pertama membuat sediaan apus darah
yang diwarnai dengan pewarna Giemsa, Wright atau May Grunwald. Amati di bawah
mikroskop dan hitung jenis-jenis leukosit hingga didapatkan 100 sel. Tiap jenis sel
darah putih dinyatakan dalam persen (%). Jumlah absolut dihitung dengan mengalikan
persentase jumlah dengan hitung leukosit, hasilnya dinyatakan dalam sel/μL.

Hitung jenis leukosit dilakukan pada counting area, mula-mula dengan

pembesaran 100x kemudian dengan pembesaran 1000x dengan minyak imersi. Pada
hitung jenis leukosit hapusan darah tepi yang akan digunakan perlu diperhatikan
hapusan darah harus cukup tipis sehingga eritrosit dan leukosit jelas terpisah satu
dengan yang lainnya, hapusan tidak boleh mengandung cat, dan eritrosit tidak boleh
bergerombol (Ripani,2010).
 Hitung jenis leukosit digunakan untuk mengetahui jumlah berbagai jenis leukosit.
Terdapat lima jenis leukosit, yang masing-masingnya memiliki fungsi yang khusus
dalam melawan patogen. Sel-sel itu adalah neutrofil, limfosit, monosit, eosinofil, dan
basofil. Hasil hitung jenis leukosit memberikan informasi yang lebih spesifik
mengenai infeksi dan proses penyakit. Hitung jenis leukosit hanya menunjukkan
jumlah relatif dari masing-masing jenis sel. Untuk mendapatkan jumlah absolut dari
masing-masing jenis sel maka nilai relatif (%) dikalikan jumlah leukosit total (sel/μl).

Hitung jenis leukosit berbeda tergantung umur. Pada anak limfosit lebih banyak
dari netrofil segmen, sedang pada orang dewasa kebalikannya. Hitung jenis leukosit
juga bervariasi dari satu sediaan apus ke sediaan lain, dari satu lapangan ke lapangan
lain. Kesalahan karena distribusi ini dapat mencapai 15%.

Bila pada hitung jenis leukosit, diperoleh eritrosit berinti lebih dari 10 per 100
leukosit, maka jumlah leukosit/µl perlu dikoreksi. Berikut ini merupakan beberapa
hasil yang mungkin diperoleh pada hitung jenis leukosit:

Netrofilia

Netrofilia adalah suatu keadaan dimana jumlah netrofil melebihi nilai normal.
Penyebab biasanya adalah infeksi bakteri, keracunan bahan kimia dan logam berat,
gangguan metabolik seperti uremia, nekrosia jaringan, kehilangan darah dan kelainan
mieloproliferatif.

Banyak faktor yang mempengaruhi respons netrofil terhadap infeksi, seperti

penyebab infeksi, virulensi kuman, respons penderita, luas peradangan dan
pengobatan. Infeksi oleh bakteri seperti Streptococcus hemolyticus dan Diplococcus
pneumonine menyebabkan netrofilia yang berat, sedangkan infeksi oleh Salmonella
typhosa dan Mycobacterium tuberculosis tidak menimbulkan netrofilia. Pada anak-
anak netrofilia biasanya lebih tinggi dari pada orang dewasa. Pada penderita yang
lemah, respons terhadap infeksi kurang sehingga sering tidak disertai netrofilia.
Derajat netrofilia sebanding dengan luasnya jaringan yang meradang karena jaringan
nekrotik akan melepaskan leukocyte promoting substance sehingga abses yang luas
akan menimbulkan netrofilia lebih berat daripada bakteremia yang ringan. Pemberian
adrenocorticotrophic hormone (ACTH) pada orang normal akan menimbulkan
netrofilia tetapi pada penderita infeksi berat tidak dijumpai netrofilia.
 Rangsangan yang menimbulkan netrofilia dapat mengakibatkan dilepasnya
granulosit muda keperedaran darah dan keadaan ini disebut pergeseran ke kiri atau
shift to the left.

Pada infeksi ringan atau respons penderita yang baik, hanya dijumpai netrofilia
ringan dengan sedikit sekali pergeseran ke kiri. Sedang pada infeksi berat dijumpai
netrofilia berat dan banyak ditemukan sel muda. Infeksi tanpa netrofilia atau dengan
netrofilia ringan disertai banyak sel muda menunjukkan infeksi yang tidak teratasi
atau respons penderita yang kurang.

Pada infeksi berat dan keadaan toksik dapat dijumpai tanda degenerasi, yang
sering dijumpai pada netrofil adalah granula yang lebih kasar dan gelap yang disebut
granulasi toksik. Disamping itu dapat dijumpai inti piknotik dan vakuolisasi baik pada
inti maupun sitoplasma

Eosinofilia

Eosinofilia adalah suatu keadaan dimana jumlah eosinofil melebihi nilai normal.
Eosinofilia terutama dijumpai pada keadaan alergi. Histamin yang dilepaskan pada
reaksi antigen-antibodi merupakan substansi khemotaksis yang menarik eosinofil.
Penyebab lain dari eosinofilia adalah penyakit kulit kronik, infeksi dan infestasi
parasit, kelainan hemopoiesis seperti polisitemia vera dan leukemia granulositik
kronik.

Basofilia

Basofilia adalah suatu keadaan dimana jumlah basofil melebihi nilai normal.
Basofilia sering dijumpai pada polisitemia vera dan leukemia granulositik kronik.
Pada penyakit alergi seperti eritroderma, urtikaria pigmentosa dan kolitis ulserativa
juga dapat dijumpai basofilia. Pada reaksi antigen-antibodi basofil akan melepaskan
histamin dari granulanya.

Limfositosis

Limfositosis adalah suatu keadaan dimana terjadi peningkatan jumlah limfosit

melebihi nilai normal. Limfositosis dapat disebabkan oleh infeksi virus seperti
morbili, mononukleosis infeksiosa; infeksi kronik seperti tuberkulosis, sifilis, pertusis
dan oleh kelainan limfoproliferatif seperti leukemia limfositik kronik dan
makroglobulinemia primer.

Monositosis

Monositosis adalah suatu keadaan dimana jumlah monosit melebihi nilai normal.
Monositosis dijumpai pada penyakit mieloproliferatif seperti leukemia monositik akut
dan leukemia mielomonositik akut; penyakit kollagen seperti lupus eritematosus
sistemik dan reumatoid artritis; serta pada beberapa penyakit infeksi baik oleh bakteri,
virus, protozoa maupun jamur.

Perbandingan antara monosit : limfosit mempunyai arti prognostik pada

tuberkulosis. Pada keadaan normal dan tuberkulosis inaktif, perbandingan antara
jumlah monosit dengan limfosit lebih kecil atau sama dengan 1/3, tetapi pada
tuberkulosis aktif dan menyebar, perbandingan tersebut lebih besar dari 1/3.

Netropenia

Netropenia adalah suatu keadaan dimana jumlah netrofil kurang dari nilai normal.
Penyebab netropenia dapat dikelompokkan atas 3 golongan yaitu meningkatnya
pemindahan netrofil dari peredaran darah, gangguan pembentukan netrofil dan yang
terakhir yang tidak diketahui penyebabnya.

Termasuk dalam golongan pertama misalnya umur netrofil yang memendek

karena drug induced. Beberapa obat seperti aminopirin bekerja sebagai hapten dan
merangsang pembentukan antibodi terhadap leukosit. Gangguan pembentukan dapat
terjadi akibat radiasi atau obat-obatan seperti kloramfenicol, obat anti tiroid dan
fenotiasin; desakan dalam sum-sum tulang oleh tumor. Netropenia yang tidak
diketahui sebabnya misal pada infeksi seperti tifoid, infeksi virus, protozoa dan
rickettisa; cyclic neutropenia, dan chronic idiopathic neutropenia.

Limfopenia

Pada orang dewasa limfopenia terjadi bila jumlah limfosit kurang dari nilai
normal. Penyebab limfopenia adalah produksi limfosit yang menurun seperti pada
 penyakit Hodgkin, sarkoidosis; penghancuran yang meningkat yang dapat disebabkan
oleh radiasi, kortikosteroid dan obat-obat sitotoksis; dan kehilangan yang meningkat
seperti pada thoracic duct drainage dan protein losing enteropathy.

Eosinopenia dan lain-lain

Eosinopenia terjadi bila jumlah eosinofil kurang dari nilai normal. Hal ini dapat
dijumpai pada keadaan stress seperti syok, luka bakar, perdarahan dan infeksi berat;
juga dapat terjadi pada hiperfungsi koreks adrenal dan pengobatan dengan
kortikosteroid.

Pemberian epinefrin akan menyebabkan penurunan jumlah eosinofil dan basofil,

sedang jumlah monosit akan menurun pada infeksi akut. Walaupun demikian, jumlah
basofil, eosinofil dan monosit yang kurang dari normal kurang bermakna dalam
klinik. Pada hitung jenis leukosit pada pada orang normal, sering tidak dijumlah
basofil maupun eosinofil.

4.3 Evaluasi Darah Tepi

Evaluasi darah atau disebut juga sebagai pemeriksaan gambaran darah tepi dapat
dilakukan di counting areal setelah melakukan pemeriksaan hitung jenis leukosit,
mula-mula dengan pembesaran 100X kemudian dengan pembesaran 1000 x dengan
minyak emersi selanjutnya dilihat masing-masing morfologi selnya. Pemeriksaan
hapusan darah tepi terdiri atas (Anonim, 2010)

Pemeriksaan dengan pembesaran kecil (objektif 10x).

1. Penilaian kwalitet hapusan darah dan penyebaran sel-sel dalam hapusan.

s Lapisan darah harus cukup tipis sehingga eryhtrosit dan leukosit jelas terpisah satu
dengan lainnya.
 s Hapusan tidak boleh mengandung cat.

s Eryhtrosit, leukosit dan thrombosit harus tercat dengan baik.

s Leukosit tidak boleh menggerombol pada akhir (ujung) hapusan.

1. Penafsiran jumlah leukosit dan eryhtrosit, penaksiran penghitungan differential

leukosit dan pemeriksaan apakah sel-sel ada yang abnormal. Dilakukan pada daerah
area penghitungan dari bagian hapusan tempat eryhtrosit terletak berdampingan, tidak
tertumpuk. Bila didapatkan 20-30 leukosit perlapang pandang kira-kira sesuai dengan
junlah leukosit 5.000 dan 40-50 perlapang pandang sesuai dengan leukosit 10.000.

Pemeriksaan dengan menggunakan minyak imersi (perbesaran 1000x)

a. Eryhtrosit
Penaksiran jumlahnya dan bagaimana morfologinya. Dillihat adanya eryhtrosit berinti
dan dihitung jumlahnya pada 100 leukosit untuk mengkoreksi hitung leukosit cara
Turk.

b. Leukosit
Penghitungan Differensial dan dicari kelainan morfologi. Dihitung dalam 100 sel
leukosit dan dilihat adanya kelainan selnya.

c. Thrombosit
Dilihat penyebaran, morfologi dan ukuran selnya. Hapusan yang baik thrombosit tidak
menggerombol pada bagian akhir hapusan. Bila sukar ditemukan thronbosit berarti
jumlahnya sedikit, bila terlihat banyak berarti terjadi peningkatan jumlah. Dilhat juga
adanya giant cell yang berukuran 6-8 mikron.

d. Sel abnormal : Pemeriksaan morfologi. Kelainan-kelainan dan variasi dari

leukosit, erythrosit dan thrombosit perlu dicatat.
Tujuan :

 Menilai unsur sel pada darah tepi : Eritrosit, Leukosit, Trombosit

 Mencari adanya parasit : Malaria, Mikrofilaria

Syarat Mutlak : Untuk mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik, sediaan hapus harus dibuat dan dipulas
dengan baik

Prinsip kerja :
Setetes darah dipaparkan diatas kaca objek lalu dicat dan diperiksa dibaqwah mikroskop

Alat :
kaca objek glass bebas lemak dan debu , kering dan bersih
rak pewarnaan
pipet pastuare
mikroskop

Bahan pemeriksaan :
darah kaviler
darah vena yang telah di beri antikoagulan (EDTA/ Ethylendiamine Tetraacetic Acid)

Reagen :
oil emersi
metanol
buffer
1 ml + 5 tetes giemsa induk

Cara kerja :

 objek glass harus kering, bebas air, bebas lemak, dan debu

 teteskan sedikit darah pada objek glass

 sentuh setetes darah dengan jarak kurang lebih 2cm dari ujung objek glass dan letakkan di
atas meja dengan setetes darah di sebelah kanan

 gerakkan tangan kanan pada objek glass lainnya di sebelah kiri tetes darah
  gerakkan darah sampai memcapai kurang lebih 1/2cm dari kaca

 dorong kaca penggeser ke kiri stabil memegang miring dengan sudut 30 - 40 derajat

 biarkan sediaan kering dan tulis nama penderita dan tanggal pembuatan

 lalu sediaan siap di warnai

Cara perwarnaan dengan Giemsa :

 letakkan sediaan yang akan di pulas di atas rak dengan lapisan darah ke atas

 teteskan beberapa tetes metanol ke atas sediaan hapusan sehingga bagian yang terlapis
darah tertutup semuanya , biarkan selama 5 menit

 tuanglah kelebihan metanol tadi

 lalu teteskan larutan giemsa yang telah di encerkan (1 ml + 5 tetes giemsa induk) biarkan
selama 15 -20 menit

 setelah itu bilas dengan air dan biarkan vertikal sampai kering

Nilai Normal :

 Basofil : 0 - 1 %

 Eosinofil : 1 -3 %
 Netrofil Stab : 2 - 6 %

 Netrofil Segmen : 50 - 70 %

 Limfosit : 20 - 40 %

 Monosit : 2 - 8 %