KLTP
KLT Preparatif digunakan untuk memisahkan bahan dalam jumlah gram,
namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram. Seperti halnya
KLT secara umum, KLT preparatif juga melibatkan fase diam dan fase gerak.
Fase diam berupa plat dengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk jumlah sampel
10-100 mg dapat dipisahkan dengan menggunakan KLT preparatif dengan
adsorben silica gel atau alumunium oksida dengan ukuran 20 20 cm dan tebal 1
mm. Jika tebalnya diduakalikan maka banyaknya sampel yang dapat dipisahkan
bertambah 50%. Seperti halnya KLT biasa, adsorben yang paling umum
digunakan pada KLT preparatif adalah silica gel. Adapun fase gerak atau eluen
yang digunakan disesuaikan dengan senyawa target yang akan diambil.
Pada percobaan kali ini digunakan fase diam berupa silica gel GF254 dan
fase gerak berupa n-butanol dan etanol dengan perbandingan 3:1. Sebelum
digunakan proses KLT, plat dikeringkan dulu di dalam oven untuk mengaktivasi
agar plat bebas dari molekul-molekul air yang terikat karena silica gel terdiri atas
gugus hidroksil sehingga mampu mebentuk ikatan hidrogen. Jumlah air yang
terikat tersebut sangat berpengaruh pada pemisahan karena air terikat sangat kuat
pada adsorben sehingga menghambat terjadinya keseimbangan dengan molekul-
molekul analit. Eluen n-butanol dan etanol dimasukkan ke dalam chamber dan
dijenuhkan selama 1 jam sebelum dilakukan elusi. Penjenuhan tersebut dilakukan
karena ketika fase gerak mulai naik ke fase diam sedapat mungkin tidak ada
penghalang atau gangguan. Jika chamber tidak jenuh maka di dalam chamber
masih terdapat udara dengan uap eluen, maka aliran eluen akan tertahan sehingga
menyebabkan pemisahan tidak berjalan dengan baik. Digunakan eluen n-butanol
dan etanol dengan perbandinga 3:1 karena paling cocok untuk menarik senyawa
tanin sesuai pada pemantaun KLT sebelumnya dan memiliki nilai Rf yang
mendekati tanin. Adapun fraksi yang digunakan adalah fraksi dengan
perbandingan 8:2, 7:3, 1:9, dan 0:10.
Sebelum ditotolkan pada plat KLT preparatif, fraksi tersebut dicampurkan
dalam vial dan dilarutkan terlebih dahulu dalam sedikit pelarut. Karena senyawa
target tanin mudah larut dan tertarik dalam pelarut etanol maka digunakanlah
pelarut etanol. Pelarut etanol baik digunakan karena mudah menguap sehingga
kemungkinan tidak terjadi pelebaran pita. Sedangkan jika pelarut yang digunakan
tidak mudah menguap maka akan terjadi pelabaran pita. Konsentrasi sampel juga
sebaiknya hanya 5-10%. Sampel yang ditotolkan harus berbentuk pita yang
sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga tergantung pada lebarnya
pita.
Setelah plat KLT preparatif dielusi, pita yang kedudukannya telah
diketahui dikerok dari plat. Pita yang seharunya diambil pada saat proses KLT
preparatif yaitu:
1. Pita yang memiliki warna dominan
2. Pita yang memiliki nilai Rf yang mendekati nilai literatur tanin yaitu 0,67
3. Diusahakan mengambil pita yang tidak ada tailingnya
Cara mengerok pita adalah dengan menggunakan ujung spatel pada pita
yang telah diberi tanda. Selanjutnya hasil kerokan yang mengandung senyawa
target dan silica gel diekstraksi dari adsorben dengan pelarut PA etanol 5:1 (5 mL
etanol untuk 1 gram adsorben). Makin lama senyawa kontak dengan adsorben
maka makin besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian.
Selanjutnya larutan dimasukkan ke dalam tabung efendrof dan tabung
sentrifuge. Disentrifuge selama 15 menit sehingga terbentuk fase filtrat dan
sentrat. Filtrat yang mengandung senyawa target tanin sedangkan sentrat
mengandung adsorben. Sehingga diperolehlah senyawa murni target.
Senyawa tanin pada praktikum memiliki nilai Rf sebesar 0,614 sedangkan
senyawa tanin pada literatur sebesar 0,67. Maka kedua nilai Rf berdekatan
sehingga sesuai. Semakin dekat nilai Rf dengan literatur maka akan semakin baik.
Rf merupaka parameter migrasi pada KLT. Rf (waktu tambat) adalah
waktu yang diperlukan untuk mengelusi maksimum suatu sampel dihitung dari
titik awal penotolan. Oleh karena itu bilangan Rf selalu kecil dari 1 karena daya
elusi fase gerak yang baik terletak antara 0,2 sampai 0,8.
Sebelum dikerok plat diamati pitanya di lampu UV 254 nm dan UV 366
nm. Pada lampu UV 254 nm sampel terlihat gelap sedangkan lempeng
berfluorosensi dan terlihat noda/pita. Penampakan pita tersebut karena adanya
daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluorosensi seperti timah
kadmium sulfida yang terdapat pada lempeng. Pada lampu UV 366 nm sampel
terlihat berfluorosensi sedangkan lempeng terlihat gelap. Penampakan pita karena
adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh
ausokrom yang ada pada pita tersebut.