Méthodes de

dosage des
protéines
Présenté par :

• Ouldamer Ikram
• Belhadi Fatima
• Ayadi Khaira
• Ramdan Ryad
Ahmed
• Benabed Fethi
• Bentayeb Ammar
1/Qu’est-ce qu’une
protéine ?
Les protéines sont des macromolécules
biologiques présentes dans toutes les
cellules vivantes. Ce sont des biopolymères
formés d’une ou de plusieurs chaînes
polypeptidiques. Chacune de ces chaînes est
constituée de l’enchaînement de résidus
d’acides aminés liés entre eux par des
liaisons peptidiques.
 2-A- leur rôle :
Production d’enzyme
Construction et réparation :
(rôle catalytique ) : sont des
elles participent à la croissance
protéines qui facilitent les
ou le développement des
réactions chimiques dans le
organes.
corps.

Fabrication d’hormone : Renforcement du système

immunitaire (les anticorps) : sont
par exemple l’insuline est
des protéines aident à protéger le
une protéine qui régule le
corps contre les infections, les
taux de sucre dans le sang. maladies, les bactéries et les
virus....

Transport et stockage : Support et structure : telles

certaines protéines comme que le collagène fournissent des
l’hémoglobine, transportent structures solides dans les tissus,
comme les os. Contribuant aussi
l’oxygéne dans le sang.
à la forme et la stabilité du corps.
2-B- Leur structure:
Les protéines sont composées de longues chaînes d'acides aminés liés
entre eux par des liaisons peptidiques. Leur structure se divise en
quatre niveaux : la structure primaire correspond à la séquence
d'acides aminés, la structure secondaire forme des motifs réguliers
comme les hélices alpha ou les feuillets bêta, la structure tertiaire
décrit le repliement tridimensionnel de la chaîne, et la structure
quaternaire concerne l'assemblage de plusieurs chaînes
polypeptidiques pour former une protéine fonctionnelle.

Cette organisation permet aux protéines d'accomplir leurs diverses

fonctions dans l'organisme.
Quelles sont les
principales
méthodes
utilisées pour
doser les
protéines ?
3/Principes généraux du
dosage des protéines:
3/a-But de dosage : Le but du dosage des protéines est de
déterminer leur concentration dans un échantillon, ce qui permet
d'évaluer leur présence et leur rôle dans des processus
biologiques spécifiques, comme la croissance cellulaire, la
production d'enzymes, ou l'analyse de maladies. Cette mesure est
essentielle pour comprendre les fonctions biologiques des
protéines, étudier leur expression dans des conditions
expérimentales, et contrôler la qualité des produits biologiques
dans divers domaines, tels que la biotechnologie, la médecine, et
la recherche scientifique
 4/Méthodes
colorimétriques:
a/ Réaction de Biuret : c’est une technique colorimétrique utilisée pour :
• Quantifier la concentration de protéines ou de peptides d’une solution.
• Détecter la présence ou l’absence de liaisons peptidiques dans
l’échantillon.

Principe : elle fonctionne sur le principe que les protéines contenant au moins deux
liaisons peptidiques peuvent réagir avec des ions Cuivre II (Cu2+) pour former un complexe
bleu_violet ; Cette réaction se produit dans un milieu alcalin, généralement crée par l’ajout
d’hydroxyde de Sodium (NaOH).

Ses étapes :
 Préparation du réactif Biuret.
 Prélèvement de l’échatillon protéique ( les échantillons doivent etre dissous dans un
solvant approprié, généralement de l’eau ou une solution tampon qui ne perturbe pas la
reaction ).
 Mise en susbension de l’échantillon protéique ( homogénéité ).
 Ajout du réactif biuret ( generally called Gornall ).
 Incubation : mélangez bien les solutions et laissez reposer à température ambiante
pendant environ 10 à 30 minutes ( La réaction ne nécessite pas de chauffage, car elle se
produit à température ambiante en milieu basique )
 Détermination de l’absorbance du complexe en utilisant un spectrophotométre .
Avantages et inconvénients :

Avantages :
 Méthode simple et rapide.
 Non spécifique aux types de protéines : peut être utilisée pour des mélanges complexes
de protéines, car elle réagit avec tous les types de protéines contenant des liaisons
peptidiques.
 Sensible à des concentrations relativement faibles de protéines.

Inconvénients :
 Interférences possibles : certaines substances (comme les agents réducteurs, les acides
aminés libres ou certains composés métalliques) peuvent interférer avec le test.
 Moins sensible que d'autres méthodes : comme la méthode de Bradford ou la méthode
de Lowry, qui peuvent être plus sensibles dans certains cas.

Conclusion :
La méthode de Biuret est un moyen fiable et largement utilisé pour mesurer la
concentration de protéines dans une solution. Elle repose sur une réaction colorimétrique,
et son principe est basé sur l'interaction entre les ions cuivre et les groupes peptidiques
des protéines. Avec un étalonnage approprié, cette méthode peut être utilisée pour
quantifier précisément les protéines dans divers échantillons biologiques.
b/ Méthode de Lowry : utilisée pour :
• Analyse sensible des protéines dans des échantillons dilués.
• Quantification des protéines dans des recherches fondamentales.
• Étude des interactions protéiques ou de la composition biochimique.

Principe : Basée sur la formation d’un complexe avec des ions Cu²⁺
suivie d’une réaction avec le réactif de Folin-Ciocalteu.
• Permet une haute sensibilité pour des analyses protéiques.
• Convient pour détecter des concentrations faibles de protéines.
• L’intensité colorimétrique est mesurée spectrophotométriquement.
Limites : Sensible aux interférences chimiques, et les étapes sont
complexes et longues.
c/ Méthode de Bradford : Elle est largement utilisée pour quantifier la
concentration des protéines dans une solution,
• Estimation rapide des concentrations protéiques pour des analyses
courantes.
• Quantification des protéines dans des échantillons cellulaires ou
biologiques.
• Préparation des échantillons pour l’électrophorèse ou la chromatographie.
Principe : Liaison des protéines au colorant bleu de Coomassie, entraînant
un changement de couleur mesurable à 595 nm.
Elle est basée sur l’interaction avec les acides aminés basiques et
hydrophobes.
• Permet de quantifier les protéines entre 0,1 et 1,4 mg/ml. Méthode rapide
et simple, idéale pour des analyses courantes.
Limites : La stabilité de la couleur est limitée à 15 minutes, et certains
tampons ou additifs peuvent interférer.
d/ Méthode de Kjeldahl : Les composés organiques contenant de l'azote
sont chauffés et décomposés à l'aide d'acide sulfurique et d'un catalyseur. Ce
catalyseur contient du sulfate de potassium, qui augmente la température
d'ébullition de l'acide sulfurique, et du sulfate de cuivre (CuSO4), qui agit comme
catalyseur pour la réaction. L'azote va donner quantitativement du sulfate
d'ammonium : c'est l'étape de minéralisation.

L'ammoniac est ensuite déplacé de son sel par l'hydroxyde de sodium, distillé par
entraînement à la vapeur et recueilli dans une quantité connue d'acide
chlorhydrique en excès. Cette étape est appelée distillation.
L'acide chlorhydrique qui n'a pas réagi est dosé en retour par de la soude.

Le processus de la méthode Kjeldahl :

Digestion : Dans cette méthode, une certaine substance est chauffé en présence
d'acide sulfurique. L'acide décompose la substance organique par oxydation et de
l'azote réduit sous forme de sulfate d'ammonium est libéré. Le sulfate de
potassium est généralement ajouté pour augmenter le point d’ébullition du milieu.
Des catalyseurs sont également utilisés dans le processus de digestion.
L'échantillon est complètement décomposé lorsque nous obtenons une solution
claire et incolore.
Distillation : La distillation de la solution a maintenant lieu et une petite quantité
d'hydroxyde de sodium est ajoutée pour convertir le sel d'ammonium en
ammoniac. Les vapeurs distillées sont ensuite piégées dans une solution de
piégeage spéciale de HCl (acide chlorhydrique) et d’eau.

Titrage : La quantité d'ammoniac ou la quantité d'azote présente dans

l'échantillon est ensuite déterminée par titrage en retour. Lorsque l'ammoniac se
dissout dans la solution de piégeage d'acide, une partie du HCl est neutralisée.
L'acide restant peut-être titré en retour avec une solution standard d'une base
telle que NaOH ou d'autres bases.
e/ Méthode de bicinchoninate (BCA) :

Principe : la méthode BCA (Acide Bicinchonique) est une technique

colorimétrique largement utilisée pour quantifier les protéines dans divers
échantillons. Elle repose sur deux réactions principales qui se produisent en
milieu alcalin.

Mécanisme de la Méthode BCA :

A-Réduction du Cu(II): Les protéines présentes dans l'échantillon

réduisent les ions cupriques (Cu²⁺) en ions cupriques (Cu⁺). Cette réaction
est similaire à celle observée dans la méthode de Biuret, mais elle se déroule
dans un environnement alcalin, ce qui favorise la formation du complexe
coloré.
B-Formation du complexe BCA-Cu(I) : L'acide bicinchonique se lie à l'ion
Cu⁺ formé, produisant un complexe stable qui présente une couleur pourpre.
L'absorbance de ce complexe est mesurée à une longueur d'onde maximale
de 562 nm, et elle est proportionnelle à la concentration de protéines dans
Protocole de Dosage :

Le protocole de dosage BCA comprend plusieurs étapes clés :

[Link]éparation des réactifs :

 Solution A : Contient du bicinchoninate de sodium, du carbonate de

sodium, du tartrate de sodium, et d'autres composants.
 Solution B : Contient du sulfate cuivrique.

- Un mélange des solutions A et B est préparé pour former le réactif de

travail.

[Link] :
 Mélanger l'échantillon protéique avec le réactif BCA et incubar à
température ambiante pendant environ 30 minutes à 2 heures pour
permettre le développement complet de la couleur.

[Link] :
 Mesurer l'absorbance du mélange à 562 nm à l'aide d'un
spectrophotomètre.

4.Étalonnage :
 Utiliser une gamme d'étalonnage avec une protéine standard pour établir
une courbe standard permettant de quantifier les protéines dans les
échantillons inconnus
Conclusion :

La méthode BCA est un outil efficace pour le dosage des protéines, offrant
une combinaison d'avantages en termes de sensibilité, compatibilité et
précision. Son utilisation répandue dans les laboratoires souligne son
importance dans l'analyse biochimique et la recherche biomédicale.
f/ Analyse en acides aminés :

Principe : Le dosage des protéines par acides aminés repose sur la

dégradation des protéines en acides aminés libres, suivie de leur
quantification. Ce processus est essentiel pour comprendre la
composition et la fonction des protéines dans divers contextes
biologiques.

Avant de doser les acides aminés, il est nécessaire d'hydrolyser les

protéines. Cette hydrolyse implique la rupture des liaisons peptidiques
qui unissent les acides aminés dans la chaîne protéique.

Les méthodes d'hydrolyse peuvent être chimiques ou enzymatiques :

 Hydrolyse chimique : Utilisation d'acides forts comme l'acide

chlorhydrique (HCl) à des concentrations élevées (6N) pour
décomposer les protéines en acides aminé.

 Hydrolyse enzymatique: Utilisation d'enzymes spécifiques pour

catalyser la rupture des liaisons peptidiques sans altérer les acides
aminés, bien que cette méthode puisse ne pas être complète .
Une fois que les acides aminés sont libérés, plusieurs techniques peuvent être
utilisées pour les séparées :

 Chromatographie : Cette technique sépare les acides aminés en fonction de

leur taille, charge ou affinité pour un support spécifique. Les types courants
incluent :

 Chromatographie sur couche mince (CCM) : Utilisée pour séparer et

identifier les acides aminés

 Chromatographie liquide à haute performance (HPLC) : Plus précise et

sensible, elle permet une séparation efficace des acides aminé

 Spectrophotométrie : Après réaction avec des réactifs spécifiques, les

acides aminés peuvent être quantifiés par leurs propriétés d'absorption
lumineuse à des longueurs d'onde spécifiques

 Électrophorèse : Une méthode qui utilise un champ électrique pour séparer

les molécules selon leur charge et taille, permettant ainsi un dosage précis
des acides aminés
5/Méthodes basée sur la
spectrophotométrie :
Méthode de spectrométrie UV :
C’est une technique largement utilisée en biochimie. Elle repose sur
l’absorption de la lumière UV par les AA aromatiques présents dans les
protéines, principalement le tryptophane et la tyrosine.
Principe : Les protéines absorbent la lumière à une longueur d’onde autour
280 nm. Cette absorption est due aux chaînes latérales aromatiques des AA
qui composent les protéines. En mesurant l’absorbance il est possible
d’estimer la concentration en protéines dans un échantillon.
Limites : doit être utilisée avec prudence en raison des potentielles
interférences dues à d’autres composants présents dans les échantillons.
Mode opératoire :

Effectuez les étapes 1 à 4 (280 nm uniquement) pour une estimation très

approximative. Effectuez toutes les étapes si une contamination par les acides
nucléiques est probable.
1. Préchauffez la lampe UV (environ 15 min.)
2. Ajuster la longueur d’onde à 280 nm
3. Calibrer à l’absorbance zéro avec la solution tampon uniquement
4. Mesurer l’absorbance de la solution protéique
5. Ajuster la longueur d’onde à 260 nm
6. Calibrer à l’absorbance zéro avec la solution tampon uniquement
7. Mesurer l’absorbance de la solution protéique
Commentaires :
Les solutions froides peuvent embuer la cuvette, tandis que les solutions chaudes
peuvent libérer des bulles et interférer avec les lectures. Pour les solutions
concentrées (absorbance supérieure à 2), il suffit de diluer la solution.
Coefficients d’absorption de certaines normes protéiques courantes :
 Ovalbumine de poulet : 70
 IgG bovine, humaine ou de lapin : 138
 Albumine sérique bovine (BSA) : 63
7/ 01 FIABILITE
Classement
selon les 02 FACILITE MISE
EN OEUVRE
critères
suivants: 03 RAPIDITE

04 COUT
 Facilité de mise
Méthode Fiabilité Rapidité Coût
en œuvre
Moyenne Simple (réactifs Faible
Rapide (~10
Biuret (interférences facilement (équipement de
min)
possibles) disponibles) base)
Élevée Complexe
Modéré (réactifs
Lowry (sensibilité Lente (~1h) (plusieurs
et temps requis)
accrue) étapes)
Faible (peu de
Bonne (stable et Très rapide (~5 Très simple
Bradford réactifs
précise) min) (colorant unique)
nécessaires)
Moyenne
Très élevée
Moyennement (nécessite des Modéré (réactifs
BCA (précision
rapide (~30 min) conditions spécifiques)
accrue)
contrôlées)
Variable (dépend Très faible
Très rapide (~2-3 Très simple
Adsorption UV des (spectrophotomè
min) (aucun réactif)
contaminants) tre seulement)
Complexe Élevé
Très élevée Très lente
Analyse des (hydrolyse, (équipement et
(résultats précis (plusieurs
acides aminés chromatographie expertise
et détaillés) heures)
) nécessaires)
Complexe
Bonne (précision Très lente Élevé (matériel
(réactifs
Kjeldahl pour protéines (plusieurs spécialisé et
corrosifs, étapes
totales) heures) main-d’œuvre)
multiples)
8/
Application :
Médecine : pour
Recherche diagnostiquer certaines
maladies comme le Cancer
biologique et les troubles cardiaques.

Industrie pharmaceutique et alimentaire : Dans le domaine

pharmaceutique, ces dosages sont utilisés pour assurer la qualité et
la pureté des produits biologiques, tels que les vaccins ou les
anticorps. De plus, ils jouent un rôle clé dans l'évaluation de la
nutrition et dans le contrôle de la qualité des produits alimentaires.
 Conclusi
on
Fiabilité : Les méthodes BCA, Lowry, et analyse des acides aminés
offrent la meilleure précision pour des échantillons complexes.
Rapidité : Les méthodes Bradford, Biuret, et Adsorption UV sont les
plus rapides.
Facilité de mise en œuvre : Bradford et Adsorption UV sont simples
et accessibles, tandis que Lowry, analyse des acides aminés, et
Kjeldahl sont plus complexes.
Coût : Biuret, Bradford, et Adsorption UV sont économiques,
contrairement à Kjeldahl et analyse des acides aminés qui
demandent un équipement onéreux.

La méthode de Bradford est généralement

la meilleure option pour une analyse rapide,
économique et fiable des protéines dans des
échantillons biologiques simples.
 Sources
- Scientific journals on protein analysis
- Science Direct
- Anal biochem
- Journal chromatogtaphy B
- Journal of proteome research
- [Link]
- Pubmed central
- Biochimie des proteines BCM 514
- Springer verlage publication
- Interchim
- [Link]
- eGynkosh << estimation of protein by method bradford>>
- Tiré par livre ‘’ total protein estimatiom by Lowry method ‘’
- Wikipedia
- Chatgpt (tableau : classification des dosages des proteines)
- [Link]