PCR-RFLP
(Polymerase Chain Reaction-
Restriction Fragment Length
Polymorphism)
Outil enzymatique
principale:
les enzymes de restriction
• Origine des ER
• Rôle des ER
• Caractéristiques des ER
• Utilisations: PCR-RFLP
Origine des ER:
Rôle des ER: Système de défense
2 systèmes de défense chez les
procaryotes:
• Système de défense contre les bactériophages:
Enzymes de restriction
• Système d’auto-défense contre ses propres ER:
Méthylases (ajout de CH3)
Définition:
• Endonucléases qui coupent l’ADN
bicaténaire dans des sites précis (sites de
restriction)
Caractéristiques des ER:
• Nomenclature:
Exemple:
Eco R I
Escherishia coli Résistante numéro de souche
Exemples:
• Pst I
• Taq III (Thermus aquaticus)
• Hinf V
Types de ER:
• Type I
• Type II
• Type III
Particularités des sites de
restriction des ER type II
• Exemples:
5’ AAATTAATTT 3’
3’ TTTAATTAAA 5’
Définition du palindrome
• Séquence d’ADN bicaténaire dont le nombre de
nucléotides est pair (supérieur ou égale à 4, c’est à
dire: 6, 8, 10, 12) possédant un axe de
complémentarité passant pas son milieu
• Ex: GAATTC GAA TTC
• CTTAAG CTT AAG
•5’ AAAGGTACATTACCG 3’
•3’ TTT CCATGTAATGGC 5’
Palindrome contenu dans cette séquence
Types de coupure:
• Coupure directe : au niveau de l’axe de complémentarité
Extrémités directes ou franches
• Coupure décalée ou en escalier
Extrémités cohésives
GT-TACGTAAC
CAATGCAT-TG
GT……….. TACGTAAC
CAATGCAT ...………TG
Extrémités qui s’emboitent spontanément par liaisons hydrogènes
Domaines d’utilisations des
ER:
• Clonage moléculaire
• Établissement de cartes de restriction
• Diagnostic médical direct de certaines pathologies (maladies
récessives): diagnostic par PCR-RFLP
à condition que le polymorphisme concerne directement un site
de restriction: que la mutation touche un site de restriction
NB: Soit la mutation supprime un site de restriction soit elle le crée
• Exemple de diagnostic direct par PCR-RFLP: diagnostic
d’une pathologie due à une mutation située dans un
site de restriction (qui supprime le site de restriction)
Étapes de la PCR-RFLP:
1. Extraction de l’ADN génomique total (protocole standard ou kits)
2. PCR de gène cible (touché par la mutation)
3. Incubation avec l’enzyme qui possède un site de restriction dans cette région
(ex: EcoRI)
4. Électrophorèse des fragments de restriction (issus de la coupure par l’enzyme)
5. Interprétation du gel: s’il y a coupure ou pas nous indique présence ou non de
ma mutation
Région génique différente: mutation
ponctuelle d’un seul nucléotide qui touche un
site de restriction changement de C en T
Ind 1………GAAAAAAATTCGAACCTACCCT……..
Ind 2………GAAAAAAATTTGAACCTACCCT………
EcoRI
Ind 1………GAAAAAAATTCGAACCTACCCT……..
Séquence normale
EcoRI
Ind 2……..GAAAAAAATTTGATCCTACCCT………
Séquence mutée
Coupure
Ind 1………GAAAAAAATTC GAACCTACCCT……..
Pas de Coupure
Ind 2……..GAAAAAAATTTGATCCTACCCT………
Les fragments obtenus sont des fragments de restriction polymorphes par la longueur= RFLP
Ind 1: deux bandes = pas de mutation ind sain
Ind 2: une bande= présence de mutation ind malade
Pas de mutation Mutation homozygote Mutation hétérozygote
Ind 2: trois bandes présence de la mutation à l’état hétérozygote (porteur sain)
Cas de pathologie due
à une mutation qui
crée un site de
restriction
Région génique différente: mutation
ponctuelle d’un seul nucléotide qui crée un
site de restriction changement de T en C
Ind 1………GAAAAAAATTTGAACCTACCCT……..
Ind 2………GAAAAAAATTCGAACCTACCCT………
Pas de Coupure
Ind 1………GAAAAAAATTTGAACCTACCCT……..
Séquence normale
Coupure
Ind 2……..GAAAAAAATTC GATCCTACCCT………
Séquence mutée
Les fragments obtenus sont des fragments de restriction polymorphes par la longueur= RFLP
Ind 1: une bande = absence de mutation ind sain
Ind 2: deux bandes = présence de mutation ind malade
Ind 2: trois bandes présence de la mutation à l’état hétérozygote (porteur sain)
Pas de mutation Mutation homozygote Mutation hétérozygote