Licence Sciences & Technique

Analyses Biologiques
et Contrôle Qualité
Module de Génétique
& Biologie et Moléculaire

" Biologie Moléculaire "

Année universitaire 2021-2022

Pr. Hamid LAKHIARI

 Plan du cours
I. Introduction
II. Les acides nucléiques
III. Structure de l’ADN
IV. Réplication & Maintenance de l’ADN
V. Les ARN (Acides RiboNucléiques)
VI. La transcription
VII. La régulation de la transcription
VIII. Le code génétique
IX. La synthèse protéique
X. Techniques générales de Biologie Moléculaire
 Introduction

La biologie moléculaire:
 Analyse au niveau moléculaire de l’information génétique:
 Le stockage
 La transmission
 L’expression
 Le contrôle

 Discipline au croisement de :
 Génétique, Biochimie et Biophysique

 Comprendre les mécanismes du fonctionnement de la cellule au

niveau moléculaire (Warren Weaver, 1938)

 Ensemble des techniques de manipulation d'acides nucléiques

(ADN, ARN) ou génie génétique.
Naissance de la Biologie Moléculaire

 La découverte de la structure en double-hélice de l’ADN par

Watson & Crick en 1953 situe de fait le début de la Biologie
moléculaire

 La science de la génétique : Transmission du matériel

génétique d’une génération à l’autre et non pas la copie d’un
organisme

 Le matériel génétique est constitué d’acides nucléiques de

structures différentes des autres macromolécules (protéines,
lipides, glucides).

 Le gène est l’unité de l’information génétique, de l’hérédité. Il

ne fonctionne pas de façon autonome
 Le dogme central de la biologie moléculaire

 L’expression de l’information génétique est presque

exclusivement unidirectionnelle :

Transcription inverse

ADN ARN Protéines

REPLICATION TRANSCRIPTION TRDUCTION

(Copie fidèle)
EXPRESSION GENETIQUE

 Les acides nucléiques portent l’information génétique

 Les protéines fournissent le moyen de l’exécuter.
 LES ACIDES NUCLÉIQUES

INTRODUCTION

 Isolés initialement du noyau des cellules par Friedrich

Mischer en 1868 d'où leur nom: du latin nucleus,
noyau

 Ce sont des substances présentes, non seulement dans

le noyau mais aussi dans le cytoplasme des cellules

 Il existe 2 types d`acides nucléiques:

L`ADN et L`ARN

 Ce sont des macromolécules formées par la répétition

d`une sous unité appelée nucléotide.
 Les acides nucléiques
Structure de base

Répétition d’un module de base « Le nucléotide » associant

trois molécules:

 L’acide phosphorique PO4H3

 Le ribose ou le désoxyribose, estérifié en 5’

par l’acide phosphorique

 Une base purique ou pyrimidique contractant une liaison

β N-osidique avec le pentose

Nucléotide = Acide phosphorique + Ose + Base

 Les types d’acides nucléiques :

On distingue deux types d’acides nucléiques selon le pentose :

L’ADN : Acide DésoxyriboNucléique

L’ARN : Acide RiboNucléique

CARACTERISTIQUES ADN ARN

Ose Désoxyribose Ribose

Base Purique Adénine, Guanine Adénine, Guanine

Base Pyrimidique Thymine, Cytosine Uracile, Cytosine

Structure dans la cellule Double hélice Simple brin

LES BASES AZOTÉES

 Cinq bases majeures, partagées en deux séries, entrent dans

la composition des nucléotides et leurs polymères.

 Elles vont conférer aux composés biologiques dont elles font

partie des propriétés capitales.

Les bases pyrimidiques et les bases puriques

Les dérivés oxy et/ou amino de la pyrimidine et de la purine

forment les deux familles de base des nucléotides naturels.

Les bases pyrimidiques et les bases puriques

Structure des pyrimidiques
Le noyau pyrimidine est le plus simple : c’est un noyau aromatique
à six atomes, quatre carbones et deux azotes.
Les différentes bases des acides nucléiques en dérivent selon les
substituants que portent les atomes de ces noyaux.
Structure des bases puriques
Le noyau purine est constitué de deux noyaux hétérocycliques, un
de six atomes et l’autre de cinq atomes, avec 2 C en commun.
Les différentes bases des acides nucléiques en dérivent selon les
substituants que portent les atomes de ces noyaux
Les nucléotides de l'ADN, comme ceux de l'ARN ne comportent
que quatre de ces bases azotées :

 deux puriques communes aux deux types d'acides nucléiques:

 Adénine, Guanine

 une pyrimidique commune : la cytosine

 une pyrimidique spécifique :

 l'uracile pour l'ARN

 et son dérivé méthylé, la thymine pour l'ADN

 Les bases modifiées dans l'ADN ou l'ARN

Les modifications peuvent avoir lieu sur des sites cycliques ou

exocycliques :

Exemples:
 Méthylation: 5-méthylcytosine
 Hydrogénation: 5, 6-dihydrouracile
 Bases soufrés : Thiouracile
…etc

N.B.:
Les bases modifiés sont trouvées dans l'ADN et dans
l’ARN, principalement dans les ARNt
Oses des nucléosides et des nucléotides

Les oses des nucléosides, des nucléotides, et, par suite, des
acides nucléiques, sont deux pentoses:

Le D-ribose et le 2-D-désoxyribose.

Dans les nucléotides libres et les acides nucléiques, ces deux

pentoses sont sous forme:
 Furanique
 L’anomère est fixé sous forme .
 LES NUCLÉOSIDES
Les 2 molécules sont unies par une liaison N-osidique, avec
élimination d'eau, entre le groupement hydroxyle du carbone
anomérique de l'ose (du ribose ou du désoxyribose) et d'un
groupement NH de la base azotée.
LES RIBONUCLÉOSIDES
LES DÉSOXYRIBONUCLÉOSIDES
 LES NUCLÉOTIDES

Ils résultent d'une condensation, avec élimination d'une molécule

d'eau, entre le nucléoside et l'acide phosphorique H3PO4.
LES RIBONUCLÉOTIDES
LES DÉSOXYRIBONUCLÉOTIDES
 NOMENCLATURE
Les noms des nucléosides ont comme suffixe :
 "osine" pour les nucléosides puriques
 "idine" pour les nucléosides pyrimidiques
Base Ribonucléoside Ribonucléotide
(Pentose + Base) (5’-monophosphate)
Adénine (A) Adénosine Adénylate (AMP)
Guanine (G) Guanosine Guanylate (GMP)
Cytosine (C) Cytidine Cytidilate (CMP)
Uracile (U) Uridine Uridylate (UMP)

Base Désoxyribonucléoside Désoxyribonucléotide

(Pentose + Base) (5’-monophosphate)
Adénine (A) Désoxyadénosine Désoxyadénylate (dAMP)
Guanine (G) Désoxyguanosine Désoxyguanylate (dGMP)
Cytosine (C) Désoxycytidine Désoxycytidilate (dCMP)
Thymine (T) Désoxythymidine Désoxythymidilate (dTMP)
 Nomenclature Nucléosides / Nucléotides

Les nucléotides ont des fonctions variées et importantes, ce sont :

 Des composés à "haut potentiel énergétique" dont dépendent
l'activation de molécules : ATP
 Des composés structuraux de coenzymes,
 Des seconds messagers intracellulaires de signaux et des
médiateurs extracellulaires, des régulateurs d'activité de
protéines AMPc.
Structure primaire de l’ADN

L’ADN polymère de désoxyribonucléotides:

 dAMP, dGMP, dCMP, dTMP.
Adénine
Exemple: Désoxyadénylate

Liaison ester

Liaison Osidique

Acide phosphorique

Désoxyribose
Structure primaire de l’ADN
L’union entre les nucléotides se fait par l’intermédiaire de liaisons
phosphodiesters reliant le carbone 3’ du désoxyribose d’un
nucléotide au carbone 5’ du désoxyribose du nucléotide adjacent.
 Union de plusieurs nucléotides : formation des polynucléotides

Extrémité 5’
Liaison phosphodiester
PO4 libre
(liaison covalente)
5’
Squelette sucre-phosphate orienté

3’

Extrémité 3’
OH libre ADN

A T C G A
Extrémité 5 ’ C1 ’
Extrémité 3 ’
C3 ’
(à gauche) P P P P P OH (à droite)
C5 ’
5’ 3’
p ATCGAOH ou ATCGA : ordre des bases = information génétique
Structure secondaire :
Les travaux de Watson et Crick en 1953 : l'ADN est sous forme de:
double hélice. Deux chaînes complémentaires et antiparallèles
Antiparallèles: 2 brins
5’ → 3’
3’→ 5’
5’ 3’ Complémentarités:
A en face de T : AT
G en face de C: G C
5’ A T 3’
3’ 5’ C G
G C
A T
. .
Appariement des bases 3’ C G 5’
Brin 1 Brin 2
La complémentarité est due :
 Encombrement stérique (purine + pyrimidine)
 Formation de liaisons hydrogène
 Appariement de type Watson-Crick

Dans une molécule d’ADN, il y a une complémentarité entre les bases

L’adénine (A) s’appariée avec la Thymine (T)

et la Guanine (G) avec la Cytosine (C).

Il y aura donc autant de A que de T et autant de G que de C.

A=T ==> A/T = 1 ;
de même G=C et G/C = 1

A=T et G=C ===> A+G = T+C ===> (A+G)/(T+C) = 1

Identique chez toutes les espèces.
 Conformation spatiale de l ’ADN
L'enroulement des deux brins polynucléotidiques dessine à la surface
de la molécule un grand sillon et un petit sillon; le grand sillon est large,
le petit sillon est étroit mais leur profondeur est comparable.
Le pas de l'hélice
10 pb

Distance
entre 2 bases

Interaction avec des protéines

Diamètre
(Facteurs de transcription)
Formes de la double hélice d’ADN:
La double hélice n’est pas parfaitement régulière et l’on distingue les ADN A,
B et Z qui sont autant de variants qui paraissent jouer un rôle important
dans certaines régulation comme la transcription.
Ces conformations dépendent notamment de la nature des paires de bases.

Droite
Droite
Gauche
La forme A est observée notamment dans les hélices hybrides ADN-ARN. En solution et
dans la cellule, c’est la forme B de l’ADN qui est prédominante. Une forme senestre de
l’ADN étirée en zigzag (ADN-Z) est parfois observée mais dont la signification
physiologique reste incertaine.
L'ADN dans les cellules Eucaryotes
 La quantité importante d'ADN stockée dans la cellule (1.4
m dans un noyau de quelques microns de diamètre)
nécessite des techniques d'empaquetage sophistiquées,
capables de le stocker de façon compacte tout en lui
permettant de se répliquer et d'être partagé entre cellules
filles lors de la division cellulaire.

 L'ADN des eucaryotes est étroitement associé à des

protéines, les histones, pour former la chromatine.

 Le nucléosome est l'unité élémentaire d'empaquetage de

l'ADN dans les noyaux. Il met en jeu des protéines
particulières appelées histones.

 La structure de stockage, trouvée chez tous les eucaryotes

est le chromosome
La chromatine
 Suivant le degré de spiralisation de la fibre nucléosomique, on
aura:
 Fibre A, peu spiralée, 100 A° de diamètre = Euchromatine.
 Fibre B, très spiralée, 300 à 800 A° de diamètre =
Hétérochromatine => Structure en solénoïde.
 La fibre nucléosomique = hélice d'ADN bicaténaire enroulée en
spirale autour des protéines basiques, les histones.
 Un tour = nucléosome (ADN + histones) forme la superhélice
ou Euchromatine ou fibre A.

 Plusieurs tours = super-superhélice, fibre A s'enroule sur elle

même en solénoïde Hétérochomatine ou fibre B.
 Une perle sans ADN = coeur du nucléosome ou chromatosome,
formée de 4 paires d'histones 2x (H2A, H2B, H3 et H4),
organisées en octamère.
 Chromatine : Structure de Nucléosome

Protéine H1 ADN
attachant l’ADN
Fibre
de 30 nm

Groupe de 8 histones
2x (H2A, H2B, H3 et H4)

Fibre A
Fibre B
Formation du Chromosome
Les protéines non histones

L'ADN est également associé à des protéines non histones,

groupe très hétérogène comprenant:
des enzymes:
enzymes nécessaires à la réplication, à la transcription, à la
réparation...)

des protéines de régulation de l'expression des gènes, des

protéines de structure du chromosome…
ADN répétitif
On définit 3 grandes classes de séquences d'ADN:

les segments non répétitifs représentent 70% de l'ADN

eucaryote; la majeure partie de cet ADN est non codante. Seule
une partie minoritaire est codante, il s'agit des exons. Ces
parties codantes sont généralement sous la forme d'un
exemplaire unique par génome haploïde pour une protéine
donnée (d'où la gravité d'une mutation de la séquence codante).

les segments modérément répétitifs 15 à 20%, à plusieurs milliers

d'exemplaires identiques, sont transcrits (ADN codant pour les
ARN ribosomiques et de transfert) ou non transcrits.

les segments très répétitifs 10 à 15% , présents dans la molécule à

un très grand nombre d'exemplaires identiques et souvent
courts. Ils sont situés en particulier dans les centromères des
chromosomes.
Méthylation de l'ADN
Chez les eucaryotes, la cytosine de l'ADN peut être méthylée sur
le C n°5 dans les dinucléotides CG  Rôle dans le contrôle de
l'expression des gènes:
l'hypométhylation favorise l'expression
la méthylation  une diminution de l'activité transcriptionnelle

Cas particulier de l'ADN non nucléaire

Les mitochondries contiennent de l'ADN circulaire bicaténaire
(16 600 pb chez l’homme) similaire au chromosome bactérien.
Sa composition nucléotidique  dans une même cellule de celle de
1'ADN nucléaire.
Sa séquence complète est connue pour l'ADN mitochondrial
humain.
Cet ADN ne code qu'une partie des protéines mitochondriales et
de la machinerie de synthèse protéique (ARN de transfert, ARN
ribosomiques) de la mitochondrie.
 Propriétés topologiques fondamentales de l'ADN
 Les liaisons hydrogène sont fragiles et peuvent être détruites par
chauffage ou par un pH élevé: c’est la dénaturation de la molécule.
 La dénaturation est réversible dans des conditions appropriées de
température et de force ionique et on peut reprendre la
configuration en double hélice d'origine.
 Dans la renaturation, on a formation de molécules "homoduplex".
 Propriétés topologiques fondamentales de l'ADN

 La dénaturation de l’ADN peut être suivie par l’étude de

l’absorption des U.V. (densité optique): l’ADN absorbe
spécifiquement à 260 nm.

Phénomène d’hyperchromocité
Absorbance

Simple brin: ADN dénaturé

Double brin: ADN natif

l (nm)
220 260 300
 La mesure de l’absorbance à 260 nm permet également :
La quantification ADN et ARN
Pureté des Acides nucléiques
 Propriétés topologiques fondamentales de l'ADN

 Mesure de la D.O. à 260 nm d’un échantillon d’ADN en fonction de

la température courbe sigmoïdale dont le point d’inflexion est
Tm (température de fusion = melting)

 Tm fonction :de la taille de l ’ADN & du nombre GC

 La Tm dépend de la teneur en G/C

Tm = température pour laquelle la moitié

de l’ADN est dénaturé
 Propriétés topologiques fondamentales de l'ADN

 On peut aussi mélanger des ADN dénaturés d'origines

différentes, s'il y a des complémentarités de séquences, des
"hétéroduplex" c'est à dire des molécules dont les deux brins
sont d'origine différente pourront se former.
 Enfin, toujours par complémentarité de séquences, on peut
apparier un ARN avec un brin d'ADN (il existe une possibilité
de liaison A..U) on obtient alors une molécule "hybride"
(ADN-ARN)

La réaction d'hybridation moléculaire est à la base de

nombreuses techniques de biologie moléculaire
 RÉPLICATION ET MAINTENANCE DE L'ADN

 La réplication désigne les mécanismes qui permettent le

dédoublement de l’ADN de 2n à 4n
 Elle se déroule pendant la phase S du cycle cellulaire

4n
G2
S Mitose

G1
2n

L'ADN est le support de l'information génétique. Il est donc

nécessaire pour assurer la conservation des espèces que:
 Sa biosynthèse conduise à des molécules filles répliques
identiques à la molécule parentale, c'est la réplication.
 Son intégrité soit maintenue dans les cellules, c'est la réparation.
Les mécanismes de la réplication

Réplication
conservatrice

Réplication
semi-conservatrice
Mise en évidence expérimentale de la réplication semi conservative
chez les bactéries par Meselson et Stahl (1958)

1. culture en milieu N15

=

ADN marqué « lourd » au N15

2. transfert et culture en milieu N14

=

ADN « mixte »

3. Poursuite de la culture en milieu N14

= +
Réplication "semi-conservatrice"
 Chaque brin d’ADN sert de modèle à un nouveau brin
 Ainsi tout ADN est constitué d’un brin nouveau et d’un brin
ancien
 Cette réplication utilise:
 Des désoxyribonucléosides triphosphates: dATP, dGTP, dCTP et
dTTP; du Mg2+ et des enzymes
 L’énergie nécessaire est fournie de l’hydroplyse des dATP,
dGTP…. Et qui sont substrats en même temps
Brin fils
Brin parental

2 ADN

Brin parental
ADN parental Brin fils
Mécanismes de la réplication

Ce mode de réplication semi-conservatrice suppose un ensemble de

dispositions concertées:
 Un dispositif dit d'initiation de la réplication de l'ADN, à partir
d'une origine de la réplication.

 La séparation des deux brins d'ADN parental permettant de les

obtenir à l'état non dégradé et aptes à être recopiés. C'est la
fourche de réplication.

 La biosynthèse des deux molécules filles et leur séparation

définitive, processus qui, chez les eucaryotes, est largement
compliqué du fait de la complexité de la structure de la
chromatine.

 Le contrôle de la qualité d'ADN obtenu, la correction des erreurs

éventuelles appelée édition (to edit = corriger; édition = correction
des erreurs « per réplication »)
La réplication nécessite:
Plusieurs protéines et enzymes , nous ne développerons ici que les
caractéristiques des ADN polymérases des procaryotes et des
eucaryotes.

ADN polymérases des eucaryotes

 ADN polymérases des procaryotes

Caractéristiques des ADN polymérases :

 Toutes les polymérases assurent l'élongation seulement dans le sens 5' →

3'.
 La présence d'un 3'OH libre est nécessaire.
 Il n'y a donc pas d'enzyme pour assurer l'élongation dans le sens 3' → 5'.
 Cette élongation nécessite toujours une amorce apportant un 3'OH libre.

Chez Escherichia Coli : la réplication est assurée par l'ADN polymérase III.
Chez les eucaryotes : la réplication est assurée par l'ADN polymérase α
 ADN POLYMERASES
Enzymes de polymérisation des désoxyribonucléotides
 Nécessitent une matrice, une amorce
 Ont un sens de déplacement précis
La réplication chez les procaryotes
1. Origine de réplication (microscopie électronique: Cairns, 1962)
procaryotes

ori C

-1 seule origine par chromosome : ori C

- réplication bidirectionnelle
- réplication rapide (20 à 100 min)
- 1 séquence de terminaison
Phase d’initiation

Ori C
Dna A: Se fixe au niveau
d’une séquence consensus
Composé de GATCT

3’
5’

1. reconnaissance de la séquence d’origine

Phase d’initiation

Ori C Dna A
Dna B (hélicase),
Dna G (primase)
primosome ...

SSB

3’ 5’

1. reconnaissance de la séquence d’origine

2. formation du primosome, ouverture du double brin et stabilisation des brins
Phase d’initiation

Ori C Dna A
Dna B (hélicase), Dna C
DNA primase
primosome ...
polymérase

SSB

3’ 5’

1. reconnaissance de la séquence d’origine

2. formation du primosome, ouverture du double brin et stabilisation des brins
3. accrochage de l’ADN polymérase
Phase d’initiation

Ori C Dna A
Dna B (hélicase), Dna C
DNA primase
primosome ...
polymérase

SSB

3’ 5’

1. reconnaissance de la séquence d’origine

2. formation du primosome, ouverture du double brin et stabilisation des brins
3. accrochage de l’ADN polymérase
4. synthèse d’une amorce ARN par la primase
Elongation
 L ’élongation nécessite:
 ADN polymérases (activité de copie 5 ’ → 3 ’) : III > I, II
 matrice formée par 1 simple brin, dNTP, Mg++
 amorce ARN avec OH libre en 3 ’
 hélicases, topoisomérases ...

 L ’élongation est mono directionnelle 5 ’ → 3 ’ : la synthèse

est continue sur le brin « avancé » et discontinue sur le
brin « retardé »

origine de la réplication

5’ 3’
3’ 5’
3. Elongation

 L ’élongation est mono directionnelle 5’ → 3’ :

 la synthèse est continue sur le brin « avancé »
 et discontinue sur le brin « retardé »
 clamp

primosome
brin avancé
DNA hélicase
DNA primase topoisomérase
5’

ADN pol finissant

un fragment fragment d’Okasaki
d’Okasaki début du prochain fragment d’Okasaki
fragment d’Okasaki
SSB

amorce 5’
ARN
brin retardé

- brin avancé : extension continue

- brin retardé : extension discontinue du brin néosynthétisé par fragments d’Okasaki
 Finition du brin

Terminaison et décrochage de l ’ADN pol III : séquences ter et protéine TUS

Finition du brin

Terminaison et décrochage de l ’ADN pol III : séquences ter et protéine TUS

 Terminaison
Présence de séquence terminator pour chacune des deux fourches

Point de rencontre des 2 fourches de réplication

séquences ter séquences ter

de la fourche 2 de la fourche 1

 La protéine Tus (terminator utilisation substance) reconnaît les

séquences d’arrêt de la réplication et bloque les hélicases
 Intervention d’une topoisomérase IV pour catalyser la séparation des
2 chromosomes
Réplication chez les eucaryotes
 Le mécanisme général est comparable à celui des procaryotes.
 Le processus survient à plusieurs endroits sur ce chromosome.
 Le complexe ORC permet:
 de reconnaître l'origine de la réplication,
 d'ouvrir l'ADN
 et de recruter d'autres protéines dans le cadre du modèle de
réplicon (unité de réplication).

2.104 à 1.105 origines

de réplication indépendantes
 Comparaison de la réplication
chez les eucaryotes et les procaryotes

Eucaryotes Procaryotes
Origine de réplication multiple unique
Stabilisation des brins RP-A: Replication protein A SSB

oui oui
synthétisée par α synthétisée par une primase
Amorce ARN suivit par α ou β ou  suivit par ADN pol III
dégradé par RNAse H dégradé par l'ADN pol I
trou bouché par α ou β trou bouché par l'ADN pol I

α, δ, , β,  ADN pol III, ADN pol I

ADN polymérases

Fragments d'Okazaki 200 nc 2000 nc

Elimination des amorces RNAse H et FEN1
RNAse H , ADN pol I
ARN
ADN ligase I, II ou III ADN ligase
CORRECTION DES DOMMAGES

MÉCANISMES DE CORRECTION
Maintenance de l’ADN
L’ADN subit des modifications spontanées multiples engendrant des
anomalies génétiques parmi lesquelles on peut citer les:
Les dépurinations: correspond à la rupture de la liaison entre une
purine (adénine ou guanine) et le désoxyribose auquel elle est
attachée. La dépyrimidination est beaucoup plus rare.
La désamination: correspond à l’élimination d’une fonction amine.
Réparation des dépurinations et des désaminations spontanées
LES ARN (Acides RiboNucléiques)
L'ARN a une structure voisine de celle de l'ADN, pourtant il existe trois
différences essentielles:
 L'ose est le ribose et non le désoxyribose.
 L'uracile remplace la thymine.
 L'ARN est sous forme d'une seule chaîne polynucléotidique.
Des repliements et les appariements par liaisons faibles sont possibles au
sein d'une même chaîne formant des structures IIaires autocomplémentaires
en double hélice de type A souvent sous forme d'épingles à cheveux, de
boucles...
Les ARN sont de 3 types principaux:
 ARN ribosomiques: ARNr
 ARN de transfert: ARNt
 ARN messagers: ARN m
NB: Chez les eucaryotes en + de ces 3 ARN, un grand nombre de petites
molécules d'ARN stables (100 à 300 nucléotides) présentes, dans le noyau
et/ou le cytoplasme, sous forme de ribonucléoprotéines (petits ARN
nucléaires SnRNA pour small nuclear RNA par exemple).
 Principales caractéristiques des trois familles
d’ARN chez les eucaryotes

ARNr ARN m ARNt

Nombre 4 Très nombreuses  60
d’espèces
différentes
Coefficient de 28 S, 18 S , 5,8 S, et 5 S Variable 4S
sédimentation
Longueur (en 5100, 1900, 160 et 120 Hétérogène 70 à 90
nucléotides)
Durée de vie Relativement longue Variable Relativement longue
Lieu de synthèse Nucléole (Sauf 5 S) Nucléoplasme Nucléoplasme
Rôle Ribosomes Porteurs de Adaptation de
(lecture ARNm) l’information pour la l’acide aminé au
synthèse des protéines codon
ARN RIBOSOMIQUES: ARNr
La majeure partie de l'ARN cellulaire (environ 80%).
Ils sont inclus dans des particules cytoplasmiques, les ribosomes
Les ribosomes sont particulièrement nombreux dans les cellules
présentant une activité intense de synthèse protéique.

Rôle: éléments de structure facilitant la fixation sur le ribosome des

autres ARN. Les ARNr interviennent aussi dans la reconnaissance
du site d’initiation de la traduction.
ARN DE TRANSFERT: ARNt

 De petite taille : 74 à 95 nucléotides seulement ( 30000 Da)

 Chaque ARNt est spécifique d’un acide aminé
 70 ARNt différents , plusieurs ARNt portent le même AA, ARNt
isoaccepteurs.

o Ils diffèrent entre eux au niveau de leur séquence nucléotidique

mais ils peuvent avoir soit :

 Le même anticodon
 Des anticodons différents mais qui correspondent au même
AA (car plusieurs codons du code génétique codent pour le
même AA (“ dégénérescence du code génétique ”)

Ils représentent  15% de l’ARN total

Ils comportent des nucléotides rares, inhabituels :
nucléotides méthylés, dihydroxyuracile "DHU",
pseudo uridine" ...
Schéma de la structure
en trèfle de l'ARNt

Boucle de l’anti-codon (3 nucleotides) ; le bras de fixation de

l'acide aminé (se termine par CCA) ; boucle variable ; boucle D ;
boucle T
ARN MESSAGERS: ARNm
Les ARNm représentent moins de 5% de l'ARN cellulaire. La taille et la
séquence en nucléotides variables (fonction du gène transcrit).

ARNm des eucaryotes:

 Contiennent l'information d’1 gène (ou cistron)  correspondent à une
seule chaîne polypeptidique.
 De stabilité variable
 Possèdent 2 régions transcrites non traduites de taille variable:
1 du côté 5' et une du côté 3' :

 L'extrémité 5' a une structure particulière # "capuchon" ou "cap"

retrouvée dans tous les ARNm dont le rôle est:
 La maturation de l'ARN prémessager
 L'initiation de la traduction: reconnaissance par la s/unité
ribosomique 40 S de l'extrémité 5' de l'ARNm.

 La partie 3' est terminée par une séquence Poly A (+ de 100

nucléotides), dans presque tous les ARNm (sauf les ARNm d'histones)
 Facilite le transfert de l'ARNm du noyau vers le cytoplasme
 Participe à la régulation de la stabilité de l’ARNm cytoplasmique.
ARNm des procaryotes:

 Dans la majorité des cas l'ARNm des procaryotes est

polycistronique. Un ARNm est obtenu à partir d'une série de
gènes contigus dans un ensemble appelé opéron.

L'ARNm polycistronique comporte +sieurs signaux d'initiation

et de fin de lecture et de ce fait code +sieurs chaînes
polypeptidiques différentes qui sont synthétisées en série sur des
portions contiguës de la même molécule d'ARNm.

On parle donc d'ARNm polycistroniques puisqu'ils contiennent

l'information de gènes ou cistrons distincts.

 Ils sont instables et permettent une adaptation rapide aux

changements de milieu environnant.

 Ils n'ont pas de séquence polyadénylique à l'extrémité 3' et pas

de capuchon à l'extrémité 5'.
 En résumé:
Les propriétés des ARN messagers sont les suivantes:

 Ils sont monocistroniques chez les eucaryotes (sauf dans les

mitochondries) et polycistroniques chez les procaryotes et dans
les mitochondries
 Ils sont formés d'un seul brin d'ARN
 Ils peuvent s'hybrider au brin d'ADN qui leur a donné
naissance
 Ils ne sont la copie que d'un des brins d'ADN
 Ils se fixent aux ribosomes
 Ils codent des protéines spécifiques
 Ils sont instables chez les procaryotes et de stabilité variable
chez les eucaryotes
 Chez les eucaryotes, ils ont un capuchon à l'extrémité 5' et une
séquence polyA à l'extrémité 3' (sauf pour les ARNm d'histones)
 LA TRANSCRIPTION

 Mécanismes générant les ARN, intermédiaires nécessaires entre

l’ADN nucléaire et la synthèse des protéines qui a lieu dans le
cytoplasme.

 La transcription assure aussi un fort effet d’amplification de

l’information génétique:
 1 gène, plusieurs ARNm par exemple , nombreuses synthèses
protéiques simultanées.

 Repose sur le fonctionnement d'enzymes complexes

constituées de sous-unités: les ARN polymérases ADN
dépendantes

 Chez les procaryotes une seule enzyme catalyse la synthèse des

trois classes d'ARN.

 Chez les eucaryotes on distingue 3 ARN polymérases selon le

type d'ARN dont elles catalysent la synthèse et leur localisation
cellulaire
Au cours de la transcription:

 Un seul brin d'ADN est transcrit en ARN

 Le choix du brin transcrit dépend de son orientation.
 La chaîne d'ADN servant de matrice est lue dans le sens 3'→ 5‘
 La direction du mouvement de l'ARN polymérase détermine
lequel des deux brins d'ADN est transcrit en ARN.

"Cette direction est elle même déterminée par l'orientation de la

séquence du promoteur"
Brin codant (non transcrit)
"Brin sens"

Brin transcrit (non codant)

"Brin antisens"

 Chaque molécule d'ARN produite a une polarité de 5' → 3’ et

une séquence nucléotidique (hormis la substitution de U en T)
identique au brin codant non transcrit.
 Comme pour la réplication, la transcription nécessite:

 L'ADN sert de matrice (template),

 Des précurseurs (ribonucleotides triphosphates: ATP, GTP, UTP

et CTP) et pas d’amorce

 Assuree par l’ARN polymerase

 La synthèse d'ARN se fait dans le sens 5'→3',

 Se passe en 3 étapes : initiation, élongation, terminaison:

 L'initiation: Fixation de l’ARN polymérase au niveau d'une

région particulière: promoteur,

 La synthèse nécessite l'ouverture de l'ADN,

 La terminaison se fait au niveau d'une région particulière:

terminateur.
 Transcription chez les procaryotes
Chez les procaryotes une seule enzyme catalyse la synthèse des trois
classes d'ARN (ARNr, ARNt & ARNm indifférement)
L'ARN polymérase bact. (500 kDa) est une enzyme multimérique.
Le core de l’enzyme est un complexe proteique de 4 sous unites α2ββ'
L’association du facteur σ au core de l’enzyme = holoenzyme

La sous unite β : se charge de la fixation de nucléotides triphosphates

La sous unite β’: se charge de la fixation de la matrice
Les 2 sous unite α: permettent l’assemblage des autres sous unites et
reconnaissance probable des promoteurs
Le facteur σ : se charge de la reconnaissance du site d’initiation.
 Transcription chez les bactéries
ARN polymérase se fixe à l’ADN au niveau d’une courte séquence
d'ADN placée juste avant le début du gène = promoteur reconnu par
le facteur σ

Organisation d’un gène bactérien

Promoteur Région transcrite Terminateur

Séquence signal pour

Site d’initiation de Matrice de synthèse
la libération de l’ARN
la transcription de l’ARN
pol
Initiation de la transcription
L'ARN polymérase reconnaît et se fixe sur une séquence spécifique située
en amont du site d'initiation de la transcription # promoteur

Le promoteur est constitué de courtes séquences conservées d’une unité de

transcription à l’autre et # séquences consensus :
 En -10 du site d’initiation on trouve la TATA box
ou boîte de Pribnow : « TATAAT »
 En -35 du site d’initiation on trouve : « TTGACA »

C’est la sous-unité σ qui permet donc une reconnaissance spécifique du

promoteur par l’ARN-polymérase.

Il agit de manière cyclique: après l’initiation, le facteur σ se détache pour

être réutilisé pour d’autres initiations de gènes.

La fixation de l'ARN polymérase sur le promoteur  l'ouverture d'environ

1 tour d'ADN, afin d'exposer une courte séquence d'ADN monocaténaire
qui constituera la matrice.
Structure d’un promoteur bactérien
 Promoteur et initiation de la transcription
Promoteur Région transcrite Terminateur

Brin sens
-35 Pb -10 Pb 1Pb
5’ 3’
-50 Pb TTGACA TATAAT 10 Pb
3’ 5’

1er site de Boite

fixation Pribnow Début de la transcription

Sens de la transcription

Formatin du complexe ARN pol/ADN

ouverture de la double hélice

L’initiation correspond à la synthèse de la première liaison phosphodiester

réalisé par la sous-unité β de l’ARN-polymérase
 En résumé

Le déroulement des premières étapes de la transcription est

donc :
 Liaison non spécifique de l’holoenzyme.
 Formation d’un complexe fermé au niveau du promoteur
 Formation du complexe ouvert (déroulement sur 14
nucléotides)
 Mise en place du premier nucléotide (très souvent A ou G)
 Allongement de 4 à 5 nucléotides
 Détachement du facteur sigma, après la transcription des
4-5 premiers nucléotides.
Initiation de la transcription des ARNm chez les bactéries
 Elongation de la chaîne d’ARN

Hybride ADN-ARN
Local et transitoire

 Assurée par le core de la polymérase à une vitesse d’environ 30 nucl/sec.

 Topoisomérases précèdent et suivent la polymérase
 Souvent plusieurs transcrits de la même matrice : Unité de transcription
polycistronique
La transcription se réalise à
plusieurs endroits à la fois sur
l’ADN (aspect de plume)
Terminaison de la transcription

Processus conduisant à la dissociation des sous unités de l’ARN

polymérase après la rencontre des signaux de terminaison

Deux mécanismes:

 Terminaison "rhô-indépendante": terminateurs intrinsèques

 Terminaison "rhô-dépendante": dépend de la présence d’une

protéine rho
 Dernière base transcrite
[Link] rho-indépendante:
Région riche
en AT

Brin matrice 3’ TAATTTCCGAGG A A AA CCT CGGAAAA AAAA 5’

Brin sens 5’ ATTAAAGGCTCC T T TT GGAGCC TTTT TTTT 3’

Sens de la transcription

 Les terminateurs Rho-indépendants, sont constitués d'une séquence

répétée inversée suivie d'une série de T (uraciles sur l'ARN transcrit).
 Lors de sa transcription en ARN, la séquence répétée inversée adopte
une structure en tige et boucle qui provoque une pause de l'ARN
polymérase.
 L'ARN transcrit n'est plus alors apparié au brin d'ADN matrice que par
la séquence d'uridines qui suit.
 Ces interactions A-U sont faibles et l'ARN synthétisé peut se détacher de
sa matrice. La transcription s'arrête.
 Terminaison de la transcription des ARNm

Chez les bactéries, la transcription s’achève au niveau d’une séquence palindromique

inversée. La transcription de cette séquence palindromique inversée entraine la
formation d’une épingle à cheveux au niveau de l’ARN néosynthétisé, ce qui
déstabilise le complexe de transcription.
Terminaison rho-dépendante:

 Le facteur Rho est une Hélicase

ATP dépendante

 Fixation à l’extrémité 5’ de l’ARNm, migration le long

de l’ARN, localise le complexe ARN pol et le déroule

Libération de l’ARN
nouvellement synthétisé
Terminaison rho-dépendante:
 Modification post-transcriptionnelle
 Peu ou pas de modification des ARNm

 Traduction débute avant la fin de la transcription

 Transcription chez les eucaryotes.
 Mécanisme de base de la transcription est identique à ce qui a été décrit
pour les procaryotes.
 La structure des promoteurs est différente et les transcrits primaires
obtenus sont toujours monocistroniques.

 Structure des gènes des eucaryotes : Gènes fragmentés

Exons : ADN contenant l’information génétique (traduit en acides

aminés)
Introns : séquences intercalaires non codantes
 Une des différences majeures concerne les modifications post-
transcriptionnelles des ARN eucaryotes:
 ARNr (sauf le 5S) : méthylation, bases modifiées et épissage
 ARNt : méthylation, épissage et bases modifiées
 ARNr 5S : pas de modification
 ARNm : coiffés, épissés et polyadénylés. Certaines adénines peuvent
également être méthylées
 Transcription chez les eucaryotes.
 La transcription est assurée par l’ ARN polymérases .

 Les eucaryotes possèdent trois ARN polymérases différentes:

 ARN polymérase I : transcription des ARN ribosomiques
 ARN polymérase II: transcription des ARN messagers et ARNsn
 ARN polymérase III : transcription des ARN de transfert et des ARNr
5S.
Grosses protéines multimériques présentant des propriétés différentes.

Les ARN polymérases sont incapables à elles seules, d'initier la transcription.

 Il faut pour cela les facteurs de transcription (TF) qui vont se lier au
promoteur.

 Cet assemblage fournit différentes possibilités de régulation de

l'initiation de la transcription.

 La présence de ces facteurs de transcription généraux est nécessaire au

fonctionnement de l'ARN polymérase.
 ARN polymérase II

 Elle est présente dans tous les noyaux cellulaires.

 Sa masse moléculaire est de 500000 daltons pour 10 sous-unités.

 La transcription qu’elle catalyse nécessite:

 Des ribonucléosides triphosphates comme substrats (ATP, CTP, GTP

et UTP),
 Plusieurs cofacteurs protéiniques # Facteurs de transcription
(transcription factors TF II A à TF II J).

 L’énergie est fournie par l’hydrolyse des liaisons des nucléosides

triphosphates.
 Les différentes phases de la transcription
 Étapes nucléaires :

 Transcription intégrale du gène (exons + introns)

 Addition du « cap » en 5’ :
Méthyle sur l’azote 7 d’une GMP
Mise en place rapide (avant la fin de la transcription)
Protection de l’ARNm des enzymes de dégradation

 Addition de polyA
Après transcription, addition d’environ 50 à 250 A
Aide passage vers cytoplasme

 Étapes cytoplasmiques :

 Maturation du pré-ARNm
 Excision et Épissage = coupure des introns, ligation des exons
Les différentes étapes de la transcription

INITIATION

ELONGATION

TERMINAISON
 Phase d’initiation:
La zone à transcrire est indiquée par des signaux présents au niveau du
promoteur situé en 3’ du brin à transcrire

GC Box CAAT Box TATA Box

Eléments régulateurs d'amont

Chez les eucaryotes le promoteur comprend toutes les séquences
importantes pour l’initiation de la transcription. Il est modulaire et
complexe

Promoteur basal: - TATA box (-25) TATAXAX avec X=A ou T

- Inr YYA (+1) NXYY avec Y=C ou T

Eléments en amont: - CAAT ou GC ou octamère (oct)

 LES PROMOTEURS
 Séquence riche en A et T appelée "TATA Box" localisée à environ -30 pb.

 Cette séquence permet de positionner l'ARN polymérase II au site

correct d'initiation de la transcription.

 D'autres séquences équivalentes peuvent se rencontrer dans cette région,

la "GC box", la "CAAT box"...

 Ces séquences variables sont regroupées sous le terme "d'éléments

régulateurs d'amont" ("upstream elements") par rapport au site
d'initiation de la transcription.

 Ces éléments sont essentiellement impliqués dans la fréquence

d'initiation de la transcription.

 En gl. les promoteurs eucaryotes ne contiennent pas l’ensemble de ces

éléments. Les nombres et positions des éléments en amont sont variables.

Exemple: Les gènes domestiques ne possèdent pas de TATA Box. Quand

cette dernière est absente, une séquence genre GGGCGG ou GC box la
remplace.
 Initiation de la transcription et terminaison

Signaux moléculaires nécessaires à l’initiation:

 30 pb : Boite TATA (équivalente de la Pribnow des

procaryotes)

 70 pb : CAAT ou Enhancer : stabilisation du complexe ADN-

ARNp

Signal de terminaison:
La terminaison est différente pour chaque ARNpol
ARNpol I: Facteur protéique qui bloque la transcription
ARNpol II: La terminaison est couplée à la maturation de l’ARN
ARNpol III: La terminaison impliquerait des séquences riches en U
 Formation du complexe d’initiation de la transcription chez
les eucaryotes.
 Ce complexe est formé de l’ARN polymérase II et de nombreux facteurs de
transcription. L’un deux, TBP, se lie à la TATA box (séquence consensus
TATAA).
 D’autres facteurs de transcription se lient ensuite à TBP et l’ensemble recrute
l’ARN polymérase II qui pourra initier la transcription

+ TF II D

+ TF II A
TBP est nécessaire à l’initiation de la transcription
par chacune des 3 polymérases eucaryotes
Initiation « l’ARN polymérases II »

 Fixation du FT II D via la TBP au

niveau de la TATA Box

 Fixation simultanée de II B et II A

 Recrutement de l’ARN Pol II en

association avec le II F

 Fixation du II E et II H

 Le démarrage de la transcription a lieu

après la phosphorylation de la CTD
par le II H
 Elongation de la transcription
Nécessite de quitter la région du promoteur

CTD (Carboxy Terminal Domain) est une

séquence peptidique située à l’extrémité C-
terminale de l’ARN Pol II

CTD: répétition d’une cinquantaine de séquences

“Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser”
 Elongation de la transcription

Elle nécessite un dernier facteur qui est le facteur TF II S.

 Terminaison de la transcription

la transcription se termine aux alentours de la séquence de polyadénylation.

Une fois la séquence de polyadénylation transcrite (en rose), la protéine
CPSF (cleavage and polyadenylation specficity factor) qui était associée à
l’ARN polymérase s’y lie. La perte de l’interaction CPSF/ARN polymérase
déstabilise le complexe de transcription.
Modification post-transcriptionnelle

•Capping

•Polyadénylation

•Epissage
L’ajout de la coiffe (capping)

Libération d’un 5' phosphate

Formation de
la liaison 5'-5' triph.

méthyle sur le N7 du G

Structure de la coiffe

A lieu immédiatement après le début de la transcription

Protège les ARN contre la dégradation par des ribonucléases
Permet le recrutement du ribosome pour la traduction
 La polyadénylation des pré-ARNm
 La polyadénylation est réalisée par une enzyme spécifique,
la poly (A) polymérase, qui utilise l'ATP comme substrat pour
allonger l'extrémité 3' de l'ARN.

 Cette synthèse est effectuée sans utiliser d'ADN matrice, la

séquence poly (A) n'étant pas codée dans le génome.

 Ce processus s'effectue à la fin de la transcription par l'ARN

polymérase II, au niveau d'un signal spécifique sur l'ARN qui
se situe dans la partie non codante, la séquence de
polyadénylation AAUAAA.

 Le processus nécessite un certain nombre d'autres facteurs

comme le complexe CPSF (cleavage polyadenylation specificity
factor) qui se fixe au signal AAUAAA et réalise le clivage de
l'ARN messager à l'endroit ou démarre la polyadénylation.
Epissage des ARN transcrits
 Les Exons sont des régions de l’ADN contenant l’information génétique
(régions traduites)

 Les Introns sont des régions de l’ADN qui seront éliminés lors de la
maturation des ARNm (régions non traduites)

7700 pb

1872 nucléotides
Les sites d'épissage
Au extrémités des introns existent des séquences consensus:
 GU en 5’ (site donneur)
 AG en 3’ (site accepteur)
 Nucléotides adjacents à GU et AG sont aussi ± conservés
 Un A (site de branchement)
 entre la bordure 3’ et le A : région riche en pyrimidines
 Excision de l'intron par formation d'un lasso
 Au site donneur d’épissage G, en 5’ de l’intron, se produit une
hydrolyse entre G et le dernier nucléotide de l’Exon 1. Le P en 5’ du G se
lie de façon covalente au site A (OH en 2’) de branchement
 Formation d’une boucle appelée lasso ou lariat
 L’extrémité 3’ de l’exon 1 se trouve au voisinage de l’extrémité 5’ de
l’exon 2 et ces nucléotides sont associés par transestérification après
rupture de la liaison du nucléotide à G situé à l’extrémité 3’ de l’intron.
 Epissage alternatif

Epissage alternatif d’un pré-mRNA : permet de générer des protéines

différentes à partir d’un même gène
Dans cet exemple, la protéine est codée par 4 exons: Le pré-mRNA peut subir
deux épissages différents.
 Dans le premier cas (à gauche), les 3 introns sont éliminés et les 4
exons sont ligués, générant un mRNA qui code pour une protéine
donnée
 Dans le deuxième cas (à droite), l’exon 2 est ligué à l’exon 4 au lieu
d’être ligué à l’exon 3, ce qui génère une autre protéine.
 LA RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION
La régulation de l’expression des gènes
 Pour répondre aux conditions changeantes de l’environnement
immédiat

 Le choix des portions du génome devant être exprimées à un moment

donné dans un environnement donné.

 Un moyen pour la cellule de développer des mécanismes qui lui

permettent de réprimer les gènes qui codent pour des protéines
inutiles et de les activer au moment où ils deviennent nécessaires

Toutes les cellules n'auront pas le même rôle, et la transcription des

différents gènes se fera alors en fonction du tissu, mais aussi de
l'environnement physiologique (présence d'hormones...).
 LA RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION
La régulation de l’expression des gènes

Deux modes de régulation de l’expression d’un gène cible par une

molécule régulatrice :
1- d’une façon positive : l’interaction déclenche la transcription du gène
2- d’une façon négative : l’interaction empêche la transcription du gène
LA RÉGULATION DE L’EXPRESSION DES GÈNES
Niveaux de régulation
 Régulation de la transcription chez les procaryotes

Quelques constats
1. Un organisme unicellulaire, avec un temps de génération très court, doit
pouvoir répondre rapidement à des changements de son environnement.

2. Les demi-vies de la plupart des ARNm sont courtes (de l’ordre de

quelques minutes).

3. La transcription et la traduction sont couplées et se réalisent dans le

même compartiment cellulaire.

La régulation génique doit prendre effet tôt. En effet,

Le point de contôle majeur est : l’initiation de la transcription

 Notion d’opéron
 Généralement trouvés chez les procaryotes, avec quelques exemples
maintenant connus chez les eucaryotes (Némathelmintes , Plathelminthes).
 Chez les bactéries, quand un promoteur sert une série de gènes groupés,
l’ensemble de gènes s'appelle un opéron.

Structure d’un opéron simple:

Opérateur : contrôle de la transcription

Promoteur : fixation de l’ARN polymérase
début de la transcription : 1+
RBS (‘ribosome binding site’) : fixation du ribosome
CDS (‘coding sequence’): séquence codant pour une protéine
Terminateur : fin de la transcription 120
 LES OPÉRONS

Unité de régulation d’un ensemble de gènes qui seront

transcrits à l’aide d’un même promoteur sous forme d’1 seul
ARNm traduit cependant en plusieurs protéines différentes.

Cette unité comprend:

 Les gènes de structure,
 1 ou plusieurs gènes régulateurs codant des protéines
régulatrices
 et des éléments de contrôle présent dans la séquence
ADN
 LES OPÉRONS

Deux types d’opérons sont distingués selon les protéines synthétisées.

Si on prend par exemple les enzymes d’une voie d’anabolisme ou de
catabolisme.

La synthèse des enzymes d'une voie de catabolisme:

est réprimée en absence du substrat (ou nutriment)
et se trouve induite en présence de celui-ci:
l'opéron est inductible.
Exemple: l’Opéron Lactose

Au contraire, la synthèse d'enzymes intervenant en anabolisme:

est normalement exprimée et est inhibée par le produit final de la
voie métabolique concernée:
l'opéron est répressible.
Exemple: L’Opéron tryptophane
 OPÉRON INDUCTIBLE
Exemple de l’opéron lactose de la bactérie Escherichia coli

L’opéron lactose est composé d’un gène de structure avec 3 cadres de

lectures :
 Lac Z : code pour la β-galactosidase (clive le lactose en Glu + Gal)
 Lac Y : code pour la β-galactosyl-perméase (assure la perméabilité de la
bactérie au lactose, permet les échanges de sucres à travers la
membrane)
 Lac A : code pour la β-galactoside trans-acétylase (rôle inconnu de
 OPÉRON INDUCTIBLE

Cultivé en présence de glucose et de

lactose, E. coli consomme d'abord le
glucose.
Quand la concentration de glucose
diminue, la croissance s'arrête
Puis reprend par catabolisme du
lactose provoqué notamment par
l'apparition de β- galactosidase qui
hydrolyse le lactose en galactose et
glucose.
Pour expliquer cette observation, on considère d'abord la situation en
absence de lactose.

En absence de lactose, les gènes codant pour les enzymes du

catabolisme de ce glucide ne s'expriment pas, ce qui est normal car
ces enzymes n'auraient pas de substrat.

Pour cela, le gène régulateur de l'opéron lactose code pour une

protéine, le répresseur. Celui-ci possédant une forte affinité pour
l'opérateur, empêche stériquement la RNA-polymérase de se fixer
dans cette zone et donc inhibe la transcription.
En présence du Lactose:

Le lactose possède une affinité pour la protéine répresseur dont

il modifie la conformation provoquant la dissociation du
complexe opérateur-répresseur et empêchant la formation de
nouveau complexe.

Dans ces conditions, la RNA-polymérase peut se fixer sur le

promoteur et la synthèse des enzymes permettant le catabolisme
du lactose a lieu.
 En présence du glucose et du lactose
 En présence de glucose, l'apport de lactose est insuffisant pour
déclencher la synthèse β-galactosidase, car la régulation gère la
notion de substrat préférentiel, ici le glucose.
 La synthèse est conditionnée par l'absence de glucose qui est
caractérisée par la présence d'AMPc.
 L'AMPc se fixe sur la protéine CAP et le complexe AMPc-CAP
augmente l'affinité de la RNA-polymérase pour le promoteur.
La présence d'AMPc chez les procaryotes
est un signal de faim cellulaire.

CAP:
"catabolite activator protein"

Peu de glucose => beaucoup d'AMPc => AMPc-CAP active => liaison à
l'ADN => transcription: utilisation des autres sucres

Beaucoup de glucose => peu d'AMPc => CAP inactive => pas de
transcription => utilisation du glucose
 Expression de l’opéron Lactose

Pour que la transcription ait lieu, il y a donc deux conditions :

 il faut que le répresseur soit inactif
 et que le promoteur soit actif.
Induction par le métabolite initial
Régulation négative Régulation positive
LacI : répresseur CAP : apo-
activateur
 OPÉRON RÉPRESSIBLE
 Cet opéron comporte 5 gènes groupés codant pour des enzymes
impliquées dans la synthèse du tryptophane (trpEDCBA).
 Ces gènes sont sous la dépendance d’un seul système promoteur -
opérateur.
 Le gène trpR, qui ne fait pas partie de l’opéron, code pour une protéine
qui est le répresseur spécifique de l’opéron tryptophane.
 Cependant, cette protéine est incapable de se lier au site opérateur, et
par conséquent est inactive, tant qu’elle n’est pas complexée avec une
molécule effectrice : le tryptophane lui-même. Il agit donc comme un
corépresseur dans ce mécanisme de régulation en retour par le produit
final de la chaîne métabolique de l’opéron.
 OPÉRON RÉPRESSIBLE
 SansTrp, le répresseur synthétisé par le régulateur est inactif
La RNA-pol se fixe sur le promoteur: transcription.
 il y a synthèse des enzymes d'anabolisme du Trp.

 En présence de forte concentration de Trp, la synthèse d'un excès de

Trp est empêchée par le Trp lui-même qui se combine au répresseur
et le transforme en répresseur actif.
Les régulons

Ensemble fonctionnel de gènes (formant éventuellement des

opérons) qui peuvent être localisés à différents endroits du double
brin d’ADN et dont l’expression est régulé par un même
répresseur transcriptionnel

Les riborégulateurs

Partie 5’ (non traduite : 5’ UTR) d’un ARNm qui peut lier une
petite molécule cible dont la liaison affecte l’activité du ou des
gènes localisés en aval :
l’ARNm qui contient un ribo-régulateur est directement
impliqué dans la régulation de sa propre activité en fonction de
la présence ou de l’absence de la molécule cible.
 Exemple de mécanisme d’action des riborégulateurs
Pendant la transcription, la partie 5’ UTR d’un ARNm contenant un riborégulateur
forme des structures secondaires spécifiques. Ces structures sont des récepteurs pour
des métabolites (M) cellulaires.
 Si le métabolite est en concentration suffisante, un complexe se forme entre
le riborégulateur et le métabolite, ce qui réorganise la structure de l’ARNm
et permet la transcription de l’ARNm.
 En revanche, en l’absence du métabolite, la structure du riborégulateur
forme un motif tige-boucle (tige terminatrice), ce qui engendre l’arrêt
prématuré de la transcription de l’ARNm et, par le fait même, l’inhibition de
l’expression du gène.
 Régulation chez les eucaryotes
 La régulation de l’expression des gènes chez les eucaryotes est
différente de celle des procaryotes

 Les gènes réalisant la même fonction physiologique et les

séquences qui les contrôlent sont dispersés dans le génome.

 Les seuls concepts de bases retrouvés dans les deux types de

régulations sont : la présence de promoteurs et les liaisons
protéines régulatrices-DNA.

 Il n’y a pas de modèle général de régulation génétique chez les

eucaryotes comme c’est le cas chez les procaryotes.

 La régulation génétique chez les eucaryotes s’exerce à différents

niveaux.
LA RÉGULATION DE L’EXPRESSION DES GÈNES CHEZ LES
EUCARYOTES
Niveaux de régulation du flux de l’information génétique
Régulation au niveau de l’ADN

Domaines de la chromatine
Les deux formes de la chromatine:
 Hétérochromatine : Etat condensé, transcriptionnellement
inactive,
 Euchromatine : Ouverte, transcriptionnellement active
2 moyens utilisées pour les changements de forme de la chromatine
 Le remodelage et La modification des histones

 Le remodelage : repositionnement
des nucléosomes donnant accès à
une région d’ADN
 Non covalent
 Energie-dépendant
 Modifications des histones: (acétylation, méthylation,
phosphorylation)
Les modifications des histones déterminent la structure de la
chromatine :
 acétylation: histones acétyl-transférases (HAT), désacétylase
(HDAC)
 méthylation, phosphorylation….
 L’acétylation des histones induit une décondensation
de la chromatine.

L’acétylation des histones induit une décondensation de la chromatine :

 En effet l’addition de groupements acétyles sur les histones crée
des charges qui ont un rôle répulsif entre les nucléosomes.
 Ce phénomène est réversible et est contrôlée par des histones
acétylases trasférases (HAT).
 L’élimination d’un groupement acétyl se fait par des
désacétylases.
 Méthylation des bases
 L'ADN peut être méthylé au niveau des bases, notamment les
répétitions de G et C.
 5 à 10 % des cytosines sont méthylées
 DNA-méthyltransférase (dnmt)
 La méthylation des bases est reconnue par des enzymes et
déclenche la condensation de l'ADN, et conduit donc à
l'inactivation des gènes.

N.B.:
 La méthylation est conservée au cours des divisions cellulaires
 La méthylation diminue la transcription
 Cellules cancéreuses hypométhylées
 Régulation de la transcription chez les eucaryotes

Les gènes eucaryotes ne sont pas regroupés en opérons, ils

fonctionnent de façon isolée et possèdent chacun leur propre
régulation.

La régulation s'effectue de façon positive inductible, ce qui évite à la

cellule d'avoir à synthétiser des milliers de répresseurs.

La RNA-polymérase ne reconnait pas directement le promoteur, elle

reconnait un complexe multiprotéique contenant des facteurs
transcriptionnels TFIIA -TFIIE.

Les sites régulateurs d'un gène se situent dans la région 5' non
transcrite du gène promoteur.
Ces sites, au moins au nombre de cinq et constitués de 6 à 15
nucléotides, sont # cis- régulateur.

Les facteurs de régulations extérieurs au DNA sont regroupés sous le

terme de trans- régulateur, il s'agit de protéines spécifiques souvent
des récepteurs qui reconnaissent et activent une séquence de DNA cis-
régulateur
Régulation transcriptionnelle
 Régulation de la transcription chez les eucaryotes
Les cis-régulateurs sont des séquences pouvant être placées en amont, entre, ou
dans les introns de la séquence codante.
Les trans-régulateurs reconnaissent ces séquences et activent ou inhibent leur
expression.
Ces protéines possèdent un domaine de fixation sur l'ADN, un domaine
d'action (répression ou activation) et souvent un domaine d'interaction avec
d'autres ligands.

Le domaine de fixation est souvent constitué de: Hélice-double-hélice,

Fermeture à leucine ou Doigt de zinc Fermeture à leucine
Doigt de zinc
La modulation de l’expression d’un gène peut être obtenue de
différentes manières …
La modulation de la transcription implique
généralement plusieurs protéines:
 CODE GÉNÉTIQUE
La seule partie variable de la molécule d’ADN, transcrite fidèlement en
ARNm, est la séquence des bases, on peut donc penser que cette
séquence des bases constituera le message.

Quatre bases différentes doivent coder pour 20 acides aminés

différents.

Avec 3 bases codant 1 acide aminé, le système peut coder 4 3 = 64 acides

aminés. C’est plus qu’il en faut. Les 64 combinaisons sont utilisées.
Le code est dit dégénéré, c'est-à-dire que plusieurs combinaisons de 3
bases correspondent à un même acide aminé.

Codon = séquence de 3 bases de l’ARNm codant 1 acide aminé

Le code génétique est caractérisé par:

 A trois lettres  Ponctué
 Spécifique  Colinéaire
 Universel (Sauf mitochondrie)
 Non chevauchant  Dégénéré
 Caractéristiques du code génétique

1. A trois lettres: ce qui donne comme nous l’avons déjà vu 64 codons

 61 codons pour les 20 acides aminés, dont le codon AUG qui code
la méthionine et le début de la chaîne.
 3 codons de fin de chaîne : UAA, UAG, UGA

2. Ponctué:
 Codon d’initiation: Codon AUG: Début de la traduction
 Codon stop : 3 codons de fin de chaîne : UAA, UAG, UGA: Fin de
la traduction

3. Spécifique:
Chaque acide aminé est spécifié par un ou plusieurs codons qui ne
codent que pour cet acide aminé. Non ambigu

4. Colinéaire:
Il existe une homologie entre la séquence de l’ARNm et la séquence
protéique. L’ordre des codons est le même que celui des acides aminés.
5. Universel :
Le même codon définit le même acide aminé chez tous les êtres vivants.
 Il a donc été préservé au cours de l'évolution, sauf quelques exceptions
Exemple :

Exceptions au code génétique universel chez différentes mitochondries

Organisme Codon Standard Variation
AGA, AGG Arginine Stop
Vertébré AUA Isoleucine Methionine
UGA Stop Tryptophane
AGA, AGG Arginine Serine
Invertébrés AUA Isoleucine Methionine
UGA Stop Tryptophan
AUA Isoleucine Methionine
Levure UGA Stop Tryptophane
CUA Leucine Threonine
6. Non Chevauchant : la lecture se fait par séquence de trois triplets.

 Définition du cadre de lecture: qui détermine la nature du message:

5’ – CCUAUUAACGCC – 3’

Cadre de lecture 1: – CCUAUUAACGCC – = pro-ile-asn-ala

Cadre de lecture 2: – CCUAUUAACGCC – = leu-leu-thr

Cadre de lecture 3: – CCUAUUAACGCC – = tyr-stop

Les variations affectant l’ADN sont retrouvées au niveau de l’ARN

Lorsque l’ADN modifié est transcrit. Une variation de type:

AUG >ACG au niveau de l’ARN sera équivalente à la variation

ATG > ACG au niveau de l’ADN génomique…

 Mutations ponctuelles de substitution

--- UGG UGC UCC --- = --trp-cys-ser –

C>U = --trp-cys-ser – : mutation isosémantique

C>G = --trp-trp-ser – : mutation faux sens
C>A = --trp-stop : mutation non sens

 Mutations par délétion ou insertion

--- UGG UGC UCC UUA GUU AGA ---

trp cys ser phe val arg

- --- UG-U GCU CCU UAG UU ---

cys ala pro stop Décalage du
cadre de lecture
+ --- UGG UGC AUC CUU AGU UAG A ---
trp cys ile ile ser stop
Le codon AUG de début de traduction sert de référence pour le
positionnement des mutations au niveau des acides aminés et des
nucléotides de la séquence codante
7. Dégénéré :
Un même acide aminé peut être spécifié par plusieurs codons.

 Sauf pour Met et Trp (un seul triplet), on constate que la 3ème base du
triplet peut varier tout en codant pour le même aa
 Cette fluctuation portant sur la 3ème base représente une protection vis-
à-vis des mutations.  Une mutation portant sur la 3ème base ne
changera pas l’acide aminé codé et donc la nature de la protéine
La dégénérescence du code fait intervenir des interactions variables
codon anti-codon en 3ème position:

Appariement par flottement ou de Wobble

ARNt-Phe ARNt-Leu

ARNt-Phe ARNt-Leu

3ème position Appariements normaux (en haut) et WOBBLE (en bas)

entre les codons de l’ARNm et les anticodons de l’ARNt
Exemple des appariements par «flottement»

Les différentes possibilités

des appariements par «flottement»
3ème Base flottante de l’ARNm

1ème Base flottante en de l’ARNt

 Un exemple des différents codons reconnus par l’Ala-ARNt Ala

Ainsi :
 La leucine, la sérine l'arginine ont
6 codons chacun
 La valine, proline, thréonine, alanine, glycine ont
4 codons chacun
 L'isoleucine a 3 codons
 La phénylalanine, tyrosine, histidine, glutamine, asparagine,
lysine, cystéine, aspartate et le glutamate ont
2 codons chacun.
 Le tryptophane (UGG) et la méthionine (AUG) n'ont qu'un
1 seul codon chacun
 LA TRADUCTION

C’est le mécanisme par lequel le flux d’information va passer de la

forme acide nucléique ARN (alphabet à 4 lettres) à la forme protéine
(alphabet à 20 lettres) selon un code universel.

Pour synthétiser une protéine, il faut:

 ARNm = porte l’information

 Ribosome = machine à assembler les acides aminés en protéines

 Acides aminés = pièces de construction

 ARNt = molécules qui transportent les acides aminés au ribosome.

 LA TRADUCTION
 La synthèse de la protéine est centralisée au niveau des ribosomes

 Les ribosomes se déplacent dans le sens 5' vers 3' sur l'ARNm et
synthétisent le polypeptide correspondant de l'extrémité NH2
terminale vers l'extrémité COOH terminale.

 La séquence de l'ARNm est décodée par groupe de trois nucléotides

(codon) qui correspondent à un acide aminé particulier ou aux
signaux d'initiation et de terminaison

 L’appareil de traduction et son fonctionnement:

 Reconnaître les triplets codants sur l’ARNm

 Positionner les 2 acides aminés consécutifs
 Établir une liaison covalente entre les 2 AA

 On peut distinguer trois phases dans la synthèse d'une protéine:

Initiation - Elongation - Terminaison

Etape d’activation et chargement de l’acide aminé sur l’ARNt :
Aminoacyl-ARNt synthétase

Il existe 20 aminoacyl-ARNt synthétase

L’enzyme unit l’acide aminé à

l’ARNt adéquat

Site actif de l’enzyme reconnaît:

un acide aminé particulier

Et
un anticodon particulier

Acides aminés activé

et ARNt chargé
Etape d’activation et chargement de l’acide aminé sur l’ARNt :

 L’activation des acides aminés est catalysée par les aminoacyl-tRNA synthétases.
 Il en existe au moins une pour chacun des 20 acides aminés.
 Ces enzymes sont spécifiques des aa et du tRNA non chargé correspondant.
 L’enzyme hydrolyse un ATP en AMP puis active l’acide aminé en liant son COOH
avec le phosphate α de l’AMP. Le PPi est détruit par une pyrophosphatase.
 L’acide aminé ainsi activé est transféré ensuite sur une des fonctions alcool du
ribose de l’AMP 3’-terminal du tRNA.
 Liaison acide aminé -ARNt

 L’acide aminé est lié de façon covalente avec

un lien ester au ribose de l’Adénine
terminale

 Les aminoacyl-tRNA synthétases sont

spécifiques des aa et du tRNA non chargé
correspondant

 Le tRNA chargé se lie ensuite au ribosome

pour la synthèse de la protéine

ARNt
Responsables de la lecture du code génétique
et assurent donc la fidélité de la traduction
Initiation:
Association de l’ARNm et de l’Aminoacyl-ARNt initiateur à la
petite sous unité ribosomale,
Suivi par la fixation de la grande sous unité
N.B.
Les deux sous unités sont dissociées dans le cytoplasme

Elongation:
Synthèse du peptide avec la fixation de l’ARNt au site accepteur
(A) et du peptidyl au site (P)

Terminaison:
Fin de lecture a lieu au niveau du "codon STOP "
 Initiation de la traduction chez les procaryotes

 La sous unité 30S se fixe au niveau d’une séquence spécifique sur

l’ARNm (Séquence Shine-Dalgarno) située juste avant le codon
initiateur. L’ARNr 16s est impliqué dans la reconnaissance de la
séquence SD
 Fixation de l’ARNt initiateur (N-formylméthionyl-ARNt) au code
initiateur (Premier AUG)
 La formylation s'effectue après que la méthionine soit attachée à
l'ARNt. Elle est catalysée par la methionyl-ARNt formyltransférase
Les facteurs de traduction: facteurs
d’initiations IF sont nécessaires à la
fixation de l’ARNt-fmet au complexe 30S-
ARNm

 IF-1: Fact. De dissociation du ribosome 70S

 IF-3: Fixation spécifique de la sous-unité 30S

au niveau l’ARNm et empêche la ré-
association des 2 sous-unités

 IF-2: Identifie et fixe l’ARNt initiateur au

niveau du codon AUG. IF-2 utilise le GTP
pour fixer l’ARNt.

Ils sont libérés après la fixation de la sous

unité 50S et le GTP est clivé en GDP + Pi
 Formation du complexe d’Initiation impliquant les facteurs d’initiation

 IF-3 maintient les

sous unités
ribosomales
séparées

 Après fixation du
complexe d’initiation à
la sous unité 50S, le
GTP est hydrolysé,
l’ARNt initiateur
occupe le site P et les IFs
se dissocient

 IF-2 identifie et fixe

l’ARNt initiateur. IF-2 doit
fixer le GTP pour fixer
 IF-1, IF-2 et IF-3 se fixent à
l’ARNt.
la sous unité 30S pour former
le complexe d’initiation.
 Initiation de la traduction
chez les eucaryotes
 Pas de séquence SD
 Une protéine de liaison CBP (CAP
binding protein) se fixe à la Coiffe à
l’extrémité 5’ de l’ARNm
 Un complexe d’initiation est formé
avec la CBP, les facteurs d’initiation
(eIF-1 à eIF-6) et la sous unité 40S
 Le complexe analyse l’ARNm à la
recherche du premier AUG le plus
proche de l’extrémité 5’ de l’ARNm

 eIF-2 analogue de IF-2, transfert

l’ARNt initiateur au site P. Il y a
hydrolyse de GTP

 Association de la grande s/unité 60S

et les eIFs se dissocient
 Elongation de la traduction

 Le processus d’élongation se déroule en 3 étapes:

 Positionnement correct de l’aminoacyl-ARNt au site accepteur
Un 2ème aminoacyl-ARNt spécifique du 2ème codon se place au site A
Un facteur d’élongation EF1-GTP (ou EF-Tu) se fixe et délivre
l’aminoacyl-ARNt au site A du ribosome
 La liaison entre le carboxyl de la Met et le 1er ARNt est rompue par la
peptidyl-transférase
 Cette même enzyme génère ensuite la liaison peptidique entre le
carboxyle de Met et la fonction amine du 2eme aminoacide.
 Libre de Met, l’ARNtMet est éjecté
Etape de translocation

Le ribosome se déplace de 3 nucléotides dans le sens 5’→ 3’

L’ARNt portant le dipeptide passe du site aminoacyl au site peptidique:
Changement de loge et appellation de translocation
Le facteur EF2 et le GTP sont nécessaires à cette translocation
De nombreux cycles: liaison d’un ARNt spécifique de chaque triplet de
l’ARNm, formation de liaison peptidique, translocation ont lieu jusqu’à
synthétiser un peptide de plusieurs dizaines ou centaines d’aminoacides
EF1-GTP se fixe et délivre un aminoacyl-
ARNt au site A du ribosome
 Etape de terminaison
 Les étapes d’élongation et translocation sont répétées jusqu'à ce que
le ribosome rencontre un codon STOP dans le cadre de lecture: UAG,
UAA ou UGA.
 La traduction se termine quand l'un de ces codons occupe le site A.
 Les codons STOP n'ont aucun ARNt correspondant.
 Les codons STOP sont reconnus par la protéine RF ("Releasing
Factor" - facteur de libération) ou eRF chez les Eucaryotes
 Il y a 2 facteurs de terminaison chez les Procaryotes: RF-1 reconnaît
UAA et UAG, RF-2 reconnaît UAA et UGA et un seul chez les
Eucaryotes: eRF 1.
 RF-3 fixe le GTP et stimule les activités RF-1 et RF-2 (eRF-3 pour les
eucaryotes)
 La fixation des facteurs de terminaison au codon non sens au site A
transforme la peptidyl transférase en une hydrolase, qui coupe la
chaîne peptidique de l’ARNt auquel elle est fixée
 Hydrolyse de GTP est nécessaire pour la dissociation des facteurs
RFs, des sous unités ribosomales et du nouveau peptide
Cas particuliers : ARNt suppresseurs
Une mutations d’un ARNt au niveau de la séquence anticodon peut
former un ARNt suppresseur capable de reconnaître un codon stop
et de permettre ainsi la poursuite de la traduction.

ARNt-Tyr ARNt-suppresseur

AUG AUC
 Différences entre euycaryotes et procaryotes
la traduction assez similaire. Le principe est le même avec quelques variantes.
Il y a des facteurs d'initiation (IF), d'élongation (EF) et de terminaison (RF).

Eucaryotes Procaryotes
Ribosomes 80 s : 40 s + 60 s 70 s : 30 s + 50 s
Coiffe en 5' pas de coiffe
monocistronique polycistronique
séquence de Kozak (5’- séquence SD en -10
ARNm
GCCGCCRCCATGG -3’ où R est A ou G) AUG ou GUG pour le codon
AUG comme codon initiateur initiateur
queue polyA pas de polyA en 3'
ARNt initiateur aa non formylé aa formylé

Initiation eIF1 à eIF6 IF1 IF2et IF3

eEF1 EF1 -> liaison de l'aatRNA
Elongation
eEF2 EF2 -> translocation
RF1 -> UAA et UAG
eRF 1 (release factor)
Terminaison RF2 -> UAA et UGA
eRF3
RF3
Vitesse de la
~ 16 AA / s ~ 5 AA / s
synthèse
 SIGNAL-PEPTIDE
 Lors de la synthèse d’une protéine, sa structure secondaire ou tertiaire se
construit au fur et à mesure de la traduction et elle est libérée dans le
cytoplasme.

 Si cette protéine est destinée à être incorporée dans les membranes ou les
organites de la cellule, la partie codante de l’ARNm commence par une
séquence de quelques acides aminés qui sert d’adresse pour
l’incorporation de cette protéine dans la membrane.

 Ces peptides orientent la destinée de la protéine : incorporation dans les

membranes (RE, appareil de Golgi, membrane plasmique, lysosomes...),
entrée dans les mitochondries, excrétion hors de la cellule via l’appareil
de Golgi, etc...

 Le signal-peptide est un peptide d’adressage situé à l’extrémité NH2-ter

des protéines à excréter. Parce que sa fonction est de pénétrer dans la
membrane du RE, sa structure est riche en acides aminés hydrophobes
(Phe, Leu, Ile, Met, Val).
Signal-peptide:
Chainon de quelques AA (15 à 20) à l’extrémité N-ter de la
forme traduite de certaines protéines destinées à être
excrétées hors de la cellule
 Liaison du peptide signale avec la
SIGNAL-PEPTIDE SRP (Signal Recognition Particle)
==> Arrêt de la traduction

Reconnaissance de
la SRP par une
récepteur de la
membrane du RE
=> Liaison du
ribosome à la
ribophorine de la
mbra du RE

 Le SRP est écarté, une endopeptidase spécifique va couper le peptide signal et la

synthèse se poursuivra jusqu’à la terminaison

 Le peptide en cours de synthèse est alors dirigé à travers cette membrane pour se
développer dans la lumière du RE. La protéine sera enfin incorporée dans une
membrane ou exportée, à travers l’appareil de Golgi, vers l’extérieur de la cellule.

 L’adressage des protéines vers les mitochondries fait appel à un autre type de peptide
d’adressage qui conduit les peptides à traverser la membrane mitochondriale.
 Modifications post-traductionnelles

 De nombreuses modifications chimiques se produisent après

l’incorporation des acides aminés dans la structure primaire de la
protéine (traduction) ; on les appelle modifications post-
traductionnelles.

 On distingue des modifications:

 cotraductionnelles qui se produisent alors que la traduction se
poursuit encore et que le peptide naissant est encore attaché au
ribosome qui l’a construit,
 des modifications post-traductionnelles proprement dites qui ont
lieu dans la cellule, dans les organites ou hors de la cellule.

On appelle protéine mature la forme chimique définitive que la

protéine montrera au moment où elle remplira sa fonction dans
l’organisme.
Modifications post-traductionnelles
 TECHNIQUES GÉNÉRALES
DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

Plusieurs outils ont été développés pour étudier les acides

nucléiques:
Les séparer, les purifier, les analyser, les amplifier, les cloner,
pour les transporter grâce à des vecteurs de clonage, les intégrer
dans des cellules hôtes

Ces outils ont permis de mettre en place des techniques qui sont
à l’origine du développement de la biologie moléculaire.
I. Méthodes et outils généraux

1. Extraction et purification du matériel génétique

L’extraction et la purification des AN sont les premières étapes dans la

plupart des études de biologie moléculaire et dans toutes les
techniques d’ADN recombinant.

L’objectif des méthodes d’extraction des acides nucléiques dans le cas

présent est d’obtenir des acides nucléiques purifiés, tirés de sources
diverses, afin de pouvoir mener une analyse spécifique.

Vu qu’il existe une grande diversité de méthodes d’extraction et de

purification des AN, le choix de la technique la plus adéquate repose
généralement sur les critères suivants :
 L’acide nucléique cible,
 L’organisme source et le matériel de départ (tissu, feuille, graine,
matériel transformé, etc.),
 Les résultats escomptés (rendement, pureté, temps de purification
requis, etc.),
Le déroulement d’une analyse type est décrit comme suit:
 Quantité extraite
ADN des cellules eucaryotes animales = ADN nucléaire
+ADNmit

Source: le sang, tissus (biopsies), cultures cellulaires…

 Chez l’homme
» (2 x 3 109) x 660 / 6,02 1023  6-7 10-12 g/Celllule

 1ml de sang 5-6 106 leucocytes soit 3 10-6 g d’ADN

Et 1014 cellules dans le corps humain soit

600 g d’ADN
 Principales étapes de la purification des AN
Différents protocoles pour extraire les AN avec même schéma de principe :

Prélèvement biologique

Lyse des cellules nuclées  Lyse par détergents

 Traitement mécanique

Dégradation des protéines  Traitement par la protéinase K

 Solvants organiques
Extraction des AN  Agents chaotropiques
 Fixation par interaction decharges

Précipitation de l’ADN  Alcools

 Remarque:
L'extraction des ARN est très différente de celle des ADN, car ils
sont beaucoup plus fragiles ( simple brin, —OH attaquable … ).
On utilise à peu près le même protocole qu'avec l’ADN sauf qu'il
faut ajouter un inhibiteur des RNases, des DNases ainsi qu'un agent
réducteur.
 Devenir des acides nucléiques extraits
 Exploitation directe avec ou sans amplification
 Quantification par dosage des acides nucléiques
Spectrophotomètre ( = 260 nm)
ADN double brin : 1 unité de DO <==> 50 g/ml
ADN simple brin : 1 unité de DO <==> 33 g/ml
ARN : 1 unité de DO <==> 40 g/ml
==> Détermination du rapport DO 260/DO 280 nm

 Si le rapport entre 1,7 et 2 ==> Extraction OK

 Si le rapport est < 1,7 ==> Refaire l’extraction OK
 Conservation :
 En solution, à 4°C : qq années
 Sous forme précipitée à -20°: plus long terme
 2. Outils enzymatiques pour étudier l’ADN

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques très largement utilisées

en biologie moléculaires: Couper, Lier, Copier et également Marquer:
Nucléases, Ligases, polymérases, Kinases, Phosphatases….. etc

Nucléases

Exonucléases Endonucléases
Exo 5’>3’ ou Exo 3’ >5’

DNases RNases
RNase H, A, T1, …

Enzymes de restriction Autres

Nucléase S1, Mung bean Nuclease,
DNase 1; DNase 2…
2.1. Coupure des acides nucléiques:

Les enzymes de restriction : ER

 Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le
plus souvent des bactéries.

 Les bactéries parasitées par des virus à ADN, synthétisent des

enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN
étrangers.

 Pour éviter une auto-destruction de leur propre ADN, elles se

protègent contre leurs propres enzymes de restriction par une
modification des sites de restriction correspondants.
 Modification des nucléotides de l’ADN bactérien en les
méthylant pour ne plus être reconnus par l’ER par une enzyme
méthylase.

 Ou Absence du site de restriction de l’ADN bactérien

L’ensemble du gène de restriction et du gène de méthylation

constitue un système de défense de la Bactérie vis-à-vis ADN
Nomenclature des enzymes de restriction:
 Désignées selon une sorte de codification comprenant:

 Le nom de la bactérie, puis celui de la souche et un numéro

d’ordre en chiffre romain

 Pour spécifier la séquence reconnue, un seul brin est écrit dans le

sens 5’ → 3’ et la liaison hydrolysée est représenté par un trait
Enzyme Séquences Micro-organismes
EcoRI G/AATTC Escherichia coli
HpAI GTT/AAC Haemophilus
parainfluenzae
BamHI G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens
AluI AG/CT Arthobacter luteus
HindIII A/AGCTT Haemophilus influenzae
Les sites de restrictions
ER catalysent la coupure de l’ADN non méthylé en hydrolysant les
liaisons phosphodiester en des sites d’ADN:

Site de restriction = séquence palindromique de 4, 6 ou 8 bases dans

une orientation anti-parallèle.

Selon la position de la liaison hydrolysée, les fragments ont une

propriété particulière:

 Une coupure décalée par rapport à la séquence reconnue forme

des fragments collants ou cohésifs: Coupures cohésives

 Une coupure au milieu de la séquence palindrome donne des

fragments non cohésifs: coupures Franches
Les isoschizomères:
Sont des enzymes de restriction provenant de souches bactériennes
différentes mais reconnaissant un site de restriction identique.
Leurs propriétés physiques sont parfois différentes et ceci est
particulièrement intéressant lorsque les enzymes sont sensibles à la
méthylation, ils permettent alors de repérer les cytosines méthylées des
cytosines non méthylées.
Exemples:
- Soit la séquence suivante: CCGG, - Soit la séquence suivante:
cette séquence est coupée par GGTACC, cette séquence est
l'enzyme MspI et l'enzyme HpaII: coupée par l'enzyme Kpn I et
l'enzyme Acc65 I:
Site de coupure de MspI et HpaII Site de coupure Kpn I:

Coupure par MspI Et pas par HpaII

Site de coupure Acc65 I :
Les sites de restrictions
 Les produits de cette digestion (fragments de restriction), dont la
longueur, toujours la même pour un ADN donné, ne dépend que de la
séquence primaire de cet ADN.

 La fréquence des sites de coupure est fonction du nombre de base

intervenant dans la spécificité.

 Si l’on suppose que dans l’ADN examiné, l’ordre des 4 bases est
statistiquement aléatoire

 Il est donc possible de calculer la longueur moyenne des fragments

d’ADN obtenus:

 Site EcoRI: 6 bases = probabilité 46 = 4096 paires de bases

 Site AluI : 4 bases = probabilité 44 = 256 paires de bases

 Si l’on opère avec une enzyme spécifique d’une séquence de 6 bases:

 Le génome humain génère environ 750 000 fragments de l’ordre de

4000 pb puisque le génome compte 3 milliards de pb
2.1. Coupure des acides nucléiques:
Les endonucléases
Contrairement aux enzymes de restriction, les endonucléases ont une
spécifité large et hydrolysent les liaisons ester à l’intérieur de la chaîne.
▪Nuclease S1: ADN simple brin
▪DNAses = DNAse I: ADN double ou simple
brin
▪RNAses:
 RNAse A: ARN
 RNAse H: Hybride ARN/ADN

Les exonucléases:
libèrent par hydrolyse les nucléotides situés au niveau des extrémités :
5’→ 3’ ou 3’ → 5’
extrémité 5’ Endonucléase extrémité 3’

a
b 3’
P P P P P P OH
5’
Exonucléase Exonucléase
2.2. Copier les acides nucléiques: Les polymérases
Elles permettent de synthétiser soit de l'ADN, soit de l'ARN à partir
d'une matrice ADN ou ARN, le processus s'effectuant toujours de 5' → 3'.
ADN Polymérases
 Produit : ADN
 Matrice: ADN simple brin + Amorce
 Activités exonucléases 3’ 5’ et/ou 5’ 3’ exonucléases : +/-
La Taq polymérase:
 Provient de bactéries vivant dans les sources d'eau chaude.
 Thermostable et agit à une température voisine de 65°C.
 Son utilisation principale est l'amplification enzymatique in vitro
 Pas d’activités exonucléasiques
ARN Polymérases
 Produit : ARN
 Matrice: ADN simple brin
ADN polymérase ARN dépendante (réverse transciptase)
 Produit : ADN
 Matrice: ARN + Amorce (poly T)
2.3. Coller les acides nucléiques: Les Ligases

Les ADN ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la
liaison phosphoester entre le carbone 3’-OH et le phosphate-5’ de deux
nucléotides voisins sur un brin de DNA.
2.4. Marquage de l’ADN

Il existe deux principales méthodes de marquage des acides nucléiques:

 Les isotopes radioactifs: 32P, 33P, 35S…
 Les agents intercalants: fluorophores, biotinylation...

 Marquage aux extrémités:

 Extrémité 3’-OH: Terminal transférase
 Extrémité 5’-Pi: ATP- 32P et T4 Kinase

 Marquage interne par amorçage aléatoire (random priming)

3. Séparation des fragments d’ADN
Plusieurs techniques de séparation de l’ADN sont utilisées
 Electrophorèse sur gel (Agarose, polyacrylamide….)

Ln MM en fonction de Rf

 Révélations
 Coloration chimique des gels
 Autoradiographie
 Utilisation des molécules fluorescentes
 D’autres méthodes de séparation sont également
utilisées:

 Electrophorèse en champ pulsé

 Alternance d'orientation du champ électrique au cours du
temps.
 Séparation de fragments > 50000 pb
 Electrophorèse Capillaire
Séparation des espèces chargées sous l’effet d’un champ
électrique continu dans un tube capillaire de 50 à 100 µm Ø
rempli d’une solution d’électrolytes.
 HPLC
Chromatographie Liquide Haute performance:
II. Hybridation moléculaire:
Sondes moléculaires et hybridation:
Outils moléculaire à la base des techniques d’hybridation
moléculaire (hyb .Sonde / ADN cible)

Définition: Séquence d'acide nucléique, d’au moins 20 nucléotides

homologue à une séquence d'ADN ou d'ARN avec laquelle elle
s’hybride de façon stable et spécifique par réassociation entre
bases complémentaires.

Principaux types de sondes: ADNc, Oligonucléotides de synthèse

(= oligosondes), Ribosondes (Sondes ARN)…..

Intérêt: Repérer spécifiquement une ou quelques séquences

d’acide nucléique dans un mélange complexe d’acides nucléiques.

Marquage: Necessite un marquage sur la cible ou la sonde (cf.

marquage).

Hybridation: Association de 2 séquences d’acides nucléiques sous

forme simple brin sur la base de leur complémentarité.
 HYBRIDATION MOLÉCULAIRE

Dénaturation
complète du DNA 95 °C

Renaturation par refroidissement progressive

en présence des sondes marquées
Facteurs influençant l’hybridation:
 La température: La température optimale d’hybridation est
en général inférieure à la Tm de la sonde

 La taille des fragments ou des sondes

 La force ionique: l’hybridation est accélérée en forte

concentration saline

 La nature des hybrides: la stabilité des hybrides des plus

stables aux moins stables est la suivante:
ARN/ARN > ARN/ADN > ADN/ADN
 OBTENTION D'UN ADNc
L'ADNc (complémentaire) simple brin est obtenu après une réaction
de transcription inverse d'un ARNm mature.
L'ADNc double brin résulte de la copie du premier brin par une ADN
polymérase.
L'ADNc est utilisé pour étudier l'expression des gènes: plus stable que l'ARN et
plus facile à utiliser dans les techniques de clonage de protéines recombinantes.
L'ADNc ne contient pas les introns

Amorce

Boucle en épingle
Les différents types d’hybridation

L’hybridation peut avoir lieu

1 - En solution

2 - Sur support solide :

immobilisation de la cible sur une membrane (nitrocellulose,
nylon), sur verre; colonies bactériennes; chromosomes; coupe
de tissus...

Objectif :
Détecter la présence d'une séquence donnée d'un acide nucléique
par l’utilisation d’un fragment d’ADN complémentaire = sonde
Hybridation sur membrane:
 Support solide : Membrane de Nylon
 Principales techniques:
 Southern-blot (hybridation sonde ADN/ADN cible)
 Northern-blot (hybridation sonde ADN/ARN cible)
 Western-blot (hybridation protéines/Anticorps)
 Procédure: Extraction ADN, Fragmentation, Electrophorèse
Transfert, Hybridation, Lavages et Révélation
III. Amplification des acides nucléiques
L’ADN peut être amplifié par clonage: Amplification in vivo
ou in vitro, la PCR (Polymerase chain reaction).

1. Amplification in vivo par Clonage:

C’est la recombinaison in-vitro d’un fragment d’ADN (Insert) avec
un vecteur se répliquant de façon autonome dans une cellule hôte.
La culture de cette cellule contenant le vecteur recombiné permet
l’amplification et l’isolement de l’ADN inséré.

Les propriétés du vecteur:

 Il doit se répliquer de manière autonome
 Il doit permettre la sélection des cellules l’ayant incorporé
 Il doit posséder au moins un site unique de restriction pour le
clonage du fragment recombinant

N.B.:
Construits soit à partir de molécules naturelles telles que les
plasmides ou les phages, soit de façon artificielle comme les YAC
(Yeast artificial chromosom), chromosomes artificiels de levure,
BAC….
 3. Présentation d’un vecteur : Exemple du plasmide

Promoteur (pour pouvoir

exprimer la protéine Site de clonage multiple :
a) Vecteur
d'intérêt il faut cloner la nombreux sites de restriction
séquence d'ADN en phase uniques permettant
avec le promoteur. l'insertion de l'ADN après le
promoteur

Origine de
réplication Plasmide : petite molécule
dans la extrachromosomique, d'ADN
bactérie double brin circulaire, de 3 à
10 kilobases. Capable de se
Marqueur de répliquer indépendamment
sélection : du chromosome bactérien et
résistance contre pouvant être transféré d'une
l'antibiotique cellule à une autre.
kanamycine
 2. Amplification des acides nucléiques in vitro

La PCR: Polymerase Chain Reaction

Définition:
Amplification exponentielle d’une séquence d’ADN double brin
effectuée in vitro par extension de 2 amorces situées de part et
d’autre de la région considérée à l’aide d’une ADN polymérase
thermostable .

La PCR permet de recopier un segment d’ADN des millions de

fois et de le rendre visible, grâce à un appareil qui contrôle les
changements de températures à différentes étapes de la réaction:
 Température de dénaturation
 Température d’hybridation
 Température d’extension
Principe

Il s’agit de réaliser une succession de réaction d’une matrice double

brin ADN, chaque réaction met en œuvre deux amorces dont les
extrémités 3’ pointent l’une vers l’autre.

Basée sur le mécanisme de réplication de l’ADN

Polymérase thermostable
Répétition de cycles: amplification exponentielle

4 éléments sont nécessaires:

Amorces, dNTPs, ADN, ADNpol

Les deux amorces sont de petits brins d'ADN d'environ 20 bases,

(appelés oligonucléotides) capables de s'hybrider de façon
spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin
d'ADN ou sur son brin complémentaire.

Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN

à amplifier.
 Le nombre de brins obtenus à la fin du premier cycle est le double
du nombre de brins initialement présents.

 Amplification se fait donc par répétition de cycles à 3 étapes

 Rendement théorique : 2n (n = nombre de cycles)

 Rendement réel: 1,85n

Amplification à partir d’ARN: RT-PCR

RT PCR
ARNm ADNc

Existence de nombreuses variantes de la PCR

PCR allèle spécifique, Longue PCR, Nested PCR,
PCR touch-down, PCR multiplex……
En PCR classique: 25 à 40 cycles sont effectués

Cinétique d’une PCR

Equation de la PCR:
Xn=X0En
E: efficacité d’amplification
0<E<2; n: nombre de cycles
Si E=2, Xn= X02n
 Valeur de CT et quantité d’ADN initiale

CT = valeur du cycle à partir duquel le produit devient détectable

+ Concentré - concentré

Plus la quantité d’ADN initiale est élevée, plus la

valeur de CT est faible
 Les applications de la PCR
 Détection de polymorphismes
Détection de la présence de plusieurs allèles pour un gène
ou locus donnés dans une population
 Médecine légale, Criminologie…

 Diagnostic des maladies héréditaires

 Séquençage

 Diagnostic en virologie, parasitologie, bactériologie

Détection et quantification de microorganismes
Caractérisation génomique

 Etc….
Licence Sciences & Technique
Analyses Biologiques
et Contrôle Qualité
" Biologie Moléculaire "

Fin