République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université 20 Aoû t 1995 Skikda
Exposé sur :
PCR: Polymerase Chain Reaction
Réalisé par :
-Mihoub Rokia - Mallem Nesrine
- Mezedjri Selma - Tebai Ibtissem
PLAN
C’est quoi une P C R …
Le mixe ré actionnel
Les cycles de la P C R
Dé tection et analyse du produit de P C R
Les applications de la P C R
C’ E ST Q U O I U N E P C R
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique
utilisée en biologie moléculaire pour amplifier quelques
copies d'un morceau d'ADN, générant des milliers à des
millions d'exemplaires d'une séquence d'ADN particulière.
L E MIXE RÉ ACTIONNEL
Nous avons besoin de quoi….
ADN cible
Enzyme (Taq polymerase)
dNTPs
Amorces
Mg2+
Tampon
L E MIXE RÉ ACTIONNEL
ADN cible
Environ 10000 copies de l'ADN cible sont né cessaires pour dé tecter le produit
dans 25-30 cycles de P C R .
Utilisez 1pg-1ng de plasmide ou d’ADN virales
Utiliser 1ng-1μg de modè les gé nomiques
L E MIXE RÉ ACTIONNEL
Amorces
Choix des amorces:
Généralement entre 20 et 30 nucléotides
40-60 % GC pour une bonne fusion lors de l’hybridation avec l’adn cible
des Tm comparables. Les oligonuclé otides amorces doivent s’hybrider à
l'ADN matrice dans les mê mes conditions de tempé rature,
des sé quences qui ne soient pas complé mentaires entre elles (en
particulier dans la ré gion 3’),
des sé quences qui ne contiennent pas de sé quences ré pé té es inversé es
(pas de repliement intramolé culaire).
L E MIXE RÉ ACTIONNEL
Taq Polymérase
Taq Polymérase est une enzyme thermostable extraite de la
bactérie Thermus aquaticus
Stable à T° allant jusqu'à 95° C
Haute processivité
Taq Pol a une activité exonuléasique 5'-3 ' seulement, pas
d’activité Proofreading
L E MIXE RÉ ACTIONNEL
dNTP
Deoxynucleotides : (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Concentration optimale 200 µM, en excès par rapport a
l’ADN matrice
Mg2+
Nécessaire pour la réaction de polymérisation de la Taq
Concentration optimale 1,5 à 2 mM
Tampon
Le tampon de la Taq ADN polymerase est un tampon 10X [Tris
HCl 200 mM (pH 8,4), KCl 500 mM]
L E S C YC L E S DE LA P C R
Cycle 3
Cycle 2
Cycle 1
A D N matrice
Amplification en exponentielle……
L E S C YC L E S D E L A P C R
CYCLE NUMBER DNA copy number
0 1
1 2 Amplification en exponentielle
2 4
3 8
4 16
5
6
32
64
Copies of DNA=2 N
7 128
8 256 1.8E+09
9 512 1.6E+09
10 1,024
11 2,048 1.4E+09
12 4,096 1.2E+09
DNA copy number
13 8,192
1.0E+09
14 16,384
15 32,768 8.0E+08
16 65,536
6.0E+08
17 131,072
18 262,144 4.0E+08
19 524,288
2.0E+08
20 1,048,576
21 2,097,152 0.0E+00
0 5 10 15 20 25 30 35
22 4,194,304
PCR cycle
23 8,388,608
24 16,777,216
25 33,554,432
26 67,108,864
27 134,217,728
28 268,435,456
29 536,870,912
30 1,073,741,824
31 1,400,000,000
32 1,500,000,000
33 1,550,000,000
34 1,580,000,000
L E S C YC L E S D E L A P C R
Etape 1 : Dé naturation de l’ADN matrice à 95°C
L E S C YC L E S D E L A P C R
Etapes 2: Hybridation des amorce avec l’ADN cible à la
température Tm (40 et 65°)
L E S C YC L E S D E L A P C R
Etape 3 (Elongation): a 72°C la Taq polymérase catalyse l’extension
des amorces en utilisant l’ADN cible comme matrice
L E S C YC L E S D E L A P C R
D É T E C T I O N E T A NA LY S E D U P RO D U I T D E
PCR
É lectrophorè se
D É T E C T I O N E T A NA LY S E D U P RO D U I T D E
PCR Marqueur
poids
moléculaire
Puits
Sens de
migration
Echantillon
Visualisation des bandes grâ ce a un fluorophore (EX:
Bromure d’é thidium)
L E S A P P L I C AT I O N S D E L A P C R
Clonage
L E S A P P L I C AT I O N S D E L A P C R
RT PCR: real time PCR
Technique qui permet de
quantifier l’ADN en
temps ré el
L E S A P P L I C AT I O N S D E L A P C R
Séquençage