L'IMMUNOÉLECTROPHORÈSE
• C'est une méthode qui associe l'électrophorèse
de protéines (antigènes) à une immunodiffusion
contre des anticorps spécifiques.
• Elle aboutit à une réaction antigène-anticorps en
donnant un arc de précipitation par couple Ag-Ac.
L'arc se forme à l'endroit où antigène et anti-
corps se rencontrent dans les conditions où le
rapport de leurs concentrations est optimal.
L'immunoélectrophorèse se réalise en deux
temps.
Electrophorèse Immunodiffusion
Premier temps: Le temps d'électrophorèse
• Les antigènes sont séparés en
électrophorèse de zones sur une lame
placée en position horizontale de gel
d'agar tamponné à pH variable de 8,2 à
8,6.
• La gélose tamponnée constitue un bon
support d'électrophorèse.
• L'électrophorèse dure 20 minutes / 100
volts
Deuxième temps:
L'immunodiffusion
• Une fois l’électrophorèse terminée, l'antisérum
spécifique est déposé dans une
rigole découpée parallèlement à la direction de
la migration électrophorétique. La
plaque est placée en chambre humide pendant
24 à 48 heures.
• Les arcs de précipitation apparaissent sous forme
d'arcs de cercles blanchâtres.
• En raison de la diffusion, des gradients de densité
de l'antigène et de l'anticorps sont obtenus et à
un rapport antigène/anticorps spécifique
L'interprétation
• Situation 1: Dans le cas où deux Ag identiques sont
déposés dans deux puits adjacents, il y a formation
d’un arc continu, on parle alors de réaction d’identité.
• Situation 2: si les deux Ag déposés sont différents et
sont reconnus par deux Ac différents de l’antisérum, il
y a formation de deux arcs de précipitation qui se
coupent, dans ce cas on parle de réaction de non
identité.
• Situation 3: Si les deux Ag présentent des
déterminants antigéniques communs, dans ce cas il y
a formation d’un éperon, traduisant une identité
partielle
Facteurs physico-chimiques d’influence de la stabilité de la
réaction
Ag-Ac.
• pH optimal: pH physiologique allant de 7,3 à 7,5. Les grandes variations
de pH engendrent l’altération des structures tridimensionnelles des
protéines des anticorps et des antigènes. Cela perturbe la formation et la
stabilité des complexes immuns,
• Température: La vitesse des réactions immunologiques augmente à
l’intervalle de température compris entre 0 et 37°C. Les structures
moléculaires se dénaturent à partir de 46°C.
• Agitation: une agitation douce augmente les chances de rencontre entre
l’Ag et l’Ac.
L'IMMUNOÉLECTROPHORÈSE
UNIDIMENSIONNELLE BIDIMENSIONNELLE
Application;
• Détecter la présence ou l'absence de protéines dans le sérum
dans les laboratoires cliniques.
• Déterminer les concentrations relatives d'anticorps / antigènes
• Comparer les antigènes ou pour déterminer la pureté relative
d'une préparation d'antigène.
• Il peut également montrer si un patient surproduit certaines
protéines sériques, telles que l'albumine, l'immunoglobuline ou
la transferrine.
Électrofocalisation
• C'est une méthode de séparation des protéines en fonction de leurs points
isoélectriques. L'électrophorèse est pratiquée sur lame ou sur colonne, dans
lesquelles on a préétabli un gradient de pH.
• Les protéines déposées migrent vers l'anode (+) ou la cathode (-) selon leur
charge mais, au fur et à mesure de leur déplacement, le pH extérieur varie,
ainsi que leur propre charge : elles ne migrent plus quand leur charge nette
est nulle, c'est-à-dire qu'elles focalisent à l'endroit où le pH est égal à leur
propre pHi.
Comment le gradient de pH est-il créé ?
L'ampholyte A a un pH acide
• A l'aide d'ampholynes qui sont les
ampholytes supports : ce sont des
mélanges d'un certain nombre de
molécules de faible masse molaire,
donc très mobiles, et comportant
chacune plusieurs groupements acide
carboxylique et amine. L'ampholyte B a un pH, alcalin
• On peut raisonner sur un exemple
théorique, beaucoup plus simple que la
réalité. Soit deux ampholytes:
En milieu neutre
A possède une charge nette négative. B possède une charge nette positive.
• Donc le pôle anodique (+) attire les ampholytes
acides (ayant un pH, bas), le pôle cathodique (-)
attire les ampholytes alcalins.
• Il se crée ainsi un gradient de pH qui augmente
de l'anode à la cathode.
• On utilise différents mélanges couvrant toutes
sortes d'intervalles de pH des gammes larges de
7 unités de pH (3-10), des gammes étroites
acides (5-7). La gamme de pH étant choisie en Les ampholytes a pH acide migrent
fonction de la séparation à réaliser. vers l'anode, les ampholytes a pH
basique migrent vers la cathode. où
pH = pHi , elles sera neutre et
arrêtera de migrer
Application
• La focalisation isoélectrique est utilisée pour de déterminer la
sévérité du diabète chez une personne en déterminant la variation
des charges de l’hémoglobine due à des modifications aux
groupements amines.
• Permet de faire la différenciation des protéines que l’on retrouve
dans les produits laitiers.
• La caractérisation de certaines espèces de plantes comme le blé
• Elle est utilisée pour des analyses de routine en clinique entre autres
pour l’amylase.