La Green Fluorescent Protein (GFP), une protine
incontournable pour limagerie du vivant
Exemples dapplications ltude du dveloppement vgtal
Franois Roudier
Equipe Diffrenciation et Identit Cellulaire
Biologie Cellulaire
Aequorea victoria : linventeur de la GFP
La GFP : une protine fluorescente par transfert dnergie
La GFP : une structure en lanterne et un
fluorophore protique auto-catalytique
- 238 aa (26 kDa), N- et C-terminal accessibles
- Forte stabilit : rsiste 65C, pH entre 5,5-12,2, 8M ure, 1% SDS, protases (2j)
De la GFP sauvage la GFP amliore
Plusieurs mutations ont t introduites pour :
- Optimiser lexpression de la protine
Usage optimal des codons et limination dun intron cryptique (20X plus de protine)
Maturation du fluorophore (4X plus vite)
- Modifier les proprits spectrales de la protine
Pic dexcitation unique 490 nm
Brillance (X6)
Un outil versatile pour ltude du vivant
La GFP : une protine non toxique pour des
mthodes de visualisation non invasives
Variants de la GFP et autres protines fluorescentes
CFP GFP
YFP
(DsRED) RFP
Discosoma striata
Des protines fluorescentes avec diffrentes proprits spectrales
Une plante modle: Arabidopsis thaliana
Le dveloppement vgtal est essentiellement post-embryonnaire
et rsulte de lactivit constante des mristmes
Animal
Plante
Zygote
Embryon
Adulte
Organogense et
Croissance indtermine
Les mristmes contiennent les cellules souches et sont
organiss en domaines fonctionnels
Mristme apical
feuille
mris t me
primordium
ZC
ZP
MM
ZP
L3 L2
L1
Arabidopsis
adulte
Mristme racinaire
Exemples dapplication de la technologie GFP ltude
du dveloppement des plantes
- Profil dexpression dun gne
- Etude fonctionnelle dune protine
Localisation subcellulaire
pPromoteur:GFP
(fusion transcriptionnelle)
pPromoteur:CDS::GFP
(fusion traductionnelle)
Mouvement
Interaction protine-protine (FRET)
- Biosenseurs
Le mristme racinaire : une organisation dpendante de
divisions strotypes des cellules souches
stele
epidermis
endodermis
cortex
Division asymtrique
lateral
root cap
quiescent
center
(QC)
columella
cortex/
endodermis
initial
Cell types in the Arabidopsis root meristem
Deux mutants dficients dans la mise en place et la
diffrenciation de lendoderme
cor
end
Wild type
cor+end
scarecrow
(scr)
short-root
(shr)
cor
Expression de SCR dans la racine
cortex
Promoteur SCR
GFP gene
endodermis
ARN GFP
c/e initiale
QC
Protine GFP
pSCR
GFP
Localisation de la protine de fusion SCR::GFP
cortex
Promoteur SCR
SCR gene
GFP
endodermis
c/e initiale
ARN
QC
SCR::GFP
pSCR
SCR GFP
(Complmentation du mutant scr)
SCR est ncessaire pour la mise et place et la
diffrenciation de lendoderme dans la racine
cortex
cortex
endodermis
endodermis
c/e initiale
c/e initiale
QC
QC
pSCR
GFP
pSCR
SCR GFP
SHR contrle la mise et place et la diffrenciation de
lendoderme dans la racine de faon non cellule-autonome
ep
ep co
st
co
st
en
en
in
pSHR
qc
GFP
in
pSHR
qc
SHR GFP
La protine SHR bouge de la stle vers lendoderme !
Analyse du transcriptome de lendoderme racinaire
Digestion
paroi
pSCR:GFP
Rcolte pointe
racinaire (15000)
Plantules in vitro
Hybridation
Puce Affymetrix ATH1
25K gene arrays
Triage par fluorescence
des protoplastes GFP+
Extraction ARN
Amplification
Marquage des sondes
300 000 protoplastes
Endodermis
Epidermis
Lateral
rootcap
Pericycle
Collection de
marqueurs spcifique
dun type cellulaire
Endo
+
Cortex
QC
Le mristme apical caulinaire
Le mristme apical caulinaire : Une zonation fonctionnelle
pour la croissance, lorganogense et auto-maintien
Auto maintien
Organes
latraux
ZC
ZM
ZM
ZM
Feuille
Jeune feuille
Tige
Primordium
Le mristme apical caulinaire
Une organogense dynamique et structure
Vue davion
Cintique sur 65h
Acquisition toutes
les 2h30
QuickTime et un
dcompresseur TIFF
sont requis pour visionner cette imag e.
Marqueurs molculaires des zones fonctionnelles et identits
cellulaires du MAC
SHOOT MERISTEMLESS
WUSCHEL
LEAFY
AINTEGUMENTA
CLAVATA1
CLAVATA3
ATML1
CUP-SHAPED COTYLEDONS
pANT:GFP, un marqueur de linitiation et de la mise en
place des primordia foliaires
pANT:GFP
Coloration vitale + pANT::GFP
Dynamique de la diffrenciation des primordia : recrutement puis prolifration
pANT:GFP
T = 0h
T = 32h
T = 24h
T = 48h
Dynamique de la diffrenciation des primordia : recrutement puis prolifration
aprs le recrutement : prolifration cellulaire
Phyllotaxie : initiation des primordia en 3D
Une disposition en spirale prdictible
P0
P5
P3
P6
P2
P1
P7
P4
Phyllotaxie et thorie des champs inhibiteurs
Phyllotaxie et thorie des champs inhibiteurs
Phyllotaxie et thorie des champs inhibiteurs
Phyllotaxie et thorie des champs inhibiteurs
Lauxine, une phytohormone transporte de faon polarise, est
implique dans le contrle de la phyllotaxie
Transport polaris de lauxine (AIA):
Localisation des transporteurs laide de FPs
1
(membrane apicale)
Sens du TPA
AIAH
AUX
H++ AIA-
pAUX1:AUX1::YFP
PIN
Transporteur defflux
(membrane basale)
AIAH
3
Transporteur dinflux
pPIN1:PIN1::GFP
Modle du contrle de la phyllotaxie par PIN1 et des
flux dauxine (DR5:GFP)
pDR5:GFP
Un senseur transcriptionnel de lauxine
(pDR5 : 9 x AuxREs)
Auxine
P0
P2
Gradients locaux dauxine par pompage
P3
P1
Interaction entre deux protines
Mesure de linteraction entre deux protines par
"Fluorescence Resonance Energy Transfert (FRET)
D
GFP
D A
A
RFP
1- Compatibilit spectrale des fluorochromes
2- Proximit molculaire des fluorochromes
Co-localisation de deux protines
Application de la technology FRET au vivant :
la protine camlon, un biosenseur du calcium
Mesure ratiomtrique de flux calciques chez le ver, C. elegans
Mesure ratiomtrique de flux calciques chez le ver, C.
elegans
[Ca2+] nulle
Excitation 440 nm
CFP spare de YFP
(pas de FRET)
[Ca2+] faible
YFP/CFP faible
(peu de FRET)
QuickTime et un
dcompresseur Video
sont requis pour visionner cette imag e.
[Ca2+] forte
YFP/CFP lev
(FRET max)
Exemples dapplication de la technologie GFP
Quelques limites
- Profil dexpression de gnes
- Etude fonctionnelle de protines
- Biosenseurs
Localisation subcellulaire
Mouvement
Interaction protine-protine
(FRET)
Limites :
- Sensibilit (difficile de dtecter les gnes faiblement exprims)
- Ajout dune protine (encombrement, environnement bio)
- Panoplie de FPs encore limite
LHP1::GFP
QuickTime et u n
dcompresseur Video
sont requis pour visionner cette image .
Principe de transformation gntique stable chez les plantes
Dbut de floraison
Transformation de la ligne germinale
Slection des transformants
partir des graines
Etapes de
dveloppement
In situ digitale des diffrents types cellulaires de la racine
Assises
cellulaires