Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA

Faculté des Sciences
Département de Chimie

Mémoire
Présenté par

Mohamed CHENNI

Pour l’obtention du Diplôme de

Magister
Spécialité : Chimie Moléculaire : Analyse, Modélisation, Synthèse

_ ___ ___ ___ ___ __ ___ ___ __ _

Contribution à l’étude chimique et biologique de la

racine d’une plante médicinale :
Bryonia dioica Jacq.
______________________________

Soutenu le 14/07/2010 devant la commission d’examen :

Mr S. Hacini Pr. Université d’Oran Es-Sénia Président

Melle Z. Fortas Pr. Université d’Oran Es-Sénia Examinateur

Melle H. Habib-Zahmani M .C. ( A) Université d’Oran Es-Sénia Examinateur

Mme D. El Abed Pr. Université d’Oran Es-Sénia Rapporteur

Avec l’aide de dieu, j’ai pu réaliser ce modeste travail que Je dédie :

A mes parents, qu’ils trouvent ici toute ma gratitude pour leur soutien tout au long de mes études

A ma sœur unique Fatima-Zohra

A mes très chers frères : Zoheir, Brahim, Bilal et Younes el habib

A ma très chère femme Fatima-Zohra

A toute la famille

A tous mes collègues et ami(e)s

CHENNI MOHAMED
 AVANT-PROPOS

Ce travail a été réalisé, au Laboratoire de Réactivité et Chimie Fine du Département de

Chimie, de la Faculté des Sciences de L’Université d’Oran Es-sénia, sous la direction de
Mme D. El Abed. Je tiens à lui exprimer ma profonde gratitude pour m’avoir initié à la
recherche, pour son aide efficace et les conseils judicieux qui ont contribué à ma formation et
qui m’ont permis de mener à bien ce travail.

La partie biologique a été effectuée au Laboratoire de Biologie des micro-organismes et

de Biotechnologie, Faculté des Sciences, Université d’Oran, Es-Sénia, en collaboration avec
Melle Z. Fortas, Professeur au Département de Biotechnologie. Qu’il me soit permis de la
remercier vivement pour avoir accepté de juger ce travail.

J’adresse mes respectueux remerciements à Monsieur S. Hacini, Professeur à l’Université

d’Oran Es-sénia, pour m’avoir fait l’honneur de présider ce jury.

Je tiens à remercier Melle H. Habib-Zahmani, Maître de conférences au Département de

Biologie de l’Université d’Oran Es-sénia, pour avoir accepté d’examiner ce travail.

Je ne saurais oublier de remercier Melle F-Z Chenni, chargée de Cours à l’Université

Djilali Liabes de Sidi-Bel-Abbès, Mme N. Ouis, chargée de Cours à l’Université de Mascara,
Mr M. Hamadouche, Maître de conférences, Mme S. Belahouel-Dib, Chargée de cours,
Mr S. Neggaz, Magister en Microbiologie, à l’Université d’Oran Es-Sénia, pour leurs aides
efficaces et leurs précieux conseils dans la partie biologique et Mme M. Belkheira , Chargée
de cours à l’Université de Bechar pour les spectres de RMN qu’elle m’a réalisé.

J’exprime ma gratitude à Melle S. Ameur du Laboratoire Scientifique du Commissariat

d’Oran pour les analyses chromatographiques et à mes collègues du Laboratoire de Chimie
Organique de l’Université d’Oran, Es-Sénia pour les analyses spectroscopiques IR et UV.

Enfin, j’associe à ces remerciements tous les membres de ma famille, pour leurs
encouragements et toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation
de ce travail.
 Tables des matières

INTRODUCTION GENERALE…............................................................................................2

Chapitre I : Les Cucurbitaceae

[Link]……………………………………………………………………………5

II. PRESENTATION DES CUCURBITACEAE……………………………………………...5

II.1. Appareil végétatif………………………………………………………………….......5

II.2. Appareil reproducteur………………………………………………………………….6

III. ETUDE BOTANIQUE ET PHARMACOLOGIQUE DE LA BRYONE………………...7

III.1. Répartition géographique et habitat…………………………………………………..7

III.2. Présentation de la région d’étude………………………………………………..…....8

III.3. Classification………………………………………………………………………...11

III.4. Noms et Synonymes végétaux………………………………………………………11

III.5. Description botanique……………………………………………………………….12

III.6. Usages et Propriétés thérapeutiques…………………………………………………13

IV. CONCLUSION…………………………………………………………………………...15

Chapitre II : Screening phytochimique

[Link] ………………………………………………………………………….17

II. GENERALITES SUR LES PRINCIPES ACTIFS …………………………………….....17

II.1. Les alcaloïdes .…………………………………………………………….................17

II.1.1. Caractérisation des alcaloïdes ……………………………………………………20

II.1.2. Action pharmacologique et emplois……………………..………………………..20

II.2. Les anthocyanes…………….…………………………………………………….......21

II.2.1. Caractérisation des anthocyanes…..……………………………………………....22

 II.2.2. Action pharmacologique et emplois..……………………………………………..22

II.3. Les flavonoïdes.………………………………………………………………...........23

II.3.1. Caractérisation des flavonoïdes…………………………………………………...24

II.3.2. Action pharmacologique et emplois……………………………………………....25

II.4. Les hétérosides……………………………………………..........................................26

II.4.1. Caractérisation…………………………………………….....................................28

II.4.2. Action pharmacologique et emplois……………………………………………....28

II.5. Les Huiles essentielles……………………………………………………………......28

II.4.1. Caractérisation..……………………………………………...................................31

II.4.2. Action pharmacologique et emplois.……………………………………………...31

II.6. Les quinones.…………………………………………………………………………32

II.6.1. Caractérisation des quinones.……………………………………………..............33

II.6.2. Action pharmacologique et emplois….…………………………………………..33

II.7. Les saponines ou saponosides….…………………………………………………….34

II.7.1. Caractérisation des saponines..……………………………………………………35

II.7.2. Action pharmacologique et emplois….…………………………………………...35

III.8. Les stérols et stéroïdes.……………………………………………………………...36

II.8.1. Caractérisation des stérols et des stéroïdes….…………………………………....37

II.8.2. Action pharmacologique et emplois.……………………………………………...37

II.9. Les tanins ou tannins…….…………………………………………………………...38

II.9.1. Caractérisation des tannins.……………………………………………………….40

II.9.2. Action pharmacologique et emplois.……………………………………………...40

III. TESTS PHYTOCHIMIQUES…….……………………………………………………...41

III.1. Produit végétal épuisé avec de l’eau….……………………………..……………...42

III.2. Produit végétal épuisé avec de l’éthanol…………………………………………….43

III.3. Produit végétal épuisé avec du chloroforme………………………………………...45

 III.4. Produit végétal épuisé avec de l’acide sulfurique…………………………………...46

IV. RESULTATS ET DISCUSSION………………………………………………………...46

V. CONCLUSION……………………………………………………………………………48

Chapitre III : Extraction et analyse de quelques principes actifs

I. INTRODUCTION ................................................................................................................ 50

II. RAPPEL SUR LES METHODES D’ANALYSE .............................................................. 50

II.1. Analyse chromatographique ....................................................................................... 50

II.1.1. Chromatographie sur couche mince (CCM).......................................................... 50

II.1.2. Chromatrographie sur colonne (CC) ..................................................................... 51

II.1.3. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse .................. 52

II.1.4. Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) ............ 53

II.2. Analyse spectroscopique............................................................................................. 53

II.2.1. Spectroscopie Ultraviolet-Visible (UV) ................................................................ 53

II.2.2. Spectroscopie Infra-rouge (IR) .............................................................................. 54

II.2.3. Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ................................ 54

III. PROCEDES D’EXTRACTION UTILISEES .................................................................... 55

III.1. Chauffage à reflux ...................................................................................................... 55

III.2. Hydrodistillation ........................................................................................................ 56

IV. EXTRACTION ET ANALYSE DES PRINCIPES ACTIFS DE LA BRYONE ............. 57

IV.1. Extraction et analyse des alcaloïdes ........................................................................... 57

IV.2. Extraction et analyse des flavonoïdes ........................................................................ 66

IV.3. Extraction et analyse de l’huile essentielle (H.E)....................................................... 74

IV.4. Extraction et analyse des tannins .............................................................................. 78

V. CONCLUSION ................................................................................................................... 85
 Chapitre IV : Etude biologique

I. INTRODUCTION ................................................................................................................ 87

II. MATERIEL ET METHODE............................................................................................... 87

II. 1. Matériel ....................................................................................................................... 87

II.1. 1. Souches bactériennes ............................................................................................. 87

II.1. 2. Souches fongiques ................................................................................................. 88

II. 1. 3. Principales caractéristiques des souches testées ................................................... 89

II. 1. 4. Matériel chimique ................................................................................................. 92

II. 1. 5. Milieux de culture................................................................................................. 93

II. 2. Méthodes ..................................................................................................................... 95

II. 2. 1. Préparation de L’échantillon d’extrait méthanolique ........................................... 95

II. 2. 2. Préparation des précultures................................................................................... 95

II. 2. 3. Conservation des cultures ..................................................................................... 95

II. 2. 4. Tests d’activité antimicrobienne de l’extrait méthanolique ................................. 96

III. RESULTATS ET DISCUSSION .................................................................................... 102

III.1. Bactéries .................................................................................................................. 105

III.2. Champignons filamenteux ........................................................................................ 110

III.3. Champignons levuriformes ...................................................................................... 112

V. CONCLUSION .......................................................................................................... 117

CONCLUSION GENERALE……………………………………………………………….119

BIBLIOGRAPHIE…………………………………………………………………………..122

ANNEXE……………………………………………………………………………………128
 Abréviations

Ac : Acétyle
ANRH : Agence Nationale Des Ressource Hydriques
BuOH : Butanol
CC : Chromatographie sur Colonne
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
CG/MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse
CHCl3 : Chloroforme
Cm : Centimètre
DMSO : Diméthylsulfoxide
Fig ou FIG : Figure
g : Gramme
h : Heure
HPLC : Chromatographie en phase Liquide à Haute Pression
I2 : Diiode
INSA : Institut National des Sciences Appliquées
KBr : Bromure de potassium
Kg : Kilogramme
KOH : Hydroxyde de potassium
L : Litre
MeOH : Méthanol
mg : Milligramme
mL : Millilitre
mm : Millimètre
mn : Minute
MV : Matière végétale
N : Normalité
nm : Nanomètre
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PDA : Potato Dextrose Agar
ppm : Partie par million
PPUR : Presses Polytechniques et Universitaires Romandes
Rdt : Rendement
Tr. : Temps de rétention
% : Pourcentage
°C : Degré Celsius
 Résumé

Les principes actifs ou métabolites secondaires des végétaux constituent une source
inépuisable de molécules dotées de propriétés médicamenteuses très recherchées dans le
domaine pharmaceutique.

Le travail que nous avons entrepris porte sur l’étude phytochimique de la racine d’une
plante médicinale Bryonia dioica Jacq., dite Fashira ou Querioua, de la localité de
Bouamama (Oran) et sur l’évaluation de l’activité biologique de son extrait méthanolique.

La mise en évidence des phytoconstituants par des tests chimiques de coloration et de

précipitation, menée sur les extraits racinaires aqueux, éthanoliques,…et acides de la Bryone,
a montré la présence, d’alcaloïdes, d’anthracénosides, de composés réducteurs, de
flavonoïdes, d’hétérosides, de saponosides,… et de tanins.

Les alcaloides, les flavonoides, l’huile essentielle et les tanins, contenus dans
la racine de la Bryone, ont été extraits par différents protocoles expérimentaux. Les méthodes
spectroscopique et chromatographique disponibles que nous avons utilisées nous ont permis
de caractériser les différents principes actifs isolés. La diversité des éléments les composant,
le nombre de combinaison possibles rendent complexe l’établissement de leur structure.

Par ailleurs, les résultats des tests effectués in vitro avec l’extrait méthanolique de la
racine de la Bryone sur des espèces microbiennes, par la méthode de diffusion en milieu
solide, révèlent que l’extrait méthanolique présente une activité vis-à-vis des bactéries testées
et aucune sensibilité n’est observée pour les souches fongiques.

Mots clés : Principes actifs, Bryonia dioica Jacq., Extraction, Analyse, Chromatographie,
Spectroscopie, Activité antimicrobienne
Introduction

Générale
 Introduction Générale

Introduction Générale

Les plantes aromatiques médicinales représentent un intérêt économique considérable par

leur appartenance aux industries de la parfumerie, des cosmétiques, de l’agroalimentaire et de la
pharmacie.1

De par leurs effets thérapeutiques, les principes actifs des végétaux : alcaloïdes,
flavonoïdes, hétérosides, huiles essentielles, quinones, saponosides, tannins, … et vitamines
constituent une source inépuisable de molécules doués de propriétés biologiques et
pharmacologiques très diversifiées.2
De nombreux médicaments renferment des principes actifs extraits des plantes. En effet,
environ 40% des médicaments en contiennent, par exemple en Chine les préparations
traditionnelles à base de plantes représentent entre 30 et 50% de la consommation totale des
médicaments.3
Actuellement, une grande partie de la population mondiale, particulièrement celle des
pays en voie de développement a recours aux remèdes naturels surtout d’origine végétale4.
Par exemple, en Afrique 80% de la population utilise la médication traditionnelle à base
d’extraits de plantes.5
De plus, la médication par les produits de synthèse devient préoccupante car elle présente
de nombreux effets néfastes pour la santé. A cet effet, l’étude de substances actives ou principes
actifs d’origine naturelle moins toxiques et en alternative avec les médicaments de synthèse
suscite un regain d’intérêt des scientifiques, du fait qu’elle permet la mise au point de nouveaux
médicaments. 6

1
Bruneton, J., “Pharmacognosie, Plantes médicinales”, Ed. Lavoisier, Techniques et documentation, Paris, 1999, p.405.
2
a) Beloued, A., “Plantes médicinales d'Algérie”, OPU, Alger. 1998; b) Sallé, J.L., "Le Totum en Phytothérapie’’
Approche de phytothérapie. Ed Frison-Roche. Paris 1991; c) Valnet, J., « Aromathérapie », Traitement des
maladies par les essences de plantes. Ed. Vigot, 2001.
3
Organisation mondiale de la Santé. General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of
Traditional Medicine. Genève, Organisation mondiale de la Santé, 2002-2005 (référenceWHO/EDM/TRM/2002.1).
4
Organisation Mondiale de la Santé (OMS), Aide mémoire, N° 134, révisé Mai 2003.
5
Pousset, J.L., Medecine Tropicale, 2006, 66, p.606-609.
6
a) Farnsworth, N. R., Akerele, O., Bingel, A.S., Soejarto, D.D., Guo, Z., Bulletin de l’Organisation mondiale de
la Santé, 1986, 64(2), p.159-175 ; b) Roux, D., Catier, O., “Botanique, pharmacognosie, phytothérapie”, 3ème Ed.
Porphyre, 2007, p.13.

2
 Introduction Générale

Dans le cadre de l’axe de recherche sur la valorisation de la biodiversité floristique

algérienne et plus particulièrement des plantes aromatiques et médicinales7, nous avons entrepris
l’étude phytochimique du genre Bryone dite Fashira ou Querioua8 afin de justifier scientifiquement
l’utilisation de cette plante en médecine traditionnelle.

Notre étude a pour objet de mettre en évidence, en premier lieu les principaux
phytoconstituants de la racine de la Bryone, de tenter d’extraire quelques uns d’entre eux, pour
ensuite les analyser par les méthodes chromatographiques et spectroscopiques.

Dans un deuxième lieu, l’activité biologique de l’extrait méthanolique de la racine de la

Bryone sera évaluée

Notre travail, exposé dans ce mémoire, est partagé en quatre (4) chapitres :

 Le premier chapitre est consacré à la présentation de la famille des cucurbitaceae

suivie par celle de la Bryone.

 Le deuxième chapitre traite de la mise en évidence des phytoconstituants de la

racine de la Bryone précédée par une étude des principaux métabolites secondaires
des végétaux.

 Le troisième chapitre porte sur l’extraction et l’analyse de quelques principes

actifs de la racine de la Bryone.

 L’analyse microbiologique de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone est

développée dans le dernier chapitre.

Enfin, une conclusion générale résumera l’ensemble des résultats du travail fourni et les
perspectives envisagées. La composition des réactifs utilisés dans les tests phytochimiques
préliminaires est donnée en annexe.

7
Ouis, N., “Mise en évidence, Extraction et Analyse de quelques principes actifs de l’Anis, du Fenouil et du
Persil”, Mémoire de Magister, Université d'Oran Es-Sénia, 2004.
8
Quezel, P., Santa, S., “Nouvelles Flore De L’Algérie et des Régions Méridionales”, Ed. CNRS, 1963, p.893.

3
 Chapitre I

Les Cucurbitaceae
Chapitre I Les Cucurbitaceae

I. INTRODUCTION

Le règne végétal comprend une infinité de plantes. Ces derniers s’utilisent à divers et
multiples fins : alimentaires, ornementales, …et médicinales.
Les plantes sont classées en espèces, genres, ordres, …et familles botaniques. La
famille des Cucurbitaceae comprend environ 825 espèces réparties en 120 genres, pour la
plupart réparties dans les régions subtropicales et tropicales du globe.9 C’est une famille qui
constitue une source d'alimentation importante pour les êtres humains.10

II. PRESENTATION DES CUCURBITACEAE

Les Cucurbitaceae représentent une famille de plantes Dicotylédones grimpantes à

croissance rapide, portant des feuilles aux lobes palmés, des vrilles hélicoïdales et des fleurs
unisexuées monoïques ou dioïques, à racine charnue parfois très grosse.
La famille des Cucurbitaceae est répandue dans tous les continents du monde et
particulièrement en Afrique et en Amérique latine. Elle a une grande importance économique
car elle comprend des légumes comme les Courgettes et les Concombres, des fruits
comestibles comme le Melon (Cucumis melo) et la Pastèque (Citrullus vulgaris), des plantes
décoratives comme la Coloquinte (Citrullus colocynthis),… et la Bryone (Bryonia dioica) une
des rares Cucurbitaceae que l’on trouve à l’état sauvage.11

II.1. Appareil végétatif

Les Cucurbitaceae sont des plantes annuelles, vivaces à appareil végétatif aérien
généralement herbacé, à tige rampante ou grimpante par des vrilles opposées aux feuilles, qui
s’enroulent dans un sens, puis dans l’autre autour des objets environnants.
Les tiges, assez grêles, souvent cannelées, sillonnées et anguleuses par la présence de
collenchyme, peuvent dépasser 10 m de long.
Au niveau des nœuds se différencie un complexe axillaire comprenant une ou
plusieurs feuilles, une vrille, une ou plusieurs inflorescences, ou encore une ramification. Les
feuilles, alternes et exstipulées, peuvent varier considérablement de forme au sein d'une même

9
Mabberley, D. I., “The Plant Book” Camb. Univ. Press, Cambridge, New York, 1987.
10
Qaiser, M., et A. Perveen, Pak. J. Bot., 2008, 40(1), p.9-16.
11
Encyclopédie Microsoft® Encarta ® en ligne 2008.
5
Chapitre I Les Cucurbitaceae

espèce. Elles sont simples, entières, tri- ou palmatilobées. Plusieurs Cucurbitaceae vivaces
possèdent des racines charnues et volumineuses.12

II.2. Appareil reproducteur

Les fleurs sont unisexuées (plantes monoïques ou dioïques). Les sépales et les pétales
sont au nombre de cinq (05) généralement et les pétales sont soudés au moins à la base. Les
étamines sont également plus ou moins soudées par les filets.

Chez les fleurs mâles, les étamines sont soudées les unes aux autres. Chez les fleurs
femelles, le gynécée est composé de trois carpelles et d'un ovaire infère qui donnera un fruit.
L'inflorescence que l'on rencontre le plus souvent est une cyme. Une cyme est une
inflorescence simple, dans laquelle l'axe principal est terminé par une fleur (Fig. I.1).13

Figure I.1 : Bryonia dioica

A : Fleur mâle; B : Fleur femelle; C : Diagramme floral mâle; D : Diagramme floral femelle

12
[Link]
13
Roques, H., “Précis de botanique pharmaceutique : Phanérogamie“ Ed. Librairie Maloine, Paris, 1959.

6
Chapitre I Les Cucurbitaceae

Les fruits sont en général des baies à exocarpe, généralement coriace ou induré, ou
plus rarement une capsule sèche ou charnue à déhiscence variable. Ils contiennent des graines
aplaties à albumen fugace ou absent (Fig. I.2).14

Figure I.2 : Bryonia dioica

A : Fruit (Baie); B : Coupe transversale d’un fruit; C : Graine ; D : Coupe transversale d’une graine

III. ETUDE BOTANIQUE ET PHARMACOLOGIQUE DE LA BRYONE

La Bryone tire son origine des mots « Bryone » et « bryô » qui signifient
respectivement pousser et vigoureux en grec, puisqu’elle croît très rapidement et pousse
avec vigueur.

III.1. Répartition géographique et habitat

La Bryone appartient à la famille des Cucurbitaceae. Son aire de répartition est

eurasienne. Elle se trouve au Maghreb -Algérie, Maroc, Tunisie-, au Proche Orient, dans tous
les pays d’Europe Occidentale et particulièrement en France, dans certains pays d’Europe
Centrale et Méridionale ainsi que dans certains pays d’Asie. C’est une mauvaise herbe
volubile qui pousse dans les haies, buissons, broussailles de jardins. Elle grimpe dans les
endroits incultes,… et les murs des jardins.

14
Spichiger, R. E., Figeat, M., “Botanique systématique des plantes à fleurs : une approche phylogénétique
nouvelle des angiospermes des régions tempérées et tropicales“ Ed. PPUR, Lausanne, 2002, p.413.
7
Chapitre I Les Cucurbitaceae

En Algérie, elle est commune partout dans les régions du Tell et plus rare ailleurs. Elle
pousse parmi les broussailles et dans les forêts.15

III.2. Présentation de la région d’étude

La plante étudiée provient de la localité de Bouamama (Fig.I.3) qui est mitoyenne

avec le quartier des Amandiers et se situe dans la région ouest d’Oran. Elle comprend les trois
régions suivantes :

El-Hassi

Coca-cola

Rocher

Elle est limitée au Nord par la forêt du Murdjadjou, à l’ouest par la commune de
Misserghin, au Sud par la commune d’Es-sénia (Fig. I.3) 16, à l’Est par la Deuxième Région
Militaire et le Stade Habib Bouakeul (Fig. I.4).
Cette zone est caractérisée par 400 Ha de terrains agricoles et de zone urbaine, constituée par
des terrains meubles, mi-rocheux et rocheux qui représentent environ 160 Ha.17

15
Ait Youcef, M., Brette, J. P., “Plantes Médicinales De Kabylie“ Ed. Ibis Press, 2006, p.75.
16
Sourissou, B., “Etude Hydrogéologique du Massif de Murdjadjou d’Oran“ Ed. ANRH, 1976.
17
Chenni, F. Z., Mémoire de Magister, Département de biologie, Université de Sidi Bel Abbès, 2005.
8
Chapitre I Les Cucurbitaceae

Figure I.3 : Carte représentant la zone d’étude

9
Chapitre I Les Cucurbitaceae

Figure I.4 : Situation géographique de la zone d’étude

10
Chapitre I Les Cucurbitaceae

III.3. Classification

Le genre Bryone comprend douze espèces réparties en Europe et en Asie.18 Toutes les
espèces sont dioïques à part Bryona alba qui est monoïque. Seules les espèces Bryonia alba
Linn. et Bryonia dioica Jacq. sont utilisées en médecine et se distinguent entre elles par la
couleur de leurs baies, les unes sont noires et les autres sont rouges.19
La Bryone dioïque occupe la position suivante dans la classification12 des plantes :

Embranchement : Spermatophytes (Plantes à graines)

Sous-embranchement : Angiospermes (Plantes à fleurs)

Classe : Dicotylédones

Sous-classe : Dilleniidae

Ordre : Violales

Famille : Cucurbitaceae

Genre : Bryone

Espèce : Dioïque

III.4. Noms et Synonymes végétaux

Le nom scientifique de la Bryone est : Bryonia dioica Jacq. Il faut noter que plusieurs
noms et synonymes lui sont attribués dans la littérature :
Synonymes : Bryonia acuta Desf., Bryonia cretica ssp. dioica (Jaq) Tutin.
Noms Vernaculaires : Fachira, Querioua, âneb d-dib « raisin du chacal », Karma
beida « arbre blanc », Luwwâya « celle qui s’enroule ». 15
Autres noms : Bryone, Bryone dioïque, Couleuvrée, Navet du diable, Vigne blanche,
Herbe de feu, Ipéca indigène.20

18
Bailey, L. H., “The Standard Cyclopedia of Horticulture“, The Mac-MillianCompany, New-York, 1950,
Vol.1, p.453-83.
19
Rendle, A. B., “The Classification of Flowering Plants”, The University Press Cambridge, 1959, Vol.2,
p.216-27.
20
Debelmas, A., Delaveau, P., “Guide des plantes dangereuses“, 2éme Ed. Maloine, Paris, 1978, p.105-106.
11
Chapitre I Les Cucurbitaceae

III.5. Description botanique

La Bryone est une plante dioïque : elle possède des fleurs mâles à étamines et des
fleurs femelles à carpelles sur des pieds différents. L’ovaire infère est constitué de trois carpelles.
L’inflorescence est en petit corymbe. C’est une plante vivace, très commune dans les
haies, possédant une racine rameuse, longue, fusiforme, charnue, d’un blanc jaunâtre, à stries
transversales parfois grosse comme le bras.

Ses tiges sont grêles, sarmenteuses, cannelées, velues et grimpantes. Elles peuvent
atteindre 6 m de long. Ses feuilles alternes, palmatilobées, calleuses, rudes au toucher,
présentent à la base de leur pétiole une longue vrille enroulée en spirale. 13

12
Chapitre I Les Cucurbitaceae

Le fruit dit « bacciforme » est une baie. Il mesure 6 à 8 mm de diamètre, de la grosseur

d’un grain de groseille et de forme globuleuse ou ovale. Sa surface est lisse et mate.

Il porte au sommet les restes jaunâtres des stigmates. Il est de couleur verte, puis
orange, puis rouge pourpre à maturité (durant l’automne). Il contient 4 à 6 graines appelées
« pépins ». Elles sont de forme aplatie, elliptique, avec une extrémité arrondie et l’autre
pointue (longueur 5 mm; largeur 3 mm ; épaisseur 2 mm); elles sont dépourvues d’albumen et
sont de couleur jaune à brunâtre. 15

III.6. Usages et Propriétés thérapeutiques

La Bryone présente à la fois des effets toxiques et thérapeutiques par sa racine, son
suc… et ses fruits. Elle a figuré dans la pharmacopée française jusqu’en 1884. Cet intérêt à
cette époque est dû à son emploi à très faibles doses (à raison de 1 à 2 g) comme purgatif
drastique qui a été recommandé dans le traitement des œdèmes,…et des congestions
cérébrales. Toutefois, il faut l’utiliser avec précaution car c’est un remède dangereux pouvant
donner lieu à des diarrhées cholériformes et hémorragiques.21
La racine de la plante Bryone a été employée dans différents pays en médecine
vétérinaire, en usage interne, en médecine populaire comme vomitifs d’où son appellation
ipéca indigène 20 et comme anti-laiteux (pour arrêter l’allaitement en s’opposant à la montée
laiteuse). Cet usage a conduit à des accidents avec vertiges, diarrhées et convulsions.21

21
Paris, R., Moyse, H., “Précis de matière médicale. Tome III : Pharmacognosie spéciale, Dicotylédones“ Ed.
Masson, 1971.
13
Chapitre I Les Cucurbitaceae

En Afrique du Nord le suc de la plante fraîche était employé en usage interne, comme
purgatif très violent et bon vermifuge. En usage externe, Il s’utilise dans le traitement des
ulcères, de la gale et de la lèpre. 22
En Tunisie23 et au Maroc la Bryone est employée prudemment car le contact avec des
racines fraîches, de la poudre de racine ou du suc de la plante provoque sur la peau des
irritations, des rougeurs,… et des inflammations graves qui peuvent suppurer.24La racine est
employée au Maroc en usage interne. Néanmoins, elle entraîne de nombreuses intoxications,
parfois mortelles par surdosages thérapeutiques.25

Aussi la Bryone est un remède populaire utilisé comme purgatif et dans le traitement
de la goutte.26 Elle favorise aussi l'évacuation des mucosités bronchiques. On la recommande
essentiellement en cas d'affections rhumatismales douloureuses et inflammatoires, tels que
l'ulcère du duodénum, l'asthme, les bronchites et les pleurésies.27

Elle fait également baisser la tension artérielle. La plante entière est un antiviral
puissant. Les recherches indiquent qu'elle serait adaptogénique c’est-a-dire qu’elle aiderait
l'organisme à s'adapter au stress.28
En outre, la Bryone est préconisée souvent dans le traitement de nombreux cancers
(colon, abdomen, sein, peau, glande,… etc.) à tous les stades de la cancérogenèse.29
En Algérie, la racine, seule partie de la plante à être utilisée, était employée en usage
interne, comme :
- Purgatif drastique dans les affections rhumatismales
- Diurétique
- Base de préparations homéopathiques.30

22
Le Floc’h, E., “Contribution à une étude ethnobotanique de la flore tunisienne“, Tunis, 1983, p.402.
23
Boukef, M, K., “Les plantes dans la médecine traditionnelle tunisienne“, Ed. Librairie Larose, Paris, 1986, p.350.
24
Bellakhdar, J., “La pharmacopée marocaine traditionnelle“. Ibis Press, Paris, 1997.
25
Charnot, A., “Toxicologie au Maroc. Mémoire de la Société des Sciences Naturelles au Maroc“, Ed. Siège
de l'I.S., Rabat, 1945.
26
Evans, W.C., “A Text Book of Pharmacognosy”, 14th Ed. WB Saunders Company Ltd., 24-28 Oval Road,
London, 1997, p.44, 474, 489-94.
27
Youngken, W.H., “Text Book of Pharmacognosy”, 6th Ed. The Blakiston Division, McGraw Hill Book
Company Inc., New-York, 1950, p.478-658.
28
Paul Iserin., “Encyclopedie des plantes médicinales“, 2éme Ed. Larousse, 2001, p.180.
29
Duke, A. J., DuCellier, J., Duke, K. P., “Handbook of Medicinal Herbs“, 2e Ed, CRC Press, 2002, p.621.
30
Fourement, P., Roques, H., “Répertoire des Plantes Médicinales et Aromatiques d'Algérie“, Imprimerie P.
Guiauchain, Alger, 1942, p.159.
14
Chapitre I Les Cucurbitaceae

Egalement la racine s’utilise encore sous forme de préparation en infusion et cataplasme

comme diurétique, vermifuge, troubles intestinaux, contusions… et rhumatismes.31

Les baies de la plante présentent en usage interne un certain danger. Leur

consommation accidentelle ou à des fins thérapeutiques donne lieu à des intoxications
parfois mortelles, selon la quantité ingérée. Par exemple dix baies peuvent tuer un jeune
enfant. Ces baies rouges se signalent par leur aspect séduisant ; ce qui provoque la convoitise
des enfants très jeunes qui seront tentés de les goûter. 20
Il est à noter que dans l’ouest Algérien particulièrement à Oran et à Mascara, la racine
sèche de la Bryone est populairement appelée ‘’Berestom ‘’par confusion avec celle du genre
Aristolochia (A. baetica L. & A. paucinervis) qui appartient à la famille des Aristolochiaceae.

La population locale préconise une ‘’Akda’’ composé d’un mélange de plusieurs

ingrédients à mesure égale (Aalk attarh, amandes ou cacahuettes , feuilles de pêches, griss,
henne, horf, jaada, karwiya, laktaf, marraret el hench, mensoufa, nabta elbeida, sanoudj, yazir,
halba, sauf pour la racine de la Bryone 1/2 mesure) à prendre tous les matins à jeûn avec du
miel pour le traitement du cancer sous toutes ses formes.

IV. CONCLUSION
Il ressort de cette étude que la famille des Curcubitaceae comprend des légumes, des
fruits, des plantes décoratives,… et une plante médicinale : la Bryone. Cette dernière a été très
utilisée par le passé comme purgatif. Outre sa toxicité, elle offre, par ailleurs, tout un éventail
d’activités biologiques : vermifuge, anti-cancérigène, anti-rhumatismale, anti-inflammatoire,
anti-stress…etc. Ses multiples et diverses propriétés thérapeutiques sont dues aux composants
ou principes actifs qu’elle contient. Le chapitre suivant aura pour objectif de mettre en
évidence les principaux phytoconstituants de la racine de la Bryone.

31
Cecchini, T., “Encyclopédie des plantes Médicinales“ Ed. De Vecchi, 1993, p.66.

15
 Chapitre II

Screening Phytochimique
Chapitre II Screening phytochimique

I. INTRODUCTION

Le règne végétal renferme deux types de métabolites qui se différencient entre eux par
leur constitution, leur rôle et leur emploi :
Les métabolites primaires (glucides, protides, lipides,… et acides nucléiques) qui sont
présents en permanence chez les plantes et sont indispensables à la croissance et à la
reproduction des plantes.
Les métabolites secondaires ou principes actifs dont la proportion varie selon la famille,
le genre et l’espèce ne sont pas impliqués dans le développement des plantes.
Avant d’entamer nos tests phytochimiques proprement dit sur la racine de la Bryone, Il
nous a semblé judicieux de donner un bref aperçu sur les différents principes actifs des plantes
et sur leur mise en évidence à savoir : Alcaloïdes, flavonoïdes, huiles essentielles,
saponosides,….et tanins.

II. GENERALITES SUR LES PRINCIPES ACTIFS

Les principes actifs sont des molécules de structure assez complexe à propriétés
thérapeutiques très diversifiées.

II.1. Les alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des substances organiques naturelles rappelant les alcalis par leurs
propriétés. Alcalis tire son origine de l’arabe al kaly, et du grec eidos signifiant respectivement
soude et aspect.
Ce sont des substances azotées d’origine le plus souvent végétale. Il n’en n’existe que
de rares représentants dans le règne animal. Ils existent le plus souvent sous forme de sels
(citrates, sulfates, nitrates, tartrates,…) ou combinés avec les tanins chez les végétaux. Ce sont
des composés présents principalement chez les Angiospermes Dicotylédones. Ils sont
localisés dans les tissus périphériques tels que les écorces de tige et de racine, les téguments
des graines…par exemple. 1
Ils sont doués, à faible dose, de propriétés pharmacodynamiques marquées et sont
reproductibles par synthèse.32

32
Pengelly, A., “Constituents of medicinal plants“, 2éme Ed. Sunflower Herbals, 1996, p.77-99.
17
Chapitre II Screening phytochimique

Les alcaloïdes ont des masses moléculaires variant de 100 à 900. Ils sont au nombre de
10 000 composés dont le premier à avoir été découvert, en 1803 par Derosne, est la narcotine
de l'opium. Du point de vue chimique, ils sont classés selon la nature du noyau hétérocyclique
présent dans la molécule (Fig. II.1).33

N Me N
Pyridine

Tropane

N
N N
Imidazole Pyrrolizine
Indole H

Figure II.1 : Classification des alcaloïdes selon leur noyau hétérocyclique

A titre indicatif, quelques structures d’alcaloïdes sont rassemblées dans la figure II.2.

33
Woolley, J. G., “Plant Alkaloids in Encyclopedia of life sciences“, Nature Publishing Group, 2001.
18
Chapitre II Screening phytochimique

Groupe pyrrolidine Groupe pipéridine

N
N
H
Hygrine
(+) Conïne

Groupe pyrolidine-pyridine Groupe quinoline

HO
N
O

Nicotine N

Quinine

Groupe isoquinoline Groupe indole

Berbérine Emétine

Groupe phénanthrène Groupe Tropane

Codéine
Cocaïne

Figure II.2 : Exemples de structure d’alcaloïdes

19
Chapitre II Screening phytochimique

Les alcaloïdes non oxygénés sont liquides à température ambiante, volatils, entraînables
à la vapeur d’eau comme par exemple la coniine, la nicotine…, par contre les alcaloïdes
oxygénés sont solides cristallisables et parfois colorés : berbérine, sanguinarine…. Certains
alcaloïdes sont doués de pouvoir rotatoire. Ils ont la propriété de former des sels et d'être
amers. Les alcaloïdes bases sont, en général, insolubles ou peu solubles dans l’eau, solubles
dans les solvants organiques apolaires ou peu polaires. Leurs sels sont généralement solubles
dans l’eau et dans les alcools dilués. 1

II.1.1. Caractérisation des alcaloïdes

Les alcaloïdes sont caractérisés par plusieurs réactions de précipitation qui diffèrent
par leur composition.
À une pincée de poudre végétale sont ajoutées quelques gouttes d’eau distillée
acidulée avec l’acide sulfurique (H2SO4) à 0,5N. L’extrait obtenu après filtration de la
solution est reparti sur des tubes à essai puis soumis aux réactifs suivants :

Réactif de Bouchardat (iodo - ioduré) : Précipité brun.

Réactif de Valser Mayer (tétraiodomercurate de potassium) : Précipité blanc jaunâtre.

Réactif de Dragendorff (tétraiodobismuthate de potassium) : Précipité orangé à rouge.

Réactif de Bertrand (silico-tungstique ou phospho-tungstique) : Précipité blanc jaunâtre.

II.1.2. Action pharmacologique et emplois

Les alcaloïdes sont des substances très intéressantes par leurs activités
pharmacologiques des plus variées :
Sur le système nerveux central comme anti-dépresseurs : codéine, morphine…

Sur le système nerveux autonome excitant du sympathique : hordéine, éphédrine…

Sur les vaisseaux hypertenseurs : hydrastine.

Sur la circulation sanguine : vincamine.

Ce sont pour la plupart des poisons végétaux très actifs, dotés d'une action spécifique.
La médecine les emploie le plus souvent à l'état pur. Il est à noter que les alcaloïdes jouent, à
faibles doses, le rôle d’anesthésiques locaux (cocaïne), d’analgésiques (morphine),

20
Chapitre II Screening phytochimique

d’antibiotiques, d’antiparasitaires, d’antipaludiques (quinine), d’anti-tumoraux (vinblastine),

d’amoebicides (émétine)… 1

II.2. Les anthocyanes

Le mot anthocyane tire son origine du grec anthos, fleur et kuanos, bleu violet. Les
anthocyanes sont le plus important groupe de pigments végétaux qui font partie des
polyphénols. Ces pigments hydrosolubles sont responsables de la coloration des plantes en
bleu, rouge, rose, violet ou orange. 1,34 Ces couleurs varient en fonction du pH et dépendent
aussi du nombre d’hydroxyles portés par le cycle B. Elles sont habituellement caractéristiques
des pétales de fleurs, des fruits et des baies rouges ou bleues. Elles se rencontrent également
dans les bractées, les feuilles, les pétioles, les tiges, les racines et même les graines. Elles sont
généralement localisées dans les vacuoles des cellules épidermiques qui sont de véritables
poches remplies d’eau. Leur aglycone (partie non glucidique) est appelée anthocyanidine et
dérive d’un noyau hétérocyclique de type benzopyroxonium à oxygène tétravalent. 35
Les formules de quelques anthocyanidines sont données dans le tableau II-1.
Tableau II.1 : Nomenclature des anthocyanidines
3'
2' 4'
8
HO O1
5'
7 2
6'
6
3 OH
5 4
OH

3’ 4’ 5’ Anthocyanidines correspondantes

H OH H Pélargonidine

OH OH H Cyanidine

34
a) Harborne, J., B., “Comparative biochemistrie of the flavonoïds”, Academic Press, New York, 1967, p.1-30;
b) Brouillard, R., « The flavonoids », Advances inceserch since, 1986, Ed. [Link], Chapman and Hall,
London, 1993, p.525-538.
35
a) Harborne, J., B., Grayer, R.,J., “The flavonoids”, Advances in research since, 1980, [Link],
Chapman and Hall, London, 1988, p.1-20; b) Mc-Clure, J. W., « Biochemastry of plants phenolics », éds. T.
Swain, J. B. Harborne et C. F. Van Sumere, Plenum Press, New York, 1979, p.525; c) Merlin, J. C., Statoua,
A. et Brouillard, R., « Phytochemistry », 1985, 24, p.1575-1581.
21
Chapitre II Screening phytochimique

OH OH OH Delphinidine

OCH3 OH OCH3 Malvidine

OCH3 OH H Péonidine

OH OH OCH3 Pétunidine

En général, la partie glucosidique des anthocyanes est située le plus souvent en

position 3 et 5 de la molécule par l’intermédiaire de l’hydroxyle. Les sucres les plus fréquents
sont le glucose, le galactose, …et l’arabinose).

II.2.1. Caractérisation des anthocyanes

La recherche des anthocyanes repose sur l’apparition d’une coloration rouge en milieu
acide et bleue violacée en milieu alcalin. Leur mise en évidence s’effectue sur un extrait
aqueux ou alcoolique de la matière végétale, on observe des changements de coloration en
fonction de l’acidité :
pH acide : coloration rouge
pH alcalin : coloration bleue ou bleue violacée (par ionisation des fonctions
phénols)
pH 12 : coloration jaune (par fonction d’une chalcone)

II.2.2. Action pharmacologique et emplois

L’action pharmacologique des anthocyanes est en général, limitée au domaine
vasculaire. Elles augmentent, comme tous les flavonoïdes, la solidité des capillaires. Elles
inhibent les enzymes protéolytiques de dégradation. Elles sont proposées en ophtalmologie en
cas de troubles oculaires et pour l’amélioration de la vision crépusculaire.

Elles sont peu utilisées dans l’industrie alimentaire et cosmétique, et ceci du fait de leur
instabilité vis-à-vis des facteurs physico-chimiques incontournables (lumière, température et
pH), ainsi que par leur sensibilité aux sulfites (souvent utilisés comme conservateurs) et aux
métaux (présents dans les boîtes de conserves).1

22
Chapitre II Screening phytochimique

II.3. Les flavonoïdes

Le terme flavonoïde désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à
la famille des polyphénols36. Ce sont des pigments jaunes responsables de la coloration des
plantes. Ils sont largement abondants chez les plantes supérieures, d’une manière très
générale, dans toutes les plantes vasculaires où ils peuvent être localisés dans divers organes :
racines, tiges, bois, feuilles, fleurs, fruits, pollen… Ils sont également présents dans les
légumes, le vin rouge et le thé. Les herbes aromatiques (persil, céleri,…et thym), les céréales
et les épices constituent une source importante de flavonoïdes. Il est à souligner qu’ils sont
pratiquement absents chez les algues.
De nos jours, plus de 4000 flavonoïdes ont été identifiés. Ils ont une origine
biosynthétique commune et par conséquent, possèdent tous un même squelette de base à
quinze atomes de carbone (C15), constitué de deux unités aromatiques, deux cycles en C6 (A et
B), reliés par une chaîne en C3 (Fig. II.3). 1

Figure II.3 : Squelette de base des flavonoïdes

Structuralement, les flavonoïdes se répartissent en plusieurs classes de molécules qui ont

tous en commun, la structure de la flavane, 3 cycles dont un hétérocycle dont la configuration
variée permet leur classification en familles: flavones, flavonones, flavonols, flavanediols,…
et les chalcones dont l’hétérocycle n’est pas formé et qui est un intermédiaire caractéristique
de la synthèse de différents flavonoïdes. Ils diffèrent aussi les uns des autres par le type de
sucre lié à l’aglycone, par le degré d’insaturation de l’hétérocycle et par le degré
d’hydroxylation, méthylation,… des noyaux A et B (Fig. II.4).37

36
Diehl, M. A., Schulz, C. M., Shaw, D. A., and Williams, T. M.,’’Bioflavonoïds: a new approach in cosmetics.”
Cosmetics & toiletries manufacture worldwide, 2001, p.6.
37
Richter, G., “Métabolisme des végétaux: physiologie et biochimie“ Ed. PPUR, 1993, p.330-340.
23
Chapitre II Screening phytochimique

OH O

O
Flavanones
O O
Flavones
Chalcones 3'
2' 4'
B
8 1 1' 5'
O O 2 O
7
6'
A
6 3
3 OH OH
5 4
O Anthocyanidines
Flavane
Flavonols

O
O

3 OH
4
3 OH OH
Flavan-3-ols Flavan-3,4-diols

Figure II.4 : Structure des différents types de flavonoïdes à partir du squelette flavane

Les flavonoïdes sont des solides cristallisés dont la teinte varie du blanc au jaune vif.
La grande diversité de leurs couleurs dépend principalement du nombre de groupements
phénoliques, ou des groupements méthoxy (OCH3), portés par leur cycle B. Ils sont solubles
dans les solvants organiques apolaires.
Il faut souligner que le noyau flavonoïde est souvent lié à un sucre pour former un
hétéroside qui est soluble dans l’eau, l’alcool et les solvants organiques polaires mais
insolubles dans les solvants organiques apolaires.1

II.3.1. Caractérisation des flavonoïdes

La recherche de flavonoïdes se fait par de nombreuses réactions colorées, mais la plus
connue et retenue est celle de la cyanidine.
24
Chapitre II Screening phytochimique

À un extrait alcoolique sont ajoutés quelques gouttes d’acide chlorhydrique concentré

avec quelques brins de tournures de magnésium; après dégagement d’hydrogène par réduction
des flavonoïdes en anthocyanes, on observe une coloration en fonction de la structure des
flavonoïdes mis en jeu à savoir :

Flavone : coloration rose orangée

Flavonol : coloration rouge

Flavonone : coloration rose violacée

Chalcone et Isoflavone : pas de coloration

II.3.2. Action pharmacologique et emplois

Une des propriétés majeure des flavonoïdes est de contribuer à la couleur des plantes
et notamment à celle des fleurs. Or, c’est par la couleur de ses fleurs que la plante exerce un
effet attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, assurant par ce biais une étape
fondamentale de sa reproduction. On peut également noter que les flavonoïdes, en repoussant
certains insectes par leur goût désagréable, peuvent jouer un rôle dans la protection des
plantes.38
Les flavonoïdes sont, en effet, essentiellement connus pour leur action anti-oxydante.39
Ils diminuent la perméabilité et augmentent la résistance des capillaires (action sur les artères,
veines, capillaires, lymphatiques…).1
Ils sont également reconnus pour leurs nombreuses et diverses activités
thérapeutiques: anti-allergiques, antivirales40et anti-inflammatoires.41 Ces activités sont dues à
leur capacité de piéger les radicaux libres et d’inhiber les enzymes responsables de la
formation de ces radicaux. La consommation régulière de fruits frais et de légumes diminue le
risque de développement des maladies cardiovasculaires et d’apparition de certains cancers.42

38
Bovy, A., Phytochemistry., 2004, Vol.65, p.2631-2648.
39
Woodman, O. L., Meeker, W. F., Boujaoude, M., J. Cardiovasc. Pharmacol., 2005, Vol. 46, n°3, p.302-309.
40
Van Hoof, L., Vanden Berghe, D. A., Hatfield, G. M., Vlietinck, A. J., Planta Medica., 1984, 50, p.513-517.
41
Brasseur, T., J. Pharm. Belg. 1989, 44, p. 235-241.
42
Hertog, M.G., Feskens, E.J., Hollman, P.C., Katan, M.B., Kromhout, D., Lancet., 1993, 342, p.1007-1011.
25
Chapitre II Screening phytochimique

II.4. Les hétérosides

Les hétérosides ou glycosides sont des molécules formées par combinaison d’oses et de
substances non glucidiques appelées aglycones ou génines. Ce sont les substances du
métabolisme secondaire les plus anciennement connues. Ils forment des substances de réserve
localisées dans les vacuoles cellulaires. Les hétérosides se différencient entre eux par leurs
génines qui appartiennent à tous les groupes du métabolisme secondaire (flavonoïdes,
saponosides,…et tanins) et par le mode de liaison entre la génine et l’ose, ainsi que par la
nature de la partie glucidique.43 Ils sont classés selon la nature de la liaison en C-, N, O- ou S-
hétérosides :

C- Hétérosides

OH
HO OH
La liaison entre la génine et l’ose se fait de
O OH
HO carbone à carbone. Parmi les flavonoïdes les
HO O
plus fréquents, on peut citer la vitexine.44

OH O

Vitexine

N-Hétérosides

Ce sont des dérivés du ribose ou du désoxyribose liés à des bases pour former les
nucléosides, présents dans toutes les cellules (ARN et ADN).45 En outre, la liaison
hérérosidique se produit entre la fonction réductrice de l’ose et une fonction amine.

43
Guignard, J.L., " Biochimie végétale", Ed. Masson, Paris, 2000, p. 231-241.
44
Ribéreau-Gayon, P., « Les composés phénoliques », Dunod, 1968,7, p.120.
45
Charles A. Q., Linden, G., « Abrégé de biochimie alimentaire », 4émeEd. 1997, p.118-119.
26
Chapitre II Screening phytochimique

O-Hétérosides

Quelques exemples d’hétérosides sont représentés ci-après : La digitoxoside et le

mélitoside, hétérosides cardiotoniques, se trouvent dans la digitale et le mélilot.

CH2OH
O
H
O CH2 O C Amygdaline
OH
HO C N
(Amandes amères) 45
HO OH
HO
OH

Digitoxoside (digitale)

Mélitoside (mélilot)

S- Hétérosides

CH2OH Le Sinigroside est un hétéroside sulfuré, localisé

O dans les grains de la moutarde noire et dans

H OSO3K
OH
diverses crucifères. La liaison hétérosidique se
S C N CH2 C CH2 fait entre la fonction réductrice de l’ose et un
HO H
thiol. 43
OH

27
Chapitre II Screening phytochimique

II.4.1. Caractérisation
La caractérisation des hétérosides s’effectue par l’apparition d’une couleur plus ou
moins intense selon la structure de l’hétéroside à partir d’un extrait chloroformique additionné
d’une solution d’hydroxyle d’ammonium.

II.4.2. Action pharmacologique et emplois

Il convient de noter que les différents groupes d’hétérosides ont des propriétés
pharmaceutiques et sont employés en thérapeutique. Les glycosides cardiotoniques, par
exemple, sont des médicaments utilisés dans le traitement de l’insuffisance cardiaque ou
l’arytmie cardiaque. D’autres hétérosides ont une activité vitaminique concernant les
capillaires sanguins, la peau (flavonoïdes hétérosidiques, anthocyanosides). Certains d’entre
eux, par leur goût amer et leur toxicité, protègent la plante contre les prédateurs. Néanmoins,
chez les mammifères (lapin, mouton), la forte consommation de plantes à glucosinolates peut
conduire à la formation d’un goitre. Les thiocyanates captent en effet l’iode et empêchent sa
fixation par la thyroïde. 43

II.5. Les Huiles essentielles

Les huiles essentielles (H.E) sont des extraits volatils et odorants que l'on extrait par
distillation à la vapeur d'eau, pressage ou incision de certains végétaux qui les contiennent.
Elles se forment dans un grand nombre de plantes comme sous-produits du métabolisme
secondaire.
Les H.E sont très largement répandues chez les végétaux supérieurs. Ils s'accumulent
dans certains tissus au sein de cellules ou de réservoirs à essence, sous l'épiderme des poils,
des glandules ou dans les espaces intercellulaires. Elles peuvent être localisées dans les
cellules sécrétrices isolées, mais on peut les trouver le plus souvent dans les organes
sécréteurs.46
Les H.E sont généralement liquides à température ambiante. Elles ne sont que très
rarement colorées. Leur densité est le plus souvent inférieure à l’eau. Elles ont un indice de
réfraction élevé, et le plus souvent sont douées de pourvoir rotatoire. Elles sont volatiles et
entraînables par la vapeur d’eau, elles sont très peu solubles dans l’eau, mais elles lui
communiquent leur odeur.

46
El Abed, D., et Kambouche, N., « Les huiles essentielles » Ed. Dar El Gharb, 2003.
28
Chapitre II Screening phytochimique

Elles sont solubles dans l’alcool et dans la plupart des solvants organiques. La teneur
des huiles essentielles est généralement faible, elle est de l’ordre de 1% à 5%. Il existe
quelques exceptions comme par exemple la Badiane de Chine, où la teneur en essence est
supérieure à 5%.
Les terpènes et les composés aromatiques du phénylpropane sont les principaux composants
des huiles essentielles. Le squelette carboné des terpènes dérive formellement du squelette
ramifié en C5 de l’isoprène (2méthylbuta-1,3-diène : C5H8). Ils résultent de la condensation de
deux ou plusieurs unités isopréniques. Selon le nombre d’unités associées,
47
on les classe en :

Hémiterpènes (C5)

Monoterpènes-(C10)

Sesquiterpènes(C15)

Diterpènes(C20)

TriterpènesC30)

Tétraterpènes-(C40) et polyterpènes.

Les huiles essentielles contiennent surtout des monoterpènes (C10), sesquiterpènes

(C15) et plus rarement des diterpènes (C20).48

Les terpènes sont de structures très diverses (acycliques, monocycliques,

bicycliques,…) et contiennent la plupart des fonctions chimiques des matières organiques :
alcool, aldéhyde,…et cétone.1

A titre indicatif, quelques-unes de leurs structures sont représentées sur la figure II.5.

47
Allinger, N.L., Cava, M.P., Dejougle, C.R., Jonhson, C.R., Lebel, N.A. et Stevens, C.L., “Chimie organique“,
Ediscience Mc Graw. Hill, Paris, 1975, p.813.
48
Finar, I.L., "Organic chemistry", Ed. Longman Scientific et Technical, 1994, Vol. II, p.354.
29
Chapitre II Screening phytochimique

CHO O

Limonène Géraniol Carvone

Myrcène

OH O

Bornéol Camphre
-Terpinéol -Pinène

Figure II.5 : Exemples de structures terpéniques

Les composés aromatiques dérivant du phénylpropane (C6-C3) sont moins fréquents

que les terpènes dans les HE et eux aussi peuvent contenir différentes fonctions. Nous avons
représenté sur la figure II.6 quelques unes de leurs structures.

O CHO

OCH3
OH

Eugénol Vanilline
E-anéthol Cinnamaldéhyde
(girofle)
(anis, fenouil) (cannelle)

Figure II.6 : Exemples de structures dérivant du phénylpropane

30
Chapitre II Screening phytochimique

II.5.1. Caractérisation
Les terpènes, principaux constituants des huiles essentielles, sont mis en évidence
comme les stérols insaturés par la réaction de Salkowski (addition d'acide sulfurique à la
solution chloroformique) :
Coloration jaune avec une fluorescence verte : phase inférieure sulfurique
Coloration rouge : phase supérieure chloroformique

II.5.2. Action pharmacologique et emplois

Les huiles essentielles, mélanges complexes de constituants en proportions souvent
variables, sont employées depuis les temps les plus reculés pour leurs effets thérapeutiques les
plus diversifiés. Elles sont douées de toute une gamme de propriétés biologiques. Chaque
huile possède des vertus spécifiques liées aux différents composants qu’elle renferme.
Un grand nombre d’H.E présentent des propriétés antiseptiques, d’autres des
propriétés digestives ou des propriétés antispasmodiques, sédatives, irritantes, cicatrisantes,
etc…Ces activités sont dues surtout à leurs constituants terpéniques. La mise en évidence de
leur activité biologique a fait l’objet de nombreuses études.49 Le tableau II.2 regroupe
l’activité biologique de quelques terpènes.
Tableau II.2 : Activité biologique de quelques composés terpéniques50

Composés Structures Activités biologiques

Antimicrobien; Analgésique; anti-acné; anti-

herpétique; anti-inflammatoire;
Thymol
OH antispasmodique; antioxydant; antiseptique;
antitussif; sédatif; pesticide; insectifuge.

49
Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., Idaomar, M., Food and Chemical Toxicology, 2008, 46, p.446-475.
50
Duke, J. Ac., Phytochemical and Ethnobotanical Databases, Site Internet : « [Link]
[Link]».
31
Chapitre II Screening phytochimique

Anti-acné; antiasthmatique; anti-microbien;

anti-tumorale, anti-inflammatoire;
β-Caryophyllène
sédatif; pesticide; insectifuge.

Analgésique; antimicrobien;

antispasmodique; antioxydant;
Myrcène
anti-épileptique; hypothermie; pesticide;

insectifuge.

Analgésique; allopathique; anesthésique;

Camphre CH3 anti-diarrhéique; antiémétique;
O antispasmodique; antiseptique; antioxydant;
CH3
anti-épileptique; antinévralgique;
CH3
antifongique; anti-acné; expectorant;
pesticide; insectifuge.

II.6. Les quinones

Les dérivés quinoniques renferment au sein de leur molécule des quinones. Ces
dernières sont des composés oxygénés, caractérisés par le motif 1,4-dicéto cyclohexa-2,5-
diénique (p-quinone) ou par celui du 1,2-dicéto cyclohexa3,5-diénique (o-quinone).
Elles sont liées au benzène, au naphtalène, à l’anthracène,…et au naphtodianthracène.1
O
1
6
O
2

3
5
4

o-Quinone
p-Quinone

32
Chapitre II Screening phytochimique

Les composés quinoniques existent dans le végétal (fleurs, champignons et algues) à

l’état libre ou combiné (sous forme d’hétérosides).45Ils sont classés en benzoquinones,
naphtoquinones, anthraquinones, anthracyclinones, …selon le noyau présent dans leur
molécule. A titre indicatif, sont donnés sur la figure II.7 quelques structures de dérivés benzo
et anthraquinoniques.

R1= OH, R2 = CH3 : Plumbagone

R1 = OH, R2 = H : Juglone

R1 = H, R2 = OH : Lawsone

Anthraquinone

Figure II.7 : Exemples de structures quinoniques

Les quinones libres sont solubles dans les solvants organiques et insolubles dans l’eau.
Leurs hétérosides sont solubles dans l’eau et les solutions hydro-alcooliques. Elles absorbent
dans le domaine UV. 1

II.6.1. Caractérisation des quinones

Les quinones sont caractérisées par la réaction de Bornträger effectuée soit
directement sur la matière végétale, soit après extraction au chloroforme. Une coloration rose
en milieu ammoniacal se développe révélant la présence de dérivés quinoniques.

II.6.2. Action pharmacologique et emplois

Les quinones sont des composés irritants qui ont des propriétés laxatives (émodol),
phytotoxiques (juglone) et allergiques (alkyl benzoquinones). Certaines d’entre elles ont des
propriétés tinctoriales comme par exemple la lawsone localisée dans les feuilles de l’arbuste
tropical Henne. Elle sert à teindre en orange la soie,…et les cheveux.47

33
Chapitre II Screening phytochimique

II.7. Les saponines ou saponosides

Les saponosides ou saponines (du latin sapo signifiant savon) sont des tensio-actifs
très répandus chez les végétaux. Ce sont des glycosides terpéniques. Ils se dissolvent dans
l’eau en formant des solutions moussantes comme les savons. Structuralement,
les saponosides peuvent être classés en deux groupes selon la nature de leur génine :
Saponosides triterpéniques
Ce sont les plus nombreux, environ 120. Ils sont essentiellement présents chez les
Angiospermes Dicotylédones, la structure de leur aglycone en C30 étant le plus souvent
pentacyclique comme la β-amyrine.
29 30

20 21
19
12 H
13 18 22
11 17
25 26 28
1 9 14
16
2
10 8 15
H
3 5 27
4 7
HO 6
H
24 23

β-amyrine

Saponosides stéroïdiques
Ils sont surtout représentés chez les Angiospermes Monocotylédones. La structure de
leur aglycone en C27 dérive uniquement de celle du stérane. La diosgénine en est un exemple.
21 26 27
O 25
18 H 20
12 22 24
17
11 13 23
19 O
H 16
1 9 14
2 H
10 8 15
H H
3 7
5
HO 4 6

Diosgénine
Du point de vue chimique, Ils se caractérisent également par un radical glucidique
(glucose, galactose) rattaché au groupe hydroxyle du carbone 3.
34
Chapitre II Screening phytochimique

Ils ont une importance économique comme source de composés stéroïdaux, leur
aglycone étant libéré de son oligoholoside pour synthétiser des stéroïdes humains.
Leur propriété physique principale est de réduire fortement la tension superficielle des
systèmes hétérogènes. Toutes les saponines sont fortement moussantes et constituent
d'excellents émulsifiants. Ils sont difficilement cristallisables. Ils sont solubles dans l’eau,
l’alcool dilué et dans les solvants organiques apolaires.37

II.7.1. Caractérisation des saponines

La mise en évidence des saponines peut se faire par différentes techniques :

Par examen par les rayons UV de la CCM qui révèle une fluorescence bleue pour les
saponines triterpéniques et jaune pour les stéroïdiques.

Par réaction de Libermann qui consiste à dissoudre les saponines dans l'acide
sulfurique concentré, on observe successivement une coloration jaune, rouge, bleu vert
ou bleu violet.

Par détermination de l’indice de mousse, effectuée selon la 10e Pharmacopée

Française. On introduit successivement dans une série de dix tubes à essai 1, 2, 3,
4,...10mL un décocté aqueux, obtenu par ébullition d’1g de substrat dans 100mL d’eau
pendant 30mn. Tous les tubes sont complétés à 10mL avec de l’eau distillée et agités
vigoureusement pendant 15 secondes. Après un repos de 15 minutes, la hauteur de la
mousse est mesurée. Si cette dernière est égale à 1cm, la dilution de la substance dans
ce tube correspond à l’indice de mousse recherché. Un indice supérieur à 100 est
considéré comme une réaction positive témoignant d’une richesse de la plante en
saponines.51

II.7.2. Action pharmacologique et emplois

La présence des saponines est largement commune chez les plantes médicinales, plus
de 100 familles en contiennent. Ce sont des substances naturelles à large spectre d’activité
biologique : Ils ont une action protectrice sur le système veineux d’où leur effet veinotrope.
Ils sont utilisées en thérapeutique comme : anti-tumoraux, anti-microbiens, anti-appétants,

51
Dohou, N., Yamni, K., Tahrouch, S., Idrissi, H., Badoc, A., Gmira, N., Bull. Soc. Pharm., Bordeaux, 2003, 142, p.61-78.
35
Chapitre II Screening phytochimique

anti-inflammatoires et cicatrisants notamment au niveau des plaies cutanées. Ils donnent

naissance à des mousses généralement stables, qui présentent une activité hémolytique. En
effet, ils provoquent la lyse des érythrocytes qui entraîne une toxicité à l’égard des animaux à
sang froid, principalement les poissons.1

III.8. Les stérols et stéroïdes

Les stéroïdes font partie des lipides insaponifiables et dérivent d’un triglycéride, le
squalène. Ce ne sont pas des terpènes et la « règle isoprénique » ne peut leur être appliquée,
mais ils présentent un lien avec les triterpènes du point de vue synthétique. Ce sont des
dérivés naturels caractérisés par une structure chimique commune comportant un squelette de
type cyclopentanoperhydrophénanthrénique ou stérane. Le cholestérol en est le principal
représentant.

Stérane
Cholestérol
Ils sont très répandus dans la nature où on les rencontre à tous les échelons du règne
végétal et du règne animal. Les stéroïdes naturels sont ainsi répartis en quatre séries :
Les acides biliaires
Les hormones stéroïdes
Les vitamines D
,…et Les stérols.
Les stérols sont des alcools secondaires, solides, saturés ou non, qui possèdent un
noyau polycyclique dérivé du phénanthrène et un groupement hydroxyle caractéristique en
C3. Ils se différencient les uns des autres par le nombre et la position des doubles liaisons dans
le noyau et par la structure de la chaîne latérale greffée sur le carbone 17. D’après l’origine
biologique on distingue deux types de stérols :
36
Chapitre II Screening phytochimique

Zoostérols : Ce sont des stérols d’origine animale, les plus importants sont le
cholestérol et certaines hormones stéroïdiques.
Phytostérols : Ce sont des stérols d’origine végétale, les plus importants sont
l’ergostérol, le sitostérol,… et le stigmastérol.52

II.8.1. Caractérisation des stérols et des stéroïdes

Les stérols sont caractérisés principalement en solution chloroformique par de
nombreuses réactions colorées, signalons la réaction de Liebermann-burchard et de
Salkowski. La coloration est en fonction de la structure des stérols et varie selon les stéroïdes
mis en jeu à savoir :
Réaction de Liebermann (addition d’anhydride acétique puis d’acide sulfurique à la
solution chloroformique) : coloration verte, rouge ou bleu violacé.
Réaction de Salkowski (addition d'acide sulfurique à la solution chloroformique) :
Coloration jaune avec une fluorescence verte : Phase inférieure sulfurique.
Coloration rouge : Phase supérieure chloroformique.

II.8.2. Action pharmacologique et emplois

Les différents stérols et leurs rôles biologiques sont reportés dans le tableau II.3.
Tableau II.3 : Rôle biologique de quelques stérols

Composés Structure Rôle

Participe à la synthèse biologique

des hormones de reproduction, de
Cholestérol
la vitamine D…
Activité antifongique et
HO
hémolytique53

Synthétisé in-vivo à partir du

Cholestanol cholestérol
Propriétés anticancéreuses54

52
Audigié, C., Zonszain, F., “Biochimie structurale“, Ed. Doin, 1991, p.246-252.
53
Takechi, M., Uno, C., Tanaka, Y., Phytochemistry, 1991, 30, p.2557-2558.
54
Inoue, K., Kubota, S., Seyama Y., Investigative Ophtalmology & Visual Science, 2000, 41, p.991-997.
37
Chapitre II Screening phytochimique

Propriétés anti-inflammatoires,
anti-cholestérol55
Traitement de l’hyperplasie de la
Sitostérol prostate56
Renforce le système immunitaire
(tuberculose, VIH, …)57

II.9. Les tanins ou tannins

Les tanins sont des substances d’origine végétale non azotées à structure poly-
phénolique, donc soluble dans l’eau. Leur poids moléculaire est compris entre 500 et 3000. En
plus de la réactivité usuelle des composés phénoliques, ils ont la capacité de faire précipiter
les alcaloïdes, la gélatine et les autres protéines.58

Ils sont localisés dans les feuilles, l’écorce et les fruits de nombreuses plantes. Ils font
ainsi partie intégrante de notre alimentation (thé, divers fruits…).

Chimiquement, les tanins résultent de la polymérisation de molécules élémentaires

possédant des fonctions phénols. Ils se divisent en deux catégories : les tanins hydrolysables
([Link].8) et les tanins condensés ([Link].9).
Tanins hydrolysables
Les tanins hydrolysables ou pyrogalliques donnent à l’hydrolyse un ose (le glucose) et un
acide phénolique, l’acide gallique ou l’acide ellagique. Ce dernier acide est une molécule
polycyclique qui se compose de deux cycles benzéniques portant chacun deux fonctions
hydroxylés qui sont reliés entre eux par deux fonctions quinoniques portant des cétones.
Les tanins galliques sont des polymères hétérogènes constitués d’un noyau central
-le glucose- et de chaînes latérales (en position 1, 2, 3, 4 ou 6 du glucose) comprenant 1 à n
monomères d’acide gallique.
Les tanins ellagiques sont des molécules complexes et rigides, constituées par des liaisons
carbone-carbone entre les noyaux benzéniques de l’acide ellagique et une molécule de
glucose.

55
Wong, N. C., Can. J. Cardiol, 2001, 17, p.715-721.
56
Aurad. Atif, B., Gan, Y., Fink, C. S., Nutr. Cancer, 2000, 36, p.74-78.
57
Park, E. H., Kahng, J. H., Lee, S. H., Shin, K. H., Fitoterapia, 2001, 72, p.288-290.
58
Bate. Smith, E. C., Swain, T., ‘’Flavanoïd compounds in Comparative Biochemistry’’ Academic Press, New-York,
1962, 3, p.755-809.
38
Chapitre II Screening phytochimique

Les tanins galliques et ellagiques sont caractéristiques des Dicotylédones où ils se

localisent dans tous les organes de la plante : racines, tiges, feuilles et fruit avant maturité. 44

OH

HO

O OH O
O

O
O

HO OH OH

OH OH
Acide gallique Acide ellagique

OH
HO
O OR
6 5 1
HO CO O 2
4
OR
HO CO O 3
RO

HO
OH
Figure II.8 : Exemple de structure de tanin hydrolysable (Tannin ellagique)

Tanins condensés
Les tanins condensés ou tanins catéchiques sont des polymères formés par la
condensation d’unités flavonoïdes reliées par des liaisons fortes carbone-carbone le plus
souvent 4→8 ou 4→6 non hydrolysables. Ils sont également appelés proanthocyanidines,
nom provenant de leur capacité à libérer des anthocyanidines de couleur rouge par rupture de
la liaison interflavane en milieu acide et en conditions d’oxydation.

39
Chapitre II Screening phytochimique

OH
OH

HO O

OH
OH
OH
HO O
OH

OH
OH
Figure II.9 : Exemple de structure de tanins condensés
Les tanins se dissolvent dans l'eau sous forme de solutions colloïdales. Ils sont
solubles dans les alcools et l'acétone. Ils sont précipités de leur solution aqueuse par de
nombreux réactifs, ils précipitent avec les sels de métaux lourds tels que le fer, le plomb, le
zinc et le cuivre.1

II.9.1. Caractérisation des tanins

La caractérisation des tanins se fait généralement par des réactions de coloration avec
les sels ferriques. On obtient des précipités colorés différemment selon la nature des tanins :
Les tanins hydrolysables donnent des colorations et des précipités bleu-noir et les
tanins condensés donnent des précipités brun-verdâtre.
Il existe d’autres réactions de différentiation des tannins :
Avec l’iodate de potassium : les tanins galliques donnent une coloration rose.
Avec l’acide nitreux en milieu acétique : les tanins ellagiques sont colorés en
rose, la coloration vire au pourpre puis au bleu.
Avec la vanilline chlorhydrique : les tanins condensés sont colorés en rouge.

II.9.2. Action pharmacologique et emplois

Les tanins ont des propriétés astringentes. Ils favorisent la régénération des tissus en
cas de blessure superficielle ou de brûlure. Ils sont utilisés pour fixer la teinture d'étoffes, pour
encoller le papier ou la soie et pour coaguler le caoutchouc. Ils sont largement employés dans
les industries du cuir dans le tannage des peaux animales, des vernis et de la peinture.1

40
Chapitre II Screening phytochimique

Les tanins avec les polyphénols possèdent des propriétés biologiques remarquables. Ils
ont une activité anti-oxydante59, anti-cancérigène, anti-inflammatoire dans les cas de brûlures,
anti-virale60, anti-diarrhéique, action anti-septique, vasoconstricteur de petits vaisseaux
(hémorroïdes, blessures superficielles) et possèderaient un rôle préventif contre les maladies
cardiovasculaires61.

III. TESTS PHYTOCHIMIQUES

Comme nous venons de l’exposer, les plantes contiennent plusieurs principes actifs
(flavonoïdes, alcaloïdes, tanins,… et H.E) qui se différencient entre eux par leur structure
chimique et leurs effets. Ces métabolites secondaires, substances extractibles, représentent un
grand intérêt dans de multiples industries (pharmacie, parfumerie, agro-alimentaire,
cosmétique…).
L’extraction de ces principes actifs nécessite préalablement leur mise en évidence au
sein de la plante. Pour notre part, nous nous sommes intéressés à la mise en évidence des
principes actifs présents au niveau de la racine de la Bryone (Bryonia dioica).
Afin de rechercher les constituants présents dans la racine de la Bryone, sujet de notre
étude, nous avons eu recours à différentes méthodes de détection qui consistent à réaliser des
réactions spécifiques conduisant à l’apparition d’un précipité ou un changement de couleur
confirmant la présence de ces phytoconstituants.
Plusieurs techniques ont été mises en œuvre afin de déceler la présence des principes
actifs au niveau de la racine de Bryonia dioica récoltée à Bouamama (région ouest d’Oran) en
Octobre 2008.
Après avoir récupéré la racine, nous l’avons lavé à l’eau courante, découpé en
rondelles (ou rouelles), puis séché au soleil et conservé, à température ambiante, dans un
endroit sec et à l’abri de la lumière. Après cela, les rondelles ont été broyées pour obtenir une
poudre fine, qui a servi à effectuer nos expériences.

59
Nakao, M., Takio, S., Ono, K., Phytochemistry, 1998, 49, 8, p.2379-2382.
60
a) Saint-Cricq de Gaulejac, N., Provost C., Vivas N., J. Agric. Food Chem., 1999, 47, p.425-431; b) Soleas,
G. J., Diamandis E. P., Goldberg, D. M., J. Clin. Lab. An., 1997, 11, p.287-313.
61
a) Frankel E.N., German J.B., Kinsella J.E., Parks E., Kanner J., Lancet, 1993, 341, p.454-457; b) Renaud S.,
de Lorgeril M., Lancet, 1992, 339, p.1523-1526.
41
Chapitre II Screening phytochimique

Les tests chimiques de détection des phytoconstituants ont été effectués à partir du
végétal épuisé dans différents milieu : eau, éthanol, …, milieu acide, milieu basique.

III.1. Produit végétal épuisé avec de l’eau

5g de matière végétale sont introduits dans un ballon surmonté d’un réfrigérant et
contenant 50 mL d’eau distillée. Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant 1h.
L’extrait aqueux obtenu après filtration de la solution a été soumis aux tests suivants :

Amidon :
Traiter 1mL de la solution préparée avec l’empois d’amidon ou avec l’iode I2.
L’apparition de la couleur bleu violacée indique la présence d’amidon.

Composés réducteurs :
Traiter 2 mL de la solution avec quelques gouttes de la liqueur de Fehling (0,5 mL
de réactif A et 0,5 mL de réactif B, mélange extemporané) et chauffer. L’apparition d’un
précipité rouge brique indique la présence d’hydrates de carbone.

Saponosides :
Après refroidissement de la solution, on introduit 6 mL de la solution dans un tube à
essai et on agite fortement pendant 30 secondes. Ensuite, on mesure la hauteur de la mousse
qui indique la teneur en saponosides après un repos de 20 mn :

 Pas de mousse : test négatif (-).

 Mousse moins de 1 cm : test faiblement positif (±).
 Mousse de 1-2 cm : test positif (+).
 Mousse plus de 2 cm : test très positif (++).

Tanins :
Traiter 1mL de la solution aqueuse avec 1 mL d’eau et quelques gouttes d’une solution
de chlorure ferrique (FeCl3) à 1%. L’apparition d’une coloration vert foncée ou bleu-verdâtre
indique la présence de tanins.

42
Chapitre II Screening phytochimique

Réactif de Stiasny
10 mL de formol à 30 % et 5 mL d'acide chlorhydrique concentré sont ajoutés à 5 mL
de la solution à tester. Le mélange est chauffé au bain-marie pendant 15 mn.
L’obtention d’un précipité montre la présence de tanins catéchiques. Pour les tanins
galliques, nous avons filtré la solution précédente. Ensuite, on ajoute au filtrat recueilli 5mL
d’acétate de sodium et 3 gouttes de FeCl3. L’apparition d’une coloration bleu-noir intense,
signe la présence de tanins galliques.
Réactif de Bath Smith
À 2 mL d’infusé on ajoute 2 mL d’HCL à 20 %. Le mélange est porté à l’ébullition. En
présence des tannins catéchiques on aura un précipité de couleur rouge brique. (Apparition
d’une couleur vert bouteille).

III.2. Produit végétal épuisé avec de l’éthanol

20g de matière végétale sont introduits dans un ballon surmonté d’un réfrigérant et
contenant 100 mL d’éthanol. Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant 1h. L’extrait
obtenu après filtration de la solution a été soumis aux tests suivants :
Alcaloïdes :
Deux essais ont été effectués :
 Evaporer 20 mL de la solution éthanolique.
Ajouter 5 mL d’acide chlorhydrique (HCl) à 10% au résidu et chauffer dans un bain-
marie. Filtrer le mélange et l’alcaliniser avec une solution d’hydroxyde d’ammonium
(NH4OH) à 10% jusqu’à pH = 9, extraire la solution avec l’éther diéthylique (Et2O), ensuite,
dissoudre le résidu obtenu dans l’acide chlorhydrique (HCl) à 2%.

Les alcaloïdes sont décelés par les réactifs de Mayer et de Wagner.

 Evaporer 20 mL de la solution éthanolique.
Ajouter 5mL d’acide chlorhydrique (HCl) 2N au résidu et chauffer dans un bain-marie.
Filtrer puis diviser le filtrat en deux parties :
La première est traitée avec le réactif de Mayer et la seconde avec le réactif de Wagner.
L’observation d’une turbidité ou d’un précipité indique la présence d’alcaloïdes.
 Une légère opacité : test faiblement positif (±)
 Une turbidité et non une floculation : test positif (+)
 Une floculation ou un précipité lourd : test très positif (++)
43
Chapitre II Screening phytochimique

Anthracénosides et les anthocyanosides :

25 mL de l’extrait éthanolique sont introduits dans un ballon surmonté d’un
réfrigérant et contenant 15 mL d’acide chlorhydrique (HCl) à 10%. Le mélange ainsi formé
est porté au reflux pendant 30 mn. Après refroidissement, on extrait la solution trois fois avec
15mL d’éther diéthylique. Ensuite, les deux phases sont traitées séparément.

Anthracénosides :
Traiter 8mL de la solution extractive éthérique avec le réactif de Bornträger.
L’apparition d’une couleur qui varie de l’orange-rouge au violet pourpre indique la présence
d’anthracénosides.

Anthocyanosides :
Doser la phase aqueuse acide par une solution de soude (NaOH).
Un changement de couleur en fonction du pH prouve la présence des anthocyanosides.
 pH < 3 la solution se colore en rouge, coloration qui décroît quand le pH
augmente vers la neutralité.
 4 < pH < 6 la solution prend une coloration bleue.

Composés réducteurs :
Ajouter 2 mL d’eau distillée et quelques gouttes de la liqueur de Fehling à 1mL de
l’extrait éthanolique puis chauffer. La formation d’un précipité rouge brique prouve la
présence de sucres.

Flavonoïdes :
Ajouter quelques gouttes d’acide chlorhydrique concentré (HCl) à 5 mL de l’extrait
éthanolique en présence de 0,5g de tournures de magnésium (Mg). La présence des
flavonoïdes est indiqué par l’apparition d’une couleur : rose-orangé (flavones) ; rouge
(flavonols) ; rouge, violet, bleu (flavonones) et pas de coloration (isoflavones).

44
Chapitre II Screening phytochimique

Stérols et stéroïdes :
Deux essais ont été réalisés :
 Traiter le résidu obtenu après évaporation de 10mL d’extrait éthanolique avec
10 mL de chloroforme (CHCl3). Après filtration, on ajoute quelques gouttes d’acide
sulfurique (H2SO4) concentré à 5 mL de la solution chloroformique en présence de 5 mL
d’anhydride acétique. Agiter puis laisser reposer.
L’apparition d’une coloration violacée fugace virant au vert indique la présence des stérols et
stéroïdes.
 Dissoudre le résidu obtenu par évaporation de 10mL de l’extrait alcoolique dans
0,5 mL de chloroforme (CHCl3). Traiter le filtrat avec 1mL d’acide sulfurique concentré.
L’apparition d’une couleur rouge superposée à une couleur jaune-verdâtre indique
la présence des stérols et stéroïdes.

Tanins :
Traiter 2 mL de la solution éthanolique avec quelques gouttes d’une solution de chlorure
ferrique (FeCl3) à 1%. Puis les Réactifs de Stiasny et Bath Smith sont utilisés.
L’apparition de la couleur verte ou bleu verdâtre indique la présence des tanins.

III.3. Produit végétal épuisé avec du chloroforme

5g de matière végétale sont introduits dans un ballon surmonté d’un réfrigérant et
contenant 50mL de chloroforme (CHCl3). Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant
30mn. L’extrait obtenu après filtration de la solution a été soumis aux tests suivants :

Stérols insaturés et terpènes :

Traiter 2 mL de la solution chloroformique avec 1 mL d’acide sulfurique (H2SO4)
avec précaution, l’apparition à l’intersection de deux phases, d’une couleur verte qui se
transforme en rouge confirme l’existence des stérols insaturés et terpènes.

Anthraquinones
Ajouter 1mL d’une solution de potasse [KOH aqueux 10% (v/v)] à l’extrait
chloroformique. Après agitation, la présence des anthraquinones est confirmée par un virage
de la phase aqueuse au rouge.

45
Chapitre II Screening phytochimique

III.4. Produit végétal épuisé avec de l’acide sulfurique

5g de matière végétale sont introduits dans un ballon surmonté d’un réfrigérant et
contenant 50mL d’acide sulfurique (2N). Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant
2h. L’extrait obtenu après filtration de la solution a été soumis aux tests suivants :
Quinones combinées :
Extraire la solution obtenue avec du chloroforme (CHCl3), décanter, puis après
évaporation de la phase organique, on ajoute quelques gouttes d’une solution d’hydroxyde
d’ammonium (NH4OH) diluée à 50%. L’apparition d’une couleur rouge indique la présence
de quinones combinées. Si on n’observe aucun changement de couleur cela prouve qu’il n’y a
pas de quinones combinées au niveau de cette plante.

IV. RESULTATS ET DISCUSSION

Les substances extractibles par l’eau, l’éthanol,…le milieu acide ou basique à partir de
la racine de la Bryone ont donné lieu à la formation d’un précipité ou à l’apparition d’un
changement de couleur confirmant la présence de différents phytoconstituants contenus dans
la plante étudiée. Les résultats des tests chimiques de détection des phytoconstituants de la
racine de la Bryone épuisée par l’eau sont consignés sur le tableau II.4.

Tableau II.4 : Résultats des tests chimiques de détection des principes actifs de l’extrait
aqueux de la racine

Principes actifs Techniques utilisées Résultats

Empois d’amidon +/-

Amidon
I2 +
Composés réducteurs Liqueur de Fehling +

La Mousse +
Saponosides
Indice de mousse 100
FeCl3 +

Tanins Réactifs de Stiasny +

Réactifs de Bath Smith +

+ : réaction positive +/- : réaction douteuse; - : réaction négative

46
Chapitre II Screening phytochimique

On note que tous les tests répertoriés sur le tableau II.2 sont positifs ; ce qui signifie
que la racine de la Bryone contient de l’amidon, des composés réducteurs (sucres), des
saponosides et des tanins.

Les résultats des tests chimiques de détection des phytoconstituants de la racine de la

Bryone épuisée par l’éthanol sont regroupés sur le tableau II.5.

Tableau II.5 : Résultats des tests chimiques de détection des principes actifs de l’extrait
éthanolique de la racine

Principes actifs Techniques utilisées Résultats

Réactif de Mayer +
Alcaloïdes
Réactif de Wagner +

Anthocyanosides Dosage avec NaOH +

Anthracénosides Réactif de Bornträger +

Composés réducteurs Liqueur de Fehling +

Flavonoïdes HClConcentré + Mg +

Stérols et stéroïdes Réactif de Lieberman Burchard +

FeCl3 +

Tanins Réactif de Stiasny +

Réactif de Bath Smith +

+ : réaction positive +/- : réaction douteuse; - : réaction négative

On remarque également, que tous les tests effectués sur l’extrait éthanolique sont
positifs ; ce qui indique que la racine de la Bryone contient des alcaloïdes, des
anthocyanosides, des anthracénosides, des composés réducteurs (sucres), des flavonoïdes, des
stérols, des stéroïdes et des tanins.

47
Chapitre II Screening phytochimique

Les résultats des tests chimiques de détection des phytoconstituants de la racine de la

Bryone épuisée par le chloroforme (CHCl3) et l’acide sulfurique (H2SO4) sont reportés sur le
tableau II.6.

Tableau II.6 : Résultats des tests chimiques de détection des principes actifs de la racine
épuisée au CHCl3 et H2SO4

Principes actifs Solvant d’épuisement Techniques utilisées Résultats

Stérols insaturés et
terpènes Chloroforme H2SO4 Concentré +

Quinones combinées Acide sulfurique CHCl3 + NH4OH +/-

Anthraquinones Chloroforme KOH à 10% -

+ : réaction positive +/- : réaction douteuse; - : réaction négative

Au vu des résultats des tests réalisés par le chloroforme et l’acide sulfurique,

les anthraquinones sont absentes dans notre extrait. Les quinones combinées existent en
petites quantités. Les stérols insaturés et terpènes se trouvent en grandes quantités.

V. CONCLUSION

Nous avons montré par cette étude la diversité structurale des phytoconstituants
des plantes, leur rôle et leur caractérisation. Par ailleurs, le screening phytochimique effectué
sur la racine de la Bryone, par épuisement à l’aide de divers solvants révèlent :

La présence d’amidon, d’alcaloïdes, d’anthracénosides, d’anthocyanosides, de

composés réducteurs, de flavonoïdes, d’hétérosides, de saponosides et de tanins.
Les composés les plus abondants dans la racine sont surtout les alcaloïdes et les saponosides.
Nous tenterons dans le chapitre suivant d’extraire quelques principes actifs qui ont été
mis en évidence comme les alcaloïdes, les flavonoïdes, l’huile essentielle et les tanins … à
partir de la racine de la Bryone pour les analyser.

48
 Chapitre III

Extraction et Analyse de
quelques principes actifs
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

I. INTRODUCTION

A notre connaissance aucune étude n’a été réalisée sur les constituants chimiques et
l’activité biologique de la Bryone en Algérie, ni dans les pays du Maghreb. Toutefois, la
littérature signale la présence d’alcaloïdes62, de flavonoïdes, 63de glycosides, 64de saponosides, 65
66
de triterpènes …et quelques traces d’huile essentielle.67 Les résultats des tests chimiques
positifs que nous avons obtenus sur la mise en évidence des phytoconstituants (cf. chapitre II)
nous ont incités à tenter d’extraire les alcaloïdes, les flavonoïdes, l’huile essentielle,…et les
tanins contenus dans la racine de Bryonia dioica.
Dans le but d’analyser ces principes actifs isolés à partir de la racine de la Bryone, nous
avons eu recours à la chromatographie ainsi qu’à la spectroscopie.
Ces techniques permettent d’avoir des données conduisant à l’identification des structures
moléculaires organiques. Les plus utilisées au cours de notre travail ont été : CCM, CC, CG/SM,
HPLC; UV, IR, RMN 1H et RMN 13C.

II. RAPPEL SUR LES METHODES D’ANALYSE

II.1. Analyse chromatographique

La chromatographie est une technique fréquemment utilisée pour séparer et identifier les
espèces chimiques constituant un corps. Bien que cette technique ait été développée à l’origine
pour séparer des substances colorées d’où son nom dérive (khrôma qui signifie couleur en grec),
elle est d’une grande efficacité pour l’analyse des substances organiques.

II.1.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince est un phénomène d’adsorption que l’on effectue
surtout en vue d’une analyse et de séparation des espèces chimiques constituant un corps.
L’appareillage utilisé pour la chromatographie sur couche mince est relativement simple. Il est
composé d’une plaque et d’une cuve rectangulaire pour l’élution. Cette dernière dépend du

62
Raffauf, R. F., “A Handbook of Alkaloids and Alkaloid-Containing Plants“, Smith Kline and French Laboratories,
Philadelphia, 1970, p.24-33.
63
a)Proliac, A., Chaboud, A., et Raynaud, J., Pharm Acta Helv, 1989, 64, p.207-208 ; b) Krauze-Baranowska, M. et
Cisowski W., Phytochemistry, 1995, Vol.39, N°3, p. 727-29.
64
P.J. Hylands et J. Kosugi, Phytochemistry, 1982, 21(6), p.1379-84.
65
Oobayashi, K., Yoshikawa, K., et Arihara, S., Phytochemistry, 1992, 31 (3), p. 943-46.
66
a) Hylands, P.J., Oskoni, M.T., Phytochemistry, 1979, 18 (11), p.1843-45; b) Hylands, P.J., Mansour, E.S.,
Oskoui., M.T., J. Chem. Soc., 1, 1980, p.2933-66.
67
Karryev, M.D., Artemeva, M.V., Meshcheryakov A. A., and Rozhkova L.I., Izv Akad Nauk Turkm SSR Ser
Biol Nauk, 1981, 4, p.54-66.

50
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

choix des phases stationnaire et mobile (éluant). Les phases stationnaires les plus utilisées en
chromatographie sur couche mince sont le gel de silice, l’alumine et la cellulose en poudre.
Nous rapportons dans ce qui suit le protocole effectué pour l’huile essentielle de la Bryone.

Protocole expérimental :

Sur une plaque de gel de silice de 2 × 5 cm, on trace au crayon un trait horizontal à une distance
de 0,5 cm du bord inférieur et à 0,2 cm du bord supérieur. On dilue l’H.E dans l’éther et on
dépose une goutte sur le trait du bord inférieur. La plaque est alors introduite dans une cuve
contenant l’éluant : éther/éther de pétrole (1 : 4) à une hauteur de 0,5 cm.
Lorsque l’éluant atteint le front de la plaque, cette dernière est retirée de la cuve et puis
séchée. Les taches apparaissant à l’aide d’un révélateur sont caractérisées par un facteur de
rétension (Rf) qui est défini comme étant le rapport entre la distance parcourue par la substance
(X) sur la distance parcourue par le front de l’éluant (Y) :

II.1.2. Chromatrographie sur colonne (CC)

Le principe général de cette technique est similaire à celui de la CCM. Dans cette forme
de chromatographie, la phase stationnaire est contenue dans une colonne. L’éluant qui peut être
sous la pression d’une pompe ou non, entre par une extrémité et sort par l'autre. Il peut être un
solvant unique ou un mélange de solvant.
Sous l’action de l’éluent et des liaisons qu’elles établissent avec l’adsorbant,
les molécules vont se déplacer différemment dans la colonne et prendre un certain retard les unes
par rapport aux autres pendant la migration. Elles vont donc se présenter avec un certain retard à
la sortie de la colonne.

51
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

L’élution peut se faire sous forme d’un gradient. En principe, la phase mobile est
composée des mêmes solvants que ceux utilisés pour la CCM. Toutefois, l’élution peut être
accélérée grâce à l’addition progressive de solvant de plus en plus polaire par rapport à la phase
initiale. Les différentes fractions sont collectées dans des tubes à essais. Ces fractions sont
ensuite analysées par CCM décrite précédemment.

II.1.3. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

II.1.3.1. Principe de la chromatographie en phase gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse est rapidement devenue l’une des meilleures
méthodes analytiques dans le domaine scientifique, autant en recherche que dans le domaine
industriel (industrie pharmaceutique, agriculture, environnement,…etc.). L’échantillon
à analyser est introduit dans l’injecteur de façon à ce qu’il entre dans la colonne sous forme
vapeur. La phase mobile est un gaz chimiquement inerte, appelé gaz vecteur (N2 ou He). Celui-ci
entraîne avec lui l’échantillon à travers la colonne à des vitesses différentes. Lorsqu’il arrive à la
sortie de la colonne, il est détecté par un détecteur qui transmet un signal électrique à un
enregistreur. Les résultats apparaissent sur le chromatogramme sous forme de pics, qui sont
caractérisés par un temps de rétention permettant ainsi de déterminer l’identité du constituant
dans l’échantillon.

II.1.3.2. Principe de la spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse est une technique de détection extrêmement sensible qui
permet de déterminer le poids moléculaire d’un produit pur ou de recueillir des informations
structurales à partir de la nature des fragments obtenus.
Le principe de la spectrométrie de masse est basé sur l’ionisation des molécules
introduites dans l’appareillage par un champ électrique et/ou magnétique. L’ion ainsi obtenu,
appelé ion moléculaire, permet la détermination de la masse molaire du composé.68

II.1.3.3. Principe de la CG/SM

La chromatrographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse constitue l’un
des outils le plus puissant d’analyse de mélanges complexes de molécules organiques ou
biochimiques.69 La chromatographie en phase gazeuse permet de séparer les constituants d'un

68
Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Darnell, J., Kaiser, C., Masson, L., “Biologie moléculaire de la cellule“,
3émeEd. Deboeck, Bruxelles, 2005, p.94-95.
69
Skoog, A., Holler, F., Nieman, A., “Principes d’analyse instrumentale”, Ed. De Boeck, Paris, 2003, p.528.

52
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

mélange. La spectrométrie de masse associée permet d'obtenir le spectre de masse de chacun des
constituants et bien souvent de les identifier.
La technique CG/SM consiste à injecter l’échantillon à analyser dans l'appareil de CG.
Les gaz ionisés sont injectés dans un spectrographe de masse. On obtient pour chaque pic de CG
un temps de rétention correspondant et un spectre de masse permettant de caractériser le
composé obtenu.

II.1.4. Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC)

La chromatographie en phase liquide à haute pression met en œuvre, aussi bien des
phénomènes de partage qui sont les plus courants, que des phénomènes d’adsorption, ou
d’échanges d’ions. La méthode de séparation fait sensiblement appel aux mêmes éléments de
base que ceux employés en chromatographie sur colonne. Des colonnes de large diamètre sont
utilisées avec un débit faible et sous pression. La distribution du soluté entre la phase stationnaire
greffée dans la colonne et la phase mobile, se fait grâce à une pompe qui maintient constant le
débit du liquide. Les solvants le plus souvent utilisés sont le méthanol ou l’acétonitrile purs ou
mélangé à l’eau distillée. En outre, l’emploi d’un détecteur permet l’enregistrement électronique
du message qui est traduit par des pics ou chromatogramme.

II.2. Analyse spectroscopique

L’identification des structures moléculaires organiques se fait généralement par
utilisation combinée de plusieurs techniques spectroscopiques, la spectroscopie UV,
la spectroscopie IR, la spectroscopie RMN du H1 et RMN du 13C.

II.2.1. Spectroscopie Ultraviolet-Visible (UV)

La spectroscopie UV est une technique simple et rapide qui fournit des informations sur
la nature chimique, les propriétés physico-structurales, et les caractéristiques optiques des
composés. Dans les composés, chaque fonction absorbe à une longueur d’onde bien déterminée.
L’absorption de rayonnement UV par les molécules se traduit généralement par diverses bandes
d’absorption électronique constituées de nombreuses raies. Chaque raie résulte de la transition
d’un électron de l’état fondamental à l’un des nombreux états énergétiques roto vibrationnels
associés à chaque état électronique excité. Ceci permet de caractériser surtout les molécules
possédant des doubles liaisons conjuguées. La mesure de l’absorption UV permet également de

53
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

connaître ou de déterminer la composition chimique d’un mélange, par comparaison avec des
témoins.70

II.2.2. Spectroscopie Infra-rouge (IR)

La spectroscopie infrarouge (IR) est une technique d’analyse qui sert principalement à
déterminer la présence de groupements fonctionnels dans les molécules organiques et
les structures dans certaines molécules simples. Elle est basée sur l'absorption d'un rayonnement
infrarouge par l’échantillon analysé. Elle permet via la détection des vibrations caractéristiques
des liaisons chimiques, d'effectuer l'analyse des fonctions chimiques présentes dans
l’échantillon.71

II.2.3. Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

La résonance magnétique nucléaire ou RMN est une technique utilisée pour l’analyse des
structures de nombreuses molécules chimiques. Elle sert principalement à la détermination
structurale des composés organiques. Cette méthode repose essentiellement sur le phénomène de
magnétisme. En effet, les noyaux de certains atomes (1H, 13C, etc.…) possèdent un moment
magnétique nucléaire, c'est-à-dire qu’ils se comportent comme des aimants microscopiques
caractérisés par une grandeur quantique appelée «le spin».
La technique de RMN étudie le comportement des noyaux atomiques en présence d'un
champ magnétique externe. Le champ magnétique appliqué aux produits entraîne un
dédoublement des niveaux d'énergie du spin nucléaire, de sorte qu'on puisse induire des
transitions entre eux, suite à l'absorption d'une radiation électromagnétique adéquate.
Les spectres RMN du 1H et du 13C sont enregistrés sur un appareil Brucker AC-300, qui
fonctionne à une fréquence de 300 MHz. Les échantillons sont dissous dans un solvant deutérié
qui peut être du dichlorométhane, du chloroforme, du DMSO etc… Ces solvants possèdent des
déplacements chimiques spécifiques. Le tube contenant l’échantillon est soumis au champ
magnétique permettant l’obtention des spectres utiles à l’identification structurale.

70
Skoog, D.A., West, D.W., Holler, F.J., Buess-Herman, C., “Chimie analytique“, Ed. De Boeck, Bruxelles, 1997,
p.557-63.
71
Peter, K., Vollhardt, C., Schore, N., “Traité de chimie organique“, 4émeEd. De Boeck, Bruxelles, 2004, p.444-49.

54
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Déplacement chimique (en ppm) des solvants deutériés utilisés.

Solvants δ 1H (ppm) δ 13C (ppm)

Dichlorométhane-d2 5,32 (Singlet) 53,8 (Singlet)
Chloroforme-d1 7,26 (Singlet) 77,0 (Triplet)
DMSO-d6 2,5 (Quintuplet) 39,43 (Septuplet)

II.2.3.1. RMN 1H du proton

Le spectre RMN du proton est une méthode puissante utilisée dans la détermination
structurale des composés organiques inconnus. Il fournit de nombreuses informations tels que,
les différents types d’hydrogènes présents dans la molécule analysée, les différents types
d’hydrogènes présents dans l'environnement électronique, le nombre d'hydrogènes voisins d’un
hydrogène donné et le déplacement chimique caractéristique de chaque proton.

II.2.3.2. RMN 13C du carbone 13

Cette technique permet de mettre en évidence tous les carbones de la molécule. L'analyse
se base sur les déplacements chimiques observés en fonction de l'environnement de chacun des
atomes de carbone. Cette expérience permet la mise en évidence des carbones primaires (CH3),
secondaires (CH2), tertiaires (CH) et dans une moindre mesure les carbones quaternaires.72

III. PROCEDES D’EXTRACTION UTILISES

Il existe plusieurs procédés pour extraire les principes actifs du métabolisme secondaire à
partir de la matière végétale. Cela va de l’hydrodistillation, chauffage à reflux à l’extraction par
les solvants organiques.

III.1. Chauffage à reflux

C’est un procédé qui est utilisé pour extraire les principes actifs tels que les alcaloïdes et
les tannins. Il consiste à porter à ébullition un mélange de matière végétale et de solvant. On
utilise ici un réfrigérant à boule, plutôt qu’un réfrigérant droit, afin d’augmenter la surface de
contact avec les vapeurs. La vapeur dégagée est condensée sur les parois froides du bas du
réfrigérant ce qui permet de former des gouttes de liquide qui tombent régulièrement du

72
Silverstein, R.M., Bassler, G.C., Morill, T.C., Larue, E., “Identification spectrométrique de composés organiques“, 5émeEd.
De Boeck, Bruxelles, 2004, p.165-71.

55
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

réfrigérant dans le mélange. Ainsi, on récupère le filtrat après la fin du chauffage pour entamer
l’extraction par différents solvants afin de récupérer le produit final ([Link].1).

Figure III.1: Montage de chauffage à reflux

III.2. Hydrodistillation
C’est une méthode qui est utilisée principalement pour extraire les huiles essentielles
(H.E). Elle consiste à porter à ébullition un mélange de matière végétale et d’eau. La vapeur
d'eau formée entraîne les composés organiques à l'état gazeux vers le réfrigérant qui sont
récupérés dans un ballon. Le distillat, ainsi obtenu est introduit dans une ampoule à décanter afin
de séparer l’eau de l’H.E par extraction avec des solvants tels que l’hexane ou le
dichlorométhane par exemple ([Link].2).

56
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.2: Montage d’hydrodistillation

IV. EXTRACTION ET ANALYSE DES PRINCIPES ACTIFS DE LA BRYONE

Dans toutes les analyses par CCM que nous avons effectué, le p-anisaldéhyde a été
utilisé comme révélateur. C’est un révélateur universel obtenu en dissolvant 4,5 mL de para-
anisaldéhyde, 5 mL d’acide acétique à 99 % et 5 mL d’acide sulfurique concentré dans 85 mL
d’éthanol à 95 %.

IV.1. Extraction et analyse des alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des substances naturelles qui existent le plus souvent sous forme de sels
et réagissent comme des bases. Leur extraction se fait par des solvants organiques soit en milieu
acide ou basique.

Protocole expérimental :
Le principe de l’extraction des alcaloïdes en milieu basique peut se faire par deux
méthodes, l’une utilisant le bicarbonate, l’autre l’ammoniac. Pour notre part, nous avons utilisé
l’ammoniac (Schéma III.1).

57
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Une quantité de 100g de matière végétale (racine broyée en poudre) est submergée dans
200mL de solution ammoniacale (NH4OH) à 10% pendant 24h. Ensuite, les bases libérées sont
portées au reflux pendant 20h dans 500mL de méthanol. Après filtration la solution obtenue est
extraite par l’éther puis acidifiée à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique (HCl) 1N.
Après décantation, la phase aqueuse acide obtenue est alcalinisée par une solution de
soude (NaOH : 1N), puis extraite avec trois solvants de polarité croissante : le dichlorométhane,
l’acétate d’éthyle et le butanol. Les solutions organiques sont alors évaporées après séchage sur
Na2SO4.
Le schéma III.1 représente le principe de l’extraction des alcaloïdes.

100 g de MV

 200 mL de NH4OH à 10% (macération 24h)

 500 mL de MeOH
 Reflux 20h
 Filtration

Marc épuisé Solution extractive

 Evaporation
 Extraction à l’aide de l’éther
 Epuisement par HCl 1N

Solution aqueuse acide Solvant épuisé

 NaOH (1N)
 CH2Cl2, AcOEt et BuOH
 Na2SO4 puis évaporation

Solution aqueuse épuisée Alcaloïdes Totaux

Schéma III.1: Différentes étapes d’extraction des alcaloïdes en milieu basique par le méthanol

Les résultats obtenus lors de l’extraction des alcaloïdes par chauffage au reflux dans le
méthanol sont reportés dans le tableau III.1.

58
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Tableau III.1: Résultats d’extraction des alcaloïdes

Extraits Couleur Aspect Pf Poids (g) Rdt %

Dichlorométhane Blanc Solide > 270°C 1,968 1,97

Extrait 1
Acétate d’éthyle Blanc Solide > 270°C 2,089 2,09
Extrait 2
Butanol Brun Solide 130°C 0,9 0,9
Extrait 3 jaunâtre
mt= 4,957g Rdtt= 4,96%

Analyse spectroscopique des extraits 1, 2 et 3 des alcaloïdes

Spectroscopie IR

Les spectres IR ont été réalisés sur un appareil JASCO FT/IR-4200 à transformée de
fourrier sur des échantillons conditionnés en pastilles de KBr. Les nombres d’ondes sont
exprimés en cm-1. Le spectre IR de la fraction 1 représenté sur la figure III.3 montre différentes
bandes caractéristiques :

 Une bande intense et large correspondant aux vibrations d’allongement d’un OH ou NH,
vibrations de valence qui apparaissent vers 3301,54cm-1.

 Une bande petite et large correspondant aux vibrations d’allongement des CH aliphatiques
vers 2400,94cm-1.

 Une bande fine et intense attribuable aux carbonyles vers 1679,69cm-1.

 Deux bandes intenses relatifs aux doubles liaisons C=C du benzène vers 1153,22 et
1085,73cm-1.

 Une multitude de bandes correspondant aux vibrations de déformation hors du plan des CH
du benzène à 982,554 – 820,563 - 619,038 -470,546 - 418,477.

59
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.3 : Spectre IR de l’extrait 1 d’alcaloïde

60
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Le spectre IR de l’extrait 3 reproduit sur la figure III.4 montre les bandes caractéristiques
suivantes :

 Une bande intense et large correspondant aux vibrations d’allongement d’un OH ou NH,
vibrations de valence qui apparaissent vers 3375,78cm-1.

 Une bande petite correspondant aux vibrations d’allongement des CH aliphatiques vers
2929,34cm-1.

 Une bande intense qui peut correspondre à C=C, C=O, C=N, ou N=O vers 1662,34cm-1.

 Une bande d’intensité moyenne correspondant aux doubles liaisons C=C vers 1420,32cm-1.

 Une bande d’intensité moyenne correspondant aux liaisons C-C, CO, CN vers 1050,05cm-1.

 Une multitude de bandes correspondant aux vibrations de déformation hors du plan des CH
du cycle aromatique à 669,178 -420,406 cm-1.

* Bande large et intense qui est caractéristique d’une bande OH ou NH. Il est difficile de
distinguer l’une de l’autre.

61
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.4 : Spectre IR de l’extrait 3 d’alcaloïde

62
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Spectroscopie RMN 1H

L’analyse par spectroscopie RMN de l’extrait 1 d’alcaloïde montre un signal sous forme
de quintuplet à 2,5ppm correspondant au DMSO et trois signaux sous forme de multiplet de 7,45
à 7,48ppm, de 8,02 à 8,04ppm et à 8,49ppm.

Sur la base des données spectroscopiques obtenues (IR et RMN) et en nous aidant de la
littérature, la structure que nous pouvons proposer pour l’extrait 1 d’alcaloïde est probablement
la bryonicine, un alcaloïde contenu dans les espèces du genre bryone.73

Une multitude de pics est enregistrée sur le spectre RMN du proton de l’extrait 3 reportée
sur la figure III.6. On note le signal du solvant (DMSO), un signal dans la région des systèmes
aromatiques. Toutefois, l’attribution des signaux observés n’a pu être établie.

73
Couplan, F., “Le règne végétale : Plantes sauvages comestibles “, Ed. Ellebore, 2009, p.201-202.

63
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.5 : Spectre de RMN du proton de l’extrait 1 d’alcaloïde

64
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.6 : Spectre de RMN du proton de l’extrait 3 d’alcaloïde

65
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

IV.2. Extraction et analyse des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des composés naturels appartenant à la famille des polyphénols. Ils
sont souvent liés à des sucres pour former des hétérosides flavonoïdiques. Ces hétérosides
peuvent être extraits, le plus souvent à chaud, par les alcools, l’acétone ou un mélange d’eau-
acétone et les génines libres peuvent être extraits par l’éther. Les solvants apolaires éliminent les
lipides et la chlorophylle et les solvants polaires (AcOEt, butanol,…) entraînent la majorité des
hétérosides.

Protocole expérimental :

Une macération de 100g de matière végétale (racine broyée en poudre) dans le méthanol
est réalisée pendant 24h. Après filtration, on recueille un filtrat qui est laissé de côté. La plante
est réextraite une seconde fois avec le méthanol dans les mêmes conditions. Après évaporation
des deux filtrats, on ajoute de l’eau à la solution obtenue. Après cela, on met en œuvre une série
d’extraction liquide-liquide par des solvants de polarité croissante :

par l’éther pour extraire les génines ou les flavonoïdes libres

par l’acétate d’éthyle et le butanol qui donnent la majorité des flavonoïdes glycosidiques

Les solutions organiques sont alors évaporées à sec après séchage sur Na2SO4.
Le schéma III.2 représente le principe de l’extraction des flavonoïdes.

66
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

100 g de MV
 Macération avec le MeOH (2x24h)
 Filtration
 Evaporation
 Extraction avec l’H2O et l’éther

Phase organique éthérée Phase aqueuse

 Evaporation  AcOEt

Extrait 1
Flavonoïdes libres
Phase Organique Phase aqueuse
(Génines)
 Evaporation  n-butanol

Extrait 2 Phase Organique Phase aqueuse

Flavonoïdes glycosidiques
 Evaporation

Extrait 3
Majorité des flavonoïdes
glycosidiques

Schéma III.2: Différentes étapes d’extraction des flavonoïdes par le méthanol

Les résultats obtenus lors de l’extraction des flavonoïdes par macération sont regroupés
dans le tableau III.2.
Tableau III.2 : Résultats d’extraction des flavonoïdes

Extraits Couleur Aspect Poids (mg) Rdt %

Ether diéthylique Marron foncé Pâteux 378 0,38

Extrait 1
Acétate d’éthyle Marron Liquide 111 0,11
Extrait 2
Butanol Marron clair Liquide 293 0,29
Extrait 3
mt= 782 mg Rdtt= 0,78%

67
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Analyse spectroscopique des extraits 1, 2 et 3 des flavonoïdes

Spectroscopie RMN 1H RMN 13C

L’analyse par CCM des trois extraits a été effectuée. Sur la plaque CCM de l’extrait 1,
on observe 5 spots très rapprochés; l’extrait 2 montre plusieurs spots.
Après plusieurs essais pour rechercher le meilleur éluant pour la CCM, nous avons opté
pour le système : Toluène/acétate d’éthyle/acide formique (5 : 4 : 1).
Nous avons regroupé les Rf des différents spots observés pour l’extrait 1 sur le tableau III.3.

Tableau III.3 : Facteurs de rétention (Rf) des constituants de l’extrait 1 diéthylique

N° de Taches Rf Couleur
1 0,42 Marron
2 0,49 Bleu-noir
3 0,64 Bleu
4 0,74 Mauve
5 0,61 vert

Nous avons tenté de séparer les différents composés révélés par CCM par CC. Il nous a
été impossible de le faire. Le spectre RMN du 1 H de l’extrait 1 est inexploitable ([Link].7).
Après cela, nous avons effectué la CG/Masse des trois extraits isolés.

L’établissement de la structure d’un flavonoïde est complexe et exige de résoudre le

problème concernant l’identification de ses différents composants (génine, monosaccharides… et
acide organiques). Cette détermination de structure se fait à l’aide des analyses des spectres issus
de l’absorption en UV, mais surtout de la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire du
proton et du carbone 13 mono et bi-dimensionnelle et la spectrométrie de masse.

68
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.7 : Spectre de RMN du proton de la fraction 1 des flavonoïdes

69
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Analyse par chromatographie en phase gazeuse (CG /SM)

L’analyse par CG /SM de nos échantillon a été réalisée sur un appareil GC de type PERKIN
ELMER GC : CLARUS 500, MASSE : MS CLARUS 500
Les conditions d’analyse sont les suivantes :
Colonne : ELITE 5MS 60m
Rampe 12°/min. 50C°---------160C°
Rampe 5C°/min. 160C°-------220C°
Rampe 20 C°/min. 220C°-------300C° maintenue 5min.
Débit du gaz vecteur (N2) : 30ml/min.
Volume injecté : 1L
Les tracés chromatographiques des extraits 1, 2 et 3 des flavonoïdes, enregistrés dans les
conditions citées ci-dessus sont représentés sur les figures III.8-10. Il comporte plusieurs pics.
Les profils chromatographiques obtenus montrent la présence de nombreux flavonoïdes, majoritaires
et beaucoup d’autres minoritaires.
On note sur le chromatogramme de l’extrait 2 plusieurs pics par rapport à l’extrait 3.
L’identification des composants de l’extrait 1 a été réalisée par la recherche des spectres de masse de
référence emmagasinés dans la banque de données du spectromètre de masse.
La CG/MS de l’extrait 1 révèle la présence d’un produit majoritaire caractérisé par un temps
de rétention de 34,59mn correspondant d’après la banque de données à des systèmes phénoliques.
La détection d’acides à longue chaîne (acide dodécanoique, laurique) à 13,54mn et celles des sucres
(galactose ou xylose) à 17,92mn. On note à 4,33mn, la détection de la cycloserine. Les spectres de
masse de référence sont reproduits dans l’annexe pour l’extrait 1 (Figs.1-4).
Le tracé chromatographique de l’extrait 2 enregistre la présence de plusieurs pics qui diffère
de ceux de l’extrait 1. On note à 37,18mn selon les données du spectromètre de masse à des acides à
longue chaîne (Fig.5). Par absence d’échantillons dans la banque de données, les autres pics n’ont pu
être identifiés.
Le chromatogramme de l’extrait 3 révèle peu de pics par rapport aux deux autres.
La présence du pic à 40,06mn correspond d’après les données à des acides gras (Fig.6). Il est à noter
que l’existence de l’acide palmitique a été signalée dans l’espèce Bryonia alba.74
Il convient de noter que la banque de données emmagasinées dans le spectromètre de masse que nous
avons utilisé n’est pas riche en substances naturelles.

74
Duke, A.J., “Handbook of Phytochemical Constituents of GRAS Herbs and other economic plants“, Ed. CRC Press,
1992, p.114.

70
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.8 : Chromatogramme en phase gazeuse de l’extrait 1 des flavonoïdes

71
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.9 : Chromatogramme en phase gazeuse de l’extrait 2 flavonoïdes

72
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.10 : Chromatogramme en phase gazeuse de l’extrait 3 des flavonoïdes

73
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

IV.3. Extraction et analyse de l’huile essentielle (H.E)

Les H.E sont des substances odorantes volatiles contenues dans les végétaux. Leur
extraction se fait par des solvants organiques apolaires, les plus utilisés sont le pentane, l’hexane,
mais aussi des solvants chlorés, le dichlorométhane et le chloroforme.

Protocole expérimental :

On introduit 100g de matière végétale (racine broyée en poudre) dans un ballon de 1L en

présence de 600mL d’eau distillée et quelques fragments de pierre ponce. Le mélange ainsi
formé est porté au reflux pendant 5h. Après filtration, la solution obtenue est extraite avec du
dichlorométhane (CH2Cl2). La solution organique est alors évaporée à sec après séchage sur
MgSO4. Le schéma III.3 illustre les différentes opérations effectuées pour l’extraction de l’H.E.

100 g de MV

 600 mL d’eau distillée

 Reflux pendant 5h
 Filtration

Marc épuisé Phase aqueuse

 Extraction avec dichlorométhane

Phase Organique Phase aqueuse

 Séchage sur MgSO4

 Filtration
 Evaporation

H.E

Schéma III.3 : Protocole d’extraction de l’huile essentielle

74
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Les résultats obtenus lors de nos extractions répétées de l’huile essentielle par
hydrodistillation durant 5h sont consignés dans le tableau III.4.

Tableau III.4 : Rendement d’extraction de l’H.E de la racine de Bryonia dioica

Extractions Couleur Poids (mg) Rdt %

1 Jaune verdâtre 26 0,03
2 Brun 16 0,02
3 Brun jaunâtre 20 0,02

Les rendements d’extraction calculés par le rapport de la quantité d’H.E sur la quantité de
la matière végétale, son exprimés en pourcentage.
Au vu des résultats ci-dessus, on note que le rendement d’extraction de l’huile essentielle
de la Bryone dioïque est très faible, ce qui est conforme avec la littérature. L’opération
d’hydrodistillation n’est pas reproductible car les différentes extractions conduisent à un extrait
de couleur différente.
Nous avons effectué six (06) extractions successives avec 50g de matière végétale pour
chaque extraction. Les quantités obtenues ont été regroupées, ce qui nous a permis d’avoir 50 mg
d’H.E de couleur marron foncé. Les résultats des mesures du Rf [éluant : éther/éther de pétrole
(1 : 4)] des constituants de l’H.E sont reportés sur le tableau III.5.

Tableau III.5 : Facteurs de rétention (Rf) des constituants de l’H.E

N° de Taches Rf Couleur
1 0,13 Mauve
2 0,32 Marron
3 0,44 Bleu
4 0,52 Mauve
5 0,61 Orange

L’analyse par spectroscopie de RMN 1H et du 13C de l’huile essentielle a conduit aux

spectres reportés sur les figures III.11-12.

75
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.11 : Spectre RMN 1H de l’huile essentielle extraite

76
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.12 : Spectre RMN 13C de l’huile essentielle extraite

77
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

IV.4. Extraction et analyse des tannins

Les tanins sont des composés naturels appartenant à la famille des polyphénols, soluble
dans l’eau, possédant une masse comprise entre 500 et 3000.
Ils peuvent être extraits, le plus souvent à chaud, par un mélange d’eau et d’acétone.
Le méthanol est évité, car il provoque la méthanolyse des depsides galliques.
La procédure d’extraction des tanins que nous avons utilisée est donnée ci-après :

Dégraissage du matériel végétal

100g de racine broyée en poudre sont introduits dans un ballon de 1L surmonté d’un
réfrigérant et contenant 200mL d’éther de pétrole. Le mélange ainsi formé est porté au reflux
pendant 2h. La racine dégraissée est séparée par filtration.

Protocole expérimental :

On introduit 100g de matière végétale (racine broyée en poudre) dégraissée dans un

ballon de 1L en présence de 380mL d’eau et 200mL d’acétone avec quelques fragments de pierre
ponce. Le mélange ainsi formé est porté au reflux pendant 4 jours.
Après filtration, la solution obtenue est extraite avec :
Du dichlorométhane (CH2Cl2) pour éliminer les pigments et les lipides puis avec
De l’acétate d’éthyle (AcOEt).
Les solutions organiques sont alors évaporées à sec après séchage sur Na2SO4.
Le schéma III.4 représente le principe de l’extraction des Tannins.

78
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

100g de MV

 200mL d’éther de pétrole

 Reflux 2h
 Filtration

Matière Grasse 100g de MV dégraissée

 380mL d’eau
 200mL d’acétone
 Reflux 4 jours
 Filtration
 Dichlorométhane

Phase organique Phase aqueuse

 AcOEt
 Séchage
 Filtration Phase Organique Phase aqueuse
 Evaporation
 Séchage
Pigments et lipides
 Filtration
 Evaporation
Tannins

Schéma III.4 : Protocole d’extraction des tanins

Les résultats obtenus lors de l’extraction des tannins par chauffage au reflux sont reportés
dans le tableau III.5.

Tableau III.5: Résultats d’extraction des tannins

Extraits Couleur Aspect Pf Poids (g) Rdt %

Dichlorométhane Marron foncé Liquide 28,250 28,25

Acétate d’éthyle Gris jaunâtre Solide > 270 9,686 9,69

mt= 37,936mg Rdtt= 37,94%

79
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Analyse spectroscopique des tanins

Afin d’identifier la structure des tanins extraits, nous avons fait appel aux moyens d’analyse
spectroscopique à savoir : UV, IR, RMN du H1 et RMN du 13C.

Spectroscopie Ultra-Violette (UV)

L’appareil utilisé pour enregistrer le spectre UV est un spectrophotomètre UV-Visible
Thermo Electron Corporation «Nicolet Evolution 100» qui fonctionne sur une plage de longueurs
d’onde allant de 190 à 1100 nm. L’échantillon à analyser est préparé à partir d’une solution
d’extrait dilué dans l’eau distillée.
Le spectre UV des tannins ([Link].13) présente une bande large très intense à 294 nm
relative à la transition qui correspond au système aromatique disubstitué et phénolique.

Figure III.13 : Spectre UV des Tannins

80
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Spectroscopie IR

L’échantillon à analyser a été réalisé sur des pastilles de bromure de potassium (KBr).
L’examen du spectre Infrarouge ([Link].14) des tanins extraits montre l’existence des bandes
suivantes :

 Une bande intense et large correspondant aux vibrations d’allongement des groupements OH,
vibrations de valence qui apparaissent vers 3417,24cm-1.

 Deux bandes d’intensité faible à 2917,77 et 2850,27cm-1 relatives aux vibrations d’élongation
des (C-H) oléfiniques.

 Une bande de moyenne intensité à 1658,48cm-1 attribuable aux vibrations d’élongation des
liaisons aromatiques C=C ou C=O.

 Une bande d’intensité faible correspondant aux vibrations de déformation des groupements
OH située à 1405,85cm-1.

 Une bande multiple entre 1156,12 – 1079,94cm-1correspondant aux liaisons C-C.

 Une multitude de bandes relatives aux vibrations de déformation hors du plan des CH des
cycles benzéniques à 982,554 – 606,503 -423,298cm-1.

81
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.14 : Spectre IR des tannins

82
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC)

L’analyse par HPLC a été réalisée sur un appareil Agilent 1100 HPLC-UV, avec
détecteur de barrettes de diode et détecteur de diffusion de la lumière par évaporation Sedex,
modèle 75, Séparation, quantification de composés organiques non volatils.

Les conditions d’analyse sont les suivantes :

Colonne Hypersil BDS C18 (5 µm, 250 × 4.0 mm)
λ : 280 nm
A: H2O/ HCOOH 98:2 (v/v)
B: CH3CN/HCOOH 80:20 (v/v)
Injection: 10 µL

L’analyse par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) des tanins a
conduit au chromatogramme représenté sur la figure III.15. Nous avons injecté 10L de l’extrait
et utilisé comme solvant : eau-acide formique / Acétonitrile-acide formique.
Le chromatogramme enregistré révèle trois (03) principaux pics et d’autres pics
minoritaires. Les résultats obtenus sont mentionnés sur le tableau III.6.

Tableau III.6 : Analyse par HPLC des tanins

N° de Pic 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tr. 2,78 3,04 3,13 28,83 29,66 30,04 31,26 32,01 35,01

Chaque pic a été caractérisé par son temps de rétention. Néanmoins, aucune identification
structurale n’a pu être effectuée par absence d’échantillons authentiques de référence.

83
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

Figure III.15 : Chromatogramme en phase liquide des tannins

84
Chapitre III Extraction et analyse de quelques principes actifs

V. CONCLUSION

Nous avons mis en pratique différents protocoles expérimentaux pour extraire

les alcaloïdes, les flavonoïdes, l’huile essentielle et les tanins contenus dans la racine de la
Bryone.
Les méthodes spectroscopique et chromatographique disponibles que nous avons utilisées
nous ont permis de caractériser les différents principes actifs isolés. La diversité des éléments les
composant, le nombre de combinaison possibles rendent complexe l’établissement de leur
structure.

85
 Chapitre IV

Etude Biologique
Chapitre IV Etude biologique

I. INTRODUCTION
La médication par les plantes date depuis les temps les plus reculés. Actuellement, elle
connaît un regain d’intérêt auprès des populations. Près de 80% de la population Africaine ont
recours aux plantes pour se soigner et n’ont pas accès aux médicaments dits modernes.
Plusieurs principes actifs isolés des plantes sont devenus des médicaments efficaces.

Afin de valider l’utilisation de la Bryone en médecine traditionnelle, nous nous

sommes proposés de tester in vitro le pouvoir antibactérien et antifongique de l’extrait
méthanolique de la racine de Bryonia dioica sur la croissance de différentes souches
microbiennes.

II. MATERIEL ET METHODE

II.1. Matériel
Pour la mise en évidence de l’activité biologique, huit (08) souches bactériennes et
quatre (04) fongiques ont été testées vis-à-vis de l’extrait méthanolique de la racine de la
Bryone.

II.1.1. Souches bactériennes

Bactéries en forme de sphère : les cocci à Gram positif Provenance

Enterococcus faecalis ATCC 6538 Institut Pasteur d’Oran

Micrococcus luteus MCIM 8166 Institut Pasteur de Paris

Staphylococcus aureus ATCC 6538 Institut Pasteur d’Oran

Bactéries en forme de bâtonnet : les bacilles Provenance

Bacilles à Gram positif

Bacillus subtilis ATCC 6633 Institut Pasteur d’Oran

Corynebacterium sp. LBMB*

87
Chapitre IV Etude biologique

Bacilles à Gram négatif Provenance

Escherichia coli ATCC 25922 Institut Pasteur d’Oran

Proteus mirabilis LBMB*

Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028 Institut Pasteur d’Oran

* Laboratoire de Biologie des Micro-organismes et de Biotechnologie de l’Université Es-sénia d’Oran.

II.1. 2. Souches fongiques

Les deux espèces de champignons filamenteux testées sont :

Provenance

Aspergillus niger ATCC 16404 Institut Pasteur de Paris

Fusarium oxysporum [Link]. lycopersici (f.o.l) LBMB*

Les deux espèces de levure testées sont :

Provenance

Candida albicans ATCC 10231 Institut Pasteur d’Oran

Saccharomyces oviformis LBMB*

* Laboratoire de Biologie des Micro-organismes et de Biotechnologie de l’Université Es-sénia d’Oran.

88
Chapitre IV Etude biologique

II.1.3. Principales caractéristiques des souches testées

Souches bactériennes

*Bactéries en forme de sphère : les cocci à Gram positif

Enterococcus faecalis

C’est un coccus à Gram positif, dépourvu de catalase, à métabolisme anaérobie.

Il appartient à la famille des Streptococaceae. C’est une bactérie non sporulé, immobile, qui
se présente de manière isolée ou en paire ou en courte chaînette. C’est un germe ubiquitaire
présent dans l’intestin de l’homme et des animaux, dans les eaux usées, dans l'eau douce, dans
l'eau de mer, dans le sol et sur les végétaux.

Les entérocoques sont susceptibles de contaminer les aliments comme les produits laitiers et
les viandes. Chez l'homme, les entérocoques sont des bactéries pathogènes opportunistes
responsables de septicémies, d’endocardites, d’infections urinaires, de surinfections des plaies
(notamment chirurgicales), de méningites, d’infections nosocomiales.75

Micrococcus luteus

C’est une bactérie de forme arrondie (coccus) à Gram positif, aérobie, appartenant à la
famille des Micrococcaceae.76 Elle a pour habitat le sol, l’eau. Elle est fréquente sur la peau
de l'homme. Cet organisme a été reconnu comme étant un pathogène opportuniste et
responsable d’arthrite, d’endocardites, de méningites, suppuration intracrânienne et
pneumonie chez les patients immunodéprimés.77

Staphylococcus aureus ATCC 6538

C’est un coccus à Gram positif immobile, appartenant à la famille des Micrococcaceae.

Il est disposé en amas, à la façon d’une grappe de raisin. C’est un germe ubiquitaire très
répandu dans la nature, le sol, l’air et l’eau. II se retrouve chez 30 à 40% des individus sain au
niveau de leurs fosses nasales et de la gorge. Il est pathogène et responsable d'infections
cutanées, ostéomyélites, septicémies et pneumopathies.78

75
Avril, J. L., Fauchère J. L., “Bactériologie générale et médicale“, Ed. Ellipses, Paris, 2002.
76
Young, M., et al., [Link]. 2010, Vol. 192, N°3, p.841-860.
77
Yang, S., Sugawara, S., Monodane, T., Nishijima, M., Adachi, Y., Akashi, S., Miyake, K., Hase, S., Takada,
H., Infection and Immunity, 2001, Vol. 69, N°4, p.2025-2030.
78
a) Avril, J. L., Dabernat, H., Denis, F., Monteil., H., “Bactériologie Clinique“ 2émeEd. Ellipses, 1992, p.9-21;
b) Nauciel, C., Vildé, J-L “Bactériologie médicale“ Ed. Elsevier Masson, 2005, p.77.
89
Chapitre IV Etude biologique

*Bactéries en forme de bâtonnet : les bacilles

Bacilles à Gram positif

Bacillus subtilis ATCC 6633

C’est un grand bacille à Gram positif, groupé en chaînette, mobile, aérobie strict.
Il appartient à la famille des Bacillaceae. C’est un saprophyte du sol, de l’air, de l’eau,… et
des plantes. Il n’est pas considéré comme pathogène pour l’homme, mais il peut contaminer
des aliments et peut exceptionnellement provoquer des intoxications alimentaires.79

Corynebacterium sp.

Les bactéries du genre Corynebacterium appartiennent à la famille des

Corynebacteriaceae. Ce sont des bacilles à Gram positif, immobiles, asporulés
et éro-anaérobies facultatifs, souvent granuleux et à extrémités élargies. De nombreuses
espèces font partie de la flore normale de la cavité orale, de la muqueuse et de la peau.80

Bacilles à Gram négatif

Escherichia coli ATCC 25922

C’est un bacille à Gram négatif appartenant à la famille des Enterobacteriaceae.

C’est une bactérie à mobilité péritriche, se développant en aéro-anaérobie et sur gélose
ordinaire. C’est un hôte commun de la microflore commensale intestinale de l’homme. C’est
le germe le plus fréquemment responsable d’infections urinaires. Cette bactérie est aussi à
l’origine de septicémies, de méningites chez le nourrisson ainsi que de manifestations
intestinales telles que les diarrhées. Elle est également responsable d’infections
communautaires et nosocomiales.75

Proteus mirablis ATCC 29906

C’est un bacille à Gram négatif appartenant à la famille des Enterobacteriaceae.

C’est une bactérie très mobile, extrêmement répandue dans la nature, dans le sol, l’air et

79
a) Schaechter, M., Piggot, P. J., “Encyclopedia of Microbiology: Bacillus subtilis“, Ed. Elsevier, USA, 2009,
p.54; b) Hugo, W. B., Russell, A. D., “Pharmaceutical Microbiology“, 6émeEd. Blackwell science Ltd, 1998, p.27.
80
Schaechter, M., Smith, K. F., Oram, D. M., “Encyclopedia of Microbiology: Corynebacteria. including
diphtheria“ Ed. Elsevier, USA, 2009, p.94-106.
90
Chapitre IV Etude biologique

l’eau. C'est un commensal du tube digestif, responsable d’infection de plaie, de septicémie et

le plus fréquemment d’infections urinaires.75

Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028

C’est un bacille mobile à Gram négatif, aérobie strict. Il est connu sous le nom de bacille
pyocyanique, parce que l’une de ses caractéristiques principales est la production d’un
pigment bleu ou pyocyanine. C'est un germe qui vit normalement à l'état de saprophyte dans
l'eau et le sol humide ou sur les végétaux. Par ailleurs, cette bactérie peut vivre en
commensale au niveau du tube digestif de l’homme et de divers animaux.78
Elle est responsable de redoutables infections hospitalières ou nosocomiales surtout chez les
malades affaiblis aux défenses diminuées ou ayant une affection sévère (diabète, brûlures,
arthrite…).81

Souches fongiques

* Champignons filamenteux

Aspergillus niger ATCC 16404

Aspergillus niger est une moisissure cosmopolite. Elle fait partie des champignons
Ascomycètes très petits, extrêmement répandus dans l’environnement. Ce champignon vit au
dépend des matières organiques en décomposition et se développe dans les céréales, les fruits,
les légumes moisis et diverses plantes.82Il est responsable de la pourriture des arachides et
d’autres plantes. Il est pathogène et responsable dans les atteintes pulmonaires. Il est souvent
retrouvé dans les otites du conduit auditif externe.83

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (f.o.l)

Les Fusariums sont des champignons cosmopolites, retrouvés dans le sol, l’air ou l’eau, et
qui parasitent de très nombreuses plantes, notamment les fruits et les légumes auxquels ils
provoquent diverses maladies.82 La contamination a lieu principalement par les racines et

81
Keynes, S. A., Due, S. L., Paul, B., ‘’Age and Ageing’’, 2009, 38, p.245-246 et références citées.
82
Guillaume, V., “Mycologie : auto-évaluation, manipulations“, Ed. De Boeck Université, Bruxelles, 2006.
83
Kayser, F. H., “Medical Microbiology“, Ed. Thieme, Stuttgart, 2005, p.364-365.
91
Chapitre IV Etude biologique

s’étend dans les plantes par le système vasculaire; ce qui implique que cette espèce est
considérée comme l’agent causal de la fusariose vasculaire de la tomate.84

* Les levures

Candida albicans ATCC 10231

C’est l’espèce la plus fréquente en pathologie humaine du genre Candida. Elle est
retrouvée chez 83% de la population. Cette levure saprophyte est responsable d’infection
superficielle ne survenant que chez des individus immunodéprimés. Elle provoque alors des
infections fongiques candidoses essentiellement au niveau des muqueuses buccale, digestive
et gynécologique.85

Saccharomyces oviformis

Saccharomyces oviformis est une levure de forme ovoïde et résistante à l’alcool. Elle est
utilisée, parmi tous les ferments, levains, levures,…dans le pain, les yaourts, la bière et le
vin.86

II.1.4. Matériel chimique

L’extrait méthanolique testée a été obtenu par extraction au Soxhlet à partir de la racine
de la plante Bryone dioïque récoltée en Octobre 2008 dans la localité de Bouamama située à
l’ouest d’Oran (cf. chap. I, page 9).

Système d’extraction au Soxhlet

L’extracteur de Soxhlet permet le traitement de la matière végétale en plus grande

quantité, avec des solvants en phase liquide ou partiellement vaporisés. Le corps de
l’extracteur, contient une cartouche en cellulose remplie de matière végétale. Cette cartouche
est fixée sur un ballon qui est surmonté d’un réfrigérant. Le solvant est vaporisé puis
condensé tout en restant en contact avec la matière végétale. La solution collectée dans le
ballon s’enrichit de plus en plus en soluté à chaque cycle d'extraction et la matière végétale est

84
Reis, A., Costa, H., Boiteux, L.S., Lopes, C.A., Fitopatologia Brasileira, 2005, Vol.30, p.426-428.
85
Hart, T., Shears, P., “ Atlas de poche de microbiologie“, Ed. Médecine-Sciences, Paris, 1997, p.240.
86
Site Internet : Levure de [Link]
92
Chapitre IV Etude biologique

toujours en contact avec du solvant fraîchement distillé. L’extraction est terminée lorsque le
solvant d’extraction devient de plus en plus très coloré. ([Link].1).

Figure IV.1 : Montage d’extraction au Soxhlet

II.1.5. Milieux de culture

Plusieurs milieux ont été choisis pour les cultures bactériennes :
 Bouillon nutritif
 Gélose nutritive
 Gélose de Mueller-Hinton
Pour les cultures fongiques nous avons choisi :
 Milieu Pomme de terre Dextrose Agar (PDA) pour les champignons filamenteux
 Milieu Sabouraud pour les champignons levuriformes

93
Chapitre IV Etude biologique

II.1.5.1. Milieux pour les cultures bactériennes

Bouillon nutritif (B.N) :
 Peptone……………………………………............................5g
 Extrait de viande…………………………………………….3g
 NaCl…………………………………………………………5g
 Eau distillée…………………………………….……………1L
 Ajuster le pH à……………………………………………….7
Gélose nutritive (G.N) :

 Bouillon nutritif…………………………………………...1L
 Agar-agar………………………………………………….20g
 Ajuster le pH à …………………………………………….7
Gélose de Mueller Hinton (M.H) :
 Bouillon de Mueller-Hinton ………………………………1L
 Agar-agar…………………………………………………20g
 Ajuster le pH à ……………………………………………7,4

II.1.5.2. Milieux pour les cultures fongiques

Milieu PDA (Pomme de terre Dextrose Agar) :
 Extrait de pomme te terre………………………………….1L
 Glucose……………… ……………………………………20g
 Agar-agar……………… ………………………………….20g
 Ajuster le pH à………………………………………..5,6  0,2

Préparation de l’extrait de pomme de terre

200g de pomme de terre sont lavés, découpés en petits cubes et portés à l’ébullition
pendant une 1h dans 1L d’eau distillée. On complète le filtrat récupéré à 1L avec de l’eau
distillée. On ajuste le pH après ajout du glucose, ensuite la solution à chaud est additionnée de
20g d’Agar-agar.

N. B : Tous les milieux sont stérilisés par Autoclavage à 120°C pendant 30 minutes.

94
Chapitre IV Etude biologique

II.2. Méthodes

II.2.1. Préparation de L’échantillon d’extrait méthanolique

L’extrait méthanolique de la Bryone est dilué avec une petite quantité de méthanol.

II.2.2. Préparation des précultures

La sensibilité des bactéries et des champignons vis-à-vis de l’extrait méthanolique
peut être étudiée par la technique de culture en milieu liquide ou par la technique de diffusion
en milieu solide. Pour notre part nous avons utilisé la méthode de diffusion en milieu solide
coulé en boîte de pétri.

II.2.2.1. Bactéries
Les huit souches bactériennes conservées sont ensemencées dans des boîtes de Pétri
contenant 20mL de gélose nutritive et incubées à 37°C pendant 24h, afin de stimuler leur
croissance.

II.2.2.2. Champignons
On prélève des implants de 5mm de côté à partir de cultures mères des souches
fongiques filamenteuses conservées, qui sont ensemencés sur milieu PDA en boîte de Pétri.
Les boîtes sont incubées à 25°C pendant 7 jours.

Les levures sont ensemencées par la méthode des stries sur milieu Sabouraud en
boîtes de Pétri. Ces dernières sont incubées à 25°C pendant 48h.

II.2.3. Conservation des cultures

La conservation des souches bactériennes se fait dans des tubes de gélose nutritive
inclinée à une température de 4°C. Elles sont repiquées sur un nouveau milieu tous les
trois mois.

La conservation des champignons filamenteux se fait dans des tubes contenant du

PDA gélosé incliné, à une température de 4°C, tandis que les souches levuriformes se fait
sur des tubes contenant du milieu Sabouraud à 4°C.

95
Chapitre IV Etude biologique

II.2.4. Tests d’activité antimicrobienne de l’extrait méthanolique

II.2.4.1. Test antibactérien 87

Préparation de l’inoculum
À partir d’une préculture âgée de 24h ensemencée sur une gélose nutritive, on prélève
3 à 4 colonies bien isolées avec une anse et les émulsionner dans un tube contenant 10mL de
bouillon nutritif.
Après 24 heures d’incubation à 37°C, on compare le tube de la suspension bactérienne
avec le tube de l’étalon 0,5 Mac Farland (108UFC/mL) contre une fiche de papier blanc avec
des lignes noires pour ajuster la turbidité de la suspension. La turbidité peut être diminuée en
ajoutant plus de bouillon nutritif stérile, ou bien augmentée par l’augmentation de la durée
d’incubation.

Ensemencement des milieux de cultures en boîtes et dépôts des disques

On coule 20mL de gélose de Mueller-Hinton en surfusion dans des boîtes de Pétri de
90mm de diamètre. Ensuite, on introduit les boîtes dans l’étuve à 37°C pendant 30mn avant
de les ensemencer pour éliminer l’humidité.
1mL d’inoculum bactérien standardisé (108UFC/mL) est aseptiquement déposé et étalé
sur la surface du milieu à l’aide d’un étaloir, le liquide en excès est aspiré avec une pipette
Pasteur stérile.
On dépose 3 disques de 6mm de diamètre, imprégnés de l’extrait méthanolique, à
l’aide d’une pince stérile dans chaque boîte testée (03 boites pour chaque souche bactérienne).
Pour une bonne diffusion du contenu des disques, on laisse les boîtes à la température
ambiante 15mn avant de les incuber à 37°C. Les disques déposés dans les boîtes témoins sont
imprégnés uniquement de méthanol à 96%.

87
Joffin, J., Leyral, G.,’’ Microbiologie Technique’’, 1996, p.43.

96
Chapitre IV Etude biologique

Préparation de la suspension bactérienne

Culture Ensemencer Prélever 3 à 4

bactérienne sur GN en colonies bien
boîte de Pétri isolées

Emulsionner dans
un tube contenant
10mL de B.N

Ajuster la
turbidité avec Incubation à
l’étalon 0,5 37°C pendant
Etalon 0,5 Mac Farland 24h
Mac Farland

Couler 20mL de gélose de M.H dans des boîtes de Pétri, Puis, introduire ces
boîtes dans l’étuve à 37°C pendant 30mn avant de les ensemencer pour
éliminer l’humidité.

Déposer et étaler 1mL d’inoculum bactérien standardisé sur la

surface du milieu M.H coulé précédemment dans les boîtes.

Imprégner les disques de l’extrait MeOH à tester et de

MeOH à 96%

Déposer les disques imprégnés d’extrait MeOH dans les boîtes testées
et les disques imprégnés de MeOH dans les boîtes témoins

Incubation à 37°C pendant 24h, après un

repos de 15mn à température ambiante

Mesurer les diamètres des zones d’inhibition autour des disques.

Schéma IV.1 : Etapes du test antibactérien

97
Chapitre IV Etude biologique

II.2.4.2. Test antifongique 87

II.[Link]. Tests sur les champignons filamenteux

Préparation des suspensions sporales

On prélève des implants de 5mm de côté de chaque souche fongique filamenteuse

testée à partir des précultures âgées de 7 jours, qui sont émulsionner dans des tubes à essai
contenant chacun 10mL d’eau distillée stérile.

On compte le nombre de spores après agitation au Vortex à l’aide d’un hématimètre

(cellule de Thomas) sous microscope photonique. La concentration est calculée selon la
formule suivante :

N : Nombre de spores par mL.

6
N= n.4.10
n : Moyenne du nombre de spores dans dix petits carrés.

Les concentrations des suspensions sporales doivent être égales à 5,4 x 106 spores par mL.

Ensemencement des milieux de cultures en boîtes et dépôts des disques

On dépose 1mL de chaque suspension sporale standardisée avec la cellule de Thoma
dans une boîte de Pétri de 90mm de diamètre, puis on coule le milieu PDA en surfusion et on
homogénéise par mouvement circulaire de huit.
Des disques de papier filtre de 6mm de diamètre sont déposés dans les boîtes de Pétri.
Il faut noter qu’on ne peut pas placer plus de 3 disques dans une boîte de 90mm pour éviter le
chevauchement des zones d’inhibition. Une fois que le disque entre en contact avec la surface
de la gélose, il ne doit plus être déplacé. Les disques sont imprégnés soit de :
 L’extrait méthanolique dissout dans le méthanol à 96% pour les boîtes testées.
 Le méthanol pour les boîtes témoins.
On effectue trois répétitions pour chaque souche de champignon filamenteux. Il faut sceller
les boîtes avec un ruban adhésif et les laisser un quart d’heure à la température ambiante avant
de les incuber à 25°C pendant 48h à 72h, pour que le contenu des disques diffuse dans le
milieu.

98
Chapitre IV Etude biologique

Préparation de la suspension sporale

Préculture fongique Prélever des

implants de 5mm
filamenteuse âgée de 7 jours

Emulsionner dans un tube

contenant 10mL d’eau
Ajuster la concentration distillée stérile
à 5,4 x106 spores/mL à l’aide Agitation au
de l’hématimètre de Thoma Vortex

Déposer 1mL de suspension sporale standardisée avec la cellule de Thoma

dans une boîte de pétri

Couler le milieu PDA en surfusion et homogénéiser par un

mouvement circulaire de huit

Imprégner des disques dans l’extrait MeOH à tester et

de MeOH à 96%

Déposer les disques imprégnés de l’extrait MeOH dans les boîtes

testées et les disques imprégnés de MeOH dans les boîtes témoins

Incubation de 48h à 72h à 25°C, après un repos

de 15mn à température ambiante

Mesurer les diamètres des zones d’inhibition autour des disques

Schéma IV.2 : Etapes du test antifongique sur les champignons filamenteux

99
Chapitre IV Etude biologique

II.2.4.4. Tests sur les levures 87

Préparation de l’inoculum
Chaque culture doit être ensemencée par la méthode des stries sur le milieu
Sabouraud pour obtenir des colonies isolées. Après une incubation de 48 heures à une
température de 25°C, on prélève 4 à 5 colonies bien isolées avec une anse et on les
émulsionne dans un tube contenant 10mL de bouillon nutritif.
Après 24 heures d’incubation à 25°C, on compare le tube de la suspension de levure
avec le tube de l’étalon 0,5 Mac Farland (108UFC/mL) contre une fiche de papier blanc avec
des lignes noires pour ajuster la turbidité de la suspension. La turbidité peut être diminuée en
ajoutant plus de bouillon nutritif stérile, ou bien augmentée par l’augmentation de la durée
d’incubation.

Ensemencement des milieux de cultures en boîtes et dépôts des disques

La méthode utilisée est celle décrite précédemment pour les bactéries en remplaçant le
milieu Mueller-Hinton par celui de Sabouraud. L’incubation dure de 24h à 48 h à 25C°.

100
Chapitre IV Etude biologique

Préparation de la suspension levuriforme

Culture Ensemencer sur Incubation de Prélever 4 à 5

milieu Sabouraud colonies bien
de levure 48h à 25°C
en boîtes de Pétri isolées

Ajuster la
turbidité avec Emulsionner dans
Incubation de
l’étalon 0,5 un tube contenant
24h à 25°C 10mL de B.N
Mac Farland
Etalon 0,5
Mac Farland

Couler 20mL de milieu Sabouraud dans des boîtes de Pétri, Puis, introduire
ces boîtes dans l’étuve à 37°C pendant 30mn avant de les ensemencer pour
éliminer l’humidité

Déposer et étaler 1mL d’inoculum de levure standardisé sur la

surface du milieu Sabouraud coulé précédemment dans les boîtes

Imprégner des disques de l’extrait MeOH à tester et de

MeOH à 96%

Déposer les disques imprégnés d’extrait MeOH dans les boîtes testées
et les disques imprégnés de MeOH dans les boîtes témoins

Incubation à 25°C pendant 24h à 48h, après un

repos de 15mn à température ambiante

Mesurer les diamètres des zones d’inhibition autour des disques

Schéma IV.3 : Etapes du test antifongique sur les levures

101
Chapitre IV Etude biologique

III. RESULTATS ET DISCUSSION

Nous avons eu recours à l’antibiogramme qui est une méthode efficace pour
déterminer l’effet antimicrobien de l’extrait méthanolique de la Bryone dioïque sur les micro-
organismes testés.

Pour cela la sensibilité des souches testées est déterminée en mesurant les diamètres
des zones d’inhibition dans les deux sens perpendiculaires autour des disques.

En fonction de l’existence ou non de zones d’inhibition, trois réponses sont possibles :

Souche sensible : La dimension du diamètre de la zone d’inhibition est égale ou
supérieure à 10mm
Souche limite (intermédiaire) : La dimension du diamètre de la zone
d’inhibition inférieure à 10mm
Souche résistante : Absence de zone d’inhibition

Les résultats des tests de l’activité anti-microbienne de l’extrait méthanolique de la

racine de la Bryone vis-à-vis des souches sont reproduits sur les planches I à II regroupant
diverses figures. Les diamètres d’inhibition sont regroupés sur les tableaux IV.1-3.

102
Chapitre IV Etude biologique

PLANCHE I

Résultats de l’activité biologique de l’extrait méthanolique de la Bryone dioïque sur

les Bactéries
Bactéries en forme de sphère : les cocci à Gram positif

FIG I.1 : Résultat sur la croissance d’Enterococcus faecalis, après 24h d’incubation à 37°C,
sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

FIG I.2 : Résultat sur la croissance de Micrococcus luteus MCIM8166, après 24h
d’incubation à 37°C, sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

FIG I.3 : Résultat sur la croissance de Staphylococcus aureus ATCC 6538, après 24h
d’incubation à 37°C, sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

103
Chapitre IV Etude biologique

Bactéries en forme de bâtonnet : les bacilles

Bacilles à Gram positif

FIG I.4 : Résultat sur la croissance de Bacillus subtilis ATCC 6633, après 24h d’incubation à
37°C, sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

FIG I.5 : Résultat sur la croissance de Corynebacterium sp., après 24h d’incubation à 37°C,
sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

Bacilles à Gram négatif

FIG I.6 : Résultat sur la croissance d’Escherichia coli ATCC 25922, après 24h
d’incubation à 37°C, sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

FIG I.7 : Résultat sur la croissance de Proteus mirabilis ATCC 29906, après 24h
d’incubation à 37°C, sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

FIG I.8 : Résultat sur la croissance de Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028, après 24h
d’incubation à 37°C, sur milieu Mueller-Hinton.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

104
Chapitre IV Etude biologique

III.1. Bactéries
PLANCHE I

Bactéries en forme de sphère : les cocci à Gram positif

A: Enterococcus faecalis B: Enterococcus faecalis

(Témoin) (Testée)

FIG I.1: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance

d’Enterococcus faecalis

A: Micrococcus luteus MCIM 8166 B: Micrococcus luteus MCIM 8166

(Témoin) (Testée)

FIG I.2: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Micrococcus luteus MCIM 8166

105
Chapitre IV Etude biologique

A: Staphylococcus aureus B: Staphylococcus aureus

ATCC 6538 ATCC 6538
(Témoin) (Testée)

FIG I.3: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Bactéries en forme de bâtonnet : les bacilles

Bacilles à Gram positif :

A: Bacillus subtilis ATCC 6633 B: Bacillus subtilis ATCC 6633

(Témoin) (Testée)

FIG I.4: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Bacillus subtilis ATCC 6633

106
Chapitre IV Etude biologique

A: Corynebacterium sp. B: Corynebacterium sp.

(Témoin) (Testée)

FIG I.5: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Corynebacterium sp.

Bacilles à Gram négatif :

A : Escherichia coli ATCC25922 B : Escherichia coli ATCC25922

(Témoin) (Testée)

FIG I.6: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance

d’Escherichia coli ATCC25922

107
Chapitre IV Etude biologique

A: Proteus mirabilis ATCC 29906 B: Proteus mirabilis ATCC 29906

(Témoin) (Testée)

FIG I.7: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Proteus mirabilis ATCC 29906

A: Pseudomonas aeruginosa B: Pseudomonas aeruginosa

ATCC 14028 ATCC 14028
(Témoin) (Testée)

FIG I.8: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Pseudomonas aeruginosa ATCC 14028

108
Chapitre IV Etude biologique

PLANCHE II

Résultats de l’activité biologique de l’extrait méthanolique de la Bryone dioïque sur

les champignons filamenteux

FIG II.1 : Résultat sur la croissance d’Aspergillus niger ATCC1640, après 48h à 72h
d’incubation à 25°C, sur milieu PDA.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

FIG II.2 : Résultat sur la croissance Fusarium oxysporum [Link] lycopersici (f.o.l), après 48h à
72h d’incubation à 25°C, sur milieu PDA.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

109
Chapitre IV Etude biologique

III.2. Champignons filamenteux

PLANCHE II

A: Aspergillus niger ATCC16404 B: Aspergillus niger ATCC16404

(Témoin) (Testée)

FIG II.1: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance

d’Aspergillus niger ATCC16404

A: Fusarium oxysporum [Link]. B: Fusarium oxysporum [Link].

lycopersici (f.o.l) lycopersici (f.o.l)
(Témoin) (Testée)

FIG II.2: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Fusarium oxysporum [Link]. lycopersici (f.o.l)

110
Chapitre IV Etude biologique

PLANCHE III

Résultats de l’activité biologique de l’extrait méthanolique de la Bryone dioïque sur

les levures

FIG III.1 : Résultat sur la croissance de Candida albicans ATCC 10231, après 24h
d’incubation à 25°C, sur milieu PDA.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

FIG III.2: Résultat sur la croissance de Saccharomyces oviformis, après 24h

d’incubation à 25°C, sur milieu PDA.

A : boîte témoin.
B : boîte testée.

111
Chapitre IV Etude biologique

III.3. Champignons levuriformes

PLANCHE III

A: Candida albicans ATCC10231 B: Candida albicans ATCC10231

(Témoin) (Testée)

FIG III.1: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Candida albicans ATCC10231

A: Saccharomyces oviformis B: Saccharomyces oviformis

(Témoin) (Testée)

FIG III.2: Influence de l’extrait méthanolique sur la croissance de

Saccharomyces oviformis

112
Chapitre IV Etude biologique

Au vu des résultats obtenus au cours de nos expériences, on constate que les disques
imbibés de l’extrait méthanolique sont entourés par des zones d’inhibition, ce qui traduit une
absence de croissance microbienne. Les tableaux IV.1-3 regroupent les résultats de la mesure
des diamètres d’inhibition pour les bactéries.

Tableaux IV.1 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des Bactéries en forme de sphère :
Les cocci à Gram positif, après 24h d’incubation à 37°C, sur milieu M-H.

Bactéries en forme de sphère :

Φ (Témoin) Φ (Testée)
les cocci à Gram positif
Enterococcus faecalis 6 mm 14 mm

Micrococcus luteus 6 mm 8 mm

Staphylococcus aureus 7 mm 15 mm

Tableaux IV.2 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des Bactéries en forme de bâtonnet :
Les bacilles à Gram positif, après 24h d’incubation à 37°C, sur milieu M-H.

Bactéries en forme de bâtonnet :

Φ (Témoin) Φ (Testée)
Les bacilles Gram positif
Bacillus subtilis 6 mm 12 mm

Corynebacterium sp. 6 mm 6 mm

Tableaux IV.3 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des Bactéries en forme de bâtonnet :
Les bacilles à Gram négatif, après 24h d’incubation à 37°C, sur milieu M-H.

Bactéries en forme de bâtonnet :

Φ (Témoin) Φ (Testée)
Les bacilles Gram négatif
Escherichia coli 6 mm 12 mm

Proteus mirabilis 6 mm 10 mm

Pseudomonas aeruginosa 6 mm 10 mm

113
Chapitre IV Etude biologique

Pour les tests antibactériens, l’intervalle des diamètres d’inhibition mesurés est
compris entre 6 et 15 mm. On remarque que l’extrait méthanolique de la Bryone a agi
positivement sur l’ensemble des souches bactériennes sauf pour Corynebacterium sp.
L’inhibition la plus élevée est observée avec les bactéries à Gram positif et particulièrement
pour Staphylococcus aureus.

Les diamètres d’inhibition mesurés pour les souches fongiques sont rassemblés sur
les tableaux IV.4 et IV.5.

Tableaux IV.4 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des champignons filamenteux, après
48h à 72h d’incubation à 28°C, sur milieu PDA.

Champignons filamenteux Φ (Témoin) Φ (Testée)

Aspergillus niger 6 mm 6 mm

Fusarium oxysporum 6 mm 6 mm

Tableaux IV.5 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibition des levures, après 24h d’incubation à
25°C, sur milieu PDA.

Levures Φ (Témoin) Φ (Testée)

Candida albicans 6 mm 6 mm

Saccharomyces oviformis 6 mm 6 mm

Pour les tests antifongiques, d’après la mesure des diamètres, aucune variation de la
dimension des zones d’inhibition par rapport au témoin n’est observée; ce qui signifie que
l’extrait méthanolique de la Bryone n’a aucun effet sur toutes les souches fongiques testées.

Afin de visualiser l’action de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone sur

les souches microbiennes testées, il nous a semblé plus commode de représenter les résultats
de nos expériences sous forme d’histogrammes (figures IV. 2-3) respectivement pour
les bactéries et les champignons.

114
Chapitre IV Etude biologique

Figure IV.2 : Influence de l’extrait méthanolique de la Bryone sur les souches bactériennes

115
Chapitre IV Etude biologique

Figure IV.3 : Influence de l’extrait méthanolique de la racine de la Bryone sur les souches fongiques

116
Chapitre IV Etude biologique

V. CONCLUSION

Les tests biologiques réalisés montrent clairement que les germes sont sensibles
à l’extrait méthanolique de la Bryone. Toutefois, aucune activité n’est observée pour les
différentes espèces fongiques testées. Les résultats des tests indiquent que la Bryone montre
une efficacité contre la population bactérienne jusqu’à atteindre 15mm d’inhibition pour
Staphylococcus aureus.

117
Conclusion

Générale
 Conclusion

Conclusion Générale

Le travail que nous avons mené sur l’étude chimique et microbiologique de la racine
de Bryonia dioica provenant de la localité de Bouamama (région ouest d’Oran) nous a permis
de dégager les points essentiels suivants :

Les Curcubitaceae dont fait partie la Bryone sont une famille qui comprend différents sortes
de plantes : des légumes, des fruits, des plantes décoratives,…Cette plante se caractérise par
son action purgatif, diverses propriétés thérapeutiques (anti-inflammatoire, vermifuge,…et
anti-cancérigène) et une certaine toxicité.

Aussi, les constituants chimiques des plantes sont de structure variée et représentent
une source de remèdes populaires des plus efficaces, surtout dans les pays en voie de
développement et sont à la base de nombreux médicaments.

Les résultats des tests phytochimiques préliminaires de coloration et de précipitation

laissent penser à l’existence prépondérante d’alcaloïdes, de flavonoïdes,…et de tanins ; ce qui
en fait une source potentielle. Il apparaît également de ces tests que la racine de la Bryone
renferme très peu de quinones combinées et pas d’anthraquinones. La recherche de ces
différents principes actifs a été conduite sur des extraits racinaires aqueux, éthanoliques,…et
acides.

L’extraction d’alcaloïdes, de flavonoïdes,…et des tanins a été effectuée selon

différents protocoles expérimentaux; celle de l’huile essentielle par hydrodistillation avec un
très faible rendement.
Les constituants chimiques de la racine de la Bryone à savoir : les alcaloïdes,
les flavonoïdes,…et les tanins ont été séparés et caractérisés par spectroscopie (UV, IR, RMN
1 13
H et C) et chromatographie (CCM, CG/SM et HPLC). Néanmoins, la détermination
structurale de ces extraits n’a pu être établie faute d’appareillage adéquat et de témoins
appropriés.

119
 Conclusion

Il est à noter que des analyses complémentaires s’avèrent nécessaires, en particulier,

pour élucider du point de vue structural, les principes actifs mis en évidence dans la racine de
la Bryone.

Par ailleurs, les tests anti-microbiens ont permis d’estimer le pouvoir de l’extrait
méthanolique de la racine de la Bryone sur huit (08) espèces bactériennes et quatre (04)
espèces fongiques (2 champignons filamenteux et 2 levures).

Les résultats de ces expériences, effectuées in vitro par la méthode de diffusion en

milieu solide, révèlent que l’extrait méthanolique est actif sur toutes les souches bactériennes
testées à l’exception de Corynebacterium sp. L’espèce Staphylococcus aureus, bactérie à
Gram positif, présente la plus grande inhibition.

Néanmoins, on note une absence totale d’activité de l’extrait méthanolique vis-à-vis

des souches fongiques testées. Cette activité anti-bactérienne enregistrée est due
essentiellement aux polyphénols présents dans la plante.

120
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126
Annexe
 Préparation des réactifs

Empois d’amidon
Disposer 1g d’amidon de blé dans 10 mL d’eau distillée froide. Ajouter ensuite 90 mL d’eau
bouillante à la pâte formée en agitant constamment, amener le mélange à ébullition pendant 5mn et
laisser refroidir.

Liqueurs de Fehling
La solution est un mélange de deux solutions :
Solution A : Dissoudre 8.66g de CuSO4, 5H2O dans une eau contenant quelques gouttes d’acide
sulfurique (H2SO4) 0,1N, diluer ensuite la solution à 125 mL.
Solution B : Dissoudre 15g de NaOH et 43,25 g de tartrate de sodium et de potassium dans 50 mL
d’eau. Filtrer puis diluer la solution à 125 mL.
Les deux solutions à volume égal sont mélangées au moment de l’emploi.

Réactif de Bornträger
C’est une solution de dilution d’ammoniac à 10% agitée avec un volume égal d’extrait
étherique à tester.

Réactif de Bouchardat
C’est une solution contenant 2g d’iode et 2g d’iodure de potassium dissous dans 100mL d’eau
distillée.

Réactif de Dragendorff

Dissoudre 5g de carbonate de bismuth et 25g d'iodure de potassium dans 50mL d'eau

distillée, puis mélanger avec 10mL d’HCL concentré et compléter à 100mL avec de l'eau distillée.

Réactif de Lieberman Burchard

5mL d’anhydride acétique et quelques gouttes d’acide sulfurique concentré sont ajoutés à
5mL de la solution à tester. Agiter et laisser la solution reposée pendant 30mn à température
ambiante.

128
 Réactif de Mayer
Dissoudre 1,35g du chlorure de mercure (HgCl2) et 5g d’iodure de potassium (KI) dans 60mL
d’eau distillée. Ensuite, agiter jusqu’à dissolution et compléter le volume à 100mL.

Réaction de Salkowski
C’est une solution chloroformique additionnée d’un égal volume d’acide sulfurique
concentré.

Réactif de Wagner
Dissoudre 2g d’iodure de potassium (KI) et 6g d’iode (I2) dans 60mL d’eau distillée. Ajuster
le volume total à 100mL.

Réactif de Stiasny
10mL de formol à 30 % et 5 ml d'acide chlorhydrique concentré sont ajoutés à 5mL de la
solution à tester. Le mélange est chauffé au bain-marie pendant 15 min.

Réactif de Bath Smith

A 2 mL d’infusé on ajoute 2 mL d’HCL à 20 %. Le mélange est porté à l’ébullition.

129
Figure.1 : Spectre de masse des échantillons de référence de l’extrait 1 des flavonoïdes à 34,601 mn

130
Figure.2 : Spectre de masse des échantillons de référence de l’extrait 1 des flavonoïdes à 13,540 mn

131
Figure.3 : Spectre de masse des échantillons de référence de l’extrait 1 des flavonoïdes à 17,920 mn

132
Figure.4 : Spectre de masse des échantillons de référence de l’extrait 1 des flavonoïdes à 4,334 mn

133
Figure.5 : Spectre de masse des échantillons de référence de l’extrait 2 des flavonoïdes à 37,176 mn

134
Figure.6 : Spectre de masse des échantillons de référence de l’extrait 3 des flavonoïdes à 40,006 mn

135
 Glossaire

Aérobie : se dit des micro-organismes qui ne peuvent se développer qu’en présence d’air ou d’oxygène.
Albumen : tissus de réserve d’une graine enveloppant l’embryon de la plante.
Amas : Assemblage, accumulation, entassement de plusieurs choses.
Amoebicide : substance traitant l'amibiase, qui est une infection parasitaire.
Anaérobie : se dit des micro-organismes qui peuvent vivre sans oxygène.
Analgésique : supprime la douleur.
Anesthésique : qui provoque une privation complète ou partielle de la faculté de sentir.
Angiosperme : sous embranchement de phanérogame qui englobe les plantes à fleurs.
Antibactérien : inhibe et détruit les bactéries.
Anti-diarrhéique : lutte contre les diarrhées.
Antiémétique : qui à la propriété d’arrêter le vomissement.
Antifongique : actif contre les champignons et les levures parasites.
Anti-herpétique : lutte contre l’herpès.
Antihypertenseur : protège contre l’augmentation de la tension vasculaire.
Anti-inflammatoire : qui combat les inflammations.
Antimicrobien : inhibe et détruit les microbes.
Antioxydant : permet aux aliments de résister à l’oxydation et à une détérioration graduelle.
Antipaludique : qui agit sur le paludisme : maladie parasitaire qui se manifeste par des accès de fièvres.
Antiparasitaire : lutte contre les parasites animaux et végétaux.
Antiseptique : détruit les microbes et empêche leur développement.
Antispasmodique : lutte contre les spasmes.
Anti-tumorale : détruit les tumeurs.
Antivirale : toute substance active contre les virus.
Bractée : petite feuille située à la base du pédoncule [Link] qui recouvre la fleur avant son développement
Calice : enveloppe extérieure des fleurs.
Cannelé : rayure profonde de la tige de certaines plantes.
Carpelle : organe femelle d’une fleur, c’est le compartiment dont est constitué l'ovaire.
Cataplasme : compresse humide que l’on applique sur une partie du corps comme agent thérapeutique.
Collenchyme : tissu de soutien des végétaux, constitué de cellulose.
Contusion : lésion produite par un choc sans déchirure de la peau.
Coriace : tenace, flexible et plus ou moins épais comme le cuir.

136
Corymbe : inflorescence dans lequel les pédoncules sont de longueur différente et s’élèvent en
divergeant de telle sorte que les fleurs soient sur un même plan.
Cosmopolite : se dit d’un micro-organisme à distribution géographique très vaste et répandue dans divers pays.
Cotylédon : feuille embryonnaire, issue de la graine, qui se développe au-dessus ou sous la surface du sol.
Déhiscence : ouverture spontanée d'organes végétaux clos comme les fruits secs.
Dicotylédones : classe regroupant les plantes dont les graines ont 2 cotylédons. En général, ses
plantes ont des feuilles à nervures ramifiées et des fleurs du type 4 ou 5. Appelée aussi
Magnoliopsida.
Dioïque : terme désignant une plante dont les fleurs mâles et les fleurs femelles se trouvent sur des pieds différents.
Diurétique : substance permet d’augmenter la sécrétion urinaire.
Duodénum : première portion de l’intestin grêle.
Ensemencement : action d’ensemencer : déposer des microbes ou leurs spores sur un milieu de culture approprié.
Etamine : organe mâle de la reproduction chez les végétaux supérieurs ou angiospermes.
Exocarpe : couche externe de la paroi d’un fruit.
Exstipulé : dépourvu de stipule, absence de petite feuille supplémentaire.
Gale : affection contagieuse de la peau.
Goutte : maladie inflammatoire qui affecte particulièrement les articulations.
Grêle : long et mince.
Gynécée : ensemble des carpelles d'une même fleur.
Hémolytique : qui rapport avec l’hémolyse qui provoque la destruction des globules rouges.
Hyperplasie : développement excessif d’un tissu ou d’un organe.
Incubation : développement silencieux dans l’organisme d’un germe qui a pénétré et ne
manifeste pas encore chimiquement sa présence.
Induré : devenu dur, en parlant d'un tissu organique.
Inflorescence : manière dont les fleurs sont disposées dans la plante.
Lèpre : maladie infectieuse de la peau ou du système nerveux due au bacille de Hansen.
Moisissures : noms de petits champignons qui se développent sur les substances qu’ils altèrent.
Monoïque : terme désignant une plante qui porte des fleurs mâle et des fleurs femelles séparées
les unes des autres, mais sur un même pied.
Œdème : gonflement survenant dans les tissus sous-cutanés par suite d’une infiltration de liquide séreux.
Palmatilobée : terme qualifiant les feuilles palmées qui ont des lobes arrondis.
Pathogène : qui peut provoquer une ou des maladies.
Péritriche : se dit des micro-organismes ayant des flagelles implantés tout autour.
Pétale : chacune des parties dont est composée la corolle d’une fleur.

137
Pétiole : partie rétrécie de la feuille, qui lui sert de support.
Pleurésie : inflammation de la plèvre, membrane séreuse qui entoure le thorax et les poumons.
Purgatif : qui a la propriété de purger, d’évacuer le contenu de l’intestin.
Saprophyte : se dit des microbes qui se nourrissent de matières mortes et ne nuisent pas à l’organisme.
Sarmenteuse : tige flexible et grimpante, ayant besoin d’appui.
Sépale : chacune des pièces formant le calice d’une fleur.
Suppurer : laisser écouler du liquide jaunâtre qui se forme lors de l’infection d’une plaie.
Ubiquitaire : se dit des microbes qui peuvent être présents dans de très nombreux tissus de l’organisme.
Velue : couvert de poils longs, mou et rapprochés.
Vermifuge : se dit d’un remède qui a la propriété d’expulser les vers intestinaux.

138