II.

STRESS OXYDATIF

1. Définition

1.1. Le stress oxydatif

Le stress oxydant se définit classiquement comme un déséquilibre de la balance
entre les systèmes de défenses antioxydants et la production des ROS, en faveur de ces
dernières (Favier, 2003).

1.2. Les radicaux libres

Les radicaux libres sont des espèces chimiques (atomes ou molécules) possédant un
électron célibataire. Cette propriété les rend aptes à réagir avec des molécules lors de
réactions en chaîne. La réactivité des radicaux de l'oxygène ne doit pas non plus être
exagérée car elle est très variable selon la nature du radical (Favier, 1997). Parmi les
radicaux formés chez les êtres vivants, Fanion radicalaire superoxyde (02 •) comme le
monoxyde d'azote (•NO) ne sont pas très réactifs, mais constituent des précurseurs
d'autres espèces plus réactives (Favier, 2003).

2. Types des radicaux libres

2.1. Radicaux libres de l’oxygène (ROS)

L'oxygène peut subir des étapes successives de réduction conduisant à la formation
d'ERO (fig.03). En présence de métaux, de molécules organiques ou d'enzymes
(oxydases ou complexes de la chaîne respiratoire) (Barouki, 2006).

Figure03. Intermédiaires réduits de l'oxygène. Les quatre étapes de réduction mono

électronique de l'oxygène (Gardès-albertet al, 2003).
2.1.1. L’anion super oxyde
L'anion superoxyde (O2•-) est un dérivé très réactif de l'oxygène. Il est produit au
cours du métabolisme mitochondrial à la suite de la réaction suivante :
•O-O + e- O-O (O2•-)
 Relativement stable, il n'est pas très toxique pour l'organisme. Mais il est à l’origine
de cascades de réactions conduisant à la production de molécules très nocives (Pastre,
2005).

2.1.2. Le radical hydroxyle

Le radical libre hydroxyle (OH) est très réactif. Il peut réagir avec de nombreuses
molécules comme l’ADN, les glucides, les nucléotides, les protéines et être à l'origine
de lésions de nécrose. C'est un dérivé de l'anion super oxyde. Il peut être produit à la
suite de diverses réactions. Nous en citerons deux à titre d'exemple, comme :
- la réaction d'Haber-Weiss :
O2•- + H+ + H2O2 +Fe3+ •HO• +H2O +Fe2+
- la réaction de Fenton :
H2O2 + Fe2+ + H+ Fe3+ + H2O + HO• (Pastre, 2005).
2.1.3. Oxygène singlet
Lorsque de l'énergie est apportée à l'oxygène, celui-ci passe à l'état singulet qui
représente la forme active. C'est une forme très énergétique de grande réactivité qui
peut oxyder de nombreuses molécules. Il est formé à partir de l'ion super oxyde selon
la réaction suivante :
•
O-O• 1O2. (Sous l'action de la lumière)
2.1.4. Radical peroxyde H202
Le radical peroxyde est considéré comme une espèce réactive dérivée de l'oxygène
(ROS) même s'il n'a pas une structure radicalaire car il est capable d'initier ou de
propager des dommages oxydatifs. Il peut être produit au cours des mécanismes
illustrés par les réactions suivantes :

O2- + H+ → HO-2

2HO2- → H2O2 + O2

2.2. Radicaux libres nitrogènes

2.2.1 L’oxyde nitrique (•NO ; monoxyde d'azote)
Il diffuse rapidement à partir de son site de production, traverse la membrane
cellulaire et remplit un rôle vasodilatateur. Il est un second messager de courte vie
(Serteyn et al., 2002 ; Hobbs et al., 1999 ; Alderton et al. 2001 ; Deby, 2009), réagit
très rapidement avec O2•- pour former ONOO- et avec O2 pour former N2O4 (Deby,
2009). C’est un oxydant faible (E0= + 0.39 V) (Serteyn et al., 2002), incapable de
nitration, mais un bon agent de nitrosation s’il a un cofacteur approprié pour recevoir
un électron. Fixé au Fe3+ des molécules hémiques, il peut nitroser des phénols, des
thiols et des acides aminés (Serteyn et al. 2002).

2.2.2 Le péroxynitrite (ONOO-)

ONOO- est non radicalaire, instable (durée de vie < une seconde) et très oxydant
(E0=+1.4V, comme HOCl ; Serteyn et al.2002). Sa formation (•NO+ O2•-→ONOO-
) est endothermique et aurait lieu dans les macrophages, les neutrophiles, les cellules
endothéliales et les mitochondries, mais son précurseur O2 •- dismute sans longtemps
exister (Serteyn et al., 2002 ; Deby, 2009).

Au pH physiologique, il est en équilibre avec son acide conjugué, ONOOH.

ONOO— + H+ ↔ONOOH

Il se transforme rapidement en nitrites et en nitrates et se décompose en dérivés

radicalaires (•OH, •NO2).Ses réactions avec les biomolécules (principalement des
nitrations et des hydroxylations) sont agressives et délétères : attaque des fonctions
thiols, des lipides, des 25 bases nucléiques, des fonctions amines sur les protéines, et
de beaucoup d’autres molécules de petite taille (urate, ascorbate, etc......). ONOO—
attaque les sites à métaux de transition (enzymes himniques, hémoglobine,
Mn/CuZn SOD), nitre les cycles aromatiques (tyrosine, tryptophane) et par là les
enzymes dont le site actif porte un résidu tyrosyle. La réaction d’ONOO — avec le CO2
produit du peroxynitrosocarboxylate (ONOOCO2—) dont les dérivés (•NO2 et CO3•—
ou NO3 et CO2) augmentent les événements de nitration (Serteyn et al., 2002 ; Deby,
2009).

2.2.3 Le dioxyde d'azote (NO•)

NO•2, abondant dans les polluants de l’atmosphère des villes, se formerait aussi in
vivo par réaction entre NO et O2.

NO + O2 →2 NO2 (Deby, 2009)

NO2• attaque les doubles liaisons des acides gras non-saturés (acide linoléique 18:2 ω
6 ; α-linolénique 18:3 ω3 et γ-linolénique 18:3 ω 6 ; acide arachidonique 20:4 ω 6) et
transforme ces acides soit de cis-en transe, soit par nitration. Des lipoxygénases
transforment l’acide arachidonique en eicosanoïdes (prostaglandines, leucotriènes,
thromboxanes, etc…), qui sont des messagers intra et extracellulaires indispensables.
Les dérivés nitrés de l’acide arachidonique seraient également des messagers bioactifs.

NO2• s’additionnerait aux doubles liaisons d'autres molécules, arracherait soit un H

soit un électron aux molécules voisines. Ces réactions créent des radicaux libres.
Comme O2•- NO2•peut exister assez longtemps dans les espaces intra membranaires
aprotiques (Deby, 2009).

2.2.4 Autres formes de ROS

La formation de l'oxygène singulier (1O2) à partir du triplet 3O2 exige l’inversion
d’un des spins des deux électrons célibataires de 3O2. Cette inversion est endothermique
(22 Kcal) et peu vraisemblable in vivo. La formation de l'ozone(O 3) exige 69 Kcal et
n’a pas lieu in vivo, mais dans l’atmosphère suite aux rayons UV et aux étincelles
électriques (Deby, 2009).

3. Origine des radicaux libres

Deux origines des radicaux libres : endogène et exogène

3.1. Endogène
Des sources importantes de radicaux libres sont les mécanismes de cycles redox que
produit dans l'organisme l'oxydation de molécules comme les quinones. Ce cycle redox
a lieu soit spontanément, soit surtout lors de l'oxydation de ces composés au niveau du
cytochrome P450. Ce mécanisme est souvent incriminé pour expliquer la toxicité de
l'alcool, des résidus de la fumée de cigarette, ou de nombreux médicaments ; mais il se
produit aussi avec des composés endogènes comme l'acide lévulinique et surtout les
catécholamines (Favier, 2003).
Une production d'anions super oxydes se produit lors du fonctionnement de la
chaîne respiratoire mitochondriale (Favier, 2003).
L'inflammation est par ailleurs une source importante de radicaux oxygénés produits
directement par les cellules phagocytaires activées qui sont le siège d'un phénomène
appelé explosion oxydative consistant en l'activation du complexe de la NADPH
oxydase (Favier, 2003).
Une autre espèce radicalaire, le monoxyde d'azote, est elle aussi produite par les
systèmes enzymatiques que sont les différentes NO synthases (ou NOS), à des fins de
médiation par les neurones, les cellules endothéliales ou les macrophages (Favier,
2003).
 3.2 Exogène
Ces radicaux libres de l'oxygène (fig. 04) ou de l'azote, même, ne sont pas uniquement
toxiques ; au contraire, ils sont produits par divers mécanismes physiologiques afin de
détruire des bactéries au sein des cellules phagocytaires (macrophages, polynucléaires)
ou pour réguler des fonctions cellulaires létales telle la mort cellulaire programmée ou
apoptose (Favier, 2003).
Les métaux toxiques (chrome, cuivre, vanadium), mais aussi le cuivre et le fer libres
(existant lors de surcharges générales ou localisées) génèrent des radicaux hydroxyles
(Favier, 2003).

Figure 04. L’origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de
l’oxygène impliqué en biologie (Amara, 2007).

4. Conséquences du stress oxydant

L'évaluation d'un stress oxydant repose sur la présence ou l'augmentation de

marqueurs oxydatifs. Ces indicateurs comportent les produits de dégradation stables
des protéines, des glucides, des lipides et de l'ADN (Morena et al., 2002).

4.1. Peroxydation lipidique

Les premières cibles des ROS sont les lipides, notamment ceux présents dans les
membranes cellulaires et subcellulaires. Les membranes riches en acides gras
polyinsaturés (AGPI) sont très sensibles à l'oxydation en raison de leur degré élevé
d'insaturation. L'oxydation des lipides génère des peroxydes lipidiques qui sont eux-
mêmes très réactifs.
La peroxydation des lipides induit une modification de la fluidité, de la
perméabilité et de l'excitabilité des membranes. Elle fournit également une grande
variété de produits qui peuvent réagir avec les protéines et l'ADN. Parmi les produits
formés lors de la peroxydation lipidique, l'isoprostane, le malondialdéhyde (MDA) et
le 4-hydroxynonenal (4- HNE) sont étudiés comme marqueurs de la peroxydation
lipidique (Garait, 2006).

4.2 Oxydation des protéines

De façon comparable à l'oxydation des lipides, les protéines sont aussi susceptibles
d'être oxydées par les ROS. Cette oxydation provoque l'introduction d'un groupe
carbonyle dans la protéine. Ces réactions d'oxydation, fréquemment influencées par les
cations métalliques comme le Cu2+ et le Fe2+, peuvent être classées en 02 catégories :
a) celles qui cassent les liaisons peptidiques et modifient la chaîne protéique,
b) les modifications des peptides par l'addition de produits issus de la peroxydation
lipidique.
Ces changements sont tels qu'ils conduisent à une modification structurale des
protéines dont les conséquences sont majeures (perte de fonction catalytique,
augmentation de la sensibilité aux protéases) (Favier, 2003).

4.3 Dommage de L’ADN

Le stress oxydant étant principalement d'origine mitochondriale, ces organites sont
les premières cibles des ROS. En effet, le génome mitochondrial présente une
susceptibilité au stress oxydant (Garait, 2006).
Les bases qui composent l'ADN, et particulièrement la guanine, sont sensibles à
l'oxydation. L'attaque radicalaire peut être directe et entraîner l'oxydation des bases,
engendrant un grand nombre de bases modifiées : 8 oxo guanine, 8 nitroguanine, forme
amidopyrimidine, 8 oxo adénine, formimidouracile, 5 hydroxy cytosine, 5 hydroxy
méthyl uracile, thymine diol, oxazolone. Mais le stress oxydant peut aussi attaquer la
liaison entre la base et le désoxyribose, créant un site abasique, ou attaquer le sucre lui-
même, créant une coupure de chaîne simple brin. Des dommages indirects peuvent
résulter de l'attaque des lipides dont la peroxydation génère des aldéhydes mutagènes,
formant des adduits sur les bases de l'ADN de type MDA-guanine ou éthénodérivés.
L'attaque radicalaire des protéines qui sont très nombreuses à entrer en contact avec
l'ADN pour le protéger (histones) ou pour le lire (enzymes et facteurs de la réplication
ou de la transcription), entraîne des pontages des protéines ou des adduits sur des bases
de type lysinoguanine. Le rôle des nombreux métaux fixés à l'ADN, qui est un poly
anion (Fe, Mg, Zn, Cu, Ni, Cd...), est crucial pour amplifier ou orienter le profil de ces
lésions. Cette attaque de l'ADN est quotidienne (Favier, 2003).
Heureusement que notre organisme doté d’un système de défense anti oxydant.
Systèmes de défense antioxydants

5. Les antioxydants

5.1. Définition
Dès le début du XXème siècle, l'industrie s'est intéressée de près aux antioxydants

(ou anti oxygène), molécules capables par exemple de réduire les effets de l'oxygène

sur la corrosion des métaux. En biologie, les toutes premières recherches sur les

antioxydants (fig. 02) ont montré leur capacité à réduire l'oxydation des acides gras

insaturés (Defraigne et Pincemail, 2007). De façon générale, un antioxydant peut être

défini comme étant une substance qui, présente à de faibles concentrations par rapport

à un substrat, peut significativement retarder ou inhiber l'oxydation de ce substrat. Les

défenses anti oxydantes de notre organisme peuvent se diviser en deux antioxydants

primaires antioxydants secondaires : (Pincemail et al., 1998).

Figure 05. Mode d’action des principaux systèmes antioxydants (Descamps, 2004).
 5.2. Sources des antioxydants
Pour se protéger des effets délétères des RSO, l'organisme dispose d'un ensemble
complexe de défenses antioxydants. On distingue deux sources d'antioxydants: l’une
est apportée par l'alimentation sous forme de fruits et légumes riches en vitamines C,
E, caroténoïdes, ubiquinone, flavonoïdes, glutathion ou acide lipoïque; l'autre est
endogène et se compose d'enzymes (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase,
catalase), de protéines (ferritine, transferrine, cérulé plasmine, albumine) et de systèmes
de réparation des dommages oxydatifs comme les end nucléases. A cela s'ajoutent
quelques oligoéléments comme le sélénium, le cuivre et le zinc qui sont des cofacteurs
d'enzymes antioxydants (Haleng et al., 2007).

6. Systèmes de défense

6.1. Systèmes de défense enzymatique

Les systèmes de défenses antioxydants comportent des enzymes. Sont au nombre
de trois et ils fonctionnent en complémentarité (Baudin, 2007).

6.1.1. Superoxyde dismutase (SOD)

La Cu/Zn-SOD, chez l'homme, existe sous deux formes, l'une cytosolique et l'autre
extracellulaire. Toutes les sous-unités portent un ion Zn non catalytique, et un ion Cu2+
responsable de l'activité SOD, c'est-à-dire la dismutation de l'anion superoxyde selon
la réaction : (Baudin, 2007).
SOD, 2H+O2- + O2- H2O2 + O2
O2 + 2e- + 2H+ H
Une troisième forme est mitochondriale et dans son site actif on trouve du
manganèse (Mn-SOD) ; c'est une protéine importée du noyau, on ne la trouve donc pas
dans les hématies ; son activité catalytique est identique à celles des Cu/Zn-SOD. Un
autre rôle des SOD est de régénérer la vitamine C. On voit que l'action antioxydant des
SOD est incomplète car en éliminant l'anion superoxyde, elles produisent du peroxyde
d'hydrogène (Baudin, 2007).

6.1.2. Glutathion peroxydase (GPx)

Il y aurait plusieurs gènes GPx mais l'existence de formes intra- et extracellulaires

serait essentiellement due à des modifications post-transcriptionnelles et post-

traductionnelles. Dans le plasma, on trouve une forme très glycosylée qui viendrait du
foie. Toutes ces enzymes sont homo-tétramériques et séléno-dépendantes, c'est-à-dire

qu'elles contiennent dans leur site actif un atome de sélénium (Se) à la place d'un soufre

cystéinique. Le glutathion (GSH) est un substrat obligatoire, le deuxième substrat étant

un hydro peroxyde (ROOH), souvent H2O2 ; la GPx agit par son groupement sélénol et

deux molécules de GPx sont nécessaires à la transformation d'une molécule d'hydro

peroxyde. Comme ces deux GSH s'oxydent en GSSG (forme oxydée), il est

indispensable que la GPx soit couplée au système de régénération du GSH (forme

réduite active) comme suit :(Baudin, 2007).

ROOH + 2GSH ROH + GSSG + H2O.

H2O2 + 2GSH 2H2O 2 + GSSG

6.1.3. Catalase (CAT)

La catalase est localisée dans les peroxysomes et les hématies ; c'est une enzyme
tétramérique et capable d'éliminer H2O2 selon :(Baudin, 2007).
2 H2O2 2 H2O +O2

6.1.4. Peroxyredoxines
La thiorédoxine-peroxydase fonctionnant sans GSH. GPx et catalase agissent
tardivement dans le processus oxydant en éliminant H2O2 et les peroxydes
membranaires alors que les SOD agissent un peu plus précocement dès que se forme
vit C, que ce soit dans le cytosol ou la mitochondrie (Baudin, 2007).

6.2. Systèmes de défense non-enzymatique

6.2.1. Le glutathion et les protéines-thiols
Le glutathion est un tripeptide (acide glutamique-cystéine-glycine). Il est le thiol (-
SH) majoritaire au niveau intracellulaire (l'albumine étant son équivalent plasmatique)
où il est présent sous forme essentiellement réduite (GSH). Dans des conditions
physiologiques, sa forme oxydée (GSSG) est en concentration très faible.
Le rapport GSH/GSSG est considéré comme un excellent marqueur de la
peroxydation lipidique et permet d'objectiver l'importance du stress. Au cours du
vieillissement et lors d'un exercice intense, ce rapport tend à diminuer, les autres
propriétés antioxydantes du GSH sont nombreuses : cofacteur de la GPx, chélateur des
métaux de transition, régénérateur final des vitamines E et C, à partir de leur forme
radicalaire.
La plupart des protéines dont l'albumine contiennent des groupements « thiols» qui
possèdent des propriétés réductrices et piègent facilement les espèces oxygénées
activées (Haleng et al, 2007).

6.2.2. La vitamine C
La plupart des mammifères sont capables de synthétiser la vitamine C dans leur foie
ou dans leurs reins. Ce n'est pas le cas de l'homme qui doit assurer un apport journalier
d'environ 100 mg via une alimentation riche en fruits (Haleng et al, 2007).
La vitamine C est avant tout, un excellent piégeur des EOA (HO• ouO2•-). Elle inhibe
également la peroxydation lipidique en régénérant la vitamine E à partir de la forme
radicalaire issue de sa réaction avec des radicaux lipidiques. Ses fonctions sont
nombreuses : contribution au bon fonctionnement du système immunitaire, implication
dans la synthèse du collagène et des globules rouges ainsi que dans les mécanismes de
métabolisation du fer (Haleng et al, 2007).

6.2.3. La vitamine E
Ce terme désigne un ensemble d'isomères, les tocophérols (constitués d'un noyau
chromanol et d'une chaîne latérale saturée à 16 atomes de carbone) et les tocotriénols
(qui diffèrent des tocols par la présence de 3 doubles liaisons sur cette chaîne latérale).
D'un point de vue biologique, deux isomères sont particulièrement restants, T ᾳ-et l ey-
tocophérol. Leur caractère hydrophobe leur permet de s'insérer au sein des membranes
riches en acides gras polyinsaturés, où ils jouent un rôle protecteur en réagissant avec
les radicaux pyroxyles (ROO) pour former un radical tocophéryle, empêchant ainsi la
propagation de la peroxydation lipidique. Les apports journaliers d'ᾳ-tocophérol sont
de l'ordre de 10mg (Haleng et al., 2007).

6.2.4. Les caroténoïdes

Plus de 600 caroténoïdes (fig. différents ont été isolés à partir de sources naturelles,
mais seul un petit nombre d'entre eux se retrouvent dans le sang et les tissus animaux
(Haleng et al, 2007).
 Figure 06. structure du P-carotène (Goupy et al., 1999).

6.2.5. Le coenzyme Q10

Le coenzyme Q10, appelé ubiquinone en raison de son ubiquité dans les cellules, il

joue un rôle essentiel dans la chaîne mitochondriale de transport d'électrons et est un

puissant inhibiteur de peroxydation lipidique, en synergie avec la vitamine E (Haleng

et al., 2007).

6.2.6. L'acide urique

Produit terminal majeur du métabolisme des purines chez l'homme, un piégeur
puissant de radicaux (OH•, ROO•, NOO•...) (Haleng et al., 2007).

6.2.7. La bilirubine
La bilirubine est un produit terminal de la dégradation de Thème et résulte
essentiellement du catabolisme de l'hémoglobine par les cellules réticuloendothéliales.
La bilirubine est capable de piéger ROO• l'oxygène singulet. Ainsi, elle protège
l'albumine et les acides gras liés à l'albumine des attaques radicalaires (Haleng et al.,
2007).

7. Oligoéléments

Le Cuivre (Cu), le Zinc (Zn), le Manganèse (Mn), le Sélénium (Se) et le Fer (Fe) sont
des éléments essentiels dans la défense contre le stress oxydant. Toutes les enzymes
antioxydants requièrent un cofacteur pour maintenir leur activité catalytique. Ainsi, la
SOD mitochondriale a besoin de manganèse, la SOD cytosolique de cuivre et de zinc,
la catalase de fer et la GPx de sélénium.