Détails approfondis des méthodes microbiologiques de détection de la tuberculose

1. Microscopie directe par coloration

Coloration de Ziehl-Neelsen (1882)

Procédure détaillée:

1. Préparation de l'échantillon: Les crachats sont étalés en couche mince sur une lame
de verre, séchés à l'air et fixés par la chaleur (passage au-dessus d'une flamme 3 fois).

2. Coloration primaire: Recouvrir de solution de fuchsine phéniquée (carbol-fuchsine)

chauffée à ébullition douce pendant 5-10 minutes. La chaleur facilite la pénétration
du colorant à travers la paroi lipidique des mycobactéries.

3. Décoloration: Traiter avec une solution d'alcool-acide (3% HCl dans 95% d'éthanol)
pendant 3-5 minutes jusqu'à ce que la lame soit rose pâle.

4. Contre-coloration: Appliquer du bleu de méthylène ou du vert de malachite pendant

1-2 minutes.

5. Examen: Observer au microscope à immersion (objectif 100x). Les BAAR apparaissent

en rouge sur fond bleu.

Composition exacte des réactifs:

 Carbol-fuchsine: Fuchsine basique (1g), éthanol à 95% (10ml), phénol cristallisé (5g),
eau distillée (100ml)

 Solution décolorante: Acide chlorhydrique concentré (3ml), éthanol à 95% (97ml)

 Contre-colorant: Bleu de méthylène (0.3g), eau distillée (100ml)

Coloration aux fluorochromes (Auramine-O/Rhodamine)

Procédure améliorée:

1. Coloration: Appliquer l'auramine-O (0.1% dans du phénol tamponné) pendant 15-20

minutes à température ambiante.

2. Décoloration: Utiliser de l'alcool-acide (0.5% HCl dans 70% d'éthanol) pendant 2-3
minutes.

3. Contre-coloration: Permanganate de potassium (0.1%) pendant 30 secondes pour

réduire la fluorescence de fond.

4. Examen: Microscope à fluorescence avec filtre d'excitation à 450-490 nm. Les bacilles
apparaissent jaune doré sur fond noir.

Avantage principal: Permet le balayage à faible grossissement (objectif 20x ou 40x),

examinant une surface 10 fois plus grande qu'avec la méthode ZN.
2. Culture sur milieux solides

Milieu de Löwenstein-Jensen (Formulation originale)

Composition pour 1 litre:

Ingrédients de base:

- Asparagine: 3.6 g

- Phosphate de potassium monobasique: 2.4 g

- Sulfate de magnésium: 0.24 g

- Citrate de magnésium: 0.6 g

- Glycerol: 12 ml

- Œufs entiers: 20-22 œufs (environ 1 litre)

- Vert de malachite: 0.4 g (dans 20 ml d'eau distillée)

- Eau distillée: 600 ml

Procédure de fabrication:

1. Dissoudre les sels minéraux et l'asparagine dans l'eau distillée, ajouter le glycerol.

2. Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 30 minutes.

3. Laver soigneusement les œufs, les désinfecter à l'alcool 70%, casser et homogénéiser.

4. Filtrer l'homogénat d'œufs à travers de la gaze stérile.

5. Ajouter la solution de sels minéraux aux œufs.

6. Ajouter la solution de vert de malachite.

7. Répartir aseptiquement en tubes (5-7 ml par tube).

8. Coaguler en position inclinée (75° angle) dans un coagulateur à 85-90°C pendant 45

minutes.

9. Vérifier la stérilité par incubation à 37°C pendant 24-48 heures.

Variantes importantes:

 LJ sans glycerol: Pour Mycobacterium bovis qui est inhibé par le glycerol

 LJ avec pyruvate: Améliore la croissance de certaines souches

Milieu de Middlebrook 7H10 et 7H11

Composition du milieu 7H10 (pour 1 litre):

Base 7H10 (Difco):

- Chlorure d'ammonium: 0.5 g

- Sulfate de magnésium: 0.05 g

- Citrate de fer ammoniacal: 0.04 g

- Phosphate de potassium dibasique: 1.5 g

- Phosphate de sodium monobasique: 1.5 g

- Pyridoxine: 0.001 g

- Biotine: 0.0005 g

- Agar: 15.0 g

- Glycerol: 5.0 ml

- Eau distillée: 975 ml

Supplément OADC (ajouter après autoclavage):

- Acide oléique: 0.05 g

- Albumine bovine fraction V: 5.0 g

- Dextrose: 2.0 g

- Catalase bovine: 0.004 g

- Chlorure de sodium: 0.85 g

- Eau distillée: 100 ml

Différence 7H11: Contient 0.1% d'hydrolysat de caséine supplémentaire, améliorant la

croissance des souches résistantes à l'isoniazide.

Préparation spécifique:

1. Dissoudre la poudre dans l'eau distillée, ajouter le glycerol.

2. Autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

3. Refroidir à 50-55°C, ajouter aseptiquement le supplément OADC.

4. Ajouter les antibiotiques si nécessaire (PANTA: polymyxine B, amphotéricine B,

nalidixique acid, triméthoprime, azlocilline).

5. Couler en boîtes de Pétri (20-25 ml par boîte).

3. Techniques de concentration et décontamination

Méthode NALC-NaOH (N-acétyl-L-cystéine - soude)

Solution de digestion-décontamination:

- Solution A: Citrate de sodium 2.9% (agent chélateur)

- Solution B: NaOH 4% (agent décontaminant)

- Solution C: NALC 0.5% (agent mucolytique)

- Tampon phosphate 0.067 M, pH 6.8 (pour neutralisation)

Procédure étape par étape:

1. Mélanger à volume égal l'échantillon de crachat et la solution de digestion (50 ml de

A + 50 ml de B + 0.5 g de C fraîchement préparé).

2. Agir vigoureusement sur vortex pendant 20 secondes.

3. Laisser reposer 15 minutes à température ambiante.

4. Compléter à 50 ml avec du tampon phosphate stérile.

5. Centrifuger à 3000-4000 g pendant 15-20 minutes.

6. Jeter le surnageant, remettre en suspension le culot dans 1-2 ml de tampon

phosphate.

7. Ajuster le pH à 6.8-7.2 avec HCl 1N si nécessaire.

Alternative pour échantillons stériles (LCR, liquide pleural): Concentration sans

décontamination par centrifugation simple.

4. Systèmes de culture liquide

Système BACTEC 460 (détail technique)

Milieu de culture:

 Base: Middlebrook 7H12 medium contenant du 14C-palmitate

 Supplément: 0.5 ml de mélange PANTATM pour inhibition des contaminants

Principe de détection:
Les mycobactéries métabolisent le 14C-palmitate en libérant du 14CO₂. Le système aspire
l'air du flacon et le fait barboter dans une solution indicatrice. La radioactivité est mesurée
par un compteur à scintillation.
Indice de croissance (GI):

 Normal: <10

 Positif: >50 (confirmation par coloration)

 La cinétique de croissance permet d'estimer la charge bactérienne

Système MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube)

Composition du tube:

 Milieu: Middlebrook 7H9 broth avec supplément OADC

 Système indicateur: Bille de silicone imprégnée de complexe de ruthénium (tris(4,7-

diphenyl-1,10-phenanthroline) ruthenium chloride)

 Antibiotiques: PANTA supplement (polymyxin B 50 U/ml, amphotéricine B 5 μg/ml,

nalidixic acid 20 μg/ml, trimethoprim 5 μg/ml, azlocillin 10 μg/ml)

Principe physique: Le complexe de ruthénium est excité par la lumière à 450 nm et émet à
610 nm. En présence d'oxygène, la fluorescence est inhibée (quenching). La consommation
d'oxygène par les mycobactéries croissantes permet l'émission de fluorescence.

Procédure automatisée (BACTEC MGIT 960):

1. Ensemencer 0.5 ml d'échantillon concentré dans le tube MGIT.

2. Ajouter 0.8 ml de supplément OADC et 0.1 ml de PANTA.

3. Insérer dans l'incubateur qui lit automatiquement la fluorescence toutes les heures.

4. Algorithme de détection: Une augmentation continue de la fluorescence sur 5

lectures consécutives signale une croissance positive.

5. Tests de sensibilité aux antibiotiques

Méthode des proportions sur milieu solide

Concentrations critiques d'antibiotiques (μg/ml sur Löwenstein-Jensen):

 Isoniazide: 0.2 et 1.0

 Rifampicine: 40.0

 Ethambutol: 2.0

 Streptomycine: 4.0 et 10.0

Calcul de la résistance:

% Résistance = (Nombre de colonies sur milieu avec ATB ÷ Nombre de colonies sur milieu
sans ATB) × 100

 Sensible: <1% de colonies résistantes

 Résistant: ≥1% de colonies résistantes

Méthode en milieu liquide (MGIT 960 SIRE)

Procédure automatisée:

1. Préparer une suspension standardisée (0.5 McFarland) à partir d'une culture positive.

2. Diluer 1:5 dans du sérum physiologique.

3. Inoculer 0.5 ml dans chaque tube MGIT:

o Témoin de croissance

o Isoniazide (0.1 μg/ml)

o Rifampicine (1.0 μg/ml)

o Ethambutol (5.0 μg/ml)

o Streptomycine (1.0 μg/ml)

4. Le système compare le temps de détection de la croissance (TTD) entre le tube

témoin et les tubes avec antibiotiques.

5. Interprétation: Si le TTD avec ATB est > celui du témoin + un certain délai (selon
l'antibiotique), la souche est sensible.

6. Méthodes moléculaires avancées

Test GeneXpert MTB/RIF (version détaillée)

Cartouche multi-chambres:

1. Chambre de réaction de lyse: Contient du NaOH et de l'isopropanol pour lyser les

mycobactéries et inactiver les inhibiteurs de PCR.

2. Chambre d'extraction: Billes de silice pour capturer l'ADN.

3. Chambre d'amplification: Mélange de PCR en temps réel avec:

o Amorces pour amplification du gène rpoB

o 5 sondes moléculaires (pour détection du sauvage et de mutations)

o Enzymes de polymérisation thermostables

Cycles de PCR:

 Activation enzymatique: 95°C, 2 minutes

 45 cycles de: Dénaturation 95°C (15 sec), Hybridation/Extension 60°C (60 sec)

 Détection en temps réel dans 5 canaux fluorescents différents

Séquençage de nouvelle génération (NGS)

Plateformes utilisées:

 Illumina MiSeq: Séquençage par synthèse, lectures courtes (150-300 bp)

 Oxford Nanopore: Séquençage en temps réel, lectures longues (jusqu'à 100 kb)

Panels de gènes ciblés:

 Résistance de première ligne: katG, inhA, rpoB, embB, rpsL, rrs

 Résistance de deuxième ligne: gyrA, gyrB, rrs, eis, tlyA

 Identification d'espèces: gène 16S rRNA, hsp65, rpoB

7. Contrôles qualité essentiels

Pour la microscopie:

 Contrôle positif: Lame avec Mycobacterium smegmatis (moins pathogène)

 Contrôle négatif: Crachat de sujet sain

 Évaluation quantitative: Rapport résultat en fonction du nombre de champs

examinés:

o Négatif: Aucun BAAR/300 champs

o 1+: 1-9 BAAR/100 champs

o 2+: 1-9 BAAR/10 champs

o 3+: 1-9 BAAR/champ

o 4+: >9 BAAR/champ

Pour la culture:

 Contrôle de stérilité du milieu: Incuber 2 tubes/boîtes non inoculés

 Contrôle de croissance: Inoculer avec M. tuberculosis H37Rv (souche de référence)

 Contrôle de décontamination: Inoculer avec Pseudomonas aeruginosa pour vérifier

l'efficacité des inhibiteurs
Cette approche méthodologique détaillée démontre l'évolution technique qui a permis
d'améliorer considérablement la détection de la tuberculose, réduisant le délai de diagnostic
de plusieurs semaines à quelques heures tout en augmentant la sensibilité de 10⁴ à 10¹
bacilles/mL.