RAPPORT DE TRAVAUX

PRATIQUES DE BATERIOLOGIE
DU 15 AU 19 DECEMBRE 2025

PRéSEnTé PAR :
KOUAME MESSOU ANNE MARIE DORCAS Enseignant:
23P-1178TBMA
BOKA
KOUAME JEAN BAROUK EHUI CHABEOU
23-8737TBMA

TECHNICIEN DE BIOLOGIE MEDICALE

LICENCE 2
 INTRODUCTION

Dans le cadre de notre formation de Techniciens de Biologie Médicale

a l’INFAS, nous avons réalisé une séance de travaux pratiques de
Bactériologie portant la culture des colonies bactériennes
I. REALISATION DES MILIEUX DE CULTURE

Au cours de ce TP de bactériologie, nous avons été initiés à la préparation des milieux

de culture, outils essentiels pour l’étude et l’identification des bactéries.

À notre arrivée, certains milieux étaient déjà disposés dans des boîtes de Pétri.
Cependant, l’enseignant a souhaité nous montrer la procédure complète, en insistant
sur la pesée précise des poudres avec une balance de précision.

1. Poudres utilisées pour la préparation

Les poudres employées lors de la démonstration étaient :

• Kligler-Hajna (Kligler Iron Agar – KIA)

• Manitol Mobility

Avant d’être utilisées, ces poudres ont été pesées avec précision, puis dissoutes dans
l’eau distillée et, si nécessaire, stérilisées.

2. Règles pour l’utilisation de la balance

Lors de la pesée :
• Il est important de rester silencieux pour éviter les vibrations,
• La salle doit être fermée pour limiter les courants d’air,
• La balance doit être stable et bien calibrée.

Ces précautions permettent d’obtenir des mesures exactes et fiables.

3. Préparation des milieux

a) Kligler-Hajna

• Quantité de poudre : 53,5 g pour 1 litre d’eau distillée

• Dissolution : la poudre est ajoutée à l’eau, remuée et légèrement chauffée jusqu’à
dissolution complète
• Stérilisation : autoclave à 121 °C pendant 15 minutes
• Maintien au chaud avant de transvaser dans les boîtes de Pétri et les tubes à essai

b) Manitol Mobility

• Quantité de poudre : 43 g pour le volume d’eau distillée prévu

• Dissolution : la poudre est ajoutée à l’eau, mélangée et chauffée jusqu’à dissolution
totale
• Maintien au chaud avant transvasement dans les boîtes de Pétri et les tubes à essai

4. Milieux finaux obtenus

Une fois les préparations terminées et les milieux transvasés, les milieux finaux
 disponibles pour les expériences étaient :

Gélose SS Gélose Ordinaire

(Unitative/Nutritive)

Gélose EMB

Chapman kligler HAJA

Lysine de fer Citrate

 II. EXAMEN A L’ETAT FRAIS ET COLORATION DE GRAM

1. Examen à l’état frais

C’est la première étape de l’étude d’une bactérie. Il communique des informations immédiates
sur le caractère vivant et comportement des bactéries.

a) Matériels
- Microscope à fond clair
- Lames porte-objet
- Lamelle couvre-objet
- Pipette pasteur
- Produit biologique

b) Technique
Pour réaliser l’examen ; il faut :
-centrifuger l’échantillon (si l’échantillon est solide il faut le liquéfier d’abord)
-verser le surnageant
-prélever le culot et le déposer entre lame et lamelle
-lire au microscope

2. Coloration de GRAM
Après l’examen à l’état frais, si on constate une prolifération des leucocytes on fait la coloration
de GRAM. Elle permet :
-voir la morphologie (forme)
-le caractère tinctorial (couleur)
-le mode de groupement
-le choix des milieux de cultures

a) Matériels et réactifs
Pour la réalisation il nous faut : bec bunsen, anse de platine, lame porte objet, microscope,
poubelle, violet de gentiane, Lugol, alcool 95, fuchsine phéniquée ou safranine, l’échantillon

b) Technique
-fixation de l’échantillon sur la lame par la flamme du bec bunsen
-recouvrir la lame de violet de gentiane ; laisser agir 1mn et rincer à l’eau
- recouvrir la lame de Lugol, laisser agir 1mn, rincer à l’eau et égoutter
- décolorer à l’alcool, rincer à l’eau et égoutter
-recouvrir la lame de fuchsine, laisser agir 30s, laver à l’eau et égoutter
-laisser sécher à l’air
-Faire la lecture à l’objectif 100

c) Résultat

GRAM POSITIF : bactéries colorées en violet

GRAM NEGATIF : bactéries colorées en rose

III. CULTURE
La culture est une technique de laboratoire qui consiste à faire pousser des bactéries à partir
d’un prélèvement (urines, selles, crachats, etc.) sur un milieu nutritif approprié afin de les
identifier et d’étudier leur comportement.

1. Ensemencement
C’est l’étape qui consiste à déposer un prélèvement contenant des bactéries sur un milieu de
culture, afin de permettre leur croissance et leur observation

a) Matériels

un ensemenceur et les boites de Pétri contenant les milieux de culture

b) Technique
il est important de travailler en milieu totalement stérile.
- Prélever l’échantillon avec l’ensemenceur stérile
- L’étaler sur la gélose ( ici nous avons choisi l’étalement en strie et quadrant
)
- Recouvrir la boite de Pétri

2. L’incubation
Etape qui consiste à placer les milieux ensemencés dans une etuve à une temperature et une
durée précises, afin de permettre la multiplication des bactéries .

Conditions d’incubation :

- Température : généralement à 37° C

- Durée : 18 à 24 heures
3. Résultat de la culture
Après incubation, on remarque la presence de colonies bactériennes

4. Description des colonies

La description consiste à donner la forme, l’élévation, les bords des colonies observées

5. Réalisation des tests respiratoires

a) Catalase
C’est une enzyme qui décompose le peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène en produisant
des bulles.
Pour réaliser le test :
- Déposer une goutte d’eau oxygénée sur la lame
- Ajouter une colonie bactérienne
- Observer la réaction
NB :
 Si bulles immédiates : catalase positive (+) : staphylococcus
 Pas de bulles : catalase négative (-) : streptococcus

b) Oxydase
Le test de l’oxydase met en évidence la cytochrome oxydase par une coloration violette. Il se
fait en :
- Mettant une goutte d’eau dans un tube à hémolyse
- A laquelle on mélange une souche bactérienne
- Et on plonge la bandelette
NB :
 Coloration violette/ bleue : oxydase positive (+) : pseudomonas, Neisseria
 Aucune coloration : oxydase négative (-) : entérobactéries

6. Portoir réduit de Léminor

Nous avons travaillé avec l’échantillon ‘klé ’.
 Dans un tube à hémolyse on met de l’urée, on prélève une souche qu’on
plonge dans l’urée pour la diluer et on ensemence Klyler hajna et Lysine de fer
par piqure et stries. Par la suite une prélève encore la souche pour
ensemencer citrate de Simmons sans la diluer.

Urée

 Après l’ensemencement, on incube à 37°C pendant 18 à 24 heures

7. Lecture des tests du portoir de Léminor

 a) Réalisation des tests
 Indole
Ajouter une goutte de Kovacs dans l’urée ;
- Si anneau rouge à la surface : indole positif (+)
- Pas de coloration rouge : indole négatif (-)

 KLIGLER HAJNA

 LYSINE DE FER
POSITIF (+) NEGATIF (-) RESULTAT

GLUCOSE Couleur jaune du culot Absence de couleur jaune +

LACTOSE couleur jaune Pas de jaune +

GAZ Cassure observée Pas de cassure +

H2S Noircissement de la pente Absence de noir +

 POSITIF (+) NEGATIF (-) RESULTAT
LDA Couleur de la pente rouge Absence de rouge -
LDC Couleur inchangée Vire au jaune +

 CITRATE DE SIMMONS

POSITIF (+) NEGATIF (-) RESULTAT

CITRATE Si ça vire au bleu Pas de changement couleur +

 TDA
Si LDA est POSITIF (+) alors TDA est POSITIF

b) Identification de la bactérie

 Fiche de paillasse
EXAMENS SOUCHES KLE
 MACROSCOPIQUE LIQUIDE TROUBLE
ETAT FRAIS LEUCOCYTES +
GRAM BG-
CATALASE POSTIF (+)
OXYDASE NEGATIF (-)
Urée +
INDOLE +
TDA -
LDA -
GLUCOSE +
LACTOSE +
LDC +
H2S +
CITATE +
GAZ +

 INTERPRETATION

LDA UREE
KLEBSIELLA
TDA KLEBSIELLA INDOLE
PNEUMONIAE
E

Pour l’échantillon KLE , la bactérie est KLEBSIELLA PNEUMONIAE

8. Les Cocci
Les Cocci sont des bactéries de forme arrondie ou sphérique ,contrairement aux bacilles qui
sont allongées
SOUCHE STAPHYLOCOCCUS STREPTOCOCCUS NEISSERIA PNEUMONIAE

MACROSCOPIQUE TROUBLE TROUBLE TROUBLE TROUBLE

ETAT FRAIS LEUCOCYTE++ LEUCOCYTE+ LEUCOCYTE+ LEUCOCYTE +

GRAM Cg+(amas) Cg+(chainette) Cg+(grains de Cg+(diplo,flamme

café) de bougie
CATALASE + - - -

OXYDASE - + + +

CULTURE GO GO GELOSE DE S GS(FouC)

CHAPMAN GELOSE DE SANG (frais ou cuit) 10%CO2
GS(frais ou cuit) 10% CO2 10%CO2
RESULTAT EXAMEN JAUNE HEMOLYSE &,B,Y HEMOLYSE HEMOLYSE
HEMOLYSE & &,B,Y &B,Y
STAPHYLOCOAGULASE + (AUREUS)
PLASMA DE LAPIN
ADNASE + (AUREUS)

CONCLUSION
Ce TP nous a permis de mieux comprendre les étapes de la réalisation
de culture de colonies : de la preparation des milieux jusqu’à
l’interpretation des résultats.