‫الــجمهورية الــجزائرية الــديمقراطية الــشعبية‬

République Algérienne Démocratique et Populaire

‫وزارة التعليم العالي والبحث العلمي‬
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
‫جامعــة محمد البشير اإلبراهيمي برج بوعريريج‬
Université Mohammed El Bachir El Ibrahimi B.B.A
‫كلية علوم الطبيعة والحياة وعلوم األرض والكون‬
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et des Sciences de la Terre et de l’Univers
‫قسم العلوم البيولوجية‬
Département des Sciences Biologiques

Mémoire
En vue de l’obtention du diplôme de Master
Domaine des Sciences de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences Biologiques.
Spécialité : Microbiologie appliquée.

Intitulé :

Activité antifongique et antibactérienne des extraits de

clou de girofle.

Présenté par:
M. BENTOUATI Fateh, M. CHOUCHOU Ahmed & Melle. HOUAIRI Nessrine
Soutenu le 24/06/2023 Devant le Jury:

Nom &Prénom Grade Affiliation / institution

Président : Mme ZERROUG Amina MCA Université de Bordj Bou Arreridj

Encadrant : Mme ABED Hanane MCA Université de Bordj Bou Arreridj

Examinateur : Mme SOUAGUI Yasmine MCB Université de Bordj Bou Arreridj

Année Universitaire 2022/2023

 Remerciements
Tout d’abord, nous tenons à remercier ALLAH le Tout-Puissant et le
Miséricordieux de nous avoir donné la santé, la volonté, le courage et la
patience pour mener à terme notre formation et pourvoir réaliser ce travail de
recherche.
Nous tenons à remercier ensuite, les membres du jury :
Mme. ZERROUG Amina et Mme. SOUAGUI Yasmine
Qui ont bien voulus nous honorer par leur présence et leur lecture attentive de
ce mémoire, ainsi que pour les remarques qu’ils nous adresseront lors de cette
soutenance afin d’améliorer notre travail.
Nos remerciements s’adressent particulièrement au
Docteur Mme ABED Hanane
, pour son encadrement de qualité, sa motivation professionnelle, ses conseils et
critiques constructives, ses corrections, sa gentillesse et sa patience ainsi pour
le temps qu’elle a consacré à la réalisation de ce travail.
En guise de reconnaissance, nous tenons à remercier, très sincèrement, tous les
Professeurs. Nous avons eu l’honneur et la chance de bénéficier de leurs
connaissances et compétences, de leurs précieux conseils et de leur suivi tout au
long de notre parcours académique.
Nos remerciements vont également à toutes les techniciennes des laboratoires et
tous les membres de l'équipe pédagogique du département de « biologie » de
l’université de Bordj, qui nous ont ouvert les portes des structures dont ils
avaient la responsabilité et qui ont tout mis à notre disposition pour nous
permettre de travailler dans les meilleures conditions.
Nous vous remercions infiniment.
Nous voudrions enfin exprimer nos gratitudes à nos proches et les remercier de
nous avoir soutenus et encouragés et à nos collègues d’études, particulièrement
Notre promotion avec qui nous avons partagé de bons moments.
 DEDICACE
Je dédie entièrement ce modeste travail

À ma Mère

Qui m’a donné beaucoup de soutien et d’encouragement dès ma naissance, symbolisant pour
moi le sacrifice et la source d’où nait la lumière qui éclaire ma vie, et pour qui aucune
dédicace n’exprimera la profondeur de mon amour,

je vous adore,

A l’âme de mon père

la personne la plus idéale qui fut dans ce monde, c’est vrai qu’il n’est pas avec nous
aujourd’hui, mais, il reste toujours le plus présent. Mon père HAMLAOUI qui a fait de moi ce
que je suis.
Que Dieu l’accueille dans son vaste paradis.
À mes frères et sœurs

qui font de mon univers une merveille, je leurs souhaite beaucoup de bonheur et de réussite.

Je leur souhaite, une vie pleine de succès avec beaucoup de bonheur,

À toute la famille

Surtout : Pour leur véritable et sincère amour, pour tout le soutien qu’ils m’apportent.

À mes amis

Moussa, Khalil, Abdelhakim, Ahmed et Nessrine...

Pour les moments forts et agréables que nous avions passé ensemble, à tous ce qui m’aiment
et me souhaitent le bonheur et à tous qui ont contribué de près ou de loin

à la réalisation de ce travail et à l’élaboration de ce mémoire.

Enfin, je les remercie tous.

BENTOUATI Fateh
 Dédicace
Je dédie ce modeste travail
A MES PARENTS
A ma source d’amour, à la lumière de ma vie, à maman.
A mon père, j’espère fier de moi
A ma femme L.A et mes filles Iness et Serine et ma
petite ange Chaïma pour leurs encouragements permanents,
et leur soutien moral.
A mes frères et sœurs et tous mes proches.
Je te dédie ce travail.
A mes très chèrs amis ; Fateh, Benhammimid et Nessrine
A tous les membres de ma promotion.

A tous mes collègues de travail et ceux qui me sens chers et

que j’ai omis de citer.

CHOUCHOU Ahmed.
 Dédicace
A Mes chers parents Houairi Saâdi et Houairi Fadila, Quoi que je dise ou
que je fasse, je n’arrivai jamais à vous remercier comme il se doit.
C’est grâce à vos encouragements, vos bienveillances
et votre présence à mes côtés, que j’ai réussi ce respectueux parcours.

Je souhaite que vous soyez fièrs de moi, et que j’ai pu répondre aux
espoirs que vous avez fondé en moi.

A mes chers frères et soeurs ( Hicham Fares, Assia, Rita ,Assinat , et ma

belle-sœur Anna Eltsova )
A mon mari Boutiche Yacine.
Merci pour votre soutien moral, votre confiance et vos précieux conseils,
qui m’ont aidé dans les moments difficiles.
Je vous souhaite le bonheur et la réussite dans vos vies.
A toute ma famille et mes collègues (Chouchou Ahmed et Bentouati Fateh)
À travers ses lignes je ne peux pas vous décrire tous mes sentiments
d’amour,
le seul mot que je peux dire est merci, vraiment merci beaucoup à toute
personne qui a contribué à la
réalisation de ce mémoire..
HOUAIRI Nessrine
 Table des matières

Table des matières

Remerciement
Dédicaces
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations
Introduction……………………………… …………………..………….. 01
Chapitre I : matériels et méthodes ……………………..………………
I.1. Objectif d’étude …………………………………………………………………… 06
I.2. Matériels ………………………………………………………………………… 06
I.2.1. Matériels non biologiques …………………………………………………… 06
I.2.2. Matériel Biologique ………………...…………………………………………… 06
I.2.2.1. Matériel végétale …………………...………………………………………….. 06
I.3. Méthodes. ……………………………………………………….…………………. 07
I.3.1. Méthodes d’extraction …………………………………………………………… 07
I.3.1.1. Hydro-distillation ………………...……………………………………………. 07
I.3.1.2. Analyse physique des huiles essentielles………………………………………. 07
A) Le rendement …………………………………………………………………….. 07
B) La mesure de pH. ………………………………………………………………… 08
C) Conservation de l’huile essentielle ………………………………………………. 08
I.3.1.3. Macération …………………………………………………………………… 08
[Link]ération à froid………………………………………………………….. 08
[Link]ération à chaud ………………………………………………………… 09
1.3.2. Isolement et identification des agents pathogènes …………………………… 09
[Link] des moisissures…………………………………………………….. 09
I.3.2.1. Isolement des bactéries …………………………………………………….. 11
I.4. Mise en évidence de l'activité antimicrobienne et antifongique………………… 11
[Link]é antifongique …………………………………………………………… 11
I.4.2. Activité antibactérienne ………………………………………………………. 12
I.5. Détermination de la concentration minimale inhibitrice ………………………… 13
I.5.1. Détermination de la concentration minimale inhibitrice fongique (CMI F) …… 13
I.5.2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice bactérienne (CMI B)….. 15
I.5.3. Mise en évidence du pouvoir antifongique volatile……………………………. 16
 Table des matières

Chapitre II : Résultats et Discussion

II.1. Résultats et analyse physiques des extraits ………………………………….. 18
II.2. Résultats de l’isolement de la flore fongique de la tomate…………………….. 20
II.2 .[Link]éristiques des souches isolées …………………………………………. 20
II.3 Mise en évidence du l’activité antimicrobienne ……………………………….. 25
II.3.1. Résultat de l’activité antifongique………………………………………………. 25
II.3.2. Résultats de l’activité antibactérienne………………………………………. 28
II.4. Concentration minimale inhibitrice….. ……………… ………………………. 30
II.4.1. Résultat de la concentration minimale inhibitrice fongiques CMI F..……….. 30
II.4.2. Résultats de la concentration minimale inhibitrice bactérienne CMI B ……… 34
II.4.3. Résultat de test micro-atmosphère …………………………………………… 36
Conclusion……………………………………………………………………………. 41
Liste des références …………………………………………………………………. 42
Annexe
‫الملخص‬
Résumé
Abstract
 Liste des tableaux

Liste des tableaux

Tableau 01 : Caractéristique des extraits ………...................................................................18
Tableau 02 : Activité antifongique des extraits, zones d’inhibition (mm) ….........................25
 Liste des figures

Liste des figures

Figure 01 : Les clous de girofle ………….…………..………………………………...........06
Figure 02 : Protocole de Hydro-distillation……….…………...…………………….………07
Figure 03 : A papier pH , B mesure de pH ……………………..…………………….…….08
Figure 04 : Expérimentation de macération à froid ……………..…………………….…….09
Figure 05 : Expérimentation de macération à chaud ……………. .………………………...09
Figure 06 : Echantillons des fruits de tomates infectées…………………….. ……….……….10
Figure 07 : Isolement des moisissures sur milieu gélosé PDA ….…………………………..10
Figure 08 : Examen microscopique effectué entre lame et lamelle / scotche ..……......…….11
Figure 09 : Schéma explicatif de la technique de réalisation du test de sensibilité et
l’interprétation de ces résultats………………...…………………………………12
Figure 10 : Schéma représentatif de la CMI F concentration minimale inhibitrice fongique.14
Figure 11 : Détermination de la CMI B concentration minimale inhibitrice bactériennes .....16
Figure 12 : Activité antifongique par la méthode micro- atmosphère ………...…………….17
Figure 13 : Les différents extraits du clou de girofle ……….………….………….………...19
Figure 14 : Les résultats de la mesure de pH …………..…………………………….…….20
Figure 15 : Caractères morphologiques de souche 01 …………..…………………….…….21
Figure 16 : Caractères morphologiques de souche 02 ..…………. .………………………...21
Figure 17 : Caractères morphologiques de souche 03…………………….. ……….……….22
Figure 18 : Caractères morphologiques de souche 04………..….…………………………..22
Figure 19 : Caractères morphologiques de souche 05...……….………………….…...…….23
Figure 20 : Caractères morphologiques de souche 06 et 07…………………………………23
Figure 21 : Caractères morphologiques de souche 08……….………... ……………………24
Figure 22 : Activité antifongique des extraits sur les champignons …………………..…….26
Figure 23 : Représentation graphique d’activité antibactérienne des extraits........................28
Figure 24 : Résultats de l’activité antibactérienne des extraits vis-à-vis la bactérie B1.…..29
Figure 25 : Représentation graphique de la concentration minimal inhibitrice fongique CMIF
de HEs………………..………………………………………………….………………….31
Figure 26 : Résultats de la concentration minimale inhibitrice fongique CMI F ….. …...….….33
Figure 27 : Résultat de la concentration minimale inhibitrice bactérienne CMI B de B1.… ….….35
Figure 28 : Résultat de la concentration minimale inhibitrice bactérienne CMI B de B1 …………35
Figure 29 : Représentation graphique de l’activité antifongique à la méthde de
micro- atmosphère de HEs. ……… .....................................................................37
Figure 30 : Résultat de test micro-atmosphère……….………………….. …………………38
 Liste des abréviations

Liste des abréviations

°C : Degré Celsius.

% : Pourcentage

Ø : Diamètre

AFNOR : Association française de normalisation.

ATCC : American Type Culture Collection.

A. alternata : Alternaria alternata.

A. flavus : Aspergillus flavus

A. niger : Aspergillus niger

B. cereus : Bacillus cereus.

B. cinerea : Botrytis cinerea

C. albicans : Candida albicans.

B1 : Bactérie isolé

C. albicans : Candida albicans.

CG : Clou de girofle.

CGp : Clou de girofle poudre.

CGnb : Clou de girofle non broyé.

Cm : Centimètre.

Cm² : Centimètre carré

CMI B: Concentration minimale inhibitrice bactérienne

CMI F : Concentration minimale inhibitrice fongique

Disp : Distillat poudre.

Disnb : Distillat non broyé.

DMSO : Diméthylsulfoxyde.

DTm : Diamètre de témoin

DI : Diamètre de zone d’inhibition

[Link] : Escherichia coli.

 Liste des abréviations

F. monoliforme : Fusarium monoliforme.

g : Gramme

h : Heure.

H+ : Proton d’hydrogène

HE : Huile essentielle.

HEp : Huile essentielle poudre

HEnb : Huile essentielle non broyé

Gen : Gentamicine.

J : Jour

L : Litre

M. gypseum : Microsporum gypseum

Mchp : Macérâtion à chaud poudre .

Mchnb : Macérâtion à chaud non broyé .

Mfrp : Macérâtion à froid poudre .

Mfrnb : Macérâtion à f roid non broyé

MS : La masse de la matière sèche

MHE : La masse d’huile essentiel

µg : Microgramme.

µl : Microlitre

MH : Mueller-Hinton.

min : Minute.

ml : Millilitre.

mg : Milligramme

mm : Millimètre.

nm : Nanomètre

N° : Numéro.

P. aeroginosa: Pseudomonas aeruginosa

 Liste des abréviations

P. citrinum: Penicillium citrinum

P. expansum: Penicillium expansum

PCA : Plate count agar.

PDA: Potata Dextrose Agar ou pomme de terre glucosée

P/P : Poids sur poids

pH : Potentiel hydrogène.

R : Rendement

S. aureus : Staphylococcus aureus.

[Link] : Syzygium aromaticum

SDA : Sabouraud d’extrorse agar.

SM : Solution mère.

sp : Espèce.

S. typhimurium : Salmonella typhimurium.

[Link] : Trichophyton mentagrophyt

T. rubrum : Trichophyton rubrum

Tm- : Témoin négatif

Tm+ : Témoin positif

V/V : Volume sur volume

x40 : Grossissement fois 40

Introduction
 Introduction

Introduction
Depuis longtemps l'homme reconnaît et utilise les plantes pour se nourrir et pour
traiter diverses maladies. Depuis toujours, l’homme a eu recours aux plantes pour se
maquiller, se parfumer, mais aussi pour se soigner sans connaître réellement les propriétés de
ces plantes, ni avoir la moindre connaissance scientifique, même sommaire, expliquant leurs
vertus. Ce n’est qu’au moyen âge que les huiles essentielles ont été réellement découvertes
grâce aux premières distillations et plus tard, grâce aux progrès de la science et tout
particulièrement à l’apparition de la chimie. Cette médecine traditionnelle ancestrale est le
précurseur de la phytothérapie et de l’aromathérapie d’aujourd’hui. (Fontanay et al., 2015).

Actuellement, La population mondiale ne cessant de croître, ce qui exerce une

pression constante sur la demande alimentaire mondiale. Donc, il est urgent de redoubler
d’efforts et d’innover afin d’augmenter durablement la production agricole, d’améliorer la
chaîne d’approvisionnement mondiale, de réduire les pertes et le gaspillage alimentaires.
(Département des Affaires Économiques et Sociales des Nations Unies)
Ce défi nécessite de transformer les systèmes agro-alimentaires pour les rendre plus
productifs, plus efficaces, plus économes en ressources afin de garantir la durabilité de tous
les systèmes alimentaires et diminuer les pertes et le gaspillage des produits alimentaires qui
sapent les efforts menés pour éradiquer la faim et améliorer la nutrition.
Cependant, Les bioagresseurs entravent ces efforts. Ces organismes vivants attaquent
les plantes cultivées pendant leur croissance ou attaquent les produits entreposés et causent de
grandes pertes économiques. Selon l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et
l’agriculture (FAO), en 2021, environ 14 pour cent des aliments produits sont perdus entre la
récolte et la vente au détail à l’échelle mondiale. Ces organismes nuisibles aux
végétaux comprennent l'ensemble des ennemis des cultures et se répartissent en trois grandes
familles : les agents phytopathogènes (champignons, bactéries, virus principalement), cause
des maladies des plantes, les ravageurs animaux (prédateurs ou parasites des plantes) et
les adventices « mauvaises herbes » qui concurrencent les plantes cultivées. Ces dégâts
peuvent entraîner des dommages qui sont des pertes quantitatives ou une modification
qualitative de la récolte. Les dommages de récolte se traduisent généralement par des pertes
économiques.
En premier lieu, les intoxications alimentaires et les détériorations causées par des micro-
organismes entraînent d’énormes pertes d’aliments et constituent une préoccupation vitale
pour la santé publique .Par conséquent, la sécurité alimentaire est une question cruciale pour

1
 Introduction

les consommateurs ainsi que pour les industries alimentaires. En effet, l’Organisation
mondiale de la santé (OMS) estime que 1 personne sur 10 tombe malade chaque année après
avoir mangé des aliments contaminés et que 420 000 en meurent (OMS, 2015).

Cette incidence importante de menace d’origine alimentaire associée aux nouvelles

implications sociales et économiques entraîne un besoin urgent d’aliments plus sûrs grâce à la
mise au point de nouveaux agents de conservation non toxiques ayant d’importantes
propriétés antimicrobiennes et anti-oxydantes. C’est pourquoi, de nombreux agents de
conservation synthétiques sont utilisés pour contrôler la croissance microbienne dans les
aliments, ce qui réduit l’incidence des maladies d’origine alimentaire et prolonge la durée de
conservation des produits alimentaires mais leur utilisation est remise en question en raison de
préoccupations possibles perçues pour la santé et d’augmentations potentielles de la résistance
microbienne. (McDonald et Linde, 2022).

En effet, les produits chimiques synthétiques eux-mêmes, couramment utilisés pour

contrôler les souches pathogènes, soulèvent de graves préoccupations liées à la santé humaine
(Prakash et al., 2015 et Falleh et al., 2021). Gutiérrez-del-Río et ses collègues (2018). ont
signalé qu’une large gamme de conservateurs synthétiques et de traitements physiques
antibactériens sont utilisés pour prolonger la durée de conservation des aliments en inhibant la
croissance des bactéries pathogènes. De plus, certains aliments nécessitent une protection
spéciale contre la détérioration microbienne lors de leur préparation, de leur stockage et de
leur distribution afin d’augmenter leur durée de conservation et leurs propriétés
organoleptiques, en évitant la détérioration microbienne, qui modifie généralement le goût,
l’odeur, la couleur et les propriétés sensorielles ou texturales. Cependant, certains de ces
additifs antimicrobiens peuvent altérer les propriétés nutritionnelles d’un aliment donné,
comme dans le cas des sulfites qui détruisent la vitamine B1, ou de l’ajout de nitrates à la
viande, ce qui rend leur consommation très dangereuse (cancérigène).

En plus, l’autre problème majeur dans la chimiothérapie antimicrobienne est l’apparition

croissante de la résistance aux antibiotiques, ce qui conduit à l’insuffisance du traitement
antimicrobien. La sur utilisation d’antibiotiques et la pression de sélection des antibiotiques
qui en résulte sont considérées comme le facteur le plus important contribuant à l’apparition
de différents types de microbes résistants.,(Schelz et al.,2006).

Le maintien d'une forte production agricole nécessite de savoir lutter efficacement contre
les bio agresseurs des cultures. Premièrement, les champignons phytopathogènes qui sont
grâce à certaines caractéristiques de leur potentiel évolutif (comme l'asexualité partielle ou la
2
 Introduction

multiplicité des cycles d’infection dans une saison épidémique) des organismes capables de
s'adapter très rapidement à des modifications de leur environnement (McDonald et Linde,
2022).

Deuxièmement, Les bactéries sont responsables de plusieurs maladies. Leur résistance

aux antibiotiques est de plus en plus prononcée. Pour arrêter ce processus de synthèse-
résistance, il est nécessaire de chercher une autre approche afin de diminuer ou d’éliminer les
affections sans l’utilisation des antibiotiques et des produits synthétiques, donc il est évident
de trouver des solutions par l’utilisation des molécules bioactives qui sont à base de plantes
(Vlietinck et Vanden Berghe, 1991).

Donc, La situation est davantage plus préoccupante à cause de l'apparition des souches
de micro-organismes antibiorésistants et l'émergence des infections non communes qui
compromettent les traitements à l'aide des médicaments existants. Face à ces nombreux
obstacles que présente l'utilisation des antibactériens disponibles, il est indispensable de
chercher de nouvelles substances antibactériennes efficaces et à large spectre d'action (Biyiti
et al., 2004).

Par conséquent, le développement et l’utilisation d’agents antimicrobiens naturels,

sûrs et efficaces sont souhaités. De nombreux produits alimentaires doivent être protégés
contre la détérioration microbienne pendant leur durée de conservation. La demande
croissante des consommateurs pour des produits sûrs et naturels, sans conservateurs
chimiques, a donné lieu à des enquêtes approfondies de la part des autorités alimentaires et
des chercheurs pour évaluer la faisabilité de techniques de conservation douces et améliorer la
qualité microbienne et la sécurité des produits, tout en maintenant leurs bonnes propriétés
nutritionnelles et organoleptiques. (Goni et al., 2009)

Pour ces raisons, on peut trouver de nombreuses plantes aromatiques caractérisées par
la biosynthèse d’un large éventail de composés organiques qui semblent n’avoir aucune
fonction directe dans la croissance et le développement, et ceux-ci sont nommés métabolites
secondaires. Ce sont des molécules odorantes qui constituent ce qu’on appelle les huiles
essentielles (HE).

Dans notre étude, en vue de trouver des méthodes alternatives aux fongicides et aux
bactéricides synthétiques qui représentent le moyen de lutte le plus utilisé par les maraîchers,
Dans le laboratoire, notre travail se concentre sur l’utilisation de produits naturels respectueux

3
 Introduction

de l’environnement, comme stratégies de contrôle des maladies. Dans ce contexte, nous

proposons d’évaluer les propriétés antimicrobiennes des extraits d’une plante aromatique et
leur capacité à contrôler les maladies causées par les phytopathogènes.

Pour cela, nous avons choisi d’utiliser les extraits du giroflier connue par ses effets
bénéfiques; son bouton floral (clou de girofle) possède une odeur caractéristique et une saveur
chaude et piquante. Cet arbre nommé Syzygium aromaticum (S. aromaticum) (synonyme :
Eugenia cariophylata) communément appelé clou de girofle, est un arbre de taille médiane
(8-12 m) de la famille des Myrtacée originaire des îles Moluques dans l’est de l’Indonésie.
(Kamato et al.,2012).

Le clou de girofle est utilisé dans la Chine ancienne comme épice et parfum depuis
plus de 2000 ans. En médecine, dans le domaine de la phytothérapie orientale et comme
épices culinaires. Le bouton floral de la plante est utilisé à la fois pour aromatiser et à partir
duquel l’huile essentielle est extraite. Les caractéristiques de son huile essentielle sont la
nature volatile et les fortes odeurs aromatiques. Par conséquent, l’huile essentielle de clou de
girofle a été largement utilisée en aromathérapie et en cosmétique. Il a également été utilisé
comme anesthésique naturel en dentisterie.( Chee et Lee, 2007). pour la première fois en 1640
dans « Pratique de la physique » en France.

Le clou de girofle a été choisi tout particulièrement pour ce projet, car cette épice a
une huile essentielle qui est considérée comme un antibactérien puissant à très large spectre,
l’un des meilleurs chez les épices. En effet, la plante renferme15 à 20% d’HE extraite à partir
des boutons floraux du giroflier. L’essence renferme 85 à 93 % en volume d’eugénol libre et
combinés. Xue et al., (2022).Consiste à extraire l’huile essentielle de cette espèce afin de
tester son activité antimicrobienne, son potentiel contre les champignons et les bactéries à
Gram positif et à Gram négatif dans divers laboratoires à travers le monde.

Parmi les cultures les plus touchées, la tomate, (Solanum esculentum Mill) qui
représente l’un des fruits les plus consommés au monde. Cependant, des microorganismes
nuisibles constituent de véritables ennemis et entravent le développement de cette culture très
importante et menacent ses fruits. Certains agents telluriques phytopathogènes sont
responsables d’importantes pertes de récoltes en occasionnant diverses maladies dont : la
pourriture des semences, la fonte des semis, la pourriture racinaire et le flétrissement des
plantes etc. (Blancard et al., 2009).

4
 Introduction

Ce travail qui s’inscrit dans cette perspective, est dédié à une plante de la pharmacopée
traditionnelle. L’objectif principal est d’évaluer in vitro les propriétés antibactériennes et
antifongiques des extraits des fleurs de Syzygium aromaticum commercialisé au niveau de
Bordj Bou Arréridj.

La première partie de ce document est consacrée à la partie expérimentale, à savoir:

 Extraction des huiles essentielles, macérât à froid, macérât à chaud et distillat à partir
les bourgeons de clous de girofle broyé et non broyé;
 Évaluation de leurs activités antibactériennes et antifongiques;
 Enfin la deuxième partie présente les résultats obtenus ainsi que leurs discussions

5
 Chapitre I
matériels et méthodes
 Chapitre I : matériels et méthodes

Chapitre I : matériels et méthodes

I.1. Objectif d’étude
L’objectif de notre travail est de tester in vitro l’activité antifongique et
antibactérienne de plusieurs extraits de clou de girofle (syzygium aromaticum) à l’égard de
certaines champignons et bactéries. Il s’agit d’une étude s’étendant sur une durée de trois
mois, réalisée au sein des laboratoires de microbiologie et de biochimie de la faculté des
sciences de la nature et de la vie et des sciences de la terre et de l’univers (Mohamed El
Bachir El Ibrahimi, Bordj Bou Arreridj).
I.2. Matériel
I.2.1. Matériels non biologiques
L’ensemble de matériels non biologiques utilisé pour réaliser cette étude est résumé
dans l’annexe 01
I.2.2. Matériel Biologique
I.2.2.1. Matériel végétale
Des boutons floraux séchés de Syzygium aromaticum [Link]é, Merr. & [Link]
(famille des Myrtaceae), ont été utilisés comme matière première des différents extraits. Les
échantillons de clou de girofle (CG) sont subdivisés en deux parties, la première est broyée
en poudre et la deuxième partie utilisée telle qu’elle est (figure 01).

A B

Figure 01 : les clous de girofle ; A : sains, B : broyés (photo personnelle)

Les caractéristiques des boutons floraux :

- En forme de clou, brun rouge.
- Odeur aromatique très caractéristique.
- Saveur brulante.
6
 Chapitre I : matériels et méthodes

I.3. Méthodes
I.3.1. Méthodes d’extraction
I.3.1.1. Hydro-distillation
L’huile essentielle (HE) est extraite à l'aide d'un appareil de type Clevenger (figure
02) les bourgeons broyés et non broyés ont été soumis, séparément, à une hydro distillation
pendant 4 à 6 heures. La matière première (50 g) a été directement immergée dans 250 ml
d'eau distillée dans un ballon à fond rond (capacité de 1 L). L'ensemble du procédé
d'extraction a été opéré à la pression atmosphérique. Cette technique consiste à faire bouillir
le mélange, condenser les vapeurs qui se dégagent à l'aide d'une colonne de condensation
(réfrigérant). La condensation de ce mélange de vapeur provoque sa séparation en deux
phases : une phase organique, appelée huile essentielle, contenant la majorité des composés
odorants, et une phase aqueuse, appelée eau aromatique (distillat) qui contient très peu de
composés odorants. Recueillir le distillat dans un Erlenmeyer et on stopper le chauffage. A la
fin l’HE à été filtré par filtre membrane. (Kaloustian et Hadji-Minaglou, 2012).

Mélange Ebullition Décantation

Figure 02 : Protocole de l’hydro-distillation (photo personnelle)

I.3.1.2. L’analyse physique des huiles essentielles

A) Le rendement
Le rendement (R) en l’huile essentielle est le rapport entre le poids de ce produit et le
poids de la plante à traiter. Le rendement d'extraction a été calculé comme suit :
MHE x100
R% = .
MS
MS : masse de la matière sèche (g), MHE : masse d'huile essentielle(g) (Ben Hassine et al.,
2021).
7
 Chapitre I : matériels et méthodes

B) La mesure de pH
Le potentiel d’hydrogène pH mesure l’activité chimique des ions Hydrogènes (H+) en
solution. Le pH des huiles obtenus est réalisé à l’aide de papier pH (figure 03).

A B

Figure 03 : A papier pH, B mesure de pH (photo personnelle)

C) Conservation de l’huile essentielle

La conservation des huiles essentielles exige certaines précautions indispensables.
Après l’extraction l’HE avait été conservée dans des flacons en verre opaques, brun ou bleu
pour la préserver de la lumière et de l’oxygène, bien scellés. Il faut également éviter le
contact avec l'air (pas d'ouverture prolongée des flacons), par la suite il faudra garder les
flacons à une température basse entre 4 et 5 Cº (Kaloustian et Hadji-Minaglou, 2012).

I.3.1.3. Macération
I.3.1.3.1Macération à froid
La macération est un procédé qui consiste à laisser séjourner une plante dans un
solvant à froid pour en extraire les composés solubles (arômes, principes actifs).La
macération peut se faire dans une solution alcoolique, de l'eau, de l'huile... Cette technique
préserve les espèces chimiques fragiles car elle est pratiquée à froid mais elle n’est pas
toujours aussi efficace que les techniques qui utilisent le chauffage (Handa et al., 2008).

La technique consiste à placer 10 g de clous de girofle convenablement broyé

« poudre », ou non broyé dans un Erlenmeyer couvert par papier aluminium contenant 100 ml
de l’eau distillée approprié et bouché. Laisser le système au repos pendant trois jours, avec
des agitation, le liquide est ensuite filtré et le résidu solide est pressé pour récupérer le
maximum de solution occluse (figure 04) (Handa et al., 2008).

8
 Chapitre I : matériels et méthodes

Macération dans l’eau Repos (3js) + secousses Filtration

Figure 04 : Expérimentation de macération à froid (photos personnelles).

I.[Link]. Macération à chaud

Dix gramme de clous de girofle broyé, ou non broyé sont placés dans un Erlenmeyer
contenant 100 ml de l’eau distillée approprié et bouché. Bouillir le mélange à 100°c pendant
30 minutes. Après ébullition, filtrer et récupérer le macérât (figure 05) (Handa et al., 2008).

Macération dans l’eau Chauffage + agétation Filtration

Figure 05 : Expérimentation de macération ( photo personnelle).

1.3.2. Isolement et identification des agents pathogènes

[Link] des moisissures
Les moisissures ont été isolées à partir des fragments des tomates infectées (figure
06). Les tomates échantillonnées ont été découpées en petits fragments d’en moins de 10 mm
de diamètre (zone saine et blessée). Les tissus obtenus de tomate ont été aseptiquement
placés en boîtes de Pétri coulées de pomme de terre glucosée (PDA) (Annexe), à raison de
quatre à cinq fragments par boîte. Le milieu de culture PDA sert à l’ensemencement et la
purification des souches fongiques. Les boîtes ont été ensuite hermétiquement scellées à
l’aide d’un para-film. L’incubation durait 72 heures à 28 °C (figure 07). (Bessadat et al.,
2014).
9
 Chapitre I : matériels et méthodes

Figure 06 : Echantillons des fruits de tomates infectées (photo personnelle).

Incubation
28°c/ 72h

Prélèvement Ensemencement

Figure 07 : Isolement des moisissures sur milieu gélosé PDA (photo personnelle)

La caractérisation et l’identification des isolats obtenus ont été faites à l’échelle du

genre, à partir des caractères macroscopiques culturaux (forme, taille, couleur, aspect,
contour) et microscopiques. L’examen microscopique effectué entre lame et lamelle /scotche
des cultures ayant servi à l’étude des caractéristiques culturales (aspect du mycélium, des
spores, des phialides, des conidiophores,) (figure 08). (Compaore et al., 2016).

10
 Chapitre I : matériels et méthodes

Figure 08 : L’examen microscopique effectué entre lame et lamelle /scotche (photo personnelle)

I.3.2.1. Isolement des bactéries

L’isolement des bactéries a été réalisé sur des milieux de culture gélosés, selon la
méthode de (Goszczynska, 2000). Les fruits de tomate présentant des symptômes typiques
sont lavés à l’eau distillée stérile pour éliminer les débris de surface avant de procéder à
l’isolement. Les parties infectées du tissu végétal sont coupées à la limite (zone saine/zone
malade) à l’aide d’un scalpel stérile. Ces morceaux de fruits ont été ensemencés dans des
boîtes de Pétri contenant le milieu PCA (Plate count agar). Ensuite, les boîtes ont été
incubées à une température de 37 °C pendant 24 h. les colonies obtenues sont purifiées par
réensemencement dans des boîtes de Pétri coulées de milieu PCA par la méthode de stries.
Afin de déterminer la pureté et le type de Gram des souches isolées, nous avons réalisé la
coloration de Gram.

I.4. Mise en évidence de l'activité antibactérienne et antifongique

I.4.1. Activité antifongique
Nous avons utilisé la méthode de diffusion en milieu solide Sabouraud (SDA) pour
évaluer l’activité antifongique vis-à-vis des 05 isolats. La gélose a été ensemencée par
inondation avec 2 ml de chaque inoculum fongique à environ 105 spore/ml (selon le standard
Mac Farland, une densité optique de 0.5 à 1 correspond approximativement à une
concentration de 105 spore/ml à la longueur d'onde λ = 730 nm), l’excès a été éliminé. Puis,
les boîtes ont été séchées 15 minutes à la température ambiante. Des disques de papier
Wattman stériles N ͦ 3 et de diamètre 06 mm ont été imprégnés par 20 μl de chaque extrait
placés à la surface du milieu dans la boîte de pétri. Trois répétitions ont été effectuées pour
chaque extrait. Des disques imbibés par une solution aqueuse stérile considèrés comme
témoins négatifs (Tm-). Les boîtes ont été ensuite incubées à 30 °C pendant 48 h. La mesure

11
 Chapitre I : matériels et méthodes
des diamètres des zones d’inhibition entourant les disques contenant les échantillons à tester a
été réalisée à l’aide d’une règle (figure 09) (Yala et al., 2016).
I.4.2 Activité antibactérienne

L’activité antibactérienne a été évaluée par la méthode de diffusion sur gélose. La

gélose Muller- Hinton (MH) a été ensemencée par écouvillon émergé dans l’inoculum
bactérien à environ 0,5 Mac Farland, (selon le standard Mac Farland, une densité optique de
0.08 à 0.1 correspond approximativement à une concentration de 108 UFC/ml à la longueur
d'onde λ = 625 nm). Enfin, 20 µl de chaque extrait ont été déposés sur des disques de papier
wattman et les boîtes incubées à 37°C/24h. Deux répétitions ont été réalisé pour chaque
extrait. Un Disque de gentamycine commercialisée (à 10μg/ disque) est utilisé comme témoin
positif (Tm+). Les activités antibactériennes ont été évaluées en mesurant le diamètre de la
zone d’inhibition induite par les extraits ou les antibiotiques (figure09) ( Ben Abdallah et al.,
2019)

l’inoculum
fongique/Bacterienne
milieu SDA/ MH
disques imbibés

20µl

Incubation
37 c/24h pour Bac
extrait 30 c/48h pour Fon
disques de papier Wattman
.

Boit de pétri

disques imbibés par extrait

Développement des microorganismes

Zone d’inhibition

extrait lectures résultat

A __ Ø<8mm résistée
B + O9 ≤ Ø ≤ 14 intermédiaire
C ++ 15≤ Ø ≤ 20 Sensible
D +++ Ø ≥ 20 Très sensible

Figure 09 : Schéma explicatif de la technique du test de sensibilité et l’interprétation de ses résultats

12
 Chapitre I : matériels et méthodes

I.5. Détermination de la concentration minimale inhibitrice

I.5.1. Détermination de la concentration minimale inhibitrice fongique CMI F

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI F) des huiles essentielles ont été
déterminées selon la méthode rapportée par Remmal et al., (1993). et Satrani et al., (2001).
Du fait de la non miscibilité des huiles essentielles à l’eau et donc aussi au milieu de culture,
la mise en émulsion a été réalisée grâce à une gélose molle à 0,2 % afin de favoriser le contact
germe/composé. Des dilutions ont été préparées à 150 µl/ml, 100µl/ml, 75µl/ml, 50µl/ml et
25µl/ml dans cette solution d’agar.

Dans des tubes à essais contenant chacun 13,5 ml de milieu Sabouraud (SDA),
stérilisés à l’autoclave (20 min à 121 °C) et refroidis à 45 °C, on a ajouté 1,5 ml de chacune
des concentrations de façon à obtenir les concentrations finales de 15 µl/ml, 10 µl/ml, 7,5
µl/ml, 5 µl/ml et 2,5 µl/ml (v/v). Puis on agite convenablement les tubes avant de les verser
dans des boîtes de Pétri. Des témoins, contenant le milieu de culture et la solution d’agar à 0,2
% seule, sont également préparés. L’ensemencement se fait par dépôt de fragments de 0,5
cm², prélevés à partir de la périphérie d’un tapis mycélien et provenant d’une culture de 7 jour
( j ) dans milieu Sabouraud. L’incubation se fait à l’obscurité pendant 7 j à 25 °C (figure10)
(El Ajjouri et al , 2009).

Les résultats sont exprimés sous forme d’un pourcentage d’inhibition calculer selon la
formule suivante (Bouzidi et al.,2019)
(D Tm− DI) x 100
Le % d′inhibition = .
DTm

D Tm= diamètre de témoin DI= diamètre d’inhibition

13
 Chapitre I : matériels et méthodes

Préparation des Huile essentiel

concentration HEp/HEnb

1500µl 1000µl 750µl 500µl 250µl

10ml de gélose
molle à 0,2 %

150µl/ml 100µl/ml 75µl/ml 50µl/m 25µl/ml Tm

Aprés l’agitation

1,5 ml

agitation

13,5 ml de SAB à 45 C

C1 = 15µl/ml
150µl/ml

verser dans des

boîtes de Pétri
L’incubation à
25 C pendant 7 j

dépôt de fragments
de 0,5 cm²

Figure 10 : Schéma représentatif de la CMI F (concentration minimale inhibitrice fongique)

14
 Chapitre I : matériels et méthodes

I.5.2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice bactérienne CMI B

Afin de mieux évaluer cette activité une étude plus poussée a été menée par la
détermination des concentrations minimales inhibitrices bactérienne (CMIB) des huiles
essentielle de clou de girofle (poudre/non broyé) vis-à-vis la souche bactérienne. Nous avons
utilisé la méthode de diffusion en milieu solide (MH) qui a été ensemencé par l’inoculum
microbien à 0,5 Mac Farland .
Des dilutions sont préparées au 15µl/ml, 10µl/ml, 7,5 µl/ml, 5 µl/ml et 2,5 µl/ml dans
une solution de Diméthylsulfoxyde (DMSO). De ce fait, chacun des disques de papier
Wattman stérile N ͦ 3 et de diamètre 06 mm est imprégné par 20 μl de chaque concentration et
placé à la surface du milieu dans la boîte de Pétri en présence des disques imbibés par une
solution DMSO (témoins négatifs) et des disques gentamicine commercialisée (à10µg/
disque) comme témoins positifs. Les boîtes ont été ensuite incubées à 37°C pendant 24 h. La
mesure des diamètres des zones d’inhibition (mm) entourant les disques contenant les
concentrations à tester est effectuée à l’aide d’une règle. La CMI est définie comme étant la
plus faible concentration capable d’inhiber toute croissance microbienne visible à l’œil nu
(figure 11), ( Oke et al., 2009).

15
 Chapitre I : matériels et méthodes

Huile essentiel
Préparation des
HEp /HEnb
concentration

30µl 20µl 15µl 10µl

05µl

02ml de DMSO

15µl/ml 10µl/ml 7,5µl/ml 5µl/m 2,5µl/ml

Aprés l’agitation

Figure 11 : Détermination de la CMI B concentration minimale inhibitrice bactérienne

(Photo personnelle).

I.5.3. Mise en évidence du pouvoir antifongique volatile

Le pouvoir antifongique des huiles essentielles a été évalué par la méthode de micro-
atmosphère. Dans cette technique, une boîte de Pétri (90 mm) contenant 25 ml de milieu
gélosé PDA est d’abord ensemencée par un fragment de diamètre de 5 mm prélevé à la

16
 Chapitre I : matériels et méthodes
périphérie d'une culture fongique dans le milieu PDA âgée de sept jours. Puis, des disques de
papier Wattman imbibés d’une quantité de (20μl) de chaque concentration est déposés au
centre du couvercle de la boîte de Pétri. La culture est ensuite incubée à l'obscurité, couvercle
en bas, pendant sept jours à 25 °C. Chaque essai est répété 02 fois. Un témoin, dépourvu
d'huile essentielle, est préparé dans les mêmes conditions avec un disque de papier imprégné
d'eau distillée (figure 12). (Hmiriª et al., 2011).

Les résultats sont exprimés sous forme d’un pourcentage d’inhibition calculer selon la
formule suivante.(Bouzidi et al.,2019).

(D Tm− DI) x 100

Le % d′inhibition = .
DTm

D Tm= diamètre de témoin DI= diamètre d’inhibition

Figure 12 : L’activité antifongique par la méthode micro- atmosphère (photo personnelle).

17
 Chapitre II
Résultats et Discussions
 Chapitre II : Résultats et Discussions

Chapitre II : Résultats et Discussion

II.1. Résultats et analyse physiques des extraits
Le nombre d’extraits obtenus après déférents types d’extraction était de huit : deux
huiles essentielles (HEp et HEnb), deux distillats (Disp et Disnb), deux macérâts à chaud
(Mchp et Mchnb) et deux macérâts à froid (Mfp et Mfnb). Les extraits de clou de girofle
broyé, poudre (CGp) avaient un faible rendement (Disp = 62%, Mchp= 65% et Mfp= 70%)
par rapport aux extraits de clou de girofle non broyé (CGnb) : (Disnb = 64%, Mchnb = 70% et
Mfnb= 85%). Par contre, le CGp avait un grand rendement en HE de (5,06 %) par rapport
aux CGnb qui était de (4,76 %), (voir tableau 01).
On a observé aussi que la couleur des extraits de macération était brune (Mchp,
Mchnb, Mfp et Mfnb) tandis que les couleurs des distillats étaient déférentes : transparente
pour Disp et blanche "trouble" pour Disnb. Nous avons obtenu une HEp de couleur jaune
clair, et une HEnb de couleur jaune (figure 13).
Tous les extraits ont un goût âcre et épicée, très fort surtout chez les HEs, mais ce
goût est moins fort chez les Dis et faible chez les extraits de macération. Même remarque
pour l’odeur, elle est très forte chez les HEs, forte chez les Dis et faible dans les extraits de
macération. (tableau 01).
Tableau 01 : Caractéristique des extraits :
Clou de girofle non Broyé Clou de girofle Broyé "poudre "
HEnb Disnb Mchnb Mfnb HEp Disp Mchp Mfp
Quantité % 4,76% 64% 70% 85% 5,06% 53% 65% 70%
couleur Jaune Blanche brune brune Jaune claire transparent brune brune
Odeurs Très fort Faible Très Forte fort faible
Fort
Gout Très épicée Faible Très épicée épicée Faible
épicée

HEp : huile essentiel poudre, HEnb : huile essentiel non broyé, Mchp : macérât a chaud poudre, Mchnb : macérât
a chaud non broyé, Mfrp : macérât a froid poudre ; Mfrnb : macérât a froid non broyé, Disp : distillat poudre et
Disnb : distillat non broyé.

18
 Chapitre II : Résultats et Discussions

Extrait de macération Distillat HEp HEnb

Figure 13 : les différents extraits du clou de girofle (photo personnelle).

Les résultats obtenus de notre expérimentation ont montré que les échantillons broyés
présentaient un rendement d'extraction d’HE de 5,06 %. Alors que les bourgeons de girofle
non broyés présentaient un rendement moins, environ 4,76 %. Ces résultats sont en accord
avec la norme minimale d’AFNOR qui varie de 5% à 8%. Ces résultats ne coïncident pas
avec ceux des travaux réalisés par d’autres auteurs comme Ben hassine et al., (2021), qui a
trouvé que les bourgeons de girofle non broyés ont un rendement d'extraction d'HE de 7,1 ±
0,8% et les bourgeons de girofle broyés ont présenté un rendement d'extraction plus élevé de
14 , 3 ± 0 , 6 %. De même, Kapadiya et Desai (2017). Ben hassine et al., (2010). ont trouvé
un rendement d'extraction égal à 11,35 % et une granulométrie du clou de girofle était
d'environ 565 microns pendant 45 minutes (temps d'extraction total) .

Cette différence de rendement est probablement due au niveau de la manipulation à

une perte d'huile essentielle dans la phase aqueuse du distillat. En effet, durant l’étape de
récupération de l’HE à partir de l’hydro-distillation, nous avons remarqué la présence de
gouttelettes qui restent dissoutes dans l’eau et que nous n’avons pas pu récupérer à cause de la
difficulté de leur séparation qui nécessite l’utilisation des solvants organiques spécifiques. En
plus, la simplicité du dispositif d'hydro-distillation utilisé, lors des différentes étapes
d’extraction, divers facteurs ont pu influencer les résultats obtenus et des pertes ont été
observées dans les tuyaux servant à transporter la vapeur ce qui n’a pas permis de recueillir le
maximum d’HE. Nous pensons que d’autres facteurs peuvent influencer sur le taux du
rendement comme la qualité de l’échantillon choisie, la durée et les conditions de stockage…

19
 Chapitre II : Résultats et Discussions
Les données actuelles ont montré l'influence de la méthode de broyage sur le
rendement d'extraction de l'HE. En effet, cette technique est plus pratique en agrandissant la
surface de contact entre le milieu solide et l'eau bouillie (Johner et al., 2018). Donc la
diminution de la taille des particules est liée à l'augmentation du rendement d'extraction des
huiles essentielles. De plus, le broyage améliore la vitesse d'extraction et le rendement
d'hydro-distillation. Mais, un broyage extrême peut perturber la circulation de la vapeur, et
donc ralentir la vitesse d’extraction (Ben Hassine et al., 2010).

Selon (Boukhatem et al., 2019), quel que soit le procédé utilisé, l’extrait final
correspond à une concentration des composés initialement présents dans la matière première.
De plus, au niveau biologique les méthodes de production tout comme l’origine
géographique, le climat, le sol, la période de récolte ou bien encore les pratiques
agriculturales, peuvent avoir une influence directe sur le rendement et la composition
chimique de l’huile essentielle ( Boukhatem et al., 2019).

II.1.1 Les résultats de la mesure de pH

Après avoir mesurer le pH de l'huile essentielle obtenue, que ce soit à partir du clous
de girofle broyé ou non, la valeur était comprise entre 5 et 6, ce qui signifie que l'huile
essentielle est acide en raison de sa composition chimique.

Figure 14 : Les résultats de la mesure de pH (photo personnelle).

Les résultats consignés notre pH de 5 à 6. C’est un pH légèrement acide; ceci est dû à

la composition chimique des HE de Syzgium aromaticum qui se considère comme donneur
des H+ .ce qui lui donne la propriété d’être un bon conservateur.

II.2 Résultats de l’isolement de la flore fongique de la tomate

II.2 .1 caractéristiques des souches isolées :
L’isolement a permis d’obtenir 8 souches fongiques pures. Les caractéristiques
macroscopiques et microscopiques ont été décrites comme suit :

20
 Chapitre II : Résultats et Discussions
Souche 01 : Les colonies présentent une couleur blanche puis rapidement noirâtre et
une texture granuleuse homogène (figure 15. A1) et une couleur jaune pâle au revers de la
boite (figure 15. A2). Les conidiophores sont dressés, simples et incolores ou bruns pâle
(figure 15. B1). Ils ont une paroi épaisse et lisse avec des vésicules gonflées globuleuses
portant des phialides toute autour de la surface en sorte de goupillon (figure 15. B1).

A1 (recto) A2 (revers de la boite) B1 (x40) B2

Figure 15: Caractères morphologiques de souche 01 (A1, A2) colonie fongiques

B1 Conidiphores (× 40) et B2 photo de référence (Tomé et Gilberto, 2015).

Souche 02 : Les colonies ont un aspect poudreux, plates et au pourtour finement

frangé ; la surface de la boîte est entièrement recouverte de mycélium blanc (figure 16 A1 et
A2). Arthrospores (x40) (arthroconidies) issues de la fragmentation de l’hyphe transparente à
paroi épaisse rectangulaire puis s’arrondissant blanc (figure 16 B1).

A1 (recto ) A2 (revers de la boite) B1 (x40) B2

Figure 16 : Caractères morphologiques de la souche 02 (A1, A2) colonie fongiques, B1

Arthrospore (x 40) et B2 photo de référence (Tomé et Gilberto 2015).
Souche 03 : La surface de la culture est de couleur jaune verdâtre, souvent avec des
tâches jaunes avec une texture veloutée à poudreuses (figure 17, A1). Couleur rosée du revers
de la boite (figure 17. A2) Les hyphes sont cloisonnés et les conidiophores sont longs dressés
(figure 17. B1). Les phialides sont formés sur la majeure partie des vésicules sphériques
rayonnés (figure 17, B2).

21
 Chapitre II : Résultats et Discussions

A1 (recto ) A2 (revers de la boite) B1 (x40) B2

Figure 17: Caractères morphologiques de souche 03, (A1, A2) colonie fongiques et B1
Conidiophores (× 40) et B2 photo de référence (Tomé et Gilberto, 2015).

Souche 04 : la colonie apparaît de couleur blanche, crème, (figure 18. A1) Le revers
de la boite est de couleur pâle (figure 18, A2). Les colonies ressemblent à des levures,
constituées de cellules unicellulaires bourgeonnantes, les hyphes se décomposant en
arthrospores individuelles (figure 18, B1).

A1 (recto) A2 (revers de la boite) B1 (x40) B2

Figure 18 : Caractères morphologiques de souche 04, A1et A2 colonie fongiques : B1

arthroconidie (x 40) et B2 photo de référence (Yuri ,2017).

Souche 05 : Les colonies cotonneuses à granuleuses. La coloration est blanche à jaune

pâle avec un revers (figure 19 A1et A2). Des hyphes cloisonnés hyalins caractéristiques
avec des arthroconidies unicellulaires à parois lisses et des hyphes irrégulièrement
ramifiés, (figure 19, B1).

22
 Chapitre II : Résultats et Discussions

A1 (recto ) A2 (revers de la boite) B1 (x40) B2

Figure 19 : Caractères morphologiques de souche 05 (A1, A2) colonie fongiques, B1

Arthrospor (x40) et B2 photo de référence (Tomé et Gilberto, 2015).

Souche 06 : Sont des champignons filamenteux, la colonie de cette souche développe

rapidement une couleur vert bleuâtre (la couleur des phialides) d’aspect très poudreux (figure
20. A1). Revers de la boite jaune (figure 20. A2). Les conidiophores portant des branches
appelées métules sur lesquelles s’insèrent les phialides (figure 20, B2). Ces derniers portent
des chaînes de conidies sphériques unicellulaire l'ensemble de la structure forme l'aspect
caractéristique aux pénicilles «pinceau» (figure 20, B2).

Souche 07 : champignons filamenteux, la colonie couleur brun avec un mycélien

airain (figure 20, C1et C2).

A1 (recto ) A2 (revers de la boite) B1 (x40) B2

C1 C2
Figure 20 : :Caractères morphologiques de souche 06 et 07, A1, A2, C1 et C2 colonie
fongiques : B1 Conidiophores ( ×40) et B2 photo de référence (Tomé et Gilberto, 2015).
23
 Chapitre II : Résultats et Discussions

Souche 08 : Il s’agit d’une souche bactérienne B1 qui forme de petites colonies beiges
et bombées avec un centre jaune sur milieu PCA. Sous microscope, elle présente une forme de
bacille et une couleur rose : Gram négatif (Après coloration de Gram) (figure 21).

Figure 21 : Caractères morphologiques de souche 08 Après coloration de Gram.(X40)

L’identification a été faite à partir des caractères culturaux (identification

macroscopique) et morphologiques (identification microscopique). Ces caractéristiques ont
permis d’identifier certains genres fongiques en s’appuyant par Tomé et Gilberto (2015). Ce
type d’identification fondé sur l’étude morphologique de mycélium et des spores a permis
d’identifier les souches fongiques suivantes

Souche 01 et 03 : Aspergillus sp. Souche 02 : Geotrichum sp. Souche 04 : Aureobasidium sp.

Souche 05 : Arthrographis sp. Souche 06 et 07 : Penicillium sp.
En effet, une fois cueillies, les tomates sont sujettes à plusieurs infections et altérations
fongiques qui causent de grandes pertes économiques en empêchant leur conservation plus de
quelques jours. Parmi les moisissures les plus rencontrées dans l’altération des tomates
fraîches, on peut citer les espèces Aspergillus sp et Penicillium sp responsables de lésions
molles, humides et sombres, Geotrichum sp, ce champignon levuriforme est associé à des
pourritures liquides, Fusaruim sp et Aureobasidium sp. agent de détérioration des fruites
surtouts pendant le stockage et le transport Arthrographis sp. Alternaria sp, Botrytis sp
connu pour ses taches fantômes. (Blancard et al., 2009).

24
 Chapitre II : Résultats et Discussions

II.3 Mise en évidence du l’activité antimicrobienne

II.3.1. Résultat de l’activité antifongique
L'activité antifongique des extraits a été évaluée par l’apparition d’un zone
d’inhibition de la croissance autour des disques contenant les extraits testés vis-à-vis des
souches isolées à partir des fruits de tomates : Aspergillus sp, Geotrichum sp, Aureobasidium
sp sp, l’Arthrographis sp et Penicilluim sp, sur milieu de culture (Sabouraud), (figure : 22).
La lecture a été faite par la mesure des diamètres des zones d’inhibition (mm). Ces diamètres
montrent le degré de sensibilité des souches en se basant sur les normes qui suit : Ø < 10 mm,
non sensible ; 10 ≤ Ø ≤ 15 mm, sensible ; 15 ≤ Ø ≤ 20 mm, très sensible et Ø ≥ 20 mm,
extrêmement sensible (Razzouk et al., 2022).

D’après le tableau ci – dessous, Les résultats obtenus ont montré que les extraits de
clou de girofle broyé, Mchp, Mfrp et Distp, évalués avaient une action inhibitrice moyenne
sur la croissance des isolats testées avec des zones d’inhibition allant de 8 à 28 mm. Tandis
que, la souche Geotrichum sp était la plus sensibles aux ces trois extraits.
L’activité antifongique de l’HEp et HEnb était très satisfaisante contre les souches
testées, avec une moyenne égale à : 36,19 ± 9,32mm (HEp) et 37,728±6,74 mm (Henb). À
l’échelle des espèces, Penicillium sp apparait le plus sensible 50±10 mm et 46.66 ± 5.77mm
aux huiles HEp et Henb, respectivement. Alors que, Arthrographis sp est le plus ou moins
sensible (HEp : 27,33± 2,30 mm) et (Henb : 27,66 ± 4,72 mm). Par contre, les extraits
restants (Mchnb et Mfrnb) n’avaient aucun effet sur toutes les souches (Tableau 02).
Tableau 2 : Activité antifongique des extraits, zones d’inhibition (mm)
Extraits Huiles essentiels Macérât chaud Macérât froid Distillat

Souches HEp Henb MChp MChnb MFrp MFrnb DISp DISnb

Aspergillus sp 33,33 ± 5,77 37,67± 4,04 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 8 ,5±0,70

Geotrichum sp 41 ± 8,54 38,33± 2,88 25 ± 7,07 0±0 09± 1,41 0±0 28 ±01 0±0

Aureobasidium sp 29,33± 1,15 38,33 ± 2,88 15 ± 7,07 0±0 0±0 0±0 08 ±00 0±0

Arthrographis sp 27,33 ± 2,30 27,66 ± 4,72 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

Penicillium sp 50 ± 10 46,66 ±5,77 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0

Moyenne 36,19 ± 9,32 37,73 ± 6,74 8 ± 11,51 0±0 1,8 ± 4,02 0±0 7,2± 12,13 1,7 ± 3,8

(moyenne± écart-type), HEp : huile essentiel poudre, HEnb : huile essentiel non broyé,
Mchp : macérât a chaud poudre, Mchnb : macérât a chaud non broyé, Mfrp : macérât a froid
poudre ; Mfrnb : macérât a froid non broyé, Disp : distillat poudre et Disnb : distillat non
broyé.
25
 Chapitre II : Résultats et Discussions

HEP HEnb Tm

Aspergillus sp
Geotrichum sp
Aureobasidium sp
Arthrographis sp
Penicillium sp

Figure 22 : L’Activité antifongique des extraits sur les champignons. HEp : huile essentiel
poudre, HEnb : huile essentiel non broyé et Tm : l’eau physiologie.

26
 Chapitre II : Résultats et Discussions
Les huiles essentielles extraites et utilisées dans notre expérience ont montré un
pouvoir antifongique très élevé sur toutes les espèces fongiques testées. Le diamètre des zones
d’inhibition allant de 27,33 ± 2,30 à 50 ± 10 mm. Nos résultats sont supérieur à ceux rapporté
par Rana, et al., (2011). dans une étude de criblage préliminaire indiquent clairement que
l'huile essentielle de clou de girofle est hautement antifongique vis-à-vis de toutes les espèces
fongiques testées. Une variation considérable de la taille des zones d'inhibition allant de 12 à
22 mm a été observée parmi les isolats fongiques en fonction de leur sensibilité à l'huile
essentielle de clou de girofle. L'ordre de sensibilité décroissant était : Mucor sp. 22mm > M.
gypseum 18mm > F. monoliforme 15mm > T. rubrum 15mm > Aspergillus sp.12mm.

Razzouk et al., (2022). ont monté que A. niger a la sensibilité la plus élevée aux huile
essentiel de clou de girofle (diamètre d'inhibition de 44,00 mm) par rapport aux levures
[Link] 14,00 mm et [Link] 24 ,67mm.

Ceci peut s’expliquer par la forte teneur des HEs en principe actif qui peut être
probablement l’un des composés aromatiques volatils. En effet, l’HE du clou de girofle
possède une composition chimique riche en Eugénol qui présente le constituant principal avec
un pourcentage d’environ 83,02 % et de 85,3%, (Yage et al., 2011) et (Pento et al., 2009)
respectivement.

L’activité antifongique des distillats (hydrolats) a été moins forte si on la compare

avec celle des HE. Cela peut s’expliquer par leur faible teneur en composants actifs. Plusieurs
travaux confirment nos résultats et indiquent que pour que l’hydrolat soit plus efficace, on
doit l’utiliser en forte concentration. Selon les travaux de Hussien et al., ( 2011). Bien que la
composition chimique des hydrolats n'ait pas été bien élucidée, on sait qu'ils contiennent des
composants solubles dans l'eau et des gouttelettes micronisées de molécules d'huile essentielle
(Suzanne, 2001). dissoutes dans la solution d'hydrolat. Cela indique que la composition
chimique des hydrolats d'épices diffère de celle des huiles essentielles pures. Peu de rapports
sur l'analyse des composants volatils dans les hydrolats et les huiles essentielles pures
respectives ont révélé la présence d'une concentration extrêmement faible du principal
composant volatil dans les hydrolats (Inouye et al., 2008). Cette différence pourrait suggérer
que l'intensité de l'activité antimicrobienne des hydrolats n'est pas toujours la même que celle
de l'huile essentielle.

27
 Chapitre II : Résultats et Discussions

II.3.2. Résultats de l’activité antibactérienne

L’activité antibactérienne est effectuée in vitro sur un milieu gélosé solide Muller
Hinton par la méthode de diffusion sur disques, qui permet de mesurer l’efficacité des extraits
à inhiber la croissance microbienne (figure : 24). Le diamètre de la zone d'inhibition a été
mesuré (mm) et classé selon les normes comme suit : Ø < 08 mm : non sensible ; O9 ≤ Ø ≤ 14
mm : sensible ; 15 ≤ Ø ≤ 19 mm : très sensible et Ø ≥ 20 mm : extrêmement sensible
(Razzouk et al., 2022).

Les résultats de ce teste sont présentés dans l’histogramme ci - dessous (figure 23). La
plupart des extraits ont montré une activité inhibitrice vis-à-vis la croissance de la souche
bactérienne isolée B1, avec des diamètres de zones d'inhibition allant de 8,00 mm à 20 mm.
En effet, les huiles du clou de girofle (HEp et HEnb) ont montré une activité
antimicrobienne très satisfaisante et ont le même pouvoir inhibiteur de gentamicine (Témoin
positif) avec un diamètre de 20 mm. Aussi, les extraits (Mchp, Mchnb et Mfrp) ont été plus
ou moins efficaces avec des diamètres très proches, 10mm, 08mm et 09mm successivement.
Tandis que, les extraits (Mfrnb, Disp et Disnb) n'ont pas montré d'effet inhibiteur sur la B1.

L'activité antibactérienne
Ø( mm) zone d'inhibition

20
15
10
5 Extraits

0 Tm +Gen

les extraits , agents antibactériens

Figure 23 : Histogramme de l’activité antibactérienne des extraits. HEp : huile essentiel

poudre, HEnb : huile essentiel non broyé, Mchp : macérât a chaud poudre, Mchnb : macérât a
chaud non broyé, Mfrp : macérât a froid poudre ; Mfrnb : macérât a froid non broyé, Disp :
distillat poudre et Disnb : distillat non broyé, et Tm+ : antibiotique Gentamicine.

28
 Chapitre II : Résultats et Discussions

Les extraits Tm

Figure 24 : Résultats de l’activité antibactérienne des extraits vis-à-vis la bactérie B1.

Après analyse de l’histogramme ci-dessus, les résultats montrent que nos extraits
agissent comme un agent antimicrobien avec de différentes efficacités vis-à-vis la souche B1
à Gram - exprimées par différents diamètres d’inhibition allant de 0 à 20 mm. Ce qui signifie
que cette dernière est sensible à quelques extraits du clou de girofle. Mathieu et Jean-Philippe
(2013), confirment cette sensibilité bactérienne dans leurs travaux sur l’extrait de Clou de
girofle contre 06 souches différentes d’E. coli où les zones d’inhibition égale de 16,8 ± 0,02
mm. Hiwandika et al., (2021), ont montré que le clou de girofle présente une capacité
d'empêcher la croissance de B. cereus, S. aureus, P. aeruginosa et E. coli avec des diamètres
d’inhibition égales de 14,6 ± 0,37 mm, 15,8 ± 0,41 mm, 13,4 ± 0,11 mm et 11,9 ± 0,34 mm ,
respectivement.

Nos résultats montrent que les HE des bourgeons de girofle moulus et non moulus ont
un effet antibactérien significatif. Ce qui coïncide avec les travaux de Ben Hassine et al.,
( 2021). qui démontrent que l'HE des bourgeons de clou de girofle était très active contre les
bactéries Gram + et Gram- avec un diamètre de zone d’inhibition compris entre 17, 2 ± 4, 5
et 35, 5 ± 2, 6 mm. Ponce et al.,(2003), ont montré dans leurs étude du sensibilité de la
microflore native de la bette à carde à 12 huiles essentielles différentes, déterminée par la
méthode de diffusion sur gélose, a montré que le clou de girofle produisait un halo

29
 Chapitre II : Résultats et Discussions
d'inhibition de 22,2 ± 2 mm de diamètre, ce qui en faisait de cette huile avec l’effet inhibiteur
le plus élevé en le comparant avec les huiles de l'eucalyptus, à l'arbre à thé, au romarin, au
citron et à la menthe qui ont montré une sensibilité également appréciable, avec des zones
d'inhibition de diamètres respectifs de 16 ± 1, 17 ± 2, 15 + 1, 17 ± 1 et 17 ± 1 mm. (Deans, et
al ., 1995), L'huile essentielle de clou de girofle Syzygium aromaticum L. ont montré une
activité antimicrobienne significative contre une collection de 25 genres différents de
bactéries testées et 20 isolats différents de Listeria monocytogenes. ce qui signifie qu’elle a un
large spectre contre les bactéries.

L’activité des autres extraits (Macérats) était moins efficace que celle de l’HE à cause
de leur faible teneur en composants actifs qui restent emprisonnés peut être dans les
bourgeons du clou de girofle ou évaporés sous l’effet de la chaleur. L’absence totale de
l’activité antibactérienne chez les distillats vis - à -vis la souche bactérienne testée B1 peut
s’expliquer de la même manière que celle des souches fongiques. Les actions
antibactériennes des hydrolats, sont souvent observées à de fortes concentrations. Hussien et
al. (2011). montré que l’hydrolat d’Elettaria cardamomum (cardamome) utilisé à 15% (v/v)
pouvait inhiber la croissance de Salmonella typhi, S. aureus et E. coli. Néanmoins, cette
concentration n’inhibe la croissance de P. aeruginosa que de 10%. Ces informations
montrent, à ce jour, que l’action antimicrobienne des hydrolats reste limitée du fait de la forte
concentration de produit nécessaire à l’obtention de l’effet désiré. Les résultats de notre étude
ressemblaient à ceux référencés où les zones d'inhibition étaient généralement satisfaisantes
surtout pour l’HE.

II.4. les résultats de la concentration minimale inhibitrice

II.4.1. Résultat de la concentration minimal inhibitrice fongiques CMI F
La CMI relative aux extraits des HEs appliquées comme agents antifongiques sur les
souches fongiques testées : Aspergillus sp, Geotrichum sp, Aureobasidium sp,
l’Arthrographis sp et Penicillium sp par la méthode de contact directe sur le milieu de
culture (SDA) a été évaluée en mesurant le pourcentage d'inhibition de la croissance de ces
moisissures sous l’effet de différentes concentrations d’HE du clou de girofle (broyé / non
broyé) par rapport à la croissance du témoin. Après sept jours d’incubation à 25°c, nous
avons obtenu les résultats qui sont représentées par l’histogramme ci – dessous (figure:25)

Nous avons observé qu’aucunes des souches ensemencées ne s’est développée dans
les boîtes. Tandis que, dans les témoins, en absence d’agent antifongique, les souches ont
montré une croissance satisfaisante avec un diamètre de développement allant de 65 à 80 mm,

30
 Chapitre II : Résultats et Discussions
(figure : 26). Ce qui signifie que toutes les concentrations des huiles essentielles (HEp, HEnb)
appliquées ont inhibé complètement la croissance mycélienne des cinq souches étudiées.
Donc, on peut constater que la CMI F est inferieur à 2,5 µl/ml.

100%
% d'inhibition

90% Aspergillus sp
80% Geotrichum sp
70%
Aureobasidium sp
60%
50% Arthrographis sp
40% Penicillium sp
30%
20%
10%
0%
15µl/ml 10 µl/ml 7.5 µl/ml 05 µl/ml 2.5 µl/ml TM
concentration de HEp

100%
90% Aspergillus sp
% d'inhibition

80% Geotrichum sp
70%
Aureobasidium sp
60%
Arthrographis sp
50%
40% Penicillium sp
30%
20%
10%
0%
15µl/ml 10 µl/ml 7.5 µl/ml 05 µl/ml 2.5 µl/ml TM
concentration de HEnb

Figure 25 : Histogramme de la concentration minimal inhibitrice des fongique CMI F de HEs

31
 Chapitre II : Résultats et Discussions

Aspergillus sp

Geotrichum sp

Aureobasidium
sp

32
 Chapitre II : Résultats et Discussions

Arthrographis
sp

Penicillium sp

Figure 26: Résultats de la concentration minimale inhibitrice fongique CMI F.

Les résultats de l’évaluation de la CMI F de notre étude in vitro expriment une très
forte activité antifongique des deux HEs vis-à-vis les cinq souches testées avec un
pourcentage d’inhibition de 100% et à des concentrations très minimes allant de 15 µl/ml
jusqu’ à 2,5 µl/ml. Ces résultats prouvent que l’HE peut agir à des concentrations inferieures
à 2,5 µl/ml et confirment d’autres travaux antérieurs sur le pouvoir antifongiques comme
ceux de Pinto et al., (2009), qui ont trouvé une CMI F de l’huile du clou de girofle
appliquée sur l’Aspergillus sp. de 1,25 µl/ml et ceux de Uwineza et al.,(2018). avec une
CMI F de 0,312 µl/mL sur le Fusarium culmorum. Et ceux de Deans, et al., (1995) où L'huile
a été testée également contre trois souches fongiques : un phytopathogène, un type d'altération
et une souche mycotoxigène. Cela a entraîné des niveaux élevés d'inhibition de la croissance
aux deux concentrations de 1 et 10 μl ml -1 de milieu de croissance.

33
 Chapitre II : Résultats et Discussions
Par contre, la valeur de CMI F de notre expérience était inferieur à celle trouvée par
Yage et al., (2011), qui ont révélé que l'huile de girofle possédait des activités antifongiques
très fortes contre A. flavus et P. citrinum avec une CMI F de 25 µL/mL.

Ces résultats ont indiqué que l'huile de clou de girofle a montré un large spectre
d'activité contre une variété de champignons phytopathogènes. Elle s'est avérée plus active et
les valeurs de CMI F trouvées étaient similaires pour toutes les souches isolées à partir de la
tomate. Donc, grâce à ce bon potentiel, on peut l’utiliser comme un agent antifongique naturel
pour les applications dans la lutte contre les phytopathogènes présentes dans les fruits de
tomates comme le prouve les études de Yage et al., (2011). in vivo, les traitements à l'huile de
clou de girofle ont considérablement réduit la décomposition fongique, et cette huile à une
concentration de 3,0 % a montré un contrôle complet d'A. flavus et de P. citrinum dans les
fruits inoculés par blessure.

De nombreuses études affirment que les propriétés fongistatiques et fongicides de

l'huile sont probablement associées à sa forte teneur en eugénol. Pinto et al. (2009) ont étudié
l'activité antifongique de l'huile essentielle de clou de girofle, obtenue à partir de
[Link]. Ils ont déterminé la CMI F pour évaluer l'activité antifongique de l'huile de
clou de girofle et de son composant principal, l'eugénol, contre les souches cliniques Candida,
Aspergillus et dermatophytes. L'huile essentielle et l'eugénol ont montré une activité
inhibitrice contre toutes les souches testées.

II.4.2. Résultats de la concentration minimale inhibitrice bactérienne CMI B

Les deux huiles essentielles de clou de girofle broyé et non broyé à des concentrations
décroissantes par la méthode de diffusion sur le milieu PCA n’ont présenté un effet inhibiteur
sur la souche bactérienne testée B1 à Gram- qu’avec la concentration de 15µl/ml. L’action
inhibitrice se traduit par l’apparition d’une zone autour du disque de papier Watman
imprégnée d’extrait d’HEs avec de petits diamètres d’inhibition de 08 mm et 10 mm comme
le montre la courbe (figure : 27 et 28).

34
 Chapitre II : Résultats et Discussions

diamètre d'inhibition (mm)

10

HEp
5
HEnb

0
2.5 5 7 10 15

Concentration d’HEs (µl/ml)

Figure 27 : Résultat de la concentration minimale inhibitrice bactérienne de B1 CMI B.

HEp HEnb Tm + et TM-

Figure 28: résultat de la concentration minimale inhibitrice bactérienne de B1 CMIB.

À partir des résultats enregistrés, avec la concentration de 15µl/ml, les deux extraits
de l’huile ont agit plus ou moins positivement en inhibant la croissance de la souche
bactérienne B1, mais le pouvoir antimicrobien le plus élevé a été observé chez l’huile non
broyée avec un diamètre de 10mm. Ce qui signifie que la CMI B est égale à15µl/ml. En effet,
dans une étude similaire in vitro, il a été démontré que les valeurs de CMI B de l'huile de clou
de girofle et de l'eugénol vis-à-vis de Bacillus cereus étaient de 25 et 15 μg/mL, Cette activité
pourrait être attribuée au composé majeur « eugénol >85% » (Ben Hassine et al., 2021). La
CMI B était plus grande que celle trouvée dans d’autres travaux. Kim et al,( 2015). ont
rapporté que la CMI B de l'HE de clou de girofle pour 10 souches de Salmonella enterica et
10 souches de Listeria. monocytogenes sont de 0,6 μg/mL à 2,5 μg/mL,

35
 Chapitre II : Résultats et Discussions
En comparant les résultats de la CMIB de la souche B1 de notre expérience avec celles
des souches testées dans les autres travaux précédents, On peut déduire que cette bactérie
s’est montrée moins sensible que les autres souches. Cette différence de sensibilité pourrait
être attribuée à la structure membranaire des bactéries à Gram-.

II.4.3. Résultat de test micro-atmosphère

L'objectif de l'étude présentée ici était d'acquérir des connaissances sur l'activité
antimicrobienne en phase vapeur des huiles essentielles sélectionnées et de leurs principaux
constituants potentiellement actifs contre une gamme de souches fongiques d'origine
alimentaire. Dans une première étape, les activités antimicrobiennes en phase vapeur de deux
huiles essentielles HEp et HEnb ont été évaluées contre les moisissures isolées (Aspergillus
sp, Penicillium sp, Aureobasidium sp, Geotrichum sp et Arthrographis sp) (figure 30).

Au fur et à mesure que la concentration en huile augmente, le taux d’inhibition de la

croissance des champignons s’élève comme le montrent l’ histogramme (figure 29). À la plus
faible concentration de 2,5 µl/ml, les deux huiles testées HEp et HEnb ont montré une
activité antifongique très faible à l’égard de toutes les souches qui varie entre 0% et 30,76%,
surtout pour le Penicillium sp avec un taux d’inhibition de 7,14% et 0% respectivement pour
les deux huiles. Alors que, la concentration 15 µl/ml de l’HEnb semblent être très efficaces
contre les différents isolats testés. Nous avons enregistré des pourcentages d’inhibitions
allant de 21,42 et 56,92 %, où Aureobasidium sp apparait le plus sensible. En revanche au
l’effet inhibiteur de la concentration 15µl/ml de HEp, Les pourcentage d’inhibions ont été
enregistré allant de 28,57 et 61,53%. Sur le plan des individus, Arthrographis sp. était le plus
sensible.

36
 Chapitre II : Résultats et Discussions

70.00%

60.00%

50.00%
% d'inhibition

Aspergillus sp
40.00%
Geotrichum sp
30.00% Aureobasidium sp
20.00% Arthrographis sp

10.00% Penicillium sp

0.00%
2.5 5 10 7.5 15 Tm
concentration de HEp µl/ml

60.00%
% d'inhibition

50.00%

40.00%
Aspergillus sp
30.00% Geotrichum sp
Aureobasidium sp
20.00%
Arthrographis sp
10.00% Penicillium sp

0.00%
2.5 5 7.5 10 15 Tm
concentration de HEnb µl/ml

Figure 29 : Histogrammes de l’activité antifongique par la micro-atmosphère de HEs.

37
 Chapitre II : Résultats et Discussions

Aspergillus sp Geotrichum sp

Aureobasidium sp Arthrographis sp

Penicillium sp

Figure 31 : Résultat de test micro-atmosphère.

38
 Chapitre II : Résultats et Discussions
Notre étude sur le pouvoir antifongique des huiles essentielles de clou de girofle
vis-à-vis des cinq champignons causant la pourriture des tomates par la méthode micro-
atmosphère révèle que l’activité de l’HEp était légèrement supérieure à celle de l’HEnb. Une
proportion directe entre l’inhibition de la croissance des souches et les concentrations des
deux huiles. En effet, une analyse antimicrobienne in situ utilisant du pain a montré que les
champignons filamenteux microscopiques du genre Penicillium étaient inhibés par les vapeurs
d’huile essentielle de clou de girofle à toutes les concentrations testées. (Kacániová et al.,
2021). Hmiri et al., (2011). Pour évaluer l'activité antifongique des huiles essentielles ont
choisis la méthode de micro-atmosphère décrite par Neri et al., (2006). En présence
d'eugénol, les champignons testés (Les moisissures A. alternata, B. cinerea et P. expansum)
ont manifesté une sensibilité relative ; B. cinerea a été inhibé à partir d'une concentration de
156 μl/l, alors que A. alternata et P. expansum ont résisté jusqu'à 300 μl/l. En effet, Neri et al.
(2006). et Amiri et al., (2008). ont également rapporté que l’eugénol peut exercer, en fonction
de sa concentration, une activité fongistatique ou fongicide sur B. cinerea et P. expansum. Les
travaux de He et al., (2007). et Chami (2005). ont montré l'activité antifongique in vitro et in
vivo de l'eugénol sur Candida albicans.

L’analyse des résultats obtenus dans les deux méthodes (contact direct et volatile)
montre qu’il y a une grande différence. Pour la première, il y avait une inhibition totale 100%
des souches testées à de faibles concentrations 2,5 µl /ml d’HE. Par contre, L’HE utilisée dans
la méthode de micro-atmosphère avait présenté un effet inhibiteur à une concentration de 15
µl /ml qui était moins efficace sur toutes les souches allant de 21,42% à 61,53%.

Donc, on peut dire qu’il y a des différences au niveau de la sensibilité des souches
fongiques vis-à-vis des huiles en comparaison avec la méthode de contact direct. Comme
l’explique les travaux de Bouzidi et al .,(2019), ces différences peuvent s’expliquer, au moins
en partie, par la différence de composition entre la phase liquide de l’HE utilisée dans la
méthode contact direct et la phase vapeur, mise en œuvre dans la technique de micro
atmosphère et d’autre part, par la concentration d’HE utilisée. Il serait probable que les
vapeurs des HEs sont moins efficaces par rapport au contact direct. L’activité antimicrobienne
des HEs est principalement fonction de leurs compositions chimiques, et en particulier de la
nature de leurs composés volatils majeurs. Elles agissent sur les moisissures en inhibant la
germination des spores, l’élongation du mycélium, la sporulation et la production des toxines.
(Mandras et al., 2016). Les différentes activités antifongiques en liquide et en vapeur phase
pourraient être dues aux caractéristiques des huiles essentielles telles que hydrophobicité et
volatilité élevées. En fait, lorsqu'il est ajouté à un support, l’huile essentielle se répartit plus
39
 Chapitre II : Résultats et Discussions
ou moins dans la phase aqueuse en fonction de son hydrophobicité relative. En phase liquide,
l'activité dépend de la diffusibilité et la solubilité des huiles essentielles dans le milieu en le
test de vapeur dépend de la volatilité. L’activité antimicrobienne des huiles essentielles et de
leurs composants est influencée par plusieurs facteurs, y compris chimiques compositions et
conditions expérimentales.
La composition des huile essentielle varie considérablement en raison de planter
différentes espèces et chémotypes, origine géographique, saison et procédure d'extraction. En
effet, l’HE de clou de girofle obtenu avec un rendement de 12,8% a été analysé par GC et
GC-MS, et les résultats ont présenté la composition chimique suivante. Au total, 22
composants de l’huile essentielle ont été identifiés, représentant 95,80% de la quantité totale.
L’eugénol (76,23%) s’est avéré être le composant principal de l’huile essentielle, suivi du
β-caryophyllène (11,54%), de l’oxyde de caryophyllène (4,29%) et de l’acétate d’eugénol
(1,76%). ( Xu et al., 2016).
Les activités antimicrobiennes des HEs sont fortement associées à la présence des
composés majeurs, à savoir le citral, le carvacrol, le thymol et l’eugénol qui appartiennent au
phénol montre une activité significative. Ces composés phénoliques agissent efficacement
comme perméabiliseur membranaires, ils sont responsables de maximiser l’activité
antimicrobienne à travers divers aspects, y compris l’altération de la perméabilité de la
membrane, les changements d’acides gras membranaires et l’inhibition de la force motrice des
protons (Bhavaniramya et al.,2019). Il existe certains mécanismes d'inhibition de l'eugénol et
de l'HE de clou de girofle pour empêcher la croissance de diverses bactéries, telles que
l'inhibition de la migration bactérienne, l'adhésion bactérienne, le métabolisme bactérien et
l'invasion bactérienne. Chez E. coli (O157 : H7), l'eugénol inhibe significativement
l'expression des gènes liés à la migration, des gènes de virulence et des gènes d'adhésion (Hu
et al., 2018). De plus, l'eugénol peut inhiber le quorum sensing de [Link], et cette
fonction est associée à l'inhibition de la production de facteurs de virulence en inhibant le
biofilm (Zheng et al., 2007).
D’une autre part, pour les champignons, les analyses chromatographiques ont montré
que l’eugénol était le principal composé responsable de l’activité antifongique par la lyse des
spores et des micelles, la perturbation membranaire et de déformation des macromolécules.
(Devi et al., 2001). Des changements morphologiques dans les hyphes de T. mentagrophytes,
tels que des dommages à la paroi cellulaire, des modifications de la structure cellulaire
fongique au niveau de la membrane, l'expansion de son réticulum endoplasmique et les
membranes mitochondriales internes ont été partiellement détruites (Park et al., 2007).

40
Conclusion
 Conclusion

Conclusion
Les substances naturelles constituent de véritables usines chimiques dont il faut tirer le
maximum de profit. Le présent travail est porté sur l’étude des principes actifs des boutons
floraux de la fameuse épice de Syzygium aromaticum L. connue sous le nom de giroflier.
Différentes techniques d’extraction comme l’hydro distillation, la macération à chaud et à
froid appliquées sur les clous de girofle ont donné naissance à différents extraits : Huileux et
aqueux. Le clou de girofle broyé (poudre) a donné le meilleur rendement en huiles essentielles
par Hydro-distillation de l’ordre de (5,06%). La mise en évidence de leurs potentiels
antibactériens par un test de sensibilité effectué in vitro sur de nombreux types de micro-
organismes de source alimentaire (tomate) a montré que les huiles de clou de girofle et ses
composants volatiles expriment des effets inhibiteurs significatifs et à des concentrations très
minimes que ce soit à l’état liquide ou vapeur et avec plus d’efficacité en les comparant avec
les autres extraits. lorsque l'HE extrait des bourgeons de girofle broyés s’est montrée très
efficace surtout sur Penicillium sp, avec le plus grand diamètre de zone d’inhibition (±mm) La
technique de micro-atmosphère a révélé que l’effet inhibiteur le plus remarquable est donné
par la phase vapeur de l’HE de clou de girofle non broyé.

Donc, à partir de cette étude, on peut conclure que cette huile essentielle avec sa
principale composition volatile et efficace, l’eugénol, est le constituant principal responsable
des puissantes propriétés antimicrobiennes et qu’elles pourraient avoir une meilleure action in
vivo sur l’incidence de la détérioration ou pourriture des tomates. Par conséquent, Les
perspectives dégagées de cette étude sont multiples. Les études devraient être renforcées pour
promouvoir leurs effets antiseptiques et protecteurs, faire un fractionnement de ces huiles
pour savoir les molécules responsables de cette activité et leurs mécanismes d’action, élargir
la gamme des souches microbiennes et connaître les doses prescrites avec précision car leur
application en agriculture est une approche alternative qui permet de réduire l’utilisation des
produits synthétiques tout en minimisant le coût de la production et les impacts négatifs sur
l’environnement .

41
 Les références

Les références :

1. A J Vlietinck, D A et Vanden Berghe, (1991). Can ethnopharmacology contribute to

the development of antiviral drugs, 10.1016/0378-8741(91)90112-q
2. AFNOR Recueil des normes françaises ;( 1992) . Huiles Essentielles -Association
Française de Normalisation, 4ème édition, Paris.
3. AG Ponce a, R. Fritz b, C. del Valle b et SI Roura c (2003). Activité
antimicrobienne des huiles essentielles sur la microflore native de la bette à carde bio.
LWT - Science et technologie alimentaires Tome 36, N° 7, pages 679-684.
4. Amiri A., R. Dugas, A.L. Pichot et G. Bompeix, (2008). In vitro and in vivo activity
of eugenol oil (Eugenia caryophyllata) against four important postharvest apple
pathogens. Intern. J. Food Microbiol., 126, 13-19. France.
5. Ben Abdalla. R, Frikha D, Maalej S et Sassi S. (2019). Evaluation in vitro de
l’activite antibacterinne et antifongique de quatre especes algales marines. J.I. M.
Sfax,. N°31; P 38 – 44. Tunisie.
6. Bessadat, N., Simoneau, P., Benichou, S., Setti, B., Kihal, M., et Henni, D.E.
(2014). Morphological, physiological and pathogenic variability of small-spore
Alternaria sp. causing leaf blight of Solanaceous plants in Algeria. Afr J Microbiol
Res, 8, 3422-3434 Algeria.
7. Biyiti, L.F., Meko, D.J.L. et Zollo, P.H.A. (2004) . Recherche de l’activité
antibactérienne de quatre plantes médicinales Camerounaises. Pharmacologie et
Medecine Traditionelle en Afrique, 13, 11-20.
8. Boukhatem Mohamed Nadjib, Ferhat Amine et Kameli Abdelkrim, (2019).
Méthodes d’extraction et de distillation des huiles essentielles. Revue Agrobiologia 9
(2): 1653-1659. Algeria.
9. Bruce A McDonald et Celeste Linde, (2002). Pathogen population genetics,
evolutionary potential, and durable resistance. Annual Review of Phytopathology Vol.
40:349-379 doi:10.1146/[Link].40.120501.101443.
10. Chami F., (2005). Évaluation in vitro de l'action antifongique des huiles essentielles
d'origan et de girofle et de leurs composés majoritaires in vivo. Application dans la
prophylaxie et le traitement de la candidose vaginale sur des modèles de rat et de
souris immunodéprimés. Thèse de Doctorat, Faculté des Sciences Dhar El Mehraz,
Fès.

42
 Les références

11. D. Ben Hassine, H. Ben Ismail, C. Jribi, M. L. Khouja, et M. Abderrabba,

(2010).Chemical composition of some Tunisian Eucalyptus essential oils as obtained
by hydrodistillation using Clevenger type apparatus,” Biosciences, Biotechnology
Research Asia, vol. 7, no. 2, pp. 647–656.
12. Devi KP, Nisha SA, Sakthivel R et Pandian SK.( 2010). Eugenol (an essential oil of clove) acts
as an antibacterial agent against Salmonella typhi by disrupting the cellular membrane. J
Ethnopharmacol; 130(1):107–115.
13. Dominique Blancard, Henri Laterrot, Georges Marchoux et Thierry Candresse
(2009) . Les maladies de la tomate. Identifier, connaître, maîtriser. Maison d'édition
: Quæ Versailles France P : 409 -415.
14. Dorsaf Ben Hassine , Salma Kammoun El Euch, Rami Rahmani, Nessrine
Ghazouani, Rouguiata Kane, Manef Abderrabba et Jalloul Bouajila, ( 2021).
Clove Buds Essential Oil: The Impact of Grinding on the Chemical Composition and
Its Biological Activities Involved in Consumer’s Health Security, BioMed Research
International Hindawi Tunisia .Volume 2021, Article ID 9940591, 11 pages.
15. Dr. Rui Tomé et Dr. Gilberto (2015). Atlas micologia, Marques Centro Hospitalare
Universitário de Coimbra Patologia clinica - chuc .portugal.
16. Eugenia Pinto, Luı´s Vale-Silva, Carlos Cavaleiro et Lı´gia Salgueiro, (2009).
Antifungal activity of the clove essential oil from Syzygium aromaticum on Candida,
Aspergillus and dermatophyte species. Journal of Medical Microbiology, 58, 1454–
1462 Portugal.
17. FAO, ( 2021). L'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO).
18. Feyza Oke, Belma Aslim, Sahlan Ozturk et Senol Altundag, (2009). Essential oil
composition, antimicrobial and antioxidant activities of Satureja cuneifolia Ten. Food
Chemistry 112(4):874-879, DOI:10.1016/[Link].2008.06.061

19. Hakima Bouzidi, Zina Lakhlef, Zohra Hellal, et jamel Djenane. (2019). Le
conditionnement des fraises fraîches sous "micro-atmosphère" à base d’huiles
essentielles combinées : Effet durant le stockage . Revue Nature et Technologie, 11 (2)
(2019) : 35-50.
20. Hamidou Compaore, Hagrétou Sawadogo-lingani, Aly Savadogo, Dayéri Dianou
et Alfred S. Traore ,( 2016). Isolement et caractérisation morphologique de
moisissures productrices de substances antibactériennes à partir d’aliments locaux au
Burkina Faso Int. J. Biol. Chem. Sci. 10(1): p 198-210, Burkina Faso.
43
 Les références

21. Hanen Falleh, MariemBen Jemaa, MarcosA. Neves, Hiroko Isoda , Mitsutoshi Na
kajima, Riadh Ksouri (2021). Formulation, physicochemical characterization, and
anti- E. coli activity of food-grade nanoemulsions incorporating clove, cinnamon, and
lavender essential oils 129963.
22. Hee Youn Chee 1, Min Hee Lee, (2007). bAntifungal activity of clove essential oil
and its volatile vapour against dermatophytic fungi 10.4489/MYCO.2007.35.4.241.
23. Hu Q, Zhou M et Wei S (2018). Progress on the antimicrobial activity research of
clove oil and eugenol in the food antisepsis field. J Food Sci. 83(6): 1476–83.
24. Hussien, J., Teshale, C. et Mohammed, J. (2011). Assessment of the Antimicrobial
Effects of Some Ethiopian Aromatic Spice and Herb Hydrosols. Int. J. Pharmacol. 7,
635–640. doi : 10.3923/ijp.2011.635.640.
25. Ignacio Gutiérrez-Del-Río, Javier Fernández, Felipe Lombó , (2018). Plant
nutraceuticals as antimicrobial agents in food preservation: terpenoids, polyphenols
and thiols 10.1016/[Link].04.024.
26. Inder Singh Rana, Aarti Singh Rana et Ram Charan Rajak. (2011). Evaluation of
antifungal activity in essential oil of the syzygium aromaticum (L) by extraction,
purification and analyses of its main component eugenol. Brazilian Journal of
Microbiology 42: 1269-1277 India.
27. Inouye S, Takahasi M et Abe S ,(2008). Une étude comparative sur la composition
de quarante quatre hydrolats et leurs huiles essentielles. Int J Essent Oil Ther 2 : 89-
104.
28. J. C. F. Johner, T. Hatami, P. I. N. Carvalho, et M. A. A. Meireles,(2018). Impact
of grinding procedure on the yield and quality of the extract from clove buds using
supercritical fluid extraction, Open Food Science Journal, vol. 10, no. 1, pp. 1–7.
29. Jacques Kaloustian et Francis Hadji-Minaglou, (2012). La connaissance des huiles
essentielles qualitologie et aromathérapie Entre science et tradition pour une
application médicale. raisonnée © Springer-Verlag France.
30. Jean-Fabrice Yala, Véronique Ntsameso-mve-mba, Yves Azzizet Issembe ;
Nicaise Alexis Lepengue ; Alain Souza. (2016). Évaluation in vitro de l’activité
antimicrobienne de l’extrait aqueux d’Eryngium foetidium récolté dans la ville de
Franceville. Journal of Applied Biosciences 103:9886 – 9893.
31. Jian-Guo Xu , Ting Liu , Qing-Ping Hu et Xin-Ming Cao (2016). Chemical
Composition, Antibacterial Properties and Mechanism of Action of Essential Oil

44
 Les références

against periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. Molecules , 21(9), 1194

[Link]/10.3390/molecules 21091194.
32. Kacániová, M; Galovicová, L; Borotová, P; Valková, V; Dúranová, H;
Kowalczewski, P.Ł. Said-Al Ahl, H.A.H; Hikal, W.M; Vukic, M et Savitskaya,
T.( 2021). Chemical Composition, In Vitro and In Situ Antimicrobial and Antibiofilm
Activities of Syzygium aromaticum (Clove) Essential Oil. Plants Academic Editor:
Petko Denev, 10, 2185. .[Link]/10.3390/ plants10102185.
33. Kamatou GP, Vermaak I et Viljoen AM, (2012) .Eugenol from the remote maluku
islands to the international market place: a review of a remarkable and versatile
molecule. Molecules. 17:6953–81. 10.3390/molecules17066953.
34. Kapadiya .S et M. A. Desai, (2017). Isolation of essential oil from buds of Syzygium
aromaticum using hydro-distillation : multiresponse optimization and predictive
modelling, International Journal of Advanced Science and Technology, vol. 6, n°. 1,
pp. 405–418. India.
35. Kim, Y. G., Lee, J. H., Kim, S. I., Baek, K. H., et Lee, J. (2015). Cinnamon bark oil
and its components inhibit biofilm formation and toxin production. International
Journal of Food Microbiology, 195, 30 –39.
[Link]/10.1016/[Link].2014.11.028.
36. M.-J. Park, K.-S. Gwak, I. Yang, W.-S. Choi, H.-J. Jo, J.-W. Chang, E.-B. Jeung
et I.-G. Choi. (2007). Antifungal activities of the essential oils in Syzygium
aromaticum (L.) Merr. Et Perry and Leptospermum petersonii Bailey and their
constituents against various dermatophytes. The Journal of Microbiology. 45(5): 460-
465.
37. Mathieu Deshaies, et Jean-Philippe Gamache., (2013). Le clou de girofle à la
rescousse.
38. McDonald BA, et Linde C. (2022). Pathogen population genetics, evolutionary
potential, and durable resistance. Annu Rev Phytopathol 40: 349-379.
39. Mustapha El Ajjouri, Fatiha Amarti, Badr Satrani, Mohamed Ghanmi, Abdellah
Farah, Abderrahman Aafi, Lotfi Aarab, , Abdelaziz Chaouch. (2009).
Composition chimique et activité antimicrobienne des huiles essentielles de Thymus
algeriensis Boiss. & Reut. et Thymus ciliatus (Desf.) Benth. du Maroc. Biotechnol.
Agron. Soc. 14(1), 141-148.
40. Neri F., M. Mari et S. Brigati, (2006). Control of Penicillium expansum by volatile
compounds. Plant Pathol., 55, 100-105.

45
 Les références

41. Narcisa Mandras, Antonia Nostro , Janira Roana, Daniela Scalas, Giuliana
Banche, Valeria Ghisetti, Simonetta Del Re, Giacomo Fucale, Anna Maria
Cuffini et Vivian Tullio (2016). Liquid and vapour-phase antifungal activities of
essential oils against Candida albicans and non-albicans Candida . BMC
Complementary and Alternative Medicine 16:330. doi 10.1186/s12906-016-1316-5.
42. Nathaniel Hiwandika, Susana Elya Sudrajat ,Ika Rahayu (2021). Antibacterial and
Antifungal Activity of Clove Extract (Syzygium aromaticum) Journal Homepage
Eureka Herba Indonesia Vol 2 Issue 2.
43. OMS , (2015). L'Organisation mondiale de la Santé.
44. P. Goñi , P. López , C. Sánchez , R. Gómez-Lus , R. Becerril et C. Nerín, (2009).
Antimicrobial activity in the vapour phase of a combination of cinnamon and clove
essential oils10.1016/[Link].03.058.
45. Qing Xue, Zedong Xiang, Shengguang Wang et Zhufeng Cong,(2022). Recent
advances in nutritional composition, phytochemistry, bioactive, and potential
applications of Syzygium aromaticum L. (Myrtaceae). doi.10.3389/fnut.1002147.
46. Razzouk, S.; Mazri, M.A.; Jeldi, L.; Mnasri, B.; Ouahmane, L.; et Alfeddy,
M.N.(2022).Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Essential Oils from
Three Mediterranean Plants against Eighteen Pathogenic Bacteria and Fungi. journal
Pharmaceutics, 14, 1608. Maroc. [Link]/10.3390/ pharmaceutics14081608.
47. S. G. Deans, R. C. Noble, R. Hiltunen, W. Wuryani, et L. G.
Pénzes .(1995). Propriétés antimicrobiennes et antioxydantes de Syzygium
aromaticum (L.) Merr. & Perry : Impact sur les niveaux de bactéries, de champignons
et d'acides gras chez les souris vieillissantes. [Link]/10.1002/ffj.2730100507.
48. Shama Hmiri, Mohamed Rahouti, Zakaria Habib, Badr Satrani, Mohamed
Ghanmi et Mustapha El Ajjouri, (2011). Évaluation du potentiel antifongique des
huiles essentielles de mentha pulegium et d'eucal yptus camaldulensis dans la lutte
biologique contre les champignons responsables de la détérioration des pomme en
conservation. Bulletin de la Société Royale des Sciences de Liège, Vol. 80, 2011,
p.824 – 836. Maroc.

49. Shama Hmiri, Nabila Amrani et Mohamed Rahouti (2011). Détermination in vitro
de l’activité antifongique des vapeurs d'eugénol et d’huiles essentielles de Mentha
pulegium L. et de Tanacetum annuum L. vis-à-vis de trois champignons responsables

46
 Les références

de la pourriture des pommes en post-récolte. Acta Botanica Gallica. 158: 4, 609-616,

doi:10.1080/12538078.2011.10516298.
50. Stéphane Fontanay, Marie-Eugénie Mougenot et Raphaël E. Duval,(2015).
Evaluation of antibacterial properties of essential oils and/ or of their major
components doi:10.4267/2042/56635.
51. Sukhdev Swami Handa, Suman Preet Singh Khanuja, Gennaro Longo et Dev
Dutt Rakesh,(2008).Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants.
International centre for science and high technology. Trieste Italy, p 68.
52. Sundaresan Bhavaniramya , Selvaraju Vishnupriya , Mohammad Saleh Al-
Aboody , Rajendran Vijayakumar et Dharmar Baskaran. (2019). Rôle des huiles
essentielles dans la sécurité alimentaire : applications antimicrobiennes et
antioxydantes. Science et technologie des céréales et de l’huile Volume 2, p: 49-55.
53. Rohit Prakash , Yu Zhang, Weiran Feng et Maria Jasin , (2015). Homologous
recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated
proteins 10.1101/cshperspect.a016600.
54. Suzanne Catty .(2001). Hydrolats : la prochaine aromathérapie Healing Arts Press P :
352 USA.
55. Teresa Goszczynska, (2000). Introduction to Practical Phytobacteriology; A manual
for phytobacteriology ,Agricultural Research Council, South Africa p 05.
56. Uwineza M. S, El Yousfi B et Lamiri A, (2018). Activités antifongiques in vitro des
huiles essentielles de Mentha pulegium, Eugenia aromatica et Cedrus atlantica sur
Fusarium culmorum et Bipolaris sorokiniana. Revue Marocaine de Protection des
Plantes, n° 12: 19-32.
57. Yage Xing, Qingliian Xu, Xihong Li, Zhenmin Che et Juan Yun (2011). Activites
antifongiques del’huile de girpfle contre Rhizopus nigricans, Aspergillus flavus et
Penicillium citrunum, in vitro et sur des fruits blesses . [Link]/10.1111/j.1745-
4565.2011.00347.x.
58. Yuri ,(2017). fun with microbiology. Short descriptions and photographs of some
photogenic microorganisms.
59. Zhang Y, Wang Y, Zhu X, Cao P et Wei S (2017). Antibacterial and antibiofilm
activities of eugenol from essential oil of Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.
Perry (clove) leaf.
60. Zsuzsanna Schelz a, Joseph Molnar a et Judit Hohmann b, (2006). Antimicrobial
and antiplasmid activities of essential oils Fitoterapia 77 279–285.

47
 Annexe de materiel

Annexe de materiel
Matérielles de laboratoire utilisé
Béchers (250ml, 500ml, 1000ml). Disque en papier filtre.
Erlenmeyers (250 ml, 500 ml, 1000ml). Elastique.
Éprouvette graduée (100ml). Embouts stériles.
Entonnoir en verre. Gant médical.
Flacons en verre (10ml, 200ml, 100ml). Marqueur permanant.
Pipettes pasteur. Micropipette (de 100µl à 1000µl).
Tubes à culture. Papier aluminium.
Anse de platine.. Papier film.
Barreau magnétique. Papier filtre.
Boites de Pétri. Papier pH.
Ciseau. Pince métallique.
Couteau. Règle en millimètre.
Coton tige Para-filme
Cuillère. pinces
Disque d’antibiotique
 Annexe de materiel

Autre matériaux utilisés

Matérielles lourds

Vortex de la marque
Balance Rebo « Rhinos » Spectrophotomètre Fisher Scientific F3
15024

Agitateur Autoclave de la Etuve réglable à

Bain marie de la magnétique avec marque température
marque Memmert plaque chauffante de SANOCLAV différente de la marque
( Germany). la marqu
DIAB (MS-H-S). La M-3-20-ECZ-J. Memmert ( Germany).
 Annexe de materiel

Les milieux de culture utilisés

Gélose Sabouraud PCA Plate count MH : Mueller-

Dextrose (SDA) agar Hinton D- Glucose
PDA : La gélose dextrose
Eau Physiologique à la pomme de terre
Constituants Quantité - 200g de pomme de
terre
en 9 g de Na cl 9.
-1 L eau distillée
dans 1 litre d’eau
- 20 g Glucose
distillée. - 15 g Agar
Autoclaver à 121°C - pH = 5,1±0,2
pendant 15 minutes Autoclaver à 121°C
pendant 15 minutes ATB Gentamicine Agar poudre
 Annexe des tableaux

Annexe des tableaux

Tableau 01 : Résultat d’activité antibactérienne des extraits

HE MC MF Dis
Extrait
HE MC MF Tm (+) Tm-
(20µl/disque) HE p MC p MF p DIS p DIS nb
nb nb nb
Zone
d'inhibition 20 20 10 8 9 0 0 0 20 00
(mm)

HEp : huile essentiel poudre, HEnb : huile essentiel non broyé, Mchp : macérât a
chaud poudre, Mchnb : macérât a chaud non broyé, Mfrp : macérât a froid poudre, Mfrnb :
macérât a froid non broyé , Disp : distillat poudre, Disnb : distillat non broyé et Tm+ :
antibiotique Gentamicine.

Tableau 02 : Résultat de CMI F d’huile essentielle poudre

Concentration Aspergillus Geotrichum Aureobasidium Arthrographis Penicillium

HEp sp sp sp sp sp
15µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%
10 µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%
7.5 µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%
05 µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%
2.5 µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%

TM
00% 00% 00% 00% 00%

Tableau 03 : Résultat de CMI F d’huile essentielle non broyé

Concentration Aspergillus Geotrichum Aureobasidium Arthrographis Penicillium

HEnb sp sp sp sp sp

15µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%

10 µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%
7.5 µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%
05 µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%
2.5 µl/ml 100% 100% 100% 100% 100%

TM
00% 00% 00% 00% 00%
 Annexe des tableaux

Tableau 04 : Résultat de CMI Bdes huiles essentielles : diamètre de zone d’inhibition (mm)

Concentration 2.5 µl/ml 05 µl/ml 07 µl/ml 10 µl/ml 15 µl/ml

Ø de zone d’inhibition
00 00 00 00 10
HEp (mm)
Ø de zone d’inhibition
00 00 00 00 08
HEnb (mm)

Tableau 05 : Résultat de test micro-atmosphère d’huile essentielle poudre

Concentration Aspergillus Geotrichum Aureobasidium Arthrographis Penicillium

HEp sp sp sp sp sp

2.5 µl/ml 6,25% 23,07% 30,76% 23,07% 7,14%

05 µl/ml 12,50% 35,38% 30,76% 30,76% 7,14%

10 µl/ml 25% 38,46% 38,46% 53,84% 14,28%

7.5 µl/ml 12,50% 35,38% 33,84% 30,76% 14,28%

15µl/ml 52,50% 43,07% 50,76% 61,53% 28,57%

Tm 0% 0% 0% 0% 0%

Tableau 06 : Résultat de test micro-atmosphère d huile essentielle non broyé

Concentration Aspergillus Geotrichum aureobasiduim Arthrographis Penicillium

HEnb sp sp sp sp sp

2.5 µl/ml 18,75% 23,07% 30,76% 23,07% 0%

05 µl/ml 31,25% 30,76% 35,38% 27,69% 0%

7.5 µl/ml 37,50% 38,46% 43,07% 30,76% 0%

10 µl/ml 37,50% 38,46% 46,15% 38,46% 14,28%

15µl/ml 50% 38,46% 56,92% 46,15% 21,42%

Tm 0% 0% 0% 0% 0%
 Résumé

‫الملخص‬
‫في إطار تثمين مستخلصات براعم القرنفل و استعمالها كبديل حيوي مطهر و حافظ في الصناعة الغذائية بفضل تتمتعها بمزايا مفيدة في مكافحة العديد‬
Syzygium ‫ أين تركز عملنا على الدراسة المخبرية للمركبات المختلفة المستخلصة من هذه التوابل المسماة‬.‫من الكائنات الحية الدقيقة ذات المصدر الغذائي‬
‫ تم الحصول على عدة‬.‫ مسحوقة وغيرمسحوقة بهدف إثبات نشاطها المثبط ضد مسببات األمراض النباتية المعزولة من عينة طماطم متعفنة‬aromaticum L.
‫ ومن ثم تم تقييم النشاط المضاد للميكروبات الذي تبديه هذه المستخلصات‬.‫ النقع الساخن والنقع البارد‬،‫ التقطير المائي‬:‫مستخلصات من هذه البراعم عن طري ق‬
‫ بعدها تم‬.)MH ‫ و‬PDA( ‫المختلفة ضد ثماني عزالت المأخوذة من العينة السابقة و قد تم ذلك بقياس درجة حساسيتها بواسطة تقنية االنتشار في أوساط هالمية‬
،HEp، ‫في البداية تم الحصول على ثمانية مستخلصات‬.SDA ‫ و‬MH ‫تحديد تراكيز المستخلصات الدنيا والمثبطة للفطريات والبكتيريا في األوساط الصلبة‬
‫ وأظهرت التحاليل الفيزيائية و الكيميائية المطبقة عليها أن األس الهيدروجيني للزيوت المستخرجة‬.Disnb ،Disp ،M frnb ،Mfrp ،Mchnb ،Mchp ،HEnp
.‫على التوالي‬HEnb‫و‬HEp‫ من زيوت‬٪4.76 ‫ و‬5.06 ‫ و قد تم الحصول على مردود مرضي نسبيا قدره‬، 6 ‫ و‬5 ‫حامضي و الذي كانت قيمته محصورة بين‬
‫ ساللة بكتيرية واحدة سلبية‬:‫ سمح الفحص العيني و المجهري بتحديد صفاتها ومن ثم التعرف على األنواع التالية‬،‫بعد عمليتي العزل والتنقية للبكتيريا والفطريات‬
Penicillium sp:2, Arthrographis sp, aureubasidium sp, Geotricum sp, Aspergillus sp:2 :‫الغرام و عدة عزالت فطرية‬
‫النقية‬HE‫حيث لوحظ أن الزيوت‬،‫أبدى اختبار الحساسية تباين في التأثير للمستخلصات النقية على العزالت المدروسة وذلك حسب حجم قطرالتثبيط لكل عينة‬
‫ و قد تم تسجيل قيمة التركيز االدنى المثبط‬.‫ مم على البكتيريا‬20 ‫ مم و‬10 ± 50 ‫ إلى‬2.30 ± 27.33 ‫أظهرت فعالية كبيرة على الفطريات بطول قطري من‬
‫طا للعزلة البكتيرية وبتركيز اكبرمن ذلك على‬ ً ‫ مل مثب‬/ ‫ ميكرولتر‬15 ‫ بينما كان التركيز‬.‫ مل لجميع العزالت الفطرية‬/ ‫ ميكرولتر‬2.5 ‫ أقل من‬CMIF ‫للفطريات‬
‫ النتائج التي تم الحصول عليها تؤكد أفضلية استخدام زيت القرنفل األساسي كبديل واعد للمضادات الحيوية ومضادات‬.‫مستوى إختبار الغالف الجوي المصغر‬
.‫الفطريات االصطناعية‬

.‫ و اختبار الغالف الجوي المصغر‬CMIB،CMIF ‫ اختبار‬،‫ نشاط مضاد للفطريات‬،‫ نشاط مضاد للجراثيم‬،‫ زيت عطري‬،.Syzygium aromaticum(L) :‫الكلمات األساسية‬

Résumé
En tant qu’antiseptique potentiel et précieux dans l’industrie alimentaire, le clou de girofle présente des avantages
bénéfiques dans la lutte contre de nombreux microorganismes de source alimentaire. Notre travail porte sur l’étude in vitro
des différents extraits de cette épice nommée Syzygium aromaticum L. broyé et non broyé pour la mise en évidence de leurs
activités antimicrobiennes vis-à-vis des agents phytopathogènes isolés à partir des tomates infectées. Les extraits de ces
boutons floraux ont été obtenus par plusieurs méthodes : hydro-distillation, macération à chaud et macération à froid.
L’activité antimicrobienne, exercée par ces différents extraits à l’égard de huit souches microbiennes isolées à partir de
tomates infectées, a été évaluée en mesurant leurs degrés de sensibilité par la technique de diffusion en milieux gélosés (PDA
et MH).Aussi, les concentrations minimales fongicides et bactéricides ont été déterminées sur les milieux solides MH et
SDA.
Huit extraits ont été obtenus, HEp, HEnp ,Mchp, Mchnb, Mfrp,M frnb ,Disp, Disnb. L’analyse physicochimique a montré
que le pH des huiles extraites est acide situé entre 5 et 6, avec un rendement satisfaisant de 5,06 et 4,76 % des huiles HEp et
HEnb respectivement Après l’isolement et la purification.L’examen macroscopique et microscopique a permis
l’identification des espèces : [Link], [Link], Aureubasidium. sp, [Link], [Link],et une
souche bactérienne à G- .Le test de sensibilité a montré que les extraits purs ont exercé des activités antimicrobiennes
variables traduites par des zones d’inhibition à l’égard des souches testées. Le plus grand potentiel exprimé était celui de
l’HE de 27,33 ± 2,30 à 50 ± 10 mm sur les champignons et de 20 mm sur la bactérie. La CMIF enregistrée était inférieure à
2,5 µl/ml pour toutes les souches fongiques. Alors que, la concentration 15 µl/ml a été inhibitrice pour la souche bactérienne
et d’une concentration plus ou moins grande au niveau du test micro-atmosphère. Les résultats obtenus confirment l'intérêt
d'utiliser l'huile essentielle de clous de girofle comme alternative aux antibiotiques et antifongiques synthétique.

Mots clés: Syzygium aromaticum (L)., huile essentielle, activité antibactérienne, activité antifongique, CMIF, CMIB test micro-atmosphère.

Summary
As a potential and valuable antiseptic in the food industry, clove has beneficial advantages in combating many
food-source microorganisms. Our work focuses on the in vitro study of the different extracts of this spice named Syzygium
aromaticum L. ground and unground for the demonstration of their antimicrobial activities against plant pathogens isolated
from infected tomatoes. The extracts of these flower buds were obtained by several methods: hydro-distillation, hot
maceration and cold maceration. The antimicrobial activity, exerted by these different extracts against eight microbial strains
isolated from infected tomatoes, was evaluated by measuring their degrees of sensitivity by the technique of diffusion in agar
media (PDA and MH).Also, the minimal fungicidal and bactericidal concentrations were determined by Macrodillution on
the solid media MH and SDA. Eight extracts were obtained, HEp, HEnp, Mchp, Mchnb, Mfrp, M frnb, Disp, Disnb. The
physicochemical analysis showed that the pH of the extracted oils is acidic between 5 and 6, with a satisfactory yield of 5.06
and 4.76% for the HEp and HEnb oils respectively. The microscopic examination allowed the identification of the species:
[Link], Geotricum. sp, Aureubasidium. sp, [Link], 2 Penicillium. sp, and a bacterial strain with [Link]
sensitivity test showed that the pure extracts exerted a variable antimicrobial activity against the tested strains translated by
zones of inhibition. After isolation and purification. The macroscopic and microscopic examination allowed the identification
of the species:
The sensitivity test showed that the pure extracts exerted variable antimicrobial activities reflected by zones of inhibition
against the strains tested. The greatest potential expressed was that of EO from 27.33 ± 2.30 to 50 ± 10 mm on fungi and 20
mm on bacteria. The FICM recorded was lessth an 2.5 µl/ml for all fungal strains. Whereas, the 15 µl/ml concentration was
inhibitory for the bacterial strain and more than this for the micro-atmosphere test. The results obtained confirm the interest
of using clove essential oil as an alternative to synthetic antibiotics and antifungals.

Key words: Syzygium aromaticum (L)., essential oil, antibacterial activity, antifungal activity, FICM, BICM, micro-atmosphere test.