C.
Méthodes spécifiques d’allèle
PCR et Mise en Évidence des ASO-PCR : amorces/sondes spécifiques d’allèle, amplification
Variants de Séquence seulement si parfaite complémentarité.
ARMS-PCR : deux PCR parallèles avec amorces spécifiques
normal vs mutant → distingue homo/hétérozygotes.
Plan ACRS-PCR : création artificielle d’un site de restriction dans
1. Introduction une amorce pour discriminer les variants.
2. PCR : principe et caractéristiques générales
- Définition D. Méthodes de screening de mutations inconnues
- Étapes du cycle SSCP : migration différente d’ADN simple brin selon sa
- Composants essentiels conformation.
- Caractéristiques Hétéroduplex : mésappariement normal/mutant → migration
3. PCR et mise en évidence des variants de séquence ralentie.
- A. PCR + digestion enzymatique (PCR-RFLP) DGGE : mutation modifie la fusion d’ADN dans un gel à
- B. PCR multiplex et détection de délétions gradient dénaturant.
- C. Méthodes spécifiques d’allèle (ASO, ARMS, ACRS)
- D. Méthodes de screening de mutations inconnues E. Séquençage (méthode de référence)
(SSCP, hétéroduplex, DGGE) Permet d’identifier avec précision la mutation.
- E. Séquençage (méthode de référence) Méthode de Sanger : fragments courts (500–1000 pb).
4. Applications médicales NGS : séquençage massif en parallèle, utile pour
5. Conclusion génome/exome entier.
1. Introduction 4. Applications médicales
La PCR (Polymerase Chain Reaction), mise au point en 1985 - Drépanocytose : PCR-RFLP, ASO-PCR, ARMS-PCR.
par Kary Mullis, est une technique d’amplification in vitro de - ApoB : polymorphisme détecté par PCR + EcoRI.
séquences d’ADN. Elle a révolutionné la biologie moléculaire - DMD/BMD : PCR multiplex.
par sa rapidité, sa sensibilité et sa simplicité. Son intérêt - Oncologie moléculaire : recherche de mutations somatiques.
majeur en médecine est la détection de variants de séquence : - Diagnostic infectieux : VIH, VHC, Mycobacterium
mutations ponctuelles, délétions, duplications ou tuberculosis.
polymorphismes. - Médecine légale : empreintes génétiques, identification.
2. PCR : principe et caractéristiques générales 5. Conclusion
a) Définition : amplification d’un fragment d’ADN situé entre La PCR et ses dérivés sont des outils essentiels pour détecter
deux séquences connues. les variants de séquence. Elles permettent un diagnostic
rapide, sensible et spécifique. Le séquençage reste toutefois la
b) Étapes d’un cycle : méthode de référence pour confirmer et caractériser
- Dénaturation (94–95 °C) → séparation des brins. précisément les mutations.
- Hybridation (50–65 °C) → fixation des amorces.
- Élongation (72 °C) → synthèse par la polymérase.
Répétées 25–35 fois → amplification exponentielle (≈10⁹
copies).
c) Composants : ADN matrice, amorces spécifiques, dNTP,
polymérase thermostable (Taq, Pfu), tampon avec Mg²⁺.
d) Caractéristiques : spécifique (amorce-dépendant), sensible,
rapide, rendement limité (plateau après 30–35 cycles).
3. PCR et mise en évidence des variants de séquence
A. PCR + digestion enzymatique (PCR-RFLP)
Amplification d’un fragment contenant un site de restriction,
puis digestion enzymatique.
Exemples : Drépanocytose (mutation HbS), ApoB
(polymorphisme G→A supprimant un site EcoRI).
B. PCR multiplex et détection de délétions
Plusieurs couples d’amorces dans une seule réaction →
amplification simultanée de plusieurs exons.
Exemple : dystrophinopathies (DMD/BMD).