EXPOSE VIROLOGIE
THEME 22 : ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DU
VIRUS DE LA ROUGEOLE ET LA RUBEOLE PAR
CULTURE DANS LES CELLULES VERO
Rédigée par: FOTSING PANKA GILLIAN LENAIC
SUPERVISEUR : Dr TCHOUANGUEU
1
LABORATOIRE DE VIROLOGIE DE LA FACULTE DE MEDECINE DE
L’UNIVERSITE DSCHANG
MANUEL DES PROCEDURES
TITRE PROCEDURE OPERATOIRE STANDARDISEE POUR ISOLEMENT ET
IDENTIFICATION DU VIRUS DE LA ROUGEOLE ET LA RUBEOLE PAR CULTURE
DANS LES CELLULES VERO
CODE POS-VIROLOGIE-022 Nombre de pages : 07
CETTE POS A ETE REDIGEE, LUE ET COMPRISE PAR :
NOMS TITRE VERSION SIGNATURE DATE
FOTSING PANKA MSc. en Biologie
001
GILLIAN LENAIC Clinique
CETTE POS A ETE APROUVEE ET VALIDEE PAR :
Date Date de
Approuvée par : Signature Validée par : Signature
d’approbation validation
Coordonnateur du
Dr TCHOUANGUEU
laboratoire
HISTORIQUE DE LA POS
Date prévue pour
Date de création Version initiale Date de révision effective Nouvelle version
révision
16/05/2023 001 16/05/2024
2
Table des matières
I. BUT.................................................................................................................................................4
II. PRINCIPE.........................................................................................................................................4
III. RESPONSABILITES.......................................................................................................................4
IV. DEFINITION.................................................................................................................................4
V. REFERENCES...................................................................................................................................5
VI. ÉQUIPEMENT/REACTIFS.............................................................................................................5
VII. MESURE DE SECURITE................................................................................................................6
VIII. PROCEDURE................................................................................................................................6
IX. CONTROLE DE QUALITE..............................................................................................................7
3
I. BUT
Ce document vise à décrire la technique employée pour inoculer une lignée cellulaire vero
avec un échantillon potentiellement infectieux afin d’isoler et d’identifier le virus de la
rougeole et de la rubéole permettant ainsi de poser un diagnostic de l’infection par ces virus.
II. PRINCIPE
Il consiste à propager les cellules Véro dans un milieu nutritif (à base du sérum ou non) puis
d’inoculer notre échantillon. L’inoculation de l’échantillon permet lorsqu’il y a présence de
virus de fixer ces derniers sur la paroi cellulaire. Les virus une fois absorbés pénètrent dans la
cellule pour se multiplier. Cette multiplication permet généralement d’observer un ECP.
III. RESPONSABILITES
- Le traitement de l'échantillon et l'interprétation sont effectués par les techniciens de
laboratoire, ingénieur médicaux-sanitaire et stagiaires ;
- Le processus est supervisé et validé par le biologiste ;
IV. DEFINITION
Cellule vero : C’est une lignée cellulaire isolée à partir de cellules épithéliales de rein
extraites d’un singe vert africain et utilisée pour la culture cellulaire.
ECP (Effet cytopathique) : altération biochimique, métabolique et morphologique d’une
cellule hotte infectée par un virus
MEM : Minimal essential medium
4
V. REFERENCES
- [Link] . Classification virale- Méthodes de diagnostic en virologie-
Introduction
- [Link] Le virus de la rougeole, un système complexe,
adaptation, atténuation (thèse)
- [Link] .dz Le virus de la rubéole, cours de microbiologie.
Année universitaire : 2019-2020
VI. ÉQUIPEMENT/REACTIFS
EQUIPEMENT
- Incubateur (36 – 38°C) avec 5% de CO2
- Micropipette de 10 à 100 µL
- Embouts stériles
- Cabinet de sécurité biologique de niveau 2
- Echantillon
- Microscope
- Cellule de comptage
- Flacon
- Ampoule d’azote liquide
REACTIFS
- Milieu de culture
- Sérum de veau fœtal
- Antibiotique ( penicilline et streptomicine)
- Trypsine
5
- Cellule vero
- Bleu trypan à 0,4%
- Milieu MEM
VII. MESURE DE SECURITE
Les règles générales de biosécurité doivent être appliquées lors de la manipulation du matériel
potentiellement infectieux. De manière générale :
- L’accès au laboratoire de virologie n’est autorisé que pour le personnel
- Le personnel doit se laver les mains avant et après manipulation de tout échantillon
potentiellement infectieux et avant de quitter le laboratoire
- La manipulation doit se faire strictement à l’intérieur d’une cabine de sécurité de niveau 2
- Le personnel doit être équipé des EPI (Equipement de protection Individuel) adéquat.
- La réalisation de toutes les procédures doit être faite de manière à minimiser le risque
de formation des aérosols
VIII. PROCEDURE
PREPARATION DES REACTIFS/INGREDIENTS
Milieu de culture : milieu MEM + 10% sérum de veau fœtal + 1% hépès + 1% glutamine
NB : Nous ajouterons un mélange d’antibiotique dans notre milieu ( penicilline G (60
unités/ml) et la streptomycine ( 60µg/ml)
ÉCHANTILLON :
- Rougeole : urine , prélèvement nasopharyngée
- Rubéole : urine , prélèvement nasopharyngée (le plus recommandé)
TECHNIQUE
6
Mettre le cabinet de sécurité en marche
Calculer le volume du milieu à prélever et celui de la cellule de vero en fonction de la
concentration par cm2 désirée.
Ensemencées les cellules Vero dans notre milieu de culture à la concentration de 2 x
104 cellules / cm2
Pour un flacon de 75 cm2, il faut une quantite de 3 x 106 cellules dans 20 mL de
milieu (sachant que les cellules vero viennent dans des flacons à une concentration
donnée. Pour un flacon de 10 mL contenant une suspension de cellules VERO 35 à
40.106 cellules, soit 3,5 à 4.106 cellules/mL.) permettant d’obtenir une confluence à 3-
4 jours
NB : Verifier l’aspect et la confluence des cellules régulièrement
Inoculer le virus en faisant une décharge de notre échantillon dans le milieu
Incuber à 37°C + 5% de CO2
NB : Incuber un flacon de cellules non infectée qui servira comme contrôle négatif
IDENTIFICATION
Rubéole
Le virus de la rubéole n’a pas d’ECP (apparait tardivement et très discret), son identification
se fera par immunofluorescence ou par immunohistochimie ou par un test d’interférence à
l’aide d’un virus épreuve (Echovirus par exemple)
Test d’interférence virale :
Cette technique utilise la propriété du virus de la Rubéole d'inhiber la croissance d'autres virus
comme echovirus, qui normalement sont responsables d'un ECP.
Cellules + virus de la rubéole → Pas d’ECP
Cellules + virus épreuve ([Link]) → ECP
Cellules + Prélèvement = incubation → pas d’ECP ?+([Link]) :
ECP (+) → Culture (-) pas de Rubéole
ECP(-) → Culture (+) Rubéole
Rougeole
7
L’apparition d’un syncytium et des inclusions cytoplasmiques après 3 à 4 jours d’incubation
sont caractéristiques du virus de la rougeole.
IX. CONTROLE DE QUALITE
Nous avons le contrôle qualité des cultures cellulaires qui regroupe différent contrôle à
savoir :
- Contrôle de l’absence de mycoplasme
- Contrôle de l’absence de bactéries et de champignons
- Contrôle de l’absence de virus
- Contrôle de la sensibilité des cellules au virus recherchés
- Contrôle visuel de l’aspect des cellules
CONTROLE DE L’ABSENCE DE MYCOPLASME
Ce contrôle est effectué pour chaque nouvelle production d’un stock de cellules 1 ou 2
passages après la décongélation.
- Une boite de culture de 25 cm2 est ensemencée pour obtenir un tapis confluent après une
incubation de 24h à 37°C, dans 5 ml de milieu de culture complet mais sans antibiotique.
- Après 24h d’incubation enlever 4 ml de milieu de culture. A l’aide d’un grattoir stérile,
détacher le tapis cellulaire et récolter 500 µl de suspension cellulaire.
- Chauffer cet échantillon 15 min à 100 °C pour éliminer les traces de phosphatase alcaline
puis le stocker à 4°C jusqu’à utilisation.
NB : Le test de révélation est réalisé à l’aide kit Plasmo Test réf . rep-pt2 (InvivoGen) selon
les instructions du fabriquant
CONTROLE DE L’ABSENCE DE BACTERIES ET DE CHAMPIGNONS
Ce contrôle est effectué visuellement, avant le stockage des cellules en azote liquide et lors de
chaque passage. Le milieu de culture cellulaire ne doit pas être trouble, ni acide (indicateur
coloré).
8
CONTROLE DE L’ABSENCE DE VIRUS
Ce contrôle est effectué visuellement, avant le stockage des cellules en azote liquide et lors de
chaque passage par vérification de l’absence de virus manipulés dans le laboratoire et qui
provoquent un effet cytopathogène (ECP).
CONTROLE DE LA SENSIBILITE DES CELLULES AUX VIRUS
RECHERCHES)
Afin d’obtenir des résultats reproductibles, il est recommandé d’utiliser les lignées sur un
nombre limité de passages après décongélation. Procéder à une nouvelle décongélation de
cellules stockées dans l’azote lorsque les cellules en cours atteignent le nombre de passages
où elles risquent de perdre leur sensibilité vis-à-vis du virus recherché. Après chaque
décongélation, un test de sensibilité est effectué par titrage d’une souche virale préétirée aux
passages 2 ou 3 après décongélation.
CONTROLE VISUEL DE L’ASPECT DES CELLULES
Contrôle de l’absence d’arrondissement des cellules, vacuolisation, rétractation, détachement
du support. Ce contrôle est effectué avant le stockage des cellules en azote liquide et lors de
chaque passage.
NB : Chaque analyse doit inclure un contrôle interne négatif (via de cellules non infecté)
Un contrôle positif doit être inclus à l’utilisation d’un nouveau lot de cellules (portion aliquote
adéquate de contrôle positif interne)