THESE DE DOCTORAT DE

L'UNIVERSITE
DE BRETAGNE OCCIDENTALE

ECOLE DOCTORALE N° 600

Ecologie, Géosciences, Agronomie, Alimentation
Spécialité : Microbiologie

Par
Marie BELAIR
Les agents du dépérissement des noyers en France : écologie,
diversité et cycle de vie
Thèse présentée et soutenue à Plouzané, le 1er décembre 2023

Unité de recherche : Laboratoire Universitaire de Biodiversité et Écologie Microbienne (UR 3882 / USC
INRAE 1504)

Rapporteurs avant soutenance :

Marie FOULONGNE-ORIOL Chargée de Recherches, INRAE, UR 1264 MycSA, Centre INRAE Nouvelle-Aquitaine
Bordeaux, Villenave d’Ornon
Marc BUEE Directeur de Recherches, INRAE, UMR 1136 IAM, Centre INRAE Grand-Est - Nancy,
Champenoux

Composition du Jury :
Président : Cécile ROBIN Directrice de Recherches, INRAE, UMR 1202 BIOGECO,
INRAE - Université de Bordeaux, Cestas

Examinateurs : Marie FOULONGNE-ORIOL Chargée de Recherches, INRAE, UR 1264 MycSA

Marc BUEE Directeur de Recherches, INRAE, UMR 1136 IAM

Dir. de thèse : Gaétan LE FLOCH Professeur des Universités, UR 3882 LUBEM, UBO, Plouzané

Encadrantes : Flora PENSEC Maîtresse de Conférences, UR 3882 LUBEM, UBO, Plouzané

Encadrantes : Adeline PICOT Maîtresse de Conférences, UR 3882 LUBEM, UBO, Plouzané

Invitée Cyrielle MASSON Chargée d’expérimentation, Station d’Expérimentation

Nucicole Rhône Alpes
Remerciements
Je tiens dans un premier temps à remercier chaleureusement les membres du jury d’avoir
accepté d’évaluer ce travail. Merci à Marie Foulongne-Oriol et Marc Buée d’avoir accepté
d’être rapporteurs, ainsi qu’à Cécile Robin d’avoir accepté d’être examinatrice de ce travail de
thèse.

Je tiens à remercier le Pr. Emmanuel Coton, directeur du LUBEM, de m’avoir permis de réaliser
cette thèse au sein du laboratoire.

Je souhaite par la suite remercier mon directeur de thèse, Gaétan Le Floch. Merci pour ta
présence et ton soutien nécessaires au bon déroulement de cette thèse, pour ton
accompagnement et tes conseils aux instants clefs de ce projet.

Je remercie particulièrement mes encadrantes, Flora Pensec et Adeline Picot. Merci pour votre
soutien sans faille, vos conseils avisés et votre oreille attentive. Merci d’avoir cru en moi, de
m’avoir aiguillée, mais aussi d’avoir laissé la place à mes idées et de m’avoir suivie. Flora,
merci pour ton accompagnement et ton aide à la décision concernant les isolats, pour ton soutien
et ton investissement dans l’analyse des données de génétique. Merci aussi pour toutes ces
discussions, pour ton amour de la science que tu sais si bien transmettre, et pour ta personnalité
que j’ai tant apprécié découvrir. Adeline, tu as su me soutenir, m’accompagner, me remettre
dans le droit chemin quand mes pensées s’égaraient. Merci pour ta réactivité permanente et
pour tes bonnes idées, même lors d’un passage éclair de 5 minutes dans ton bureau. A toutes
les deux, merci pour ce que vous m’avez apporté, pour votre joie de vivre qui fait du bien, vos
encouragements et compliments qui remettent d’aplomb, et pour m’avoir aidée à cultiver cette
passion du laboratoire. Je suis sincèrement reconnaissante d’avoir pu réaliser cette thèse sous
votre encadrement.

Merci à vous trois pour votre accompagnement et soutien quant à la poursuite de ma carrière.
Merci de m’avoir permis de découvrir l’enseignement. J’ai une chance inestimable de travailler
une année de plus à vos côtés.

Je tiens par la suite à remercier les membres de mon comité de suivi individuel. Cécile Robin,
c’est un plaisir, après avoir communiqué avec vous autour de mes résultats de thèse lors de ces
réunions, que vous soyez à présent l’examinatrice de ce manuscrit de thèse final. Florent
Trouillas, merci pour ton expertise sur les agents du dépérissement du noyer en Californie et
pour ces discussions enrichissantes concernant mon projet.

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Merci au personnel administratif, Cathy, Anne-Cécile, Sophie, Zindy, Céline, pour votre
sympathie et votre bonne humeur. Marielle, merci pour ton accompagnement indispensable,
c’est grâce à toi que tout se déroule si bien. Sabine R., Florence C., merci pour votre
accompagnement lors de mes enseignements à l’IUT. Merci également à Michèle Kerleroux,
Cécile Faure, Véronique Ziegler, et Isabelle Baumgarten.

Merci aux membres du LUBEM, Amélie, Franck, Gaëtan B., Jean-Luc, Jérôme, Karim,
Laurence, Marie-Elisabeth, Monika, Nolwenn, Patrice, Valérie. Patrice, merci d’avoir partagé
avec moi ton expertise en mycologie, l’identification morphologique de mes isolats en a été
grandement simplifiée. Merci Amélie pour ton accompagnement dans la mise en collection.
Jean-Luc, merci beaucoup d’avoir pris le temps de me former à la phylogénie, d’avoir partagé
avec moi tes connaissances et m’avoir guidée. Jérôme, merci pour ton intégration dans l’équipe
enseignante. Merci à tous pour votre bonne humeur et ces petites discussions au fil de couloirs
qui m’ont fait sentir membre à vos côtés.

Un énorme merci à Audrey, Christophe, Clément, Elisabeth, Stella, Sylvie. Audrey, j’ai
vraiment apprécié te rencontrer, merci pour ton rire si communicatif et ta joie de vivre. Stella,
merci pour ton accompagnement inestimable lors de mon arrivée au laboratoire, tu m’as formée
à toutes les techniques dont j’ai eu besoin. Sylvie, tous mes champignons n’auraient pas pu
avoir l’attention que je leur ai portée si tu n’avais pas été là pour couler ces centaines et
centaines de boîtes, c’est grâce à toi aussi que tout cela a pu se faire. Enfin, Christophe, je ne
saurais te remercier assez pour ton soutien durant les TP, qui n’auraient pas pu se dérouler aussi
bien sans ta présence à mes côtés. A vous tous, ce fut un réel plaisir de faire votre connaissance
et d’avoir partagé cette aventure avec vous.

Merci aux stagiaires avec qui j’ai pu travailler, Axel, Charline, Léa et Vincent. Axel, Charline,
ce fut un plaisir de vous rencontrer et de vous voir avancer. Léa, merci pour ton aide et le sérieux
de tes travaux qui ont permis à cette thèse une belle avancée. Vincent, le livret de
reconnaissance que tu as créé nous suit partout pour chaque identification. Je vous souhaite à
tous le meilleur pour l’avenir, et que vos projets se réalisent.

Une pensée pour Gwennina et Romain. Quel plaisir de vous avoir rencontrés, merci pour votre
esprit si drôle et décalé, vous êtes uniques.

Merci à vous, Amandine, Océane C., Charlotte G., Claire Quelle équipe de copines, quelle joie
d’avoir tissé avec vous des liens si forts, et de me sentir ici comme chez moi grâce à vous. Merci
pour ces soirées quasiment hebdomadaires, ces discussions interminables, ces camemberts

4
rôtis, ces soirées à la Gua. Une grosse pensée pour toi aussi copain Steven. Merci pour tes
conseils sur les manips, merci pour ces fous rires, merci pour ces cours express sur la bière, le
métal, les vikings.

Un immense merci aux doctorants du LUBEM, ceux qui sont dans la même barque et qui sont
d’un soutien indispensable. Merci à Aurélie et Ewen, avec qui j’ai eu la chance de commencer
ma thèse. Aurélie, mon Doudou, les mots sont rarement suffisants. Tu m’as été indispensable,
merci pour tes expressions remodelées, merci pour ta passion des sorties entre amies, merci
pour la personne que tu es. Ewen, tu es arrivé, puis tu es parti (merci Paris), et puis tu es revenu.
Ça fait du bien de t’avoir dans les locaux et de partager avec toi, ta perpétuelle remise en
question du moindre détail aide indéniablement à la réflexion et la prise de recul.
Adrien, je te souhaite de réussir. Merci pour ta façon d’être, tu es assurément unique, le seul à
vivre la thèse de cette façon.
Nolwenn, sois fière de toi. C’est un plaisir d’avoir rencontré une telle battante.
A tous, je suis si heureuse de rester un an de plus, et impatiente de vous voir à votre tour,
terminer cette aventure, boucler votre manuscrit, et tourner la page.

Mélanie, merci pour cette année et demie. Tu es pour moi une véritable amie, ton départ du
laboratoire n’aura rien changé à nos habitudes. Merci pour ton aide, pour tes conseils, quand
les manips font douter et que la remise en question est douloureuse. Merci pour ces sessions de
rédaction, toi le manuscrit, moi la revue, merci pour le métabarcoding, qui nous a fait perdre
autant de cheveux et que de patience. Merci pour tout, encore. Je suis extrêmement chanceuse
de t’avoir rencontrée. Cette thèse n’aurait pas été si agréable sans toi.
Océane S., Vincent, Bastien, ce fut un plaisir de vous rencontrer et de passer ces quelques
premiers mois avec vous. Merci pour cette intégration en bonne et due forme au sein de l’équipe
des doctorants.

A ceux arrivés en cours de route, et qui attaquent la troisième année, Damien, Toan, Nicolas,
merci. Damien, merci pour ces discussions qui ont rarement de sens, tu as cette capacité à rendre
une pause plus fatigante que le travail lui-même. Nicolas, quelle belle personne tu es. Merci
pour ces formations accélérées en biochimie, merci pour tes folles idées.

Marco, I am so happy to have met you. You are such a wonderful person. Thank you so much
for all the conversations and the beers by the sea. You have been so helpful to see the PhD from
another point of view and putting life into perspective. I wish you all the best, you really deserve
it.

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Aux dernières arrivées, Charlotte, Charlène, et Mélanie C., je vous souhaite le meilleur. France,
un peu plus d’1 an que tu as rejoint le laboratoire, et tu fais déjà largement partie du groupe des
amies. Merci pour ton grain de folie et tes accents saugrenus.

Merci aussi aux post-doctorants, Beatriz et Maxence, pour votre expérience de la thèse et les
discussions.

Enfin, merci à mes amis, qui ont suivi de près ou de loin cette folle aventure bretonne, Julian,
Inès, Anaïs. Anaïs, ma meilleure amie depuis bientôt plus de 10 ans. Le destin nous aura fait
quitter les Ardennes en même temps, et nous aura réunies dans ce magnifique Finistère. Tu as
toujours été un soutien incroyable, le meilleur de tous. Du fond du cœur, merci.

Merci à ma famille, qui m’aura appris à croire en mes rêves et à ne jamais les lâcher. Malgré la
difficulté, merci de m’avoir laissée partir, et de toujours être mon cocon à chacun de mes
retours. Merci pour votre soutien, je ne saurais être forte sans vous.

Merci à la famille Devaux, pour votre soutien. Vous m’avez suivie durant toute cette aventure,
et je vous en suis extrêmement reconnaissante.

Je terminerais cette partie par remercier Thomas. Tu as suivi cette thèse depuis l’autre bout de
la France, et ce malgré ces presque 800 km, presque 7h00 de train. Cette aventure n’aurait pas
eu la même saveur sans toi, tu as été un pilier indispensable, tu m’as donné la force d’aller
jusqu’au bout. De nouvelles aventures nous attendent, j’ai hâte de construire ces nouveaux
projets avec toi.

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Sommaire

Liste des abréviations ................................................................................................................. 8

INTRODUCTION .................................................................................................................... 11
Liste des illustrations ................................................................................................................ 13
Liste des tableaux ..................................................................................................................... 15
Introduction générale ................................................................................................................ 17
Contexte bibliographique ......................................................................................................... 21
1. Le noyer commun (Juglans regia L.) ........................................................................................ 21
2. Les maladies de dépérissement ................................................................................................. 30
3. Décrypter le pathobiome fongique : diversité inter et intraspécifique des micro-organismes et
interactions ........................................................................................................................................ 46
RESULTATS ........................................................................................................................... 75
CHAPITRE I - Mise au point méthodologique du séquençage métabarcoding pour son
application aux échantillons environnementaux de noyer ....................................................... 77
I. Introduction des travaux ....................................................................................................... 79
II. Article publié dans Plants .................................................................................................... 80
CHAPITRE II - Etude de la diversité fongique associée aux fruits et rameaux de noyer
présentant des symptômes de dépérissement et leurs interactions ......................................... 115
I. Introduction des travaux ..................................................................................................... 117
II. Article en préparation ........................................................................................................ 119
CHAPITRE III - Etude de la diversité intraspécifique des populations de B. dothidea et N.
parvum .................................................................................................................................... 173
I. Introduction des travaux ..................................................................................................... 175
II. Article en préparation ........................................................................................................ 176
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ............................................................... 213
ANNEXES ............................................................................................................................. 235
I. Annexe 1 - Revue publiée dans Pathogens ......................................................................... 236
VALORISATIONS SCIENTIFIQUES .................................................................................. 251
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................... 261

7
Liste des abréviations
AASW Aguas Agrias Stream Water
ACT Actine
ADN Acide désoxyribonucléique
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
ANOVA Analysis of Variance
ANSES Agence national de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du
travail
AOP Appellation d’Origine Protégée
ARN Acide ribonucléique
ARNr Acide ribonucléique ribosomique
ASV Amplicon sequence variant
BAN Brown Apical Necrosis
BDA Black Dead Arm
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BPP Bayesian posterior probabilities
CAL Calmoduline
CARIBOU Caractérisation d’Outils Innovants de CARactérisation et de détection des
Botryosphaeriaceae
CASDAR Compte d’Affectation Spéciale Développement Agricole et Rural
CAZymes Carbohydrate active enzymes
CHS-1 Chitine synthase 1
CNV Copy number variation
CTIFL Centre Technique Interprofessionnel des Fruits et Légumes
CWDE Cell Wall Degrading Enzymes
DAPC Discriminant Analysis of Principal Components
DGDDI Direction Générale des Douanes et Droits Indirects
EF1-α Facteur d’élongation 1 alpha
FAOSTAT Food and Agriculture Organization Corporate Statistical Database
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GEVES Groupe d’Etude et de contrôle des Variétés Et des Semences

8
HIS Histone 3
INSEE Institut National de la Statistique et des Etudes Economiques
ITS Internal Transcribed Spacer
LSU Large subunit (grande sous-unité ARNr 28S)
LWM Leaf Wetness Model
MAGIC Gestion des Maladies fonGIques du noyer par des solutions de bioContrôle
MCMC Markov Chain Monte Carlo
MLG Multilocus genotype
MP-PCR Microsatellite-Primed PCR
NCBI National Center for Biotechnology Information
NGS Next Generation Sequencing
PCC Pearson’s correlation coefficient
PCoA Principal Coordinates Analysis
PCR Polymerase Chain Reaction
PDA Potato Dextrose Agar
PERMANOVA Permutational Multivariate Analysis of Variance
PGTB Plateforme Génome Transcriptome de Bordeaux
qPCR Quantitative PCR
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RPB1 sous-unité RPB1 de l’ARN polymerase II
RPB2 sous-unité RPB2 de l’ARN polymerase II
SDA Sabouraud Dextrose Agar
SENuRA Station d’Expérimentation Nucicole Rhône Alpes
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SparCC Sparse Correlations for Compositionnal data
SSP Small Secreted Protein
SSR Simple Sequence Repeat
SSR-seq SSR sequencing
SSU Small subunit (petite sous-unité ARNr 18S)

9
TUB β-tubuline
UBO Université de Bretagne Occidentale
UBOCC Collection de culture de l’UBO
UPGMA Unweighted Paired Group Mean Arithmetic

10
 INTRODUCTION

11
12
Liste des illustrations
Figure 1. Surfaces cultivées (ha) et production (t) de noix non décortiquées en France, et
exportation (t) vers l'Europe entre 1961 et 2021 (d'après FAOSTAT 2021). Les données
concernant les surfaces dédiées ne sont disponibles qu'à partir de 1985. ................................ 22

Figure 2. Répartition en pourcentage des pays de destination des noix non décortiquées
exportées depuis la France en 2021 (d'après DGDDI 2022). ................................................... 23

Figure 3. Verger de noyers commun (Juglans regia L.) de la variété Franquette en Isère
échantillonné durant ce projet de thèse (photographie personnelle). ....................................... 24

Figure 4. Planche photographique de symptômes de ravageurs et maladies sur le noyer

commun. A : Nécroses sur fruits provoquées par les larves de la mouche du brou (d’après
SENuRA 2019) ; B : Symptômes de la nécrose apicale du fruit (d’après Moya-Elizondo et al.
2021) ; C : Symptômes sur fruit de l’anthracnose causée par la présence de Colletotrichum
(d’après SENuRA 2019) ; D : Symptômes sur fruits de la bactériose causée par Xanthomonas
campestris pv. juglandis (d’après SENuRA 2019) ; E : Symptômes sur rameau de la bactériose
causée par Xanthomonas campestris pv. juglandis (d’après SENuRA 2019) ; F : Symptômes
sur fruits de l’anthracnose à Gnomonia (d’après SENuRA 2019) ; G et H : Symptômes sur fruits
du dépérissement du noyer (Flora Pensec, Adeline Picot) ; I et J : Symptômes sur rameaux du
dépérissement du noyer (Flora Pensec, Adeline Picot). ........................................................... 29

Figure 5. Carte de la surface (ha) dédiée à la nuciculture et recensement des espèces majeures
de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe isolées à partir d'échantillons de J. regia présentant des
symptômes de dépérissement (Figure réalisée sur la base des données FAOSTAT 2021 et de la
littérature citée précédemment). ............................................................................................... 36

Figure 6. Cycle biologique commun aux différentes espèces de Botryosphaeriaceae et de

Diaporthe sur noyer commun selon les conditions climatiques des pays à climat méditerranéen
(d'après López-Moral et al. 2020b). ......................................................................................... 39

Figure 7. Risque d'infection des fruits du pistachier par N. mediterraneum d'après le modèle
LWM en Californie. Les courbes de régression correspondent aux durées d'humectation et
températures nécessaires au développement de nécroses sur 10 % (courbe du haut) et sur 5 %
(courbe du bas) des feuilles de pistachiers inoculées artificiellement (adapté de Morgan et al.
2009)......................................................................................................................................... 43

13
Figure 8. Diversité des espèces de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe étudiées sur milieu PDA
après incubation à température et lumière ambiante et structures de reproduction sexuée et
asexuée (d’après Phillips et al. 2013; Udayanga et al. 2014a, respectivement). A-E. B.
dothidea ; F-J. N. parvum ; K-O. D. eres. A-B. Face supérieure et inférieure de B. dothidea à
10 jours. C. Ascospores. D. Conidies. E. Conidies âgées. F-G. Face supérieure et inférieure de
N. parvum à 10 jours. H. Ascospores. I. Conidies. J. Conidies âgées. K-L. Face supérieure et
inférieure de D. eres à 7 jours. M. Ascospores dans asques. N. ɑ-conidies. O. ꞵ-conidies. Barres
d’échelle : C-E = 10 µm, H = 10 µm, I-J = 5 µm, M-N = 15 µm, O = 10 µm......................... 51

Figure 9. Diversité des espèces de Colletotrichum et de Fusarium étudiées sur milieu PDA
après incubation à température et lumière ambiante et structures de reproduction asexuée
(d’après Damm et al. 2012; Crous et al. 2021, respectivement). A-C. C. fioriniae ; D-F. C.
godetiae ; G-I. F. juglandicola UBOCC-A-119001. A-B. Face supérieure et inférieure de C.
fioriniae à 7 jours. C. Conidies. D-E. Face supérieure et inférieure de C. godetiae à 10 jours. F.
Conidies. G-H. F. juglandicola UBOCC-A-119001 à 7 jours. I. Conidies. Barres d’échelle : C,
F, I = 10 µm. ............................................................................................................................. 52

Figure 10. Arbre phylogénétique de genres de la famille des Botryosphaeriaceae obtenu à l'aide
des loci SSU, LSU, ITS, EF1-α et TUB combinés, et enraciné par Saccharata proteae CBS
1125206 (Philips et al. 2013). .................................................................................................. 55

Figure 11. Arbre phylogénétique d'espèces du genre Diaporthe obtenu à l'aide des loci ACT,
Apn2, CAL, EF1-α, HIS, FG1093 (protéine ribosomique L37) et TUB combinés, et enraciné
par D. citri AR3405 (Udayanga et al. 2014a). ......................................................................... 56

Figure 12. Arbre phylogénétique d'espèces du genre Fusarium obtenu à l'aide des loci EF1-α,
RPB1 et RPB2 combinés, et enraciné par F. heterosporum CBS 391.68 (Crous et al. 2021). 56

14
Liste des tableaux
Tableau 1. Liste des maladies et ravageurs majeurs du noyer commun (Juglans regia L.) en
France et des principales espèces associées. ............................................................................ 25

Tableau 2. Exemples d’hôtes ligneux et principales espèces de Botryosphaeriaceae et de

Diaporthe reconnues comme étant associées aux symptômes de dépérissement à travers le
monde. ...................................................................................................................................... 32

Tableau 3. Caractéristiques des principales espèces pathogènes étudiées. .............................. 53

Tableau 4. Longueur et diamètre des nécroses moyens après inoculation de Botryosphaeriaceae

sp., Colletotrichum sp. et Diaporthe eres selon la méthode, le modèle, les conditions
d'inoculation et le cultivar de J. regia. ..................................................................................... 65

15
16
Introduction générale
L’agriculture tient une place importante dans le paysage français. En 2020, près de 47 %
du territoire français étaient dédiés à l’agriculture, soit près de 30 millions d’hectares,
positionnant la France comme premier pays producteur européen (Agreste 2022a). Ces surfaces
sont partagées en trois principales catégories, soit les cultures dites grandes cultures (environ
13 millions d’hectares en 2020), les cultures fourragères (environ 15 millions d’hectares) et les
cultures dites permanentes (plus d’1 million d’hectares), majoritairement représentées par les
vignobles et les vergers (Agreste 2022a). Parmi les vergers, les pommeraies (40 000 hectares
en 2020) et les noyeraies (environ 27 000 hectares en 2020) sont les deux cultures les plus
étendues (Agreste 2022a; b), cette dernière plaçant la France à la 9ème position mondiale en
termes de superficie et à la 12ème position en termes de production, avec plus de 37 000 tonnes
en 2021 (FAOSTAT 2021). La production nucicole française est d’autant plus importante que
le nombre d’hectares dédiés n’a cessé d’augmenter depuis les années 1990 (FAOSTAT 2021).
Elle est répartie entre deux bassins de production majoritaires : le bassin du Sud-Ouest, ou
territoire du Périgord, et le bassin du Sud-Est, ou territoire du Dauphiné (FranceAgriMer 2022).
Les noix françaises sont majoritairement commercialisées sous forme de fruits secs non
décortiqués, dont le prix de vente hors taxe se situait entre 3,22 € et 3,40 € par kilogramme en
2021 (Réseau des Nouvelles des Marchés 2022).

Les noyeraies sont la cible de nombreux ravageurs et maladies bactériennes et fongiques

pouvant provoquer de lourdes pertes de rendement pour les nuciculteurs. Viennent s’ajouter
aux maladies et ravageurs connus et installés dans les vergers depuis de nombreuses années,
tels que la bactériose (Giraud et al. 2011) ou l’anthracnose à Gnomonia (Verhaeghe 2014), de
nouvelles maladies fongiques dites émergentes. C’est le cas de l’anthracnose causée par les
espèces du genre Colletotrichum, constatée dans les noyeraies françaises au début des années
2000 (Giraud & Verhaeghe 2015), tandis que de nouveaux symptômes de dépérissements des
arbres ont été signalés à partir de 2015 (Laloum et al. 2022). Ces nouveaux symptômes étaient
principalement caractérisés par des brûlures et nécroses sur fruits, des nécroses et chancres sur
rameaux, ainsi que des branches et leurs rameaux totalement desséchés et improductifs (Laloum
et al. 2022). La nouveauté des symptômes et leur ampleur, jusque-là jamais décrites par les
stations d’expérimentations nucicoles, suggèrent leur caractère émergent sans toutefois exclure
que ces symptômes étaient déjà présents les années précédentes mais dans une moindre mesure
et étaient donc passés inaperçus. Suite à ces premières observations en 2015, des premiers
échantillonnages et isolements réalisés dans les vergers du bassin du Sud-Ouest en 2018 ont

17
permis de mettre en avant la présence d’espèces de la famille des Botryosphaeriaceae et du
genre Diaporthe (F. Trouillas, communication personnelle). L’identification de ces espèces
pathogènes associée à la description des symptômes ont permis d’orienter le diagnostic vers la
maladie du dépérissement du noyer, autrement appelée Botryosphaeria/Phomopsis canker and
blight disease, maladie particulièrement étudiée en Californie de par son impact dans les
noyeraies (Michailides et al. 2013, 2016).

De ces différentes observations est né ce projet de thèse dont l’objectif central est l’étude
des agents fongiques pathogènes associés au dépérissement du noyer en France. Les différentes
questions scientifiques qui se sont posées durant ce projet visaient à apporter des éléments de
réponse quant à l’étiologie, c’est à dire l’identification des agents pathogènes responsables de
ces symptômes, d’une part, mais aussi l'épidémiologie et le cycle de vie de ces agents
pathogènes, et sont les suivantes :

1. Quels sont les agents fongiques pathogènes responsables du dépérissement du noyer en

France et quels sont les facteurs influençant leur répartition ?

Afin de répondre à cette première question, quatre campagnes de prélèvements

d’échantillons de noyers sur deux années ont été réalisées. Les échantillons collectés étaient des
fruits (deux campagnes) et des rameaux (deux campagnes) à la fois d’apparence saine, afin
d’étudier le caractère latent des infections, et présentant des symptômes de dépérissement du
noyer. Un total de 12 parcelles a été échantillonné, six parcelles réparties dans le bassin du Sud-
Ouest et six autres dans le bassin du Sud-Est. La sélection des parcelles a été réalisée sur la base
de leur historique de symptômes de dépérissement réalisé par les stations expérimentales
nucicoles.

La caractérisation des communautés fongiques associées à ces échantillons a été réalisée

à l’aide de deux approches complémentaires : une approche culturale et une approche culture-
indépendante par la réalisation de séquençage métabarcoding. Par la suite, le pouvoir pathogène
des principales espèces fongiques suspectées d’être pathogènes et responsables des symptômes
a été évalué à l’aide d’inoculations sur rameaux détachés. Dans un deuxième temps, les
différents facteurs pouvant influencer la présence et le développement des agents pathogènes
ont été évalués, tels que la zone géographique, les conditions météorologiques ou encore les
pratiques agronomiques. Les résultats obtenus font l’objet du chapitre I, visant à valider une
méthode d’analyse par métabarcoding du pathobiome et du chapitre II, portant sur sa
caractérisation.

18
2. Quelles sont les interactions entre ces micro-organismes et le microbiome présent dans
les noix et rameaux ?

La présence simultanée de différents agents pathogènes associés aux symptômes sur

rameaux et sur noix, dans des proportions variables, suggère fortement la possibilité
d’interactions entre les composants du pathobiome, pouvant conduire à un ralentissement ou à
l’accélération du développement des symptômes. Une analyse des interactions entre les agents
pathogènes, entre eux d’une part, mais aussi avec l’ensemble des genres fongiques composant
le phytomicrobiome d’autre part a donc été réalisée afin d’approfondir la compréhension du
développement des agents pathogènes et donc des symptômes. Des hypothèses ont été émises
sur la base des résultats des analyses culture-dépendante et -indépendante présentées
précédemment, via des analyses de corrélations et des réseaux de co-occurrence. Des tests
d’inoculations simultanées ou différées ont ensuite été réalisés afin de valider certaines
hypothèses d’interactions compétitives ou facilitatrices entre les agents pathogènes. Ces travaux
sont inclus dans le chapitre II.

3. Quelle est la répartition des populations de Botryosphaeriaceae émergentes et leur degré

de diversité génétique dans les noyeraies françaises ?

Les maladies de dépérissement des espèces ligneuses sont souvent associées à la

présence de champignons de la famille des Botryosphaeriaceae. Aussi, cette partie du projet a
été centrée sur les principales espèces de Botryosphaeriaceae collectées lors des campagnes
d’isolement afin de comprendre les particularités de cette famille dans le cadre du
dépérissement des noyers en France. Une analyse de la diversité génétique et de la structure des
populations des deux espèces présentes, à savoir N. parvum et B. dothidea, a donc été réalisée
à l’aide d’un séquençage de régions microsatellites. Cette étape a pour objectif de comprendre
la répartition de ces populations dans les deux bassins de production échantillonnés ainsi que
leur degré de diversité génétique dans le but d’émettre des premières hypothèses concernant
leur origine, leur capacité à se reproduire de manière sexuée et les éventuelles voies de
dispersion. Ont ainsi été ajoutés à cette analyse des isolats provenant de Californie (collectés à
partir de noyers et d’amandiers) ainsi que d’Espagne (collectés à partir de noyers), mais aussi à
partir de vignes en France, culture particulièrement impactée par des dépérissements associés à
la présence des Botryosphaeriaceae. Cette analyse est présentée dans le chapitre III.

Ces recherches ont été possibles grâce au travail collaboratif mené avec les stations
nucicoles françaises et le Centre Technique Interprofessionnel des Fruits et Légumes (CTIFL),

19
notamment dans le cadre du projet CARIBOU (Développement d’Outils Innovants de
Caractérisation et de détection des Botryosphaeriaceae responsables du dépérissement du
noyer, 2021-2022). Ce projet d’une durée de 18 mois est un projet CASDAR porté par le CTIFL
par le biais du Centre opérationnel de Lanxade et réunit trois autres structures partenaires : la
Station d'Expérimentation Nucicole Rhône-Alpes (SENuRA), la Station Expérimentale de
Creysse, et le Laboratoire Universitaire de Biodiversité et Écologie Microbienne (LUBEM).
Les stations expérimentales nucicoles de Creysse et de la SENuRA ont eu un rôle crucial dans
la détection des symptômes aux vergers et l’échantillonnage des organes pour la réalisation des
analyses culturales et culture-indépendantes et ont apporté leur expertise sur la conduite de la
culture.

Ce manuscrit rend compte de l’ensemble des études menées sur les agents fongiques
pathogènes associés aux symptômes de dépérissement du noyer en France et résultats obtenus
via des articles publiés et en préparation.

20
Contexte bibliographique

1. Le noyer commun (Juglans regia L.)

1.1. La nuciculture - une culture à l’échelle mondiale

1.1.1. La noix à travers le monde

Le noyer commun, Juglans regia L., est l’espèce de noyer la plus cultivée à travers le
monde pour la production commerciale (Martínez-García et al. 2016). Son origine n’est à ce
jour pas encore totalement clarifiée, les études paléobotaniques suggérant actuellement de
multiples origines possibles allant de l’Europe de l’Est à l’Asie centrale (Aradhya et al. 2017).
Sa culture est aujourd’hui étendue à la majorité des continents, principalement en Europe et en
Amérique, et dans une moindre mesure au continent africain ainsi qu’à l’Océanie (Luo et al.
2022; McGranahan & Leslie 2012).
La production mondiale de noix non décortiquées ne cesse de croître, de plus de 800
000 tonnes en 1986 à 1,6 millions de tonnes en 2007, elle atteint en 2021 plus de 3,5 millions
de tonnes (FAOSTAT 2021; McGranahan & Leslie 1991, 2012). Le podium à l’échelle
mondiale est largement dominé par la Chine, avec 1 100 000 tonnes en 2021, suivie par les
Etats-Unis (657 710 tonnes) et l’Iran (386 976,5 tonnes). L’Union européenne se place quant à
elle en cinquième position après la Turquie (325 000 tonnes) avec une récolte s’élevant à 217
350 tonnes en 2021 (FAOSTAT 2021).

1.1.2. La filière nucicole française

La filière nucicole française se positionne dans le top 15 mondial en termes de

production récoltée (tonnes) et de surfaces dédiées (ha) en 2021. A l’échelle de l’Union
européenne, la France est le troisième plus gros pays producteur de noix (37 740 tonnes en
2021) et se positionne en tête des pays européens possédant le plus de surfaces dédiées à la
nuciculture avec un total de 26 850 ha en 2021 (Agreste 2022b; FAOSTAT 2021). Depuis 1991,
après une légère baisse entre 1985 et le début des années 90, les surfaces dédiées aux noyers
n’ont cessé d’augmenter, la valeur actuelle étant près de 2,5 fois supérieure à celle de 1991,
tendance suivie par la production dont les quantités ont été multipliées par 2,7 entre 1991 et
2021 (Figure 1). La nuciculture en France fait partie aujourd’hui des cultures fruitières les plus
importantes en termes de surfaces dédiées en se positionnant à la deuxième place derrière la

21
culture des pommiers (Agreste 2022b). Le commerce extérieur de noix est un important
débouché pour la production française. La majorité des noix exportées le sont sous forme de
noix sèches ou fraîches non décortiquées (21 579 tonnes contre 3 132 tonnes de noix exportées
sous forme de cerneaux en 2021). En lien avec l’augmentation des surfaces dédiées et de la
production, plus de la moitié de la production française est exportée depuis la fin des années 90,
dont plus de 95 % vers le continent européen, notamment l’Italie, l’Espagne et l’Allemagne
(DGDDI 2022; FAOSTAT 2021; Figure 1 et Figure 2).

Figure 1. Surfaces cultivées (ha) et production (t) de noix non décortiquées en France, et
exportation (t) vers l'Europe entre 1961 et 2021 (d'après FAOSTAT 2021). Les données
concernant les surfaces dédiées ne sont disponibles qu'à partir de 1985.

22
Figure 2. Répartition en pourcentage des pays de destination des noix non décortiquées exportées
depuis la France en 2021 (d'après DGDDI 2022).

La production française de noix est majoritairement concentrée dans deux bassins de

production : le bassin du Sud-Est, représenté par la région Auvergne-Rhône-Alpes, et le bassin
du Sud-Ouest, s’étendant de la région Nouvelle-Aquitaine à l’Occitanie. Les cinq départements
les plus producteurs sont, dans l’ordre décroissant de production en tonnes, la Dordogne, l’Isère,
la Drôme, le Lot et la Corrèze. A eux seuls, ces cinq départements représentent plus de 85 %
de la production française de noix (FranceAgriMer 2022). Le territoire périgourdin (bassin du
Sud-Ouest) et le territoire du Dauphiné (bassin du Sud-Est) sont tous deux concernés par une
Appellation d’Origine Protégée (AOP) : la Noix du Périgord (Syndicat professionnel de la noix,
du cerneau et de l’huile de Noix du Périgord n.d.) et la Noix de Grenoble (Comité
Interprofessionnel de la Noix de Grenoble n.d.) respectivement. Chacune de ces AOP soutient
la production des variétés typiques des deux territoires (les variétés Corne, Marbot et Grandjean
pour la première, les variétés Mayette et Parisienne pour la seconde), mais aussi la variété
Franquette, variété la plus répandue sur le territoire français et commune aux deux bassins bien
qu’initialement cultivée en Auvergne-Rhône-Alpes (Bernard et al. 2018; Garcin et al. 1999;
Figure 3).

23
Figure 3. Verger de noyers commun (Juglans regia L.) de la variété Franquette en Isère
échantillonné durant ce projet de thèse (photographie personnelle).

1.2. Intérêts et utilisation du noyer

Le noyer est particulièrement apprécié pour la qualité nutritionnelle de ses cerneaux du

fait de leur forte concentration en acides gras insaturés, vitamines, stérols, polyphénols et fibres.
En effet, des propriétés anti-oxydantes, anti-inflammatoires ainsi que protectrices du système
cardiovasculaire sont communément associées à ces composés (Ni et al. 2022). De plus, il a été
démontré que les noix présentent des effets positifs dans la régulation du diabète de type II et
du microbiote intestinal ainsi que dans la prévention de certains types de cancers et maladies
neurodégénératives (Jahanban-Esfahlan et al. 2019; Ni et al. 2022). Ces effets bénéfiques ont
été constatés lors d’une consommation de noix constante et proche des recommandations, soit
une poignée par jour (Jahanban-Esfahlan et al. 2019; Ni et al. 2022; Santé publique France
2019). La noix peut également être associée en co-formulation avec d’autres produits tels que
la viande, afin de réduire les risques cardiovasculaires associés à la consommation de ce type
d’aliment (Jiménez-Colmenero et al. 2010).

24
 Outre ses cerneaux destinés à l’alimentation, le noyer présente nombreux autres intérêts
notamment industriels et technologiques. Tout d’abord dans l’industrie du bois, second
domaine d’utilisation le plus important après l’alimentation, le noyer fait partie des essences les
plus précieuses pour l’ameublement et la menuiserie, du fait notamment de ses propriétés
physiques et mécaniques ainsi que la diversité de ses couleurs qui en font un bois
particulièrement esthétique (Voulgaridis & Vassiliou 2005). D’autres utilisations mineures
concernent notamment la coque et le brou de noix dans le domaine des matériaux (Prabhakaran
et al. 2021; Shejkar et al. 2020), de la cosmétique (Beiki et al. 2018), pour l'absorption de
colorant ou pour la décontamination des eaux (Li et al. 2020) ou encore dans le domaine des
biotechnologies comme la bioraffinerie et la chimie verte (Morales et al. 2021, 2022; Tan et al.
2019).

1.3. Les bio-agresseurs du noyer commun

Les noyers sont la cible de nombreux ravageurs mais aussi de maladies, aussi bien
bactériennes, virales que fongiques, toutes responsables de dégâts potentiellement importants
(Tableau 1).

Tableau 1. Liste des maladies et ravageurs majeurs du noyer commun (Juglans regia L.) en France
et des principales espèces associées.

Type d’agression Agresseur (Espèce) Première référence associée

Ravageur Acarien rouge (Panonychus ulmi) Koch, 1836

Carpocapse (Cydia pomonella) Linnaeus, 1758

Cochenille du noyer (Quadraspidiotus juglansregiae) Comstock, 1881

Gros puceron du noyer (Panaphis juglandis) Goeze, 1778

Lécanium du cornouiller (Parthenolecanium corni) Bouché, 1844

Mouche du brou (Rhagoletis completa) Cresson, 1929

Petit puceron du noyer (Chromaphis juglandicola) Kaltenbach, 1843

Phytopte du noyer (Aceria erinea) Nalepa, 1891

Maladie bactérienne Bactériose ou Brûlure du noyer Pierce, 1901

(Xanthomonas campestris pv. juglandis)

Chancre vertical suintant Pierce, 1901

(Xanthomonas campestris pv. juglandis)

Galle du collet (Agrobacterium tumefaciens) Conn, 1942

Nécrose de l’écorce (Brenneria nigrifluens) Hauben, 1999

25
Table 1. Suite.

Type d’agression Agresseur (Espèce) Première référence associée

Maladie fongique Anthracnose (Ophiognomonia leptostyla) Cesati & de Notaris, 1863

Anthracnose (Colletotrichum godetiae, C. fioriniae) Neergaard, 1950

Marcelino & Gouli, 2008

Chancres (Cytospora sp.) Ehrenb, 1818

Chancres des tiges (Fusarium solani) Saccardo, 1881

Chancres (Phaeoacremonium spp.) Gams, Crous and Wingfield,

1996

Dépérissement du noyer (Botryosphaeriaceae spp., Theissen & Sydow, 1918

Diaporthe spp.) Nitschke, 1870

Encre du noyer (Phytophthora sp.) de Bary, 1876

Nécrose apicale du fruit (Alternaria spp., Fusarium Nees, 1817

spp.) Link, 1809

Pourridié (Armillaria mellea) Kumm, 1871

Maladie virale Maladie de la ligne noire (Cherry Leaf Roll virus) -

Parmi ces ravageurs et maladies, cinq sont particulièrement répandus depuis plusieurs
années dans les vergers de noix français : la mouche du brou, la bactériose à Xanthomonas, la
nécrose apicale du fruit, et enfin, l’anthracnose causée par Gnomonia ou par Colletotrichum.
Ces ravageurs et maladies ont la particularité de provoquer des symptômes similaires au cours
de leur développement et peuvent alors être confondus :

 La mouche du brou (Rhagoletis completa) est l’un des principaux ravageurs des noyers
français. Originaire du continent américain, elle est présente en Europe depuis la fin des
années 80, et sa présence en France a été rapportée en 2007 (Verheggen et al. 2017).
Les dégâts causés par la mouche du brou sont dus à ses larves, que la femelle pond dans
le brou des fruits, et qui s’en nourrissent après éclosion jusqu’à la fin de leur cycle
larvaire. Leur développement entraîne alors un pourrissement important du brou et du
fruit (Figure 4A). Les pertes de rendement provoquées par sa présence peuvent aller de
moins de 10 % à 100 % en cas d’absence de traitement (ANSES 2014).

 La bactériose du noyer, aussi appelée brûlure du noyer, est une maladie bactérienne
causée par l’espèce Xanthomonas campestris pv. juglandis (syn. X. arboricola pv.
juglandis; Radix et al. 1994). Cette bactérie phytopathogène est capable de provoquer
des symptômes sur les fruits, mais aussi sur les bourgeons, les feuilles, les rameaux ainsi

26
 que sur les fleurs femelles et les chatons (Giraud et al. 2011; Radix et al. 1994). Sur
fruits, la bactériose se caractérise par l’apparition de petites taches noires huileuses qui
évoluent vers d’importantes nécroses au cours de l’avancement de la maladie
(Figure 4D). L’infection précoce des fruits entraîne de façon importante leur chute
avant maturité (Giraud et al. 2011). Sur rameaux, elle est responsable de dessèchement
du bois pouvant entraîner un enroulement caractéristique en crosse (Figure 4E).

 La nécrose apicale du fruit, autrement appelée BAN (pour Brown Apical Necrosis), est
une maladie fongique principalement causée par des espèces des genres Alternaria (dont
A. alternata) et Fusarium. La bactérie X. campestris pv. juglandis, régulièrement
collectée de fruits présentant des symptômes de BAN, semble aussi avoir un rôle dans
le développement de cette maladie (Belisario et al. 2002, 2010; Moragrega et al. 2011).
Observée et étudiée en France à la fin des années 1990, elle est caractérisée par le
noircissement et un décollement de l’extrémité stigmatique ainsi que le pourrissement
des tissus internes (Figure 4B; Belisario et al. 2002; Moragrega & Özaktan 2010). A
un stade avancé, les nécroses peuvent s’étendre sur plus de la moitié des fruits
(Belisario et al. 2010).

 L’anthracnose associée à Gnomonia, aussi appelée maladie des tâches foliaires, est une
maladie fongique causée par Ophiognomonia leptostyla (auparavant Gnomonia
leptostyla), espèce phytopathogène appartenant au phylum des Ascomycota, qui touche
les deux espèces cultivées Juglans regia (noyer commun) et J. nigra (noyer noir
d’Amérique; Belisario et al. 2008; Sogonov et al. 2008). Cette maladie, fortement
répandue sur la totalité des continents cultivateurs de noix, cible essentiellement les
feuilles et les fruits et son développement se traduit principalement par l’apparition de
tâches nécrotiques irrégulières, entourées de halos chlorotiques et dont le centre présente
une coloration typique vert clair à blanchâtre lors de stades avancés (Figure 4F;
Verhaeghe 2014). Des infections précoces peuvent entraîner la malformation des fruits
ainsi que leur chute. Enfin, lors d’infections sévères, les arbres peuvent souffrir d’une
sévère défoliation, impactant la santé des branches et des fruits (Verhaeghe 2014;
Woeste & Beineke 2001).

 L’anthracnose associée à Colletotrichum est une maladie apparue plus récemment sur
noyers. En France, elle a été rapportée pour la première fois en 2007 (Da Lio et al. 2018;
Giraud & Verhaeghe 2015; Verhaeghe et al. 2021). De nombreuses espèces du genre

27
 Colletotrichum sont associées à cette maladie, appartenant principalement aux
complexes d’espèces C. acutatum et C. gloeosporioides. Parmi celles-ci, les espèces
majoritairement identifiées en France sont C. fioriniae et C. godetiae, toutes deux
appartenant au complexe C. acutatum (Da Lio et al. 2018). Cette maladie provoque
principalement des symptômes sur fruits (Da Lio et al. 2018; Giraud & Verhaeghe
2015). Elle se caractérise par l’apparition de petites tâches nécrotiques qui évoluent
jusqu’à recouvrir l’entièreté du brou, causant des nécroses importantes. Lors d’un stade
avancé au cours duquel le cerneau est souvent atteint, le développement d’acervules
oranges caractéristiques peut être visualisé (Figure 4C; Giraud & Verhaeghe 2015).
Des symptômes sont aussi observables sur les feuilles, sous la forme de tâches
nécrotiques à centre clair. Les pertes de rendement provoquées par la maladie sont
conséquentes et peuvent aller jusqu’à 70 % certaines années en France
(Da Lio et al. 2018; Giraud & Verhaeghe 2015; Verhaeghe et al. 2021).

Les symptômes provoqués par ces cinq maladies et ravageurs peuvent facilement être
confondus, aussi bien au début du développement des symptômes que plus tard dans l’avancée
de la maladie. Sur fruits, les nécroses provoquées par ces cinq maladies sont semblables lors
des premiers stades de développement, jusqu’à l’apparition de centres blancs caractéristiques
des tâches nécrotiques causées par O. leptostyla. L’observation de nécroses causées par les
espèces du genre Colletotrichum à un stade avancé est commune aux nécroses provoquées par
la bactériose, la nécrose apicale de fruit et par la mouche du brou sur fruits. Ces maladies
pouvant être présentes conjointement sur un même fruit, leur distinction devient alors
particulièrement difficile voire impossible.
De plus, les cinq maladies et ravageurs présentés ci-dessus provoquent sur fruits des
symptômes similaires à ceux causés par le dépérissement du noyer, maladie qui fait l’objet de
ce manuscrit et dont la description se trouve dans la partie suivante.

28
Figure 4. Planche photographique de symptômes de ravageurs et maladies sur le noyer commun.
A : Nécroses sur fruits provoquées par les larves de la mouche du brou (d’après SENuRA 2019) ;
B : Symptômes de la nécrose apicale du fruit (d’après Moya-Elizondo et al. 2021) ; C : Symptômes
sur fruit de l’anthracnose causée par la présence de Colletotrichum (d’après SENuRA 2019) ;
D : Symptômes sur fruits de la bactériose causée par Xanthomonas campestris pv. juglandis
(d’après SENuRA 2019) ; E : Symptômes sur rameau de la bactériose causée par
Xanthomonas campestris pv. juglandis (d’après SENuRA 2019) ; F : Symptômes sur fruits de
l’anthracnose à Gnomonia (d’après SENuRA 2019) ; G et H : Symptômes sur fruits du
dépérissement du noyer (Flora Pensec, Adeline Picot) ; I et J : Symptômes sur rameaux du
dépérissement du noyer (Flora Pensec, Adeline Picot).

29
2. Les maladies de dépérissement

2.1. Le dépérissement des ligneux

Les maladies dites de dépérissement sont des pathologies atteignant les branches et les
racines, et provoquant un déclin progressif de l’hôte atteint pouvant aller jusqu’à sa mort
(Shurtleff & Averre 1997). Elles sont répandues partout à travers le monde, sur de très
nombreux hôtes, et sont provoquées par une très grande diversité d’agents pathogènes.
Les maladies du dépérissement provoquées par des pourritures racinaires sont causées
par un agent pathogène commun à la majorité des arbres présentant cette maladie : les espèces
du genre Phytophthora. Sur noyer, ce genre est responsable de la maladie de l’encre du noyer,
détruisant les racines du porte-greffe et entraînant la mort de l’hôte (Belisario et al. 2005;
Mircetich & Matheron 1983). Plus de 10 espèces différentes de Phytophthora sont associées
aux symptômes de la maladie de l’encre, dont plusieurs ont été retrouvées conjointement.
Certaines espèces semblent être associées à des symptômes différents (Belisario et al. 2005;
Vettraino et al. 2003).
Les maladie de dépérissement de la partie aérienne des arbres ligneux peuvent, quant à
elles, se manifester sous la forme de divers symptômes sur les feuilles (de type chloroses), les
jeunes rameaux, les branches voire les troncs (de type assèchement, brûlures, nécroses et
chancres), les bourgeons, ainsi que sur fruits dans le cas de quelques arbres fruitiers et arbres à
fruits à coques et à noyaux (de type flétrissement, nécroses, brûlures et momification, qui se
caractérise par un assèchement complet des fruits). Ces divers dépérissements sont regroupés
sous le terme plus large de “maladies du troncs”, ou “trunk diseases”, du fait de leur important
impact sur les organes lignifiés des hôtes cibles. Ces maladies de dépérissement peuvent toucher
une large gamme d’hôtes ligneux, des arbres fruitiers aux plantes ornementales en passant par
les cultures et les arbres forestiers (voir paragraphe ci-dessous).
Parmi celles-ci, il est possible de citer le mondialement répandu et étudié dépérissement
de la vigne, regroupant entre autres, le dépérissement à Botryosphaeria ou Botryosphaeriose
(aussi nommé Black Dead Arm - BDA ou Botryosphaeria canker) ainsi que les dépérissements
causés par Diaporthe. Les maladies responsables de ces dépérissements ont une aire de
répartition à l’échelle mondiale et ont été rapportés dans de nombreux pays viticoles sur tous
les continents (en Afrique (Guerin-Dubrana et al. 2019; Lesuthu et al. 2019; van Niekerk et al.
2006), Amérique (Larach et al. 2022; Travadon et al. 2022; Úrbez-Torres et al. 2013a; Úrbez-
Torres & Gubler 2009), Asie (Guerin-Dubrana et al. 2019; Manawasinghe et al. 2019;

30
Yan et al. 2013), Europe (Guarnaccia et al. 2018; Guerin-Dubrana et al. 2019) et en Océanie
(Billones-Baaijens & Savocchia 2019)). Leurs symptômes sont similaires, représentés
principalement par des chancres pérennes, la mortalité des jeunes pousses et des bourgeons, le
flétrissement des fruits et le développement de chloroses foliaires. Les agents pathogènes
associés à ces deux maladies sont parfois retrouvés en co-occurrence dans les organes
symptomatiques (Guerin-Dubrana et al. 2019; Hrycan et al. 2020; Travadon et al. 2022; Úrbez-
Torres et al. 2013a), soit des espèces de la famille des Botryosphaeriaceae, principalement
associées au dépérissement à Botryosphaeria, et des espèces du genre Diaporthe (forme
téléomorphe de Phomopsis spp.), principalement associées avec les dépérissements causés par
Diaporthe. A présent, plus de 25 espèces de Botryosphaeriaceae ont été reconnues comme
associées aux symptômes de dépérissement de la vigne, dont principalement Botryosphaeria
dothidea, Diplodia seriata, Lasiodiplodia theobromae et Neofusicoccum parvum (Billones-
Baaijens & Savocchia 2019; Gramaje et al. 2018; Larignon 2016; Úrbez-Torres 2011; Úrbez-
Torres & Gubler 2009), ainsi qu’au moins 20 espèces de Diaporthe, dont principalement
Diaporthe ampelina (Phomopsis viticola), Dia. eres et Dia. foeniculina (Larignon 2016;
Lawrence et al. 2015; Makris et al. 2022; Manawasinghe et al. 2019; Úrbez-Torres et al.
2013a).
De nombreuses espèces de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe ont aussi été reconnues
comme faisant partie du complexe d’espèces responsable du dépérissement sur d’autres hôtes
ligneux, comme par exemple le pommier, le pistachier, l’olivier ou encore le chêne (Tableau
2). Plus de 35 espèces de Botryosphaeriaceae, dont principalement les genres Botryosphaeria
(1 espèce), Diplodia (16 espèces), Dothiorella (6 espèces), Lasiodiplodia (5 espèces) et
Neofusicoccum (8 espèces), et plus de 5 espèces de Diaporthe ont été isolées à partir de
symptômes de dépérissement sur ces différents hôtes, mais seules les espèces les plus
fréquemment retrouvées sont considérées comme majoritairement associées aux symptômes,
ces espèces étant souvent les seules dont la pathogénicité a été vérifiée, souvent par simple
inoculation. Les espèces des différents taxons, comme pour la vigne, sont fréquemment
retrouvées en co-occurrence (Tableau 2).

31
Tableau 2. Exemples d’hôtes ligneux et principales espèces de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe
reconnues comme étant associées aux symptômes de dépérissement à travers le monde.

Hôte (Espèce) Espèce Référence

Chêne (Quercus spp.) D. agrigolia Batista et al. 2020;

D. corticola Linaldeddu et al. 2013;
D. quercivora Lynch et al. 2013;
Dot. iberica Moricca et al. 2018
Phomopsis quercina

Olivier (Olea europaea) B. dothidea Linaldeddu et al. 2023;

D. mutila Moral et al. 2010;
D. seriata Úrbez-Torres et al. 2013b;
Dot. iberica van Dyk et al. 2021
L. theobromae
N. australe
N. luteum
N. mediterraneum
N. stellenboschiana
N. vitifusiforme
Dia. foeniculina
Dia. viticola

Pistachier (Pistacia vera) B. dothidea Chen et al. 2014b, 2015;

D. seriata Gusella et al. 2022;
Dot. iberica López-Moral et al. 2020a;
Dot. sarmentorum Nouri et al. 2019
L. americana
L. citricola
L. gilanensis
L. pseudotheobromae
N. hellenicum
N. mediterraneum
N. parvum
N. vitifusiforme
Dia. ambigua
Dia. chamaeropis
Dia. foeniculina

Pommier (Malus domestica) B. dothidea Delgado-Cerrone et al. 2016;

D. intermedia Díaz et al. 2022;
D. mutila Havenga et al. 2019;
D. pseudoseriata Mang et al. 2022;
D. seriata Sessa et al. 2016
L. theobromae
N. arbuti
N. australe
N. luteum
N. parvum
Dia. eres
Dia. foeniculina

Outre ces agents pathogènes majeurs, d’autres espèces fongiques saprophytes et/ou
pathogènes sont aussi parfois isolées dans les organes infectés, telles que des espèces des genres
cités précédemment (Tableau 1) : Alternaria, Colletotrichum, Cytospora, Fusarium et

32
Phaeoacremonium (Díaz et al. 2022; Gao et al. 2021; López-Moral et al. 2020a; Michailides
et al. 2013; Nouri et al. 2019; Spies et al. 2020; Úrbez-Torres et al. 2013b).

2.2. Cas du dépérissement du noyer

2.2.1. Historique du dépérissement

C’est en Californie, en 1915, que Fawcett décrit pour la première fois des symptômes
se rapprochant de ceux du dépérissement du noyer et rapporte l’implication d’espèces de la
famille des Botryosphaeriaceae, notamment l’espèce Dothiorella gregaria (Fawcett 1915). Le
dépérissement des noyers, qualifié de nouvelle maladie ciblant le noyer commun J. regia, est
alors décrit sous le nom de “Melaxuma” et sévit dans les vergers californiens depuis les années
1910. Il y est rapporté d’importants chancres et zones de nécroses sur les troncs et aux
embranchements ainsi que sur les jeunes branches, symptômes se rapprochant de la maladie du
flétrissement des branches causées par Neo. dimidiatum (Tableau 1; Fawcett 1915). La
présence d’espèces de la famille des Botryosphaeriaceae et du genre Diaporthe associée à des
nécroses et des brûlures de rameaux a ensuite été rapportée sur le continent asiatique, au Japon
en 1954 (Matuo & Sakurai 1954) puis dans l’ouest de l’Asie en 1960 (Ibragimov 1960). Le
premier rapport de la présence de dépérissement de noyer sous ce terme en Europe date du
début des années 1980, mettant en avant cette fois-ci l’implication d’espèces du genre
Diaporthe dans des noyeraies italiennes (Sisto & Luisi 1983; Vercesi 1982) ainsi qu’en Europe
de l’Est (Voronin et al. 1986). Par la suite, l’espèce B. ribis est rapportée comme étant associée
au flétrissement et dépérissement de branche de noyers en Grèce en 1987 (Rumbos 1987). Des
chancres et des dépérissements de branches et de rameaux ont ensuite de nouveau été rapportés
en Italie en lien avec l’espèce B. ribis (Frisullo et al. 1994). Toutes ces études rapportent
essentiellement la présence d’un seul acteur fongique phytopathogène principal, les différentes
espèces étaient alors rarement signalées en association, et étaient souvent associées à des
maladies distinctes. En effet, le paradigme “un agent pathogène - une maladie” était, à cette
époque, la clé de voûte de la phytopathologie, créant ainsi d’éventuels biais dans la description
de ces maladies.
La maladie du dépérissement du noyer telle qu’elle est connue et décrite aujourd’hui a
fait l’objet de nombreuses et récentes études du fait d’une ré-émergence des symptômes dans
les pays cités ci-dessus ainsi qu’une émergence dans de nouveaux pays, actuellement étendue
à la totalité des pays producteurs de noix. Ces symptômes regroupent à la fois ceux décrits
précédemment ainsi que des symptômes nouvellement constatés sur fruits et sur feuilles, en

33
association avec une plus grande diversité d’espèces. L’émergence nouvelle de la maladie a été
constatée depuis le début des années 2000. Tout d’abord aux Etats-Unis (Californie), où elle est
décrite sous le nom de “Botryosphaeria and Diaporthe canker and blight”, témoignant de la
potentielle implication conjointe d’espèces de la famille des Botryosphaeriaceae et du genre
Diaporthe (Chen et al. 2014a; Michailides et al. 2012; Michailides & Hasey 2010), puis plus
récemment au Chili (Díaz et al. 2018; Jiménez Luna et al. 2020). C’est aussi le cas sur le
continent Eurasien, particulièrement en Corée (Cheon et al. 2013), Chine (Fan et al. 2018; Li
et al. 2016; Yu et al. 2015; Zhang et al. 2017), Croatie (Novak et al. 2018), Espagne (López-
Moral et al. 2020b; Moral et al. 2010), Iran (Sohrabi et al. 2020), Italie (Gusella et al. 2021),
Hongrie (Zabiák et al. 2023), République tchèque (Eichmeier et al. 2020), Roumanie (Mihaescu
et al. 2021), Slovaquie (Juhásová et al. 2005) et Turquie (Yildiz et al. 2022). Enfin, l’Egypte
(Haggag et al. 2007) et l’Australie (Antony et al. 2023) font eux aussi des pays dans lesquels
se répand la maladie.

2.2.2. Les agents responsables et leur distribution

Comme présenté précédemment, les principaux agents pathogènes responsables du

dépérissement du noyer appartiennent à la famille des Botryosphaeriaceae et au genre
Diaporthe. A ce jour, de nombreuses études ont permis de recenser 21 espèces de
Botryosphaeriaceae isolées à partir de symptômes de dépérissement sur le noyer commun, ainsi
que 7 espèces du genre Diaporthe à l’échelle mondiale (Figure 5). Certaines espèces sont
majoritairement isolées et communes à de nombreuses zones géographiques, telles que B.
dothidea, D. seriata, N. mediterraneum, N. parvum et Dia. eres (rapportées dans 3 à 10 pays),
tandis que d’autres espèces semblent associées à certaines zones géographiques (comme par
exemple D. gallae, Dot. plurivora et L. mahajangana, à ce jour associées au dépérissement du
noyer en Iran, ainsi que Dia. nobilis à ce jour uniquement associées au dépérissement du noyer
commun en Chine; Figure 5).
Sur le continent américain, et plus particulièrement en Californie, probablement en
partie du fait de la concentration des cultures de noyers, une large diversité d’espèces associées
au dépérissement de cette culture est présente. Actuellement, 10 espèces de Botryosphaeriaceae
(B. dothidea, D. mutila, D. seriata, Dot. iberica, L. citricola, N. mediterraneum, N.
nonquaesitum, N. parvum, N. vitifusiforme et Neo. dimidiatum) et une espèce de Diaporthe
(Dia. foeniculina (syn. Dia. neotheicola/Dia. rhusicola selon Udayanga et al. 2014b) ont été
rapportées dans les noyeraies californiennes (Chen et al. 2014a; Michailides et al. 2012). De

34
même, au Chili, second pays du continent américain ayant rapporté la présence de
dépérissement du noyer sur son territoire, quatre espèces de Botryosphaeriaceae (D. mutila, D.
seriata, Dot. sarmentorum et N. parvum) et deux espèces de Diaporthe (Dia. australafricana
et Dia. cynaroidis) ont été isolées de symptômes de dépérissement sur noyer jusqu’à présent
(Díaz et al. 2018; Iqbal et al. 2023; Jiménez Luna et al. 2020, 2022a). Il est intéressant de noter
ici que ces deux espèces de Diaporthe ont exclusivement été retrouvées au Chili comme
associées au dépérissement du noyer commun.
En Europe, le dépérissement du noyer commun a été détecté et rapporté dans 7 pays à
ce jour. C’est en Espagne que la plus grande diversité d’espèces a été décrite, soit 6 espèces de
Botryosphaeriaceae (B. dothidea, D. seriata, Dot. sarmentorum, Dot. sp., N. mediterraneum,
N. parvum) et 2 espèces de Diaporthe (Dia. amygdali et Dia. foeniculina), (López-Moral et al.
2020b)). Ces espèces ont été retrouvées dans 7 des 10 vergers échantillonnés présentant des
symptômes de dépérissement, et en co-occurrence dans 5 d’entre eux, soulignant leur
potentielle forte implication dans le dépérissement des noyers (López-Moral et al. 2020b).
L’association d’espèces de la famille des Botryosphaeriaceae et du genre Diaporthe a aussi été
rapportée en Hongrie (D. seriata et Dia. eres; Zabiák et al. 2023), et en République tchèque (D.
seriata, Dot. omnivora et Dia. eres; Eichmeier et al. 2020). Enfin, seules des espèces de
Botryosphaeriaceae ont été décrites en Grèce (Chen et al. 2014a), Italie (Gusella et al. 2021) et
en Slovaquie (Juhásová et al. 2005), et de Diaporthe en Roumanie (Mihaescu et al. 2021).
De la Turquie à la Corée, la présence de B. dothidea, D. gallae, D. seriata, Dot.
omnivora, Dot. plurivora, Dot. sarmentorum, Dot. viticola, L. mahajangana, L.
pseudotheobromae, L. theobromae, N. mediterraneum, N. parvum, Neo. dimidiatum, ainsi que
de Dia. amygdali, Dia. eres et Dia. nobilis a été rapportée dans les noyeraies, dont la majorité
en Iran (Cheon et al. 2013; Derviş et al. 2019; Li et al. 2016; Liu et al. 2020; Meng et al. 2018;
Sohrabi et al. 2020; Yang et al. 2018a; Yildiz et al. 2022; Yu et al. 2015; Zhang et al. 2017).
Les noyeraies australiennes sont, quant à elles, plutôt associées au développement de D.
seriata, Dot. omnivora, Dot. viticola, N. macroclavatum et N. parvum (Antony et al. 2023).
Enfin, sur le continent africain, seule l’Egypte a rapporté la présence de dépérissement
de noyers, associé L. theobromae, la seule espèce y ayant été rapportée à ce jour
(Haggag et al. 2007).

35
Figure 5. Carte de la surface (ha) dédiée à la nuciculture et recensement des espèces majeures de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe isolées à partir d'échantillons
de J. regia présentant des symptômes de dépérissement (Figure réalisée sur la base des données FAOSTAT 2021 et de la littérature citée précédemment).

36
 2.2.3. Cycle infectieux et symptômes observés sur noyer commun

[Link]. Nature de l’inoculum

Bien que les espèces de la famille des Botryosphaeriaceae et du genre Diaporthe soient
capables de se reproduire de manière sexuée et asexuée, cette dernière a été rapportée comme
la plus répandue dans les noyeraies, comme en témoignent les travaux de Michailides et al.
(2017) dans les noyeraies californiennes et de López-Moral et al. (2020b) dans les noyeraies
espagnoles. Grâce à ces études, le cycle d’infection de ces espèces sur noyer a commencé à être
élucidé, comme détaillé dans les paragraphes ci-dessous. Bien que B. dothidea et Dia.
foeniculina aient déjà présenté la capacité à produire des ascospores dans les noyeraies, très peu
d’informations sont à ce jour disponibles concernant les autres espèces de Botryosphaeriaceae
et les espèces de Diaporthe qui y sont aussi présentes (López-Moral et al. 2020b; Michailides
et al. 2013, 2017). Ainsi, certaines questions en lien avec leur épidémiologie, telles que
l’identification de la nature de l’inoculum (spores sexuées : ascospores, asexuées : conidies,
mycélium) et leurs voies de dispersion, restent encore à préciser. De plus, aucune étude n’a été
menée à ce jour en France concernant la recherche et l’identification de structures de
reproduction (pycnides et ascocarpes) à la surface de branches de noyers présentant des
symptômes de dépérissement.

[Link]. Sources d’inoculum

En outre, les sources d’inoculum dans les noyeraies ne sont encore que partiellement
identifiées. Les principales sources actuellement définies sont les organes présentant des
symptômes du dépérissement (branches, jeunes pousses, fruits), ainsi que les résidus de taille
et de la récolte (López-Moral et al. 2020b; Michailides et al. 2017; Michailides & Hasey 2010;
Moral et al. 2019b). De plus, du fait du mode de vie endophyte des Botryosphaeriaceae et des
Diaporthe au cours de leur cycle, les organes sains dans lesquels se développent ces espèces (il
est alors possible de parler d’infection latente) peuvent aussi servir de réservoir d’inoculum. En
effet, l’affaiblissement de l’hôte sain du fait de stress biotiques (tels que les blessures causées
par la mouche du brou et les cochenilles) comme abiotiques (tels que les plaies de taille et de
la récolte, et les effets des conditions climatiques comme les brûlures ou le gel) peut conduire
à un comportement pathogène de ces espèces et causer par la suite l’apparition des symptômes
(Michailides et al. 2012, 2013, 2017; Michailides & Hasey 2010; Moral et al. 2019b; Figure 6).
De plus, les jeunes plants cultivés en pépinière peuvent aussi servir de source d’inoculum, des

37
infections latentes de L. citricola et Neo. dimidiatum ayant déjà été constatées (Chen et al.
2013). Ce phénomène d’infections latentes est largement reconnu par la communauté
scientifique sans que l’on sache toutefois déterminer leur degré de contribution par rapport aux
infections exogènes dans l’apparition des symptômes.

[Link]. Voies de dispersion

Les spores présentent un type de dispersion préférentiel en fonction de leur nature

(ascospores ou conidies). Les ascospores sont principalement dispersées à l’aide du vent, tandis
que l’eau est le vecteur principal de la dispersion des conidies (Michailides et al. 2017; Moral
et al. 2019b). Ainsi, le cycle biologique des agents pathogènes associés au dépérissement du
noyer est météo-dépendant. Dans les pays à climat dit méditerranéen ou tempéré, tels que
l’Espagne, l’Etat de Californie, l’Italie, mais aussi la France, les débuts du printemps souvent
pluvieux et humides pourraient favoriser la formation de spores et leur dispersion par splashing,
puis les longs mois d’été secs et chauds, faciliteraient le développement de l’infection et des
symptômes (López-Moral et al. 2020b; Moral et al. 2019b; Figure 6). Divers facteurs seraient
impliqués dans ce processus, tels que la fragilisation de l’hôte soumis à différents stress
abiotiques tels que la sécheresse, l’augmentation des températures à des valeurs proches de
celles permettant une croissance optimale des agents pathogènes (entre 20°C et 30°C; Chen et
al. 2014a; López-Moral et al. 2020b; Michailides et al. 2017; Moral et al. 2019b), ou encore la
diminution de la concentration en composés phénoliques dans les rameaux, jeunes pousses et
fruits en maturation au cours de l’été impliquant une plus grande susceptibilité de l’hôte (Moral
et al. 2019b; Wianowska et al. 2016). En outre, les méthodes d’irrigation des vergers pouvant
humidifier la canopée (principalement l’irrigation par aspersion) peuvent aussi servir de vecteur
de dispersion des conidies et donc de la maladie (Michailides et al. 2017; Moral et al. 2019b).
Les outils de taille sont aussi un facteur pouvant favoriser la dispersion des spores au sein des
vergers (Moral et al., 2019b), la taille d’entretien classique des noyers ayant lieu tous les 3 à 5
ans durant la période suivant la récolte au début de l’automne (SENuRA 2021).

38
Figure 6. Cycle biologique commun aux différentes espèces de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe
sur noyer commun selon les conditions climatiques des pays à climat méditerranéen (d'après
López-Moral et al. 2020b).

[Link]. Infection et développement des symptômes

L’infection des organes est étroitement liée aux différentes sources d’inoculum et voies
de dispersion citées ci-dessus. En effet, les plaies de taille, de chute de feuilles et de fruits, les
blessures provoquées par des ravageurs du noyer comme la mouche du brou et les cochenilles
ainsi que le développement de la bactériose ou brûlure du noyer sur les fruits (Tableau 1)
peuvent servir de point d’entrée aux spores et permettre par la suite le développement de la
maladie. Une autre hypothèse suggère que l’infection débuterait sur les fruits, et se propagerait
par la suite aux rameaux via le pédoncule, conduisant in fine au développement des symptômes
du dépérissement du noyer (Michailides et al. 2013; Moral et al. 2019b). Les symptômes
provoqués par le dépérissement du noyer peuvent se développer sur la quasi-totalité des organes
aériens, soit aussi bien sur les fruits et les bourgeons que sur les jeunes pousses, les rameaux,
les branches voire même le tronc dans le cas d’une importante infection (Gusella et al. 2021;
Laloum et al. 2022; López-Moral et al. 2020b; Michailides et al. 2013; Michailides & Hasey

39
2010; Moral et al. 2019b). Les fruits et les bourgeons sont la cible de flétrissements, de
déformations et de nécroses (Figure 4G,H), pouvant aller jusqu’à provoquer la mortalité des
bourgeons. Lors d’un développement sur les organes lignifiés, les jeunes pousses, rameaux,
branches et troncs peuvent être victimes d’un assèchement, d’une décoloration interne du bois,
de nécroses ainsi que de chancres plus ou moins développés (Figure 4I,J; Gusella et al. 2021;
Laloum et al. 2022; López-Moral et al. 2020b; Michailides & Hasey 2010; Moral et al. 2019b).
La maladie affecte particulièrement la production de noix. Les symptômes sur les jeunes
pousses et les rameaux les rendent improductifs, tandis que ceux ciblant les fruits les rendent
impropres à la consommation. De même, plus la canopée d’un noyer sera atteinte par le
dépérissement et le déclin de ses branches, moins il sera productif.

Ainsi, pour faire suite à la partie « 1.3 Les bio-agresseurs du noyer commun », les
symptômes associés au dépérissement du noyer sur fruits et sur rameaux sont susceptibles d’être
confondus avec ceux des dégâts causés par les ravageurs et maladies présentées précédemment,
soit les nécroses et brûlures sur fruits provoquées par la mouche du brou, l’anthracnose causée
par les espèces de Colletotrichum et l’anthracnose à Gnomonia, ainsi que la bactériose et la
nécrose apicale du fruit (Figure 4). Sur rameaux, la bactériose et le dépérissement présentent
des symptômes semblables, particulièrement au début du développement de la maladie. Lors
de son avancement, la bactériose donne lieu à des dessèchements et provoque l’enroulement
des rameaux en crosse, tandis que le dépérissement provoque principalement le noircissement
et la mort du rameau (Figure 4E,I,J).
Le dépérissement du noyer est donc associé à divers symptômes, communs aux
différents pays dans lesquels il a été rapporté. De plus, la maladie est associée à un complexe
d’espèces de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe pouvant être collectées conjointement à partir
d’organes présentant des symptômes de dépérissement. Ce complexe se compose
principalement de B. dothidea, D. seriata, N. parvum, Dia. foeniculina et Dia. eres, tandis que
d’autres espèces collectées dans de moindres proportions sont aussi décrites.

2.2.4. Gestion des pratiques culturales et méthodes de lutte

Du fait de l’émergence des symptômes de dépérissement en France, aucune méthode de

lutte n’a à ce jour été étudiée. Les nombreuses recherches menées en Californie et en Espagne
ont quant à elles permis d’établir des recommandations quant à la gestion des vergers ainsi que
des moyens de lutte.

40
 [Link]. Prophylaxie par les pratiques culturales

Gérer les vergers différemment peut permettre de diminuer la densité des sources
d’inoculum et donc la dispersion des spores et le développement de la maladie. Ainsi, il est
recommandé d’éviter l’irrigation par aspersion et de tailler le bois présentant des symptômes
de dépérissement, mais aussi de réaliser une taille saisonnière (idéalement au début de
l’automne) plus sélective afin de limiter au maximum la création de points d’entrée pour les
spores. La protection des plaies de taille par l’application préventive de fongicides est aussi
recommandée, ainsi que la désinfection régulière des outils de taille. En effet, la proportion des
dégâts causés par le dépérissement dépend largement de la quantité d’inoculum initiale présente
dans les vergers (Michailides et al. 2016; Moral et al. 2019a). De plus, les blessures causées
par les cochenilles, la mouche du brou et la bactériose constituant une voie d’infection, il est
aussi recommandé de s’attarder particulièrement sur la gestion de ces ravageurs et agents
pathogènes afin de contrôler, et idéalement de réduire leur présence dans les vergers
(Michailides et al. 2012, 2017; Moral et al. 2019a). La densité des vergers joue aussi un rôle
important dans le cycle infectieux des espèces pathogènes responsables du dépérissement du
noyer. En effet, plus le verger sera dense, plus les sources d’inoculum seront potentiellement
nombreuses, et plus la transmission d’un arbre à un autre sera facilitée. En Californie, la culture
en ultra-haute-densité des noyers est extensivement pratiquée, et est désignée comme facteur à
risque facilitant le développement de la maladie (Moral et al. 2019a). Il est aussi recommandé
de ne pas laisser au sol les résidus de taille et de récolte, qui font office de source d’inoculum.
La transformation des résidus de taille en copeaux répartis à la surface du sol a elle aussi montré
des effets importants dans la réduction de l’inoculum à leur surface lors d’expérimentations
réalisées dans des vergers de Californie (Michailides et al. 2016; Moral et al. 2019a).

[Link]. Lutte chimique

La lutte chimique contre les espèces de Botryosphaeriaceae est décrite comme

nécessaire dans les noyeraies californiennes et espagnoles où le dépérissement prend de
l’ampleur. D’après différentes études, aucune résistance aux fongicides n’a été détectée chez
les espèces de Botryosphaeriaceae responsables du dépérissement du noyer en Californie
(Michailides et al. 2017; Moral et al. 2019a). L’application de fongicides pour la lutte chimique
contre le dépérissement du noyer est alors recommandée dans les noyeraies californiennes et
espagnoles, notamment durant la période d’infection et de développement des symptômes, soit
au cours du printemps et de l’été (Moral et al. 2019a). Elle n’est cependant pas simple et

41
totalement efficace, du fait notamment de la production de structures de reproduction (sous la
forme de stromas) dans les différentes couches externes des tissus lignifiés infectés, ce qui les
rend difficile d’accès par les fongicides. De plus, la maladie étant causée par un complexe
d’espèces, la sélection des produits de lutte chimique en est rendue d’autant plus complexe
(Moral et al. 2019a).

Aucun produit phytopharmaceutique avec une action fongicide n’est à ce jour

homologué pour la lutte contre les espèces fongiques principalement associées au
dépérissement du noyer en France (E-Phy & ANSES 2023d). Le traitement préventif des plaies
de taille mentionné par Moral et al. (Topsin M™) et dont l’efficacité a été démontrée contre L.
citricola en vergers sur branches de 1 an et de 4 ans (cultivar Chandler) se compose
principalement de thiophanate-méthyl, substance active non autorisée en France (E-Phy &
ANSES 2022; Moral et al. 2019a). Un second produit phytosanitaire (Merivon®) composé
d’une association de pyraclostrobine et de flyxapyroxade a aussi fait ses preuves en tant que
traitement fongicide préventif dans la protection des plaies de taille contre L. citricola lors d’une
application en vergers sur le cultivar Chandler durant l’automne, saison recommandée pour la
taille. A l’inverse, ce produit ne s’est pas avéré efficace quant à la réduction du nombre de
chancres et de leur longueur lors de l’inoculation de N. parvum dans les mêmes conditions
d’expérimentation (Adaskaveg et al. 2017, 2022; Michailides et al. 2016). Ces deux composés
chimiques font partie des substances actives approuvées en France (E-Phy & ANSES 2023a; b).
Actuellement, une dizaine de substances actives sont homologuées en Californie pour la lutte
contre le dépérissement du noyer, dont celles citées précédemment (Adaskaveg et al. 2017,
2022). Seulement une partie de ces substances est homologuée en France pour une utilisation
sur noyers. Il s’agit de la pyraclostrobine et du boscalid, substances composant le SIGNUM ®
(E-Phy & ANSES 2023c) et du tébuconazole, retrouvé dans AGRITEBU®,
HORIZON ARBO®, et TEBUWG®. Ces trois derniers sont homologués dans la lutte contre
l’anthracnose sur noyers, mais aussi d’autres maladies fongiques d’autres arbres à fruits à
coques, telles que le “chancre à champignons” sur amandiers et châtaigniers, ainsi que le
dépérissement cryptogamique du noisetier (E-Phy & ANSES 2020a; b, 2021). En Californie, la
fréquence recommandée des traitements homologués est d’une application par mois de mai à
août, en début de mois (Michailides et al. 2016). Il a été mis en avant qu’une seule application
réalisée au cours de la période de croissance (de mi-juin à mi-juillet) présente une grande
efficacité, permettant de considérablement réduire la densité des sources d’inoculum ainsi que
les fréquences de traitement (Michailides et al. 2016; Moral et al. 2019a).

42
 La fréquence des traitements peut aussi être réduite en fonction de la densité des sources
d’inoculum et des conditions météorologiques de certaines années. Un modèle prédictif du
risque d’infection a été développé en Californie concernant la brûlure du pistachier (Pistacia
vera), maladie de dépérissement aussi causée par des espèces de Botryosphaeriaceae et de
Diaporthe (Chen et al. 2014b; Morgan et al. 2009). Ce modèle, nommé LWM pour Leaf
Wetness Model, se base sur les températures et la durée d’humectation des feuilles lors
d’événements pluvieux durant lesquels plus de 4 mm de pluie ont été relevés et après lesquels
une période sèche d’une durée inférieure ou égale à 12 h a été enregistrée. A l’aide des données
météorologiques et l’incidence de la maladie en Californie dans les vergers de pistachiers durant
15 années, il permet de prédire les risques d’infection des vergers en 3 catégories selon les
conditions météorologiques, soit des conditions à faible risque, à risque moyen, ou à fort risque,
grâce à l’équation de régression non linéaire W = a + b/T, où W représente la durée
d’humectation et T représente la température (Moral et al. 2019a; Morgan et al. 2009). Des
durées d’humectation et des températures élevées constituent un risque élevé d’infection,
particulièrement lors d’années à forte pression de maladie (Figure 7). Ayant fait ses preuves
dans la prédiction de la maladie dans les vergers de pistachiers, ce modèle est depuis lors utilisé
par les cultivateurs afin de prédire les risques d’infection et de traiter en conséquence. Il est
depuis plusieurs années en cours d’essai dans les vergers de noyers californiens (Michailides et
al. 2016; Moral et al. 2019a; b).

Figure 7. Risque d'infection des fruits du pistachier par N. mediterraneum d'après le modèle LWM
en Californie. Les courbes de régression correspondent aux durées d'humectation et températures
nécessaires au développement de nécroses sur 10 % (courbe du haut) et sur 5 % (courbe du bas)
des feuilles de pistachiers inoculées artificiellement (adapté de Morgan et al. 2009).

43
 [Link]. Lutte biologique par utilisation de micro-organismes

Peu, voire aucune étude n’a à ce jour été réalisée concernant le développement de
méthodes de lutte biologique contre les agents pathogènes responsables du dépérissement du
noyer en particulier. D’autres études ont cependant été réalisées dans d’autres contextes.
L’utilisation de champignons endophytes (tels que Epicoccum nigrum, Alternaria alternata et
Trichoderma viride) comme agents de lutte contre l’espèce Diplodia corticola, responsable du
dépérissement du chêne, a été étudiée. La vitesse de croissance de D. corticola était
significativement réduite en présence d’E. nigrum, A. alternata et T. viride, lors de tests de
confrontation in vitro réalisés en boîte de Petri. De plus, ces espèces ont ralenti le
développement des symptômes causés par D. corticola lors d’essais de confrontation sur jeunes
plants de chêne velu (Quercus cerris), tandis que les mêmes conclusions ont pu être tirées
d’essais réalisés avec A. alternata et E. nigrum sur jeunes plants de chêne pubescent (Q.
pubescens), mettant en avant l’intérêt des espèces fongiques endophytes dans la lutte biologique
contre les espèces de Botryosphaeriaceae (Campanile et al. 2007). De la même manière, une
étude menée par Holland et al. (2021a) en Californie s’est intéressée à la lutte biologique contre
les agents associés au dépérissement de l’amandier (chancre de l’amandier ou band canker of
almond; Prunus dulcis), dont B. dothidea et N. parvum (Holland et al. 2021a). Il a été démontré
que le Vintec , composé de l’agent de lutte biologique T. atroviride SC1, présente des capacités
Ⓡ

de protection des plaies de taille équivalente à celle du Topsin M™ (cité précédemment) dans
la lutte contre B. dothidea, et des capacités supérieures à ce même produit dans la lutte contre
N. parvum (Holland et al. 2021a). Ce produit est approuvé en France et homologué, entre autres,
sur vignes dans le traitement des différentes maladies de dépérissement dont le vignoble est la
cible, ainsi que sur amandiers (E-Phy & ANSES 2023e).
D’autres études ont permis d’évaluer l’intérêt de la lutte biologique contre les espèces
de Botryosphaeriaceae à l’aide d'espèces bactériennes. C’est le cas de Chen et al. (2003), qui
ont étudié la bactérie Paenibacillus lentimorbus isolée à partir de feuilles saines de pistachier
dans le contexte de la lutte contre B. dothidea, espèce de Botryosphaeriaceae parmi celles
responsables du dépérissement et des brûlures du pistachier. Des tests in vitro ont révélé que la
souche de P. lentimorbus testée était responsable d’un taux d’inhibition de germination des
spores de B. dothidea de 100 %. De plus, l’application d’une suspension bactérienne de manière
préventive comme agent protecteur de lésions sur des rameaux de pistachiers détachés réduisait
significativement la taille des lésions provoquées par B. dothidea inoculée à l’aide d’implants
mycéliens ou de suspensions de spores 3 jours après le traitement avec la suspension protectrice.

44
La viabilité des cellules bactériennes a été évaluée en présence des fongicides recommandés
dans la lutte contre le dépérissement du pistachier. Sur les 6 fongicides testés, 5 n’affectaient
pas la viabilité des cellules bactériennes de P. lentimorbus à la plus forte concentration
recommandée (Chen et al. 2003).

Ces études permettent alors d’émettre l’hypothèse que la recherche d’espèces fongiques
et bactériennes endophytes du noyer dans le cadre de la lutte biologique contre le dépérissement
du noyer pourrait permettre d’obtenir des candidats potentiels. Toutefois, la transposition de
résultats d’efficacité in vitro ou sur organes détachés aux conditions réelles de production
représente un enjeu considérable dans le domaine de la lutte biologique où l'efficacité de
protection est souvent bien moindre lorsque les conditions ne sont plus contrôlées (Lahlali et
al. 2022).

[Link]. Résistance variétale

La résistance variétale est aussi un facteur important dans la lutte contre des agents
pathogènes et ravageurs. Actuellement, 34 variétés et cultivars sont inscrits au Catalogue
officiel des espèces et variétés de plantes cultivées en France (GEVES 2023). Parmi ceux-ci se
trouvent les variétés françaises traditionnelles telles que Corne, Franquette, Grandjean, Marbot,
Mayette et Parisienne, des cultivars américains tels que Chandler, Hartley, Pedro et Serr, ou
encore des cultivars français issus de programmes de sélections tels que Feradam, Ferbel,
Ferjean, Fernette, Fernor, Ferouette et Fertignac (Bernard et al. 2018; Florilège n.d.;
GEVES 2023).

Peu de données sont disponibles quant à leur résistance aux agents fongiques associés
au dépérissement du noyer à l’échelle mondiale. Seules deux études s’y sont récemment
intéressées, soit l’étude de Chen et al. (2014a) en Californie et l’étude de López-Moral et al.
(2022) en Espagne. Le cultivar Chandler s’est avéré être le moins sensible à toutes les espèces
de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe inoculées sur branches et fruits en vergers.
Particulièrement, il était le moins sensible aux symptômes provoqués par B. dothidea et N.
parvum lors d’inoculations sur branches, ainsi qu’à l’inoculation de B. dothidea sur fruits lors
d’expérimentation en vergers en Californie par rapport aux cultivars Tulare et Vina. Le cultivar
Chandler s’est aussi avéré être le moins sensible à l’inoculation de ces deux espèces sur
branches en vergers en Espagne mais aussi sur branches détachées en conditions in vitro, et ce
par rapport aux cultivars Fernette, Hartley, Horward, Scharsch-Franquette, Serr, Sundland et

45
Tulare (López-Moral et al. 2022). Des sensibilités différentes ont été constatées pour d’autres
cultivars en fonction des conditions d’expérimentation, soit in vitro ou in natura. Alors que les
cultivars Fernette et Scharsch-Franquette étaient parmi les moins sensibles à B. dothidea lors
d’expérimentations in vitro, ils étaient à l’inverse parmi les plus sensibles à cette même espèce
lors d’expérimentations en vergers. A l’inverse, ces mêmes cultivars étaient parmi les plus
sensibles à N. parvum en conditions contrôlées, mais parmi les moins sensibles in natura. Le
cultivar Serr restait quant à lui parmi les plus sensibles à B. dothidea et N. parvum quelques
soient les conditions d’expérimentation (López-Moral et al. 2022).

Ces résultats sont les premiers à donner des informations comparatives quant à la
sensibilité de certains cultivars à l’infection par B. dothidea et N. parvum. Bien que les cultivars
Chandler, Hartley, Serr et Fernette soient inscrits au catalogue national des variétés, ils ne sont
pas parmi les plus cultivés. Aucune information n’est à ce jour disponible concernant la
sensibilité des variétés traditionnelles françaises à ces pathogènes. Il serait alors intéressant de
réaliser ces expérimentations en France, idéalement en vergers afin de se rapprocher le plus
possible des conditions de développement réelles des symptômes, et ce sur différents cultivars
et à l’aide d'espèces de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe. Par ailleurs, les essais de résistance
variétale décrits dans le paragraphe précédent ne tiennent pas ou peu en compte la variabilité
intraspécifique (de 1 à 3 souches testées par espèce). Or, on peut légitimement supposer que le
pouvoir pathogène varie en fonction des souches et cette variabilité doit être prise en compte
pour déterminer la résistance des cultivars.

3. Décrypter le pathobiome fongique : diversité inter et

intraspécifique des micro-organismes et interactions

3.1. Le concept de pathobiome

Le paragraphe précédent a mis en évidence la complexité de la maladie du

dépérissement du noyer, probablement causée par une multitude d’espèces incluant
principalement des espèces de la famille des Botryosphaeriaceae et du genre Diaporthe. Ce
constat remet donc sérieusement en cause le paradigme “un agent pathogène - une maladie”
(Mannaa & Seo 2021). En effet, la compréhension d’une maladie passe par l’identification des
agents pathogènes responsables, mais aussi des interactions qui existent entre ces agents
pathogènes ainsi qu’avec les espèces composant le phytomicrobiome et l’hôte dans le
développement des symptômes. Ce principe est à l’origine du concept de pathobiome, défini

46
selon Bass et al. (2019), comme étant “l’ensemble des organismes associés à un état de santé
réduit (ou potentiellement réduit) de l’hôte, en raison d’interactions entre ces organismes et
avec l’hôte”. Le phytomicrobiome, quant à lui, correspond à l’ensemble des organismes
associés à la plante, sans forcément faire de distinction entre une plante saine ou malade. Dans
le cadre de cette thèse, nous avons considéré que l’ensemble des microorganismes fongiques
associés à des échantillons symptomatiques constituent le pathobiome fongique. Les espèces
responsables du dépérissement du noyer et les autres espèces composant le phytomicrobiome
de manière large pourraient donc ainsi travailler en synergie et/ou de façon antagoniste pour
créer, favoriser ou atténuer l’apparition et le développement des symptômes. Dans ce contexte,
il est donc fondamental d’identifier l’ensemble des membres d’un pathobiome et leur
contribution à l’expression des symptômes, en tenant aussi compte des interactions entre ces
espèces pathogènes mais aussi avec le reste du phytomicrobiome. Compte tenu de la diversité
et co-occurrence d’agents pathogènes associés au dépérissement du noyer, il semble primordial
d’étudier cette maladie sous un angle écologiste et de s’intéresser aux potentielles interactions
entre les membres qui le composent. Différentes études illustrant ce concept sont ainsi
présentées dans les sous-parties suivantes. L’étude des interactions entre les membres du
microbiome suppose, au préalable, d’accéder à une description fine des micro-organismes
associés ou non aux symptômes, en se basant sur différentes techniques décrites ci-dessous.

3.2. Méthodes de description des écosystèmes : avantages et limites

3.2.1. Méthodes d’identification des agents pathogènes

Deux approches majeures sont aujourd’hui régulièrement utilisées dans l’étude des
communautés composant le phytomicrobiome : l’approche culturale, ou culture-dépendante, et
l’approche culture-indépendante. Comme leur nom l’indique, ces deux méthodes diffèrent
majoritairement par l’existence ou non d’une étape de mise en culture sur boîte de Petri. Il
s’agit, dans ce paragraphe, de décrire la mise en œuvre et la contribution de ces deux techniques,
auxquelles nous avons eu recours dans le cadre de ces travaux de thèse, dans l’étude du
pathobiome et du phytomicrobiome fongiques des noyers présentant des symptômes de
dépérissement.

47
 [Link]. Approche culturale

La méthode culture-dépendante est la méthode classiquement utilisée dans l’étude de

communautés fongiques. Elle permet ainsi de s’intéresser au microbiote dit “cultivable” qui
compose ces communautés. Elle consiste en la mise en culture sur boîte de Petri d’échantillons
environnementaux afin d’en isoler les agents fongiques cultivables et par la suite de les
identifier dans le but de déterminer la diversité fongique associée aux échantillons
environnementaux ciblés. L’identification des espèces fongiques peut ensuite être effectuée à
l’aide d’une caractérisation phénotypique, par l’analyse des caractères macro- et
microscopiques, ainsi que par un séquençage de gènes dits code-barres permettant une
identification taxonomique.

De nombreux milieux de culture peuvent être utilisés pour la mise en culture des
échantillons environnementaux et l’isolement des communautés fongiques associées. En
fonction de leur composition, ces milieux vont être plus ou moins favorables à la croissance de
certains groupes ou genres microbiens. Ainsi, les milieux dits sélectifs vont présenter une
composition particulière dont le but est de favoriser la croissance des micro-organismes ciblés
mais aussi d’inhiber la croissance des micro-organismes non recherchés. La sélectivité d’un
milieu peut aussi prendre en compte différents paramètres de croissance des micro-organismes
tels que la durée, la température d’incubation et l’exposition à la lumière. Des milieux sélectifs
génériques ont été développés, tel que le milieu Sabouraud (Sabouraud Dextrose Agar - SDA)
dont la composition inhibe la croissance des genres bactériens et permet l’étude des agents
fongiques de type levures notamment associés à des échantillons cliniques (Sandven & Lassen
1999), mais aussi des milieux ciblant des environnements particuliers, tels que le milieu AASW
(Aguas Agrias Stream Water) créé pour étudier les communautés fongiques issues de la rivière
du même nom, considérée comme un environnement extrême du fait de sa forte acidité et teneur
en métaux (Álvarez-Pérez et al. 2011), ou encore le milieu Raclette de Savoie, utilisé dans le
cadre de la culture d’espèces de Nectriaceae isolées à partir de matrices fromagères (Savary et
al. 2022). Le milieu PDA (Potato Dextrose Agar) est le milieu non sélectif classiquement utilisé
lors de la culture d’isolats fongiques et bactériens ne requérant pas de conditions de cultures
particulières. Il est massivement utilisé pour l’analyse des communautés fongiques associées à
des nombreux environnements, dont les échantillons issus de végétaux. Il est possible de
supplémenter le milieu en antibiotiques antibactériens (tels que la pénicilline, la streptomycine
ou encore le chloramphénicol) pour inhiber la croissance bactérienne et favoriser l'isolement
des espèces fongiques. Il a par exemple été utilisé dans l’étude d’agents pathogènes fongiques

48
associés au colza à partir de graines (Alternaria spp.; Brazauskiene & Petraitiene 2006), à la
vigne à partir de sarments et de bras (D. seriata et N. parvum; Morales-Cruz et al. 2018), aux
noyers à partir de rameaux, jeunes pousses, fruits, bourgeons et feuilles (Botryosphaeriaceae
spp., Colletotrichum spp. et Diaporthe spp.; Chen et al. 2014a; Da Lio et al. 2018; López-Moral
et al. 2020b), mais aussi des espèces fongiques endophytes d’orchidées à partir de feuilles, de
racines et de fleurs (comme Alternaria spp., Fusarium spp. et Trichoderma spp.; Chowdappa
et al. 2020) ou encore de noyers à partir de racines, branches, feuilles et fruits (Alternaria spp.,
Diaporthe spp., Dothiorella spp., Fusarium spp., Phoma spp. et Phomopsis spp. entre autres;
Wang et al. 2020). Malgré la diversité des genres fongiques qu’il est possible de cultiver sur ce
milieu, la méthode culturale présente la limite de favoriser seulement une partie des micro-
organismes présents, en particulier les plus abondants et/ou se développant rapidement sur
milieu de culture, entraînant ainsi un biais dans l'évaluation de la diversité des communautés.
L’utilisation simultanée de plusieurs milieux de culture peut alors être réalisée pour tenter de
pallier cette limite. La sélection du milieu de culture est un facteur d’autant plus important dans
l’étape de caractérisation phénotypique que les caractères morphologiques des champignons
peuvent évoluer en fonction du milieu de culture utilisé (Ermel et al. 2020; Griffith et al. 2007;
Savary et al. 2022). Cette technique présente toutefois un avantage de facto sur les méthodes
culture-indépendantes dans la mesure où les cultures fongiques sont obtenues et peuvent donc
faire l’objet d’une identification plus poussée.

Suite à l’isolement et la purification des isolats après la mise en culture des échantillons,
l'identification repose dans un premier temps sur l’analyse des caractères morphologiques
macro- et microscopiques afin d'orienter le diagnostic. Les six espèces majoritaires étudiées
dans ces travaux de thèse font l’objet ci-après d’une rapide description des caractères macro- et
microscopiques (Figure 8 et 9 et Tableau 3). Les descriptions macroscopiques sont basées sur
une mise en culture sur milieu PDA :

 B. dothidea présente un mycélium faiblement dense aérien blanchâtre prenant une

coloration olivâtre à noire en vieillissant et présentant des pigmentations noires. Lorsque
le mycélium est jeune, il se compose d’hyphes hyalins prenant une teinte brune en
vieillissant. De même, les ascospores et les conidies, hyalines et aseptées, prennent une
couleur brune à olivâtre en vieillissant et présentent des cloisons. Sa croissance est
particulièrement rapide.

49
 N. parvum présente un mycélium faiblement dense aérien et blanchâtre lorsqu’il est
jeune, difficilement différenciable de B. dothidea à cette étape, de croissance
particulièrement rapide. En vieillissant, le mycélium devient particulièrement dense et
présente une coloration grise à noire. Le mycélium de cette espèce est hyalin et branché,
et présente une coloration brune en vieillissant. Les ascospores et les conidies jeunes,
hyalines et aseptées deviennent septées en vieillissant. De plus, les conidies âgées
peuvent présenter une couleur brune.

 L’espèce D. eres présente un mycélium blanchâtre duveteux avec une pigmentation

grise à marron au centre sur la face inférieure lorsqu’il est jeune, puis une pigmentation
grisée répartie sur tout le mycélium ainsi que des stromas noirs lorsqu’il est âgé.

 C. fioriniae présente un mycélium blanc duveteux lorsque jeune, puis un mycélium

dense de coloration verdâtre à grise en vieillissant entouré de marges blanches nettes.
La face inférieure présente une coloration rose à rouge foncé en vieillissant. La face
supérieure peut présenter des acervules orangés dans lesquels se développent les
conidiophores.

 L’apparence de C. godetiae est blanche à gris clair lorsqu’il est jeune, et prend une
coloration gris foncé en vieillissant ainsi que des marges blanches nettes. Il présente une
coloration orangée sur la face inférieure ainsi que des pigmentations grises. La face
supérieure peut présenter des acervules oranges.

 F. juglandicola est une espèce nouvellement décrite, isolée de bourgeons de noyers en

2021 (Crous et al., 2021). Sa croissance est particulièrement lente. Son mycélium est
aérien cotonneux blanc à rose pâle lorsque jeune. En vieillissant, il prend des teintes
rosées à orange clair sur la face supérieure et inférieure. Cette espèce de Fusarium
présente la caractéristique de ne pas produire de microconidies aériennes, ni de
chlamydospores.

50
Figure 8. Diversité des espèces de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe étudiées sur milieu PDA
après incubation à température et lumière ambiante et structures de reproduction sexuée et
asexuée (d’après Phillips et al. 2013; Udayanga et al. 2014a, respectivement). A-E. B. dothidea ; F-
J. N. parvum ; K-O. D. eres. A-B. Face supérieure et inférieure de B. dothidea à 10 jours. C.
Ascospores. D. Conidies. E. Conidies âgées. F-G. Face supérieure et inférieure de N. parvum à
10 jours. H. Ascospores. I. Conidies. J. Conidies âgées. K-L. Face supérieure et inférieure de D.
eres à 7 jours. M. Ascospores dans asques. N. ɑ-conidies. O. ꞵ-conidies. Barres d’échelle : C-E =
10 µm, H = 10 µm, I-J = 5 µm, M-N = 15 µm, O = 10 µm.

51
Figure 9. Diversité des espèces de Colletotrichum et de Fusarium étudiées sur milieu PDA après
incubation à température et lumière ambiante et structures de reproduction asexuée (d’après
Damm et al. 2012; Crous et al. 2021, respectivement). A-C. C. fioriniae ; D-F. C. godetiae ; G-
I. F. juglandicola UBOCC-A-119001. A-B. Face supérieure et inférieure de C. fioriniae à 7 jours.
C. Conidies. D-E. Face supérieure et inférieure de C. godetiae à 10 jours. F. Conidies. G-H.
F. juglandicola UBOCC-A-119001 à 7 jours. I. Conidies. Barres d’échelle : C, F, I = 10 µm.

52
Tableau 3. Caractéristiques des principales espèces pathogènes étudiées.

Classification Genre Forme anamorphe Forme téléomorphe Mycélium Ascospores Conidies Référence

Botryosphaeriaceae Botryosphaeria Fusicoccum aesculi B. dothidea Hyphe ramifié et septé Ovoïdes-fusoïdes- Fusoïdes-ellipsoïdes hyalines Phillips et al. 2013
hyalin, brun en ellipsoïdes hyalines aseptées, septées et olivâtres
vieillissant aseptées, septées et en vieillissant
brunes en vieillissant

Neofusicoccum N. parvum B. parva Hyphe branché et Fusoïdes-ellipsoïdes Ellipsoïdes hyalines aseptées, Philips et al. 2013
hyalin, brun en hyalines aseptées, septées et brunes en
vieillissant septées en vieillissant vieillissant

Diaporthaceae Diaporthe Phomopsis oblonga D. eres - Ellipsoïdes allongées Type ɑ : Ovoïdes-ellipsoïdes Udayanga et al. 2014a
hyalines bicellulaires aseptées hyalines.
Type ꞵ : Fusoïdes crochues
hyalines aseptées.

Glomerellaceae Colletotrichum C. fioriniae Glomerella fioriniae Hyphe ramifié septé Fusoïdes droites Fusoïdes cylindriques Damm et al. 2012;
hyalin à brun hyalines hyalines aseptées Marcelino et al. 2008

C. godetiae - Hyphe ramifié septé - Fusoïdes cylindriques Damm et al. 2012

hyalin à brun hyalines aseptées

Nectriaceae Fusarium F. juglandicola - Hyphe ramifié hyalin - Macroconidies : droites à Crous et al. 2021
incurvées hyalines septées.
Cellule apicale incurvée à
crochue. Cellule basale en
forme de pied.

53
 Dans la mesure où les observations macro et microscopiques peuvent facilement
conduire à des erreurs d’identification, le séquençage multigénique reste la méthode de
référence dans l’identification d’espèces fongiques cultivées. Elle consiste en l’amplification
par PCR (Polymerase Chain Reaction) de l’ADN et le séquençage des gènes d'intérêts cibles
dont la séquence est caractéristique des genres ou espèces étudiées. En effet, bien que l’Internal
Transcribed Spacer (ITS) soit considéré comme le marqueur génétique universel des
champignons (Schoch et al. 2012), sa résolution taxonomique peut s’avérer insuffisante pour
discriminer certains genres ou espèces phylogénétiquement proches. De nombreuses études ont
alors permis d’identifier des gènes plus appropriés en fonction des genres et des espèces lorsque
l’ITS n’est pas suffisant. Ainsi, en plus de l’ITS, les gènes codant l’ARNr 28S (LSU), l’ARNr
18S (SSU), le facteur d’élongation 1 alpha (EF1-ɑ), la β-tubuline (TUB) et la sous-unité RPB2
de l’ARN polymérase II ont été largement utilisés pour discriminer les genres et les espèces au
sein de la famille des Botryosphaeriaceae (Crous et al. 2006; Phillips et al. 2008; Sakalidis et
al. 2011; Yang et al. 2017; Figure 10). Concernant le genre Diaporthe et les espèces qui le
composent, les gènes codant le facteur d’élongation alpha (EF1-ɑ), la β-tubuline, la calmoduline
(CAL) et l’histone H3 (HIS) sont classiquement utilisés (Fan et al. 2018; Santos et al. 2017;
Udayanga et al. 2012; Figure 11). Ainsi, différentes études se sont intéressées aux séquences
ITS, EF1-ɑ et β-tubuline pour l’étude phylogénétique des différentes espèces de
Botryosphaeriaceae et Diaporthe associées au dépérissement du noyer en Californie, Espagne
et Italie (Chen et al. 2014a; Gusella et al. 2021; López-Moral et al. 2020b). Dans le même
objectif, Li et al. (2016) ont ciblé les séquences ITS et EF1-ɑ pour analyser les isolats de B.
dothidea et L. theobromae isolés de symptômes du dépérissement en Chine. L’identification
moléculaire des espèces du genre Fusarium est préférentiellement réalisée par le séquençage
de l’EF1-ɑ, mais aussi des sous-unités RPB1 et RPB2 de l’ARN polymérase II (O’Donnell et
al. 2022; Figure 12). Enfin, de nombreuses régions sont recommandées pour l’identification et
la discrimination des espèces du complexe Colletotrichum actutatum auquel appartiennent C.
fioriniae et C. godetiae, tels que l’ITS, l’histone 3, la β-tubuline, mais aussi les gènes codant
pour l’actine (ACT), la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et la chitine
synthase 1 (CHS-1; Damm et al. 2012).

54
Figure 10. Arbre phylogénétique de genres de la famille des Botryosphaeriaceae obtenu à l'aide
des loci SSU, LSU, ITS, EF1-α et TUB combinés, et enraciné par Saccharata proteae CBS 1125206
(Philips et al. 2013).

55
Figure 11. Arbre phylogénétique d'espèces du genre Diaporthe obtenu à l'aide des loci ACT, Apn2,
CAL, EF1-α, HIS, FG1093 (protéine ribosomique L37) et TUB combinés, et enraciné par
D. citri AR3405 (Udayanga et al. 2014a).

Figure 12. Arbre phylogénétique d'espèces du genre Fusarium obtenu à l'aide des loci EF1-α,
RPB1 et RPB2 combinés, et enraciné par F. heterosporum CBS 391.68 (Crous et al. 2021).

56
 [Link]. Approche par métabarcoding

L’analyse culture-indépendante repose sur l’analyse de l’ADN total présent dans les
échantillons environnementaux, sans mise en culture préalable. De nombreuses technologies de
séquençage massives appelées Next Generation Sequencing (NGS) ont été développées ces
dernières années, et parmi elles, la métagénétique. Cette dernière, aussi appelée métabarcoding,
désigne l’étude de communautés suite à l’extraction de la totalité de l’ADN présent dans un
échantillon donné. Après une première étape d’amplification de la région code barre ciblée, le
séquençage massif permet d’identifier les communautés bactériennes, virales, ou fongiques
dans notre cas. Lors de la réalisation du séquençage métabarcoding, le choix de la région ciblée,
la sélection des amorces et le choix du pipeline bioinformatique pour l’analyse des résultats
sont des points cruciaux. En effet, de nombreux biais peuvent survenir lors de l’étape
d’amplification du fait des caractéristiques des amorces et de la région cible. La formation de
chimères, ou séquences artefacts, peut aussi survenir lors de cette étape. De plus, lors des étapes
de PCR, les amplicons de plus petite taille sont préférentiellement amplifiés, ce qui peut résulter
en une sur-estimation des espèces associées à ces amplicons, et, de manière corollaire, une sous-
estimation de celles présentant des amplicons de plus grande taille, la taille des gènes cibles,
notamment l’ITS, pouvant grandement varier d’une espèce à l’autre (Yang et al. 2018b). Du
fait de ces PCR, cette méthode permet uniquement d’accéder à une quantification relative des
communautés et non absolue. Les données sont dites compositionnelles, permettant de
déterminer l’abondance des taxons les uns par rapport aux autres.
Enfin, lors de l’analyse bioinformatique, la sélection des outils et paramètres peut
fortement faire varier les résultats, et principalement entraîner de fortes pertes d’informations.
Par exemple, le choix du seuil de pourcentage d’identité trop élevé pour la classification des
séquences obtenues peut générer une perte de données (Nilsson et al. 2019). Il existe différentes
technologies de séquençage NGS, telles que la technologie Illumina, Nanopore ou encore
PacBio. Dans le contexte de la métagénétique, la technologie Illumina MiSeq est la plus utilisée
à ce jour. Elle permet le séquençage de séquences courtes de 250 ou 300 paires de bases. La
région ITS est également le marqueur moléculaire universel le plus utilisé pour l’étude des
communautés fongiques par séquençage métabarcoding. Du fait de la taille limitée des
amplicons, les régions ITS1 ou ITS2 qui composent l’ITS sont préférentiellement séquencées.
Une mise au point méthodologique semble donc appropriée pour la réalisation de séquençage
métabarcoding, afin d’évaluer et de corriger dans la mesure du possible les différents biais
pouvant intervenir.

57
 Actuellement, seules deux études dédiées au décryptage du pathobiome du noyer par
une approche métagénétique ont été publiées dans le contexte de l’anthracnose causée par
Colletotrichum. La première porte sur l’analyse comparative du phytomicrobiome associé à des
feuilles de noyers d’apparence saine et des feuilles présentant des symptômes d’anthracnose en
Chine par séquençage métabarcoding de la région ITS1 (Wang et al. 2022). Les résultats ont
mis en évidence une très large diversité fongique avec la prédominance des genres Cercospora,
Vishniacozyma et Ramularia tandis que les espèces du genre Colletotrichum, ont également été
retrouvés aussi bien dans les échantillons symptomatiques qu’asymptomatiques (bien qu’en
plus faibles proportions), en association avec d’autres genres pathogènes moins abondants
(Alternaria, Diaporthe et Fusarium). Vishniacozyma est le principal genre significativement
plus prédominant dans les échantillons asymptomatiques que symptomatiques. Par ailleurs, les
feuilles symptomatiques présentaient une richesse, une abondance et une équitabilité croissante
au cours du développement des symptômes, phénomène généralement admis et suggérant que
le développement des espèces pathogènes est croissant au cours du temps, et que la présence de
symptômes favoriserait l’apparition et le développement de nouveaux taxons (Wang et al.
2022).
Da Lio et al. (2018) ont démontré que C. godetiae et C. fioriniae sont les espèces
majoritairement associées aux symptômes d’anthracnose du noyer en France, en s’appuyant sur
une approche culturale et par séquençage metabarcoding de la région ITS. Bien que ceux-ci ne
soient pas décrits, le séquençage de l’ITS a également permis l’amplification d’un grand
nombre d’autres taxons fongiques. De manière surprenante, il s’avère que seuls 2,64 % des
lectures totales obtenues par le séquençage métabarcoding correspondent aux espèces de
Colletotrichum, soit une part infime de la richesse et diversité fongique détectée dans les
échantillons de bourgeons. Il n’est cependant pas possible de déterminer si ce faible
pourcentage est dû à une sous-estimation des Colletotrichum du fait de l’utilisation d’amorces
peu appropriées à ce genre fongique, aucun contrôle de type communautés synthétiques n’ayant
été utilisé dans cette étude.

Ainsi, les deux approches présentées ci-dessus sont donc deux méthodes d’analyse
complémentaires du phytomicrobiome d'échantillons environnementaux. Elles apportent à la
fois des informations concordantes, ce qui vient renforcer les analyses, ainsi que des
informations supplémentaires propres à chacune sur les communautés étudiées. Dans notre cas,
l’approche culture-dépendante est essentielle pour évaluer l’étendue de la maladie au sein des
échantillons, par l’estimation de la prévalence, soit le nombre d’organes infectés par une espèce

58
donnée par rapport au nombre total d’organes étudiés. Cette approche est de plus indispensable
à la création d’une collection de travail ainsi qu’à la préservation de la biodiversité isolée, et à
la caractérisation des espèces étudiées. L’une des principales limites de cette méthode est
qu’elle ne permet d’étudier que la partie “cultivable” et prédominante des champignons associés
aux échantillons, limite en grande partie palliée par le métabarcoding qui permet d’étudier la
totalité de l’ADN fongique présent. Cette dernière présente toutefois des limites,
particulièrement celles liées à la résolution taxonomique souvent au genre voire à l’espèce et à
l’obtention de données de quantification relative.
L’analyse des communautés par le séquençage métabarcoding permet donc une
description plus large des membres composant le phytomicrobiome, mais aussi de les quantifier
en termes d’abondance relative et d’étudier leur structure en fonction de différents facteurs (par
exemple, en fonction des types d’organe, facteurs climatiques, géographiques, pratiques
culturales, etc.). Cependant, le séquençage métabarcoding ne permet pas de déterminer la
contribution des membres dans le développement des symptômes. Il est dans ce cas nécessaire,
soit d’être en possession des isolats obtenus grâce à l’approche culturale afin d’évaluer leur
potentiel pouvoir pathogène, par la réalisation de tests de pathogénicité ou par le séquençage
de leur génome afin d'évaluer leur teneur en gènes associés aux facteurs de pathogénicité, soit
d’avoir recours à d’autres types d’approches permettant d’obtenir une représentation plus
fonctionnelle du développement des symptômes telles que la métagénomique, la
métatranscriptomique ou encore la métaprotéomique (Gutleben et al. 2018; Scholz et al. 2012).
Par exemple, l’étude menée par Morales-Cruz et al. sur certains agents pathogènes fongiques
associés à différentes maladies du bois de la vigne a mis en avant la complémentarité des
analyses culture-dépendante, métagénomique et métatranscriptomique dans l’identification de
la richesse taxonomique fongique d’échantillons de vigne mais aussi des mécanismes de
pathogénicité (Morales-Cruz et al. 2018). L’analyse du transcriptome a permis de révéler la
surexpression de gènes associés à la pathogénicité par les agents pathogènes étudiés
(notamment les CAZymes - Carbohydrate-Active Enzymes et les transporteurs), mais aussi des
différences d’expression en fonction des symptômes présents sur les échantillons traités. Dans
une seconde étude portant sur l’analyse métatranscriptomique des communautés microbiennes
dans des échantillons de bois dégradé ou asymptomatique de vigne, le rôle de ces communautés
dans le développement des symptômes et en particulier celui des communautés virales a été
démontré (Nerva et al. 2022). Ces études mettent toutes les deux en avant l’importance de
s’intéresser à la partie fonctionnelle du pathobiome et du phytomicrobiome dans l’amélioration
de la compréhension du développement de maladies.

59
 3.3. Evaluation de la pathogénicité

Les approches présentées précédemment permettent d’identifier les espèces fongiques

composant le phytomicrobiome et le pathobiome associés avec l’échantillon environnemental
cible. La caractérisation de la pathogénicité d’une espèce est une étape clé dans l’étude de
l'étiologie d’une maladie. En effet, la présence d’une espèce dans un échantillon symptomatique
ne présume pas de son caractère pathogène. Pour vérifier cela, il faut s’assurer que cette espèce
est capable de reproduire les symptômes étudiés par inoculations artificielles tout en ré-isolant
l’espèce étudiée à partir des symptômes.

3.3.1. Les facteurs de pathogénicité

La pathogénicité se traduit comme la capacité d’un organisme à provoquer une maladie

et/ou à causer des dommages à un hôte. L’agressivité est une variable quantitative qui
représente le degré de la pathogénicité, soit l’importance des symptômes et dommages causés
par l’organisme (Manawasinghe et al. 2016). Les mécanismes moléculaires responsables de
l’agressivité mettent en jeu ce qu’on appelle des facteurs de pathogénicité. Ces facteurs peuvent
être des petites protéines sécrétées (ou Small Secreted Proteins, SPP) de type effecteurs, des
molécules résultant du métabolisme secondaire tels que les toxines, des transporteurs, ou encore
des enzymes telles que les enzymes de dégradation des parois cellulaires (ou Cell Wall
Degrading Enzymes, CWDE). De nombreuses fonctions leur sont associées, telles que la
pénétration dans l’hôte, la manipulation voire la suppression des défenses de l’hôte ou encore
l’absorption de nutriments (Doehlemann et al. 2017; Peng et al. 2021).

Le développement des nombreuses techniques de séquençage dites de nouvelle

génération (ou Next-Generation Sequencing) a permis d’étudier massivement les facteurs de
pathogénicité chez de nombreux organismes notamment grâce au séquençage des génomes et
des transcriptomes, dont des espèces de Botryosphaeriaceae. De nombreuses études ont ainsi
mis en avant que les génomes d’espèces de Botryosphaeriaceae sont riches en enzymes de
dégradation des hydrates de carbone, protéases, lipases ainsi que des gènes de biosynthèse de
métabolites secondaires (Nagel et al. 2021).

La revue “Pathogenicity Factors of Botryosphaeriaceae Associated with Grapevine

Trunk Diseases: New Developments on Their Action on Grapevine Defense Responses” (DOI
10.3390/pathogens11080951) a été publiée le 22 août 2022 dans le journal Pathogens, volume
11:8 (Annexe 1). Après une description des gènes associés aux facteurs de pathogénicité dans

60
le génome de principales espèces de Botryosphaeriaceae associées au dépérissement à
Botryosphaeria de la vigne et de leur expression, elle présente les effets de ces facteurs sur le
métabolisme de la vigne et les réponses défensives associées. Dans la mesure où très peu
d’études ont mis en évidence les mécanismes de pathogénicité de ces espèces sur noyers, le
modèle vigne semblait le plus pertinent pour réaliser une veille bibliographique sur le sujet.

3.3.2. Les postulats de Koch et leur application dans le contexte d’une maladie
complexe

Les postulats de Koch présentés ci-après ont été définis dans le cadre du paradigme “un
agent pathogène - une maladie”. Ils doivent être vérifiés afin de pouvoir déterminer qu’un
organisme cible est pathogène de l’hôte étudié :
1. L’organisme suspecté d’être responsable de la maladie doit être présent dans tous les
organes symptomatiques étudiés ;
2. L’organisme suspecté doit être isolé à partir d’organes symptomatiques, cultivé et
purifié ;
3. Quand une culture pure de l’organisme suspecté est inoculée à un hôte sain, les
symptômes étudiés doivent être reproduits ;
4. L’organisme suspecté doit pouvoir être ré-isolé à partir des organes symptomatiques de
l’hôte artificiellement infecté et doit présenter les mêmes caractéristiques que
l’organisme isolé lors de la première étape et inoculé.

Ces postulats sont actuellement revisités, car le concept de pathobiome, illustrant

l’implication d’un complexe d'espèces dans le développement d’une maladie et l’importance
de ses interactions avec les autres microorganismes présents, est à prendre en considération
pour certaines maladies. Ce complexe d’espèces peut impliquer des interactions entre espèces
dont le pouvoir pathogène en tant que tel est établi mais aussi avec d’autres micro-organismes,
non pathogènes en soi, composant le phytomicrobiome mais dont la présence peut faciliter ou
inhiber le développement des symptômes. Les espèces du phytomicrobiome mises en jeu dans
ces différentes interactions doivent aussi être considérées comme des actrices du
développement ou non de la maladie (Mannaa & Seo 2021). Leur rôle dans le développement
des symptômes peut être d’autant plus important dans le cas de maladies causées par des agents
pathogènes dont une partie du cycle de vie se réalise sous une forme endophyte ne causant pas
de symptômes visibles, comme c’est le cas pour le dépérissement du noyer. Ceci ne permet
donc pas de valider les deux premiers postulats de Koch. L’intégration des méthodes omiques
dans les postulats de Koch permet d’avoir une représentation plus globale des micro-organismes

61
présents, et par la suite de procéder à une mise en culture plus précise afin de vérifier leur
pathogénicité (Byrd & Segre 2016). En outre, le développement d’une maladie ne dépend pas
seulement des micro-organismes composant le phytomicrobiome, mais aussi d’autres facteurs
tels que les pratiques culturales appliquées, la potentielle résistance ou sensibilité génétique de
l’hôte à la maladie, l’âge de l’hôte ou encore les conditions météorologiques pouvant par
exemple affaiblir son système immunitaire. Enfin, comme indiqué précédemment, il ne faut pas
négliger les interactions entre les différents agents pathogènes et certaines espèces du
phytomicrobiome, pouvant permettre de limiter leur développement et donc les symptômes, en
lien avec l’évolution récente du postulat de Koch de “un agent pathogène, une maladie” à sa
définition plus écologique proposée par Vonaesch et al. (2018): “un microbiote dysfonctionnel,
une maladie”. Les postulats de Koch ont particulièrement été réévalués dans le domaine de la
biologie clinique et des maladies infectieuses et en particulier les maladies intestinales. Cette
nouvelle interprétation des postulats de Koch prend en compte l’écosystème intestinal comme
entité à part entière jouant un rôle dans le développement ou non de la maladie.
Bien qu’insuffisantes pour totalement valider la pathogénicité d’espèces participant à
des maladies complexes, la réalisation d’inoculations artificielles reste indispensable pour
évaluer le pouvoir pathogène des agents fongiques d’intérêt, mais aussi leur agressivité sur
l’hôte en question. Dans le contexte du dépérissement du noyer, cela passe principalement par
la mesure des nécroses provoquées sur branches ou sur fruits en fonction du modèle testé, en
laboratoire (in vitro), sur plants en serre (in planta) ou directement en verger (in natura). Les
tests au laboratoire sont à consolider par des analyses in planta et idéalement in natura, car la
mise en place de réactions de défenses par la plante sont à prendre en compte dans
l’établissement de la maladie (van Wyk et al. 2010).

3.3.3. Agressivité des espèces d’intérêt sur noyers

Il a ainsi été démontré que les espèces B. dothidea, N. parvum, D. eres, C. godetiae et
C. fioriniae sont des agents pathogènes du noyer, capables de provoquer des symptômes de
type brûlure et nécrose sur fruits et sur branches pour les trois premières, et des symptômes
d’anthracnose sur fruits pour les deux dernières (Tableau 4). De plus, Varjas et al. (2020) ont
constaté des brûlures de rameaux causées par C. godetiae et se sont donc intéressés à son
pouvoir pathogène sur ce type de modèle. Ils ont ainsi démontré sa capacité à provoquer des
symptômes sur des rameaux en vergers. Du fait de sa récente découverte, aucune information
n’est à ce jour disponible concernant le pouvoir pathogène de F. juglandicola sur noyer
(Crous et al. 2021). De plus, quelles que soient les études, N. parvum est toujours ou quasiment

62
toujours plus agressif que B. dothidea sur fruits et rameaux (Tableau 4), provoquant des
nécroses plus sévères lorsque les inoculations sont réalisées à partir d’implants mycéliens par
rapport à des suspensions de spores. Les espèces de Colletotrichum et D. eres semblent quant
à elles présenter un pouvoir pathogène plus faible sur rameaux et sur fruits (Tableau 4). Il a en
effet déjà été démontré que les espèces de ces deux genres sont associées à un pouvoir
pathogène plus faible que certaines espèces de la famille des Botryosphaeriaceae
(Jiménez Luna et al. 2022a; Mang et al. 2022; Moral et al. 2017).

Les variations d’agressivité qui peuvent être observées lors de réalisation de tests de
pathogénicité peuvent résulter de différents facteurs, tels que la méthode d’inoculation (implant
mycélien, suspension de spores, type d’incision, etc.), les conditions d’inoculation (âge de la
culture, âge du modèle, tests réalisés en vergers ou sur organes détachés, cultivar, etc.), la durée
de l’expérimentation, mais surtout de la grande diversité génétique et variabilité de virulence
des différentes espèces et isolats (Antony et al. 2023; Chen et al. 2014a; Da Lio et al. 2018;
López-Moral et al. 2022; Sohrabi et al. 2020). La méthode d’inoculation ayant un rôle
important dans l’évaluation de la pathogénicité, des études se sont intéressées à la comparaison
d'inoculations par implant mycélien et par suspension de spores. Alors que Chen et al. (2014a)
ont démontré que B. dothidea et N. parvum ne présentaient pas de capacité à développer des
symptômes sur fruits et sur branches de 2 ans en vergers lors d’inoculations avec une suspension
de conidies de concentration 1,0 x 106 conidies/mL, López-Moral et al. (2022) ont quant à eux
démontré que N. parvum provoquait des nécroses sur branches détachées de 1 an en conditions
contrôlées lors d’inoculation avec une suspension de concentration 5,0 x 104 conidies/mL. Les
deux études ont mis en évidence une taille de nécroses supérieure lorsque l’inoculation était
réalisée à partir d’implants mycéliens. Ceci vient mettre en avant les nombreux facteurs
intervenant dans l’évaluation de la pathogénicité et dans la variabilité d’agressivité constatée
entre et au sein des espèces. En effet, il est possible de considérer que des essais réalisés en
vergers et à l’aide de suspensions de conidies sont plus proches de la réalité du terrain dans
laquelle se développe la maladie que des essais in vitro à partir d’implants mycéliens. Il a ainsi
été démontré qu’il n’existait pas de corrélation linéaire entre la longueur des lésions provoquées
sur branches détachées et sur branches en vergers (López-Moral et al. 2022). De plus, il est
difficilement possible de comparer l’inoculation par implant mycélien et par suspension de
spores, la première dépendant de l’âge de la culture et n’étant pas quantifiable, contrairement à
la seconde.

63
 Ces tests de pathogénicité sont traditionnellement réalisés en n'incluant qu’une seule
espèce afin de satisfaire les postulats de Koch traditionnels, voire en intégrant plusieurs isolats
appartenant à une espèce afin de tenir compte de la diversité intraspécifique. Cela ne permet
toutefois pas de prendre en compte les interactions entre les différents membres du pathobiome,
comme indiqué dans le paragraphe « 3.3.2. Les postulats de Koch et leur application dans le
contexte d’une maladie complexe ». Il semble donc indispensable d’évaluer la pathogénicité en
s'intéressant à différentes espèces composant le complexe d’espèces suspecté d’être responsable
des symptômes, qui peuvent être inoculées au même moment ou encore de manière
séquentielle. Ces dernières permettraient de mettre en avant de potentielles interactions
facilitatrices ou compétitrices entre les espèces inoculées et détaillées dans le paragraphe
suivant.

64
Tableau 4. Longueur et diamètre des nécroses moyens après inoculation de Botryosphaeriaceae sp., Colletotrichum sp. et Diaporthe eres selon la méthode, le modèle,
les conditions d'inoculation et le cultivar de J. regia.

Méthode Modèle Cultivar de Espèce inoculée Conditions d’inoculation Nécrose (mm) Délai d’observation Référence
d’inoculation Juglans regia (jours)

Implant mycélien Scion 1 an et demi Chandler N. parvum in natura (Chili) 100 90 Jiménez Luna et al. 2022a
Cultures âgées de 7 jours

Plant 1 an Apollo Dia. eres in natura (République 24 180 Eichemeier et al. 2020
tchèque)
Cultures âgées de 7 à 20
jours

- B. dothidea in vitro 9 30 Gusella et al. 2021

N. parvum Cultures âgées de 13 jours 33

Branches 2 ans Chandler B. dothidea in natura (Californie) 26,10 ± 5,22 21 Chen et al. 2014a
N. parvum Cultures âgées de 7 jours 98 ± 17,02 21

Tulare B. dothidea 38,30 ± 5,08 21

N. parvum 134,17 ± 54,09 21

Vina B. dothidea 39,50 ± 16,45 21

N. parvum 146,00 ± 37,72 21

Milotai 10 C. godetiae in natura (Hongrie) 12-17 14 Varjas et al. 2020

Branches 1 an Chandler B. dothidea in natura (Espagne) 10,9 120 López-Moral et al. 2020b
N. parvum Cultures âgées de 10 jours 90,5 120

Chandler B. dothidea in natura (Espagne) 10,9 ± 2,2 90 López-Moral et al. 2022

N. parvum Cultures âgées de 10 jours 90,8 ± 22,2 90

65
Tableau 4. Suite.

Méthode Modèle Cultivar de Espèce inoculée Conditions d’inoculation Nécrose (mm) Délai d’observation Référence
d’inoculation Juglans regia (jours)

Implant mycélien Branches 1 an Fernette B. dothidea in natura (Espagne) 23,2 ± 2,2 90 López-Moral et al. 2022
N. parvum Cultures âgées de 10 jours 40,8 ± 11,0 90

Hartley B. dothidea 20,0 ± 1,4 90

N. parvum 105,0 ± 33,3 90

Howard B. dothidea 19,7 ± 1,6 90

N. parvum 138,7 ± 24,3 90

Scharsch-Franquette B. dothidea 20,3 ± 2,1 90

N. parvum 49,6 ± 17,3 90

Serr B. dothidea 20,9 ± 2,7 90

N. parvum 109,5 ± 28,7 90

Sundland B. dothidea 22,4 ± 1,7 90

N. parvum 170,8 ± 23,1 90

Tulare B. dothidea 25,4 ± 3,7 90

N. parvum 96,5 ± 6,2 90

Branches Chandler B. dothidea in vitro 130,7 21 López-Moral et al. 2020b

détachées 1 an N. parvum Cultures âgées de 10 jours 134,3 21

Chandler N. parvum in vitro 118 42 Antony et al. 2023

Cultures âgées de 3 jours

Chandler B. dothidea in vitro 35,6 ± 9,6 14 López-Moral et al. 2022

N. parvum Cultures âgées de 10 jours 50,4 ± 6,3 14

Fernette B. dothidea 40,3 ± 6,8 14

N. parvum 101,3 ± 4,5 14

Hartley B. dothidea 51,2 ± 11,3 14

N. parvum 68,3 ± 5,3 14

66
Tableau 4. Suite.

Méthode Modèle Cultivar de Espèce inoculée Conditions d’inoculation Nécrose (mm) Délai d’observation Référence
d’inoculation Juglans regia (jours)

Implant mycélien Branches Howard B. dothidea in vitro 47,6 ± 8,2 14 López-Moral et al. 2022
détachées 1 an N. parvum Cultures âgées de 10 jours 84,7 ± 3,6 14

Scharsch-Franquette B. dothidea 36,9 ± 8,0 14

N. parvum 101,8 ± 13,1 14

Serr B. dothidea 79,2 ± 15,4 14

N. parvum 118,3 ± 4,7 14

Sundland B. dothidea 65,0 ± 4,7 14

N. parvum 73,1 ± 4,9 14

Tulare B. dothidea 73,8 ± 10,9 14

N. parvum 57,7 ± 0,6 14

Chandler N. parvum in vitro 154,1 ± 16,4 14 Lopez-Moral et al. 2022

Cultures âgées de 10 jours

Branches - B. dothidea in vitro 74 10 Li et al. 2016

détachées

- B. dothidea in vitro 49 40 Sohrabi et al. 2020

N. parvum Cultures âgées de 10 à 16 175,40 40
jours

Fruits Chandler B. dothidea in natura (Californie) 36,53 ± 0,90 21 Chen et al. 2014a
N. parvum Cultures âgées de 7 jours 56,33 ± 2,08 21

Tulare B. dothidea 47,03 ± 4,30 21

N. parvum 56,00 ± 6,93 21

Vina B. dothidea 54,70 ± 2,38 21

N. parvum 60 21

67
Tableau 4. Suite.

Méthode Modèle Cultivar de Espèce inoculée Conditions d’inoculation Nécrose (mm) Délai d’observation Référence
d’inoculation Juglans regia (jours)

Implant mycélien Fruits - C. fioriniae in natura (Hongrie) 10-19 14 Varjas et al. 2019

Milotai 10 C. godetiae in natura (Hongrie) 9-17 14 Varjas et al. 2020

Fruits détachés - B. dothidea in vitro 33 7 Gusella et al. 2021

N. parvum Cultures âgées de 14 jours 51 7

Lara C. fioriniae in vitro 27,0 19 Da Lio et al. 2018

C. godetiae - 39,0 19

- C. fioriniae in vitro 10-19 14 Varjas et al. 2019

-

Suspension de spores Branches Chandler N. parvum in vitro 63,3 ± 11,7 14 Lopez-Moral et al. 2022
détachées 1 an 5,0 x 104 conidies/mL

68
 3.4. Pathobiome et interactions

L’étude des interactions est un point essentiel de l’étude du pathobiome associé à une
maladie. En effet, les approches culture-dépendante et -indépendante présentées ci-dessus
(paragraphe « 3.2.1 Méthodes d’identification des agents pathogènes ») apportent des
informations cruciales concernant la composition en espèces fongiques des échantillons
environnementaux étudiés et la dynamique des communautés. Par ailleurs, ces résultats peuvent
être exploités afin d’évaluer certaines corrélations et co-occurrences entre les membres
composant ces communautés. Ces études peuvent ainsi mettre en avant de potentielles
interactions positives (par exemple facilitatrices) et négatives (par exemple compétitrices ou
antagonistes) qui peuvent par la suite être évaluées à l’aide de tests de pathogénicité. Il est
indispensable de chercher à reproduire et observer ces interactions lors d’expérimentations, les
analyses in silico n’étant pas suffisantes pour démontrer l’existence de ces interactions. En effet,
une corrélation ne signifie pas qu’il existe une relation de cause à effet. Deux taxons peuvent
être corrélés positivement sans que cela ne soit forcément lié à une interaction de type
facilitatrice mais tout simplement parce qu’ils partagent les mêmes besoins trophiques et/ou le
même habitat. A l’inverse, deux taxons corrélés négativement ne signifient pas forcément une
interaction de type antagoniste mais peut être le reflet d’une spécificité d’hôtes ou de niches,
ou celui d’une succession des communautés au cours de la maturation du fruit par exemple. Il
est donc nécessaire de comparer des échantillons qui proviennent du même type d’organes et à
un même stade de développement (notamment pour les fruits). Malgré ces limites, ces
différentes analyses peuvent permettre de dégager des hypothèses sur de potentielles
interactions mutualistes, neutres ou encore compétitrices entre différentes espèces pathogènes,
mais aussi entre ces espèces pathogènes et d’autres espèces non pathogènes, permettant ainsi
d’identifier des taxons potentiellement d’intérêt en lutte biologique. Différents types
d’interaction mettant en jeu des agents pathogènes entre eux ou avec d’autres membres du
phytomicrobiome ont d’ores et déjà été décrites, illustrant le concept de pathobiome et sont
précisées ci-après.

Silva-Valderrama et al. (2021) se sont ainsi intéressés aux espèces endophytes de la

vigne comme potentiels agents de lutte biologique contre certains agents pathogènes
responsables de maladies du bois de la vigne, dont N. parvum, s’appuyant ainsi sur le paradigme
“1 pathogène + 1 communauté = 0 maladie” (Byrd & Segre 2016). Parmi les 6 espèces
endophytes testées (Trichoderma sp., Clonostachys rosea, Cladosporium sp., Epicoccum

69
nigrum, Purpureocillium lilacinum et Chaetomium sp.), toutes ont présenté une activité
antagoniste et une capacité à réduire la croissance de N. parvum en dual-culture (Silva-
Valderrama et al. 2021). La co-inoculation d’espèces pathogènes sur matériel végétal permet
aussi d’évaluer de potentielles interactions de type synergiques ou antagonistes entre ces
espèces. Lors de co-inoculations séquentielles d’Ilyonectria macrodidyma, responsable de la
maladie du pied noir de la vigne, et de D. seriata par immersion de racines de ceps de
Chardonnay dans une suspension de conidies et de mycélium d’I. macrodidyma puis le dépôt
d’une suspension de conidies de D. seriata à la surface de la terre à 7 semaines d’intervalle,
l’association des deux espèces entraînait un développement de symptômes, de type nécroses
sur le porte-greffe, supérieur à celui observé lors d’inoculations simples d’I. macrodidyma, sans
que l’on sache attribuer ce développement de symptômes accrus à un meilleur développement
de l’une et/ou l’autre espèce (Whitelaw-Weckert et al. 2013). En outre, il a été démontré que
l’inoculation de N. mediterraneum 4 jours après Dia. rhusicola (syn. Dia. foeniculina) entraînait
le développement de nécroses significativement plus longues que lors de l’inoculation de
Dia. rhusicola seule mais moins longues que celles provoquées par N. mediterraneum seul. Ces
résultats ont été constatés sur branches détachées mais aussi en vergers et sur fruits détachés de
noyer. L’hypothèse émise face à ces résultats est que le délai de croissance (4 jours de
différence) peut être responsable de cette différence, et qu’un délai d’expérimentation plus long
pourrait potentiellement permettre d’obtenir des nécroses plus longues que celles provoquées
par N. mediterraneum seul (Agustí-Brisach et al. 2019).

L’analyse de réseaux d’interaction et de co-occurrence présente l’intérêt d’étudier les

interactions au sein de la communauté microbienne la plus large possible obtenue à partir de
données de séquençage d’ADN total. Bekris et al. (2021) ont mené une étude sur le
phytomicrobiome du bois de la vigne et les schémas de co-occurrence entre les principaux
genres fongiques responsables de maladies du bois de la vigne et les autres genres fongiques et
bactériens présents dans des échantillons asymptomatiques et symptomatiques. Une co-
occurrence significativement négative, c’est-à-dire une présence moindre d’un agent lorsque
l’autre était présent, a été mise en avant entre le genre Alternaria et les genres
Phaeoacremonium et Phaeomoniella (tous les deux associés aux maladies du bois de la vigne)
dans des échantillons asymptomatiques. Ces co-occurrences, absentes dans les échantillons
symptomatiques et associées à la présence systématique du genre Alternaria dans les
échantillons asymptomatiques, suggèrent soit, que ce genre pourrait présenter un rôle de
suppression dans le développement des maladies du bois de la vigne et potentiellement des

70
interactions négatives sur le développement des genres fongiques pathogènes, soit qu’il est un
faible compétiteur et est moins capable de se développer en présence des deux autres genres
(Bekris et al. 2021). Dans le noyer, la forte présence d’espèces du genre Alternaria dans des
échantillons asymptomatiques (à la fois de racines, feuilles, rameaux et de fruits) a également
été constatée (Wang et al. 2020, 2022; Yabaneri & Sevim 2023), un effet antagoniste de ce
genre ayant déjà été démontré contre O. leptostyla (Yabaneri & Sevim 2023). Des co-
occurrences négatives ont aussi été constatées entre les genres pathogènes fongiques
Phaeomoniella et Seimatosporum et le genre bactérien Bacillus, ainsi qu’entre
Phaeoacremonium et le genre bactérien Streptomyces dans les échantillons asymptomatiques.
Ces deux genres bactériens ayant déjà été étudiés pour leur potentiel intérêt en tant qu’agents
de lutte biologique contre les espèces pathogènes associées aux maladies du bois de la vigne
(Cobos et al. 2022), la détection de ces co-occurrences négatives dans les échantillons
asymptomatiques conforte leur potentiel suppresseur des genres fongiques cités (Bekris et al.
2021). Une co-occurrence négative a aussi été mise en évidence entre le genre Diaporthe et le
genre Fomitiporia, pouvant indiquer une certaine compétition entre ces deux agents pathogènes
et un développement préférentiel de l’une ou de l’autre maladie dont ils sont chacun
responsables en fonction de l’abondance de ces deux genres dans les échantillons
(Bekris et al. 2021).

3.5. Étude de la diversité intraspécifique et apport de la génétique des

populations sur les questions en lien avec l’épidémiologie
L’analyse des communautés fongiques peut être approfondie par une analyse
moléculaire permettant d’évaluer la diversité génétique existant au sein d’une même espèce.
Cette étude de la diversité intraspécifique permet d’obtenir des informations essentielles sur le
degré de diversité, la répartition et l’évolution des populations en fonction des zones
géographiques de l’hôte ou encore du type d’organe, mais contribue aussi à déterminer les
potentielles sources d’inoculum, les voies d’introduction des agents pathogènes et transmission
entre hôtes ainsi que le degré de recombinaison sexuée versus asexuée, points cruciaux dans le
cas de maladies émergents. Enfin, il est important de considérer la variabilité de l’agressivité
des souches pour caractériser la participation d’une espèce dans le développement d’une
maladie.

L’étude de la génétique des populations repose principalement sur la sélection de

marqueurs moléculaires polymorphes au niveau intraspécifique. Les marqueurs microsatellites

71
(SSR ou Simple Sequence Repeats) et SNP (Single Nucleotide Polymorphism) font partie des
marqueurs de référence les plus communément utilisés à l’heure actuelle (Guichoux et al.
2011), tandis que les méthodes basées sur l’AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism), la RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ou encore la RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) font désormais partie des méthodes plus
obsolètes de par leur manque de reproductibilité et de comparaison des résultats obtenus de
différentes études. De plus, ces méthodes présentent aussi un certain manque de précision dans
la lecture des résultats, la différenciation d’amplicons de taille proche ainsi que la numération
des amplicons dans le cas d’un très grand nombre étant particulièrement difficile lors de la
migration sur gel d’électrophorèse (Borah et al. 2018; Oliveira & Azevedo 2022;
Tsedaley 2015).
Les études présentées ci-après s'appuient sur l’utilisation des méthodes RAPD, MP-
PCR, ainsi que sur le séquençage de régions microsatellites. La méthode RAPD se base sur
l’amplification aléatoire de régions polymorphes de l’ADN (Bardakci 2001), tandis que la MP-
PCR consiste en l’amplification de régions de l’ADN située à une distance amplifiable entre
deux séquences microsatellites identiques (Weising et al. 1995). L’analyse des résultats de ces
deux méthodes consiste principalement en la révélation par électrophorèse. Le SSR-seq, ou
séquençage de marqueurs microsatellites, consiste à développer des amorces spécifiques à partir
de génomes disponibles afin de cibler les régions les plus polymorphes au sein des espèces
étudiées. L’obtention des génotypes est ensuite permis par le séquençage des régions
microsatellites amplifiées (Lepais et al. 2020). Ces régions sont des séquences d’ADN
ubiquitaires des génomes eucaryotes, hautement polymorphes et reproductibles, co-
dominantes, et se caractérisent par la répétition en tandem de motifs variant de 1 à 6 bases
(Guichoux et al. 2011; Jarne & Lagoda 1996; Tautz & Renz 1984).

De nombreux outils d’empreinte génétique ont été développés et appliqués à l’étude de

populations de B. dothidea et N. parvum soutenant ainsi l’hypothèse de transmission entre
différents hôtes et différents pays. Ma et al. (2001) ont réalisé une étude comparative de
populations de B. dothidea collectés dans différents comtés de Californie à partir de pistachiers,
mûriers, eucalyptus, pacaniers, saules et noyers, associée à une combinaison des techniques
RAPD et MP-PCR pour un total de 23 marqueurs étudiés (Ma et al. 2001). Les populations
associées à des hôtes natifs (saules, mûriers et noyers de Californie) présentaient une diversité
génétique supérieure à celles associées à des hôtes relativement nouvellement introduits
(pacaniers, pistachiers et eucalyptus) sans mettre en évidence de forte différenciation génétique

72
en fonction de l’hôte, mettant ainsi en avant une potentielle transmission entre ces différents
types d’hôtes (Ma et al., 2001). Les profils génétiques de B. dothidea isolés de pistachiers ont
ensuite été comparés sur 11 ans, entre 1990 et 2001 par MP-PCR sur la base de 116 marqueurs.
Les résultats ont montré une stabilité spatio-temporelle au sein des populations étudiées du fait
d’une identité génétique particulièrement élevée entre les populations des différents vergers
échantillonnés et entre les différentes années de prélèvement (Ma et al. 2003). Il serait toutefois
intéressant de s’assurer que cette stabilité se vérifie en ayant recours aux marqueurs de référence
actuels.
Plus récemment, Manawasinghe et al. (2018) ont réalisé une étude comparative de
populations de B. dothidea de vignes provenant de différentes régions de Chine, d’Australie,
du Canada, de Thaïlande et d’Italie, ainsi que d’isolats provenant d’autres hôtes (pommier,
poirier, pêcher et théier) par séquençage de 6 régions microsatellites ou SSR. La totalité des
isolats de cette étude provenaient de matériel végétal présentant des symptômes de
dépérissement, afin d’améliorer la compréhension de l’émergence du dépérissement du
vignoble en Chine. Cette étude a permis de mettre en avant un mode de reproduction
majoritairement clonal au sein des différentes populations étudiées ainsi qu’une très faible
différenciation génétique en fonction de l’hôte et des zones géographiques. Sur la base de ces
résultats, trois voies possibles d’émergence du dépérissement sur vignes en Chine ont été
suggérées : la transition d’un mode de vie endophyte à pathogène sous l’effet de stress
abiotiques subis par l’hôte, la transmission par l’introduction de matériel végétal, et la
transmission de proche en proche à partir d’autres hôtes (Manawasinghe et al. 2018; Marsberg
et al. 2017). En utilisant la même méthode, Mehl et al. (2017) ont également montré une faible
différenciation génétique entre des populations de N. parvum provenant de d’un hôte natif (le
marula) et d’un hôte cultivé (le manguier) de différentes localités d’Afrique du Sud, en accord
avec la capacité de N. parvum à coloniser une large diversité d’hôtes.
En résumé, ces études concernant les espèces B. dothidea et N. parvum permettent de
dégager des conclusions communes, et ce malgré la diversité des marqueurs utilisés. Les
populations étudiées présentent majoritairement un mode de reproduction principalement
clonal et un faible niveau de diversité génétique sans différenciation géographique ni en
fonction de l’hôte, hormis lors de développement sur des hôtes non cultivés et dans des
environnements sauvages. Elles confirment la caractérisation d’une faible spécificité d’hôtes
chez ces espèces et vraisemblablement une capacité de transmission d’hôte en hôte, et ce à
l’échelle mondiale compte tenu de la détection de génotypes communs à différentes zones
géographiques.

73
 Durant cette thèse, nous nous sommes intéressés à l’analyse de la diversité génétique et
de la structure des populations de B. dothidea et de N. parvum provenant de noyers. Ainsi,
seules les études génétiques concernant ces deux espèces ont fait l’objet de cette partie, en
intégrant les résultats associés aux méthodes plus anciennes (RAPD et MP-PCR) compte tenu
du faible nombre d’études de la structure génétique de populations de Botryosphaeriaceae
basées sur les marqueurs SSR et l’absence d’études basées sur les marqueurs SNPs.

74
 RESULTATS

75
76
CHAPITRE I - Mise au point méthodologique du séquençage
métabarcoding pour son application aux échantillons
environnementaux de noyer

77
78
I. Introduction des travaux
Comme décrit dans la partie introductive de ce manuscrit, l’analyse des écosystèmes
par une approche de séquençage métabarcoding apporte une vision plus large et plus fine des
communautés fongiques. Toutefois, de nombreux biais méthodologiques sont associés à ces
techniques, qu’il convient d’évaluer. Tout d’abord, le séquençage d’un seul gène barcode, tel
que la région ITS et ses sous-régions ITS1 et ITS2, n’étant généralement pas suffisant pour une
identification précise à l’échelle de l'espèce voire du genre, il est important de s’assurer de la
résolution taxonomique des amorces utilisées. De plus, la diversité des outils et des paramètres
disponibles pour l’analyse bioinformatique des résultats de séquençage peut fortement impacter
l’analyse des données. Il est donc important de comparer et d’évaluer la performance des
pipelines d’analyses et de vérifier qu’ils sont adaptés à l’écosystème analysé. Ces constats nous
ont conduits à comparer les différentes paires d’amorces, ciblant tout ou une partie de la région
ITS, et outils d’analyse bioinformatique vis-à-vis de leur spécificité et application concernant
les principales espèces fongiques ciblées durant ces travaux. Pour ce faire, nous avons eu
recours à des communautés fongiques synthétiques de composition et de concentration
connues, ou mock, afin (i) de s’assurer de la bonne amplification des espèces d’intérêt par les
amorces, (ii) d’évaluer les potentielles sur- ou sous-estimation de l’abondance relative de ces
espèces, et (iii) d’évaluer la résolution taxonomique de ces amorces en fonction des différents
outils bioinformatiques utilisés.

Après avoir cherché dans la littérature des amorces potentiellement adaptées au sujet
d’étude, puis testé in silico leur capacité à amplifier et différencier des genres/espèces fongiques
classiquement isolées de noyers (travail non présenté dans l’article), une paire d’amorces
ciblant la région ITS, une paire d’amorces ciblant la région ITS1 et 3 paires d’amorces
amplifiant la région ITS2 (dont une modifiée pour ces travaux sur la base d’amorces publiées ;
Morales-Cruz et al. 2018) ont été utilisées pour amplifier l’ADN de mocks, puis comparées.
Enfin, l’analyse des communautés fongiques d’échantillons de brous de noix et de rameaux
symptomatiques a été réalisée à l’aide des paires d’amorces les plus adaptées et d’une analyse
bioinformatique incluant ou non l’outil ITSx.

Les résultats de ces travaux ont fait l’objet d’un article publié dans le journal Plants,
présenté en partie II du présent chapitre.

79
II. Article publié dans Plants

Belair, M., Pensec, F., Jany, J.-L., Le Floch, G., Picot, A. Profiling Walnut Fungal Pathobiome
Associated with Walnut Dieback Using Community-Targeted DNA Metabarcoding. Plants
2023, 12, 2383. doi: 10.3390/plants12122383.

80
81
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106
Figures supplémentaires

107
 Supplementary Table S1. Total number of sequence reads obtained for each primer set and each mock replicate (-1, -2, -3) after read pre-
processing step with and without the ITS2 region extraction additional step.

Primer Mock1 Mock2 Mock3 Mock4 Mock5

set M1-1 M1-2 M1-3 M2-1 M2-2 M2-3 M3-1 M3-2 M3-3 M4-1 M4-2 M4-3 M5-1 M5-2 M5-3
ITS 35601 30814 27198 26126 27820 27587 40788 36961 32021 39048 39513 30496 42444 37605 36061
ITS1 38898 35619 36616 37986 37910 34191 50891 41730 48657 50890 52575 43680 60083 51699 37401
GTAA 49065 38493 41646 48554 55057 52562 42014 47906 39697 45967 40318 41336 43261 47527 41009
GTAAm 25062 24707 24207 41340 36624 40907 34170 35971 32265 30477 30591 29960 32809 34190 31484
Kyo 77209 141712 66163 63558 76730 78118 69227 77797 79702 75000 75652 74618 80320 73034 73046

108
 Supplementary Table S2. Amplification conditions for metabarcoding sequencing. Conditions are
common to all primer sets. Final volume of reaction was 25 µL. Conditions were determined by Génome
Québec Innovation Center.
Master Mix Components Final concentration Amplification cycles

Qiagen 10X Buffer with 15 mM MgCl 2 1X

Denaturing
Roche DMSO 5% 96 cycles - 15 min

Annealing
dNTP mix 10 mM_NEB 0.2 mM 96 cycles - 30 sec
52 cycles - 30 sec
Qiagen HotStarTaq 5U/µL 0.01 U/µL 72 cycles - 60 sec

Extension
H2O q.s. 25 µL
72 cycles - 10 min

Forward primer 0.6 µM

Reverse primer 0.6 µM

eDNA 8 pM

Supplementary Table S3. Optimal trimming parameters of mock and environmental samples indicated
by FIGARO for each primer pair.
Primer set Samples Fwd reads Rev reads Maximum Read Score
trimming trimming expected retention (%)
parameter (bp) parameter (bp) error
(Fwd;Rev)

ITS Mock 292 220 4;4 78,62 60,02

ITS1 Mock 284 228 2;2 82,71 80,71

GTAA Mock 281 229 3;4 82,78 69,78

GTAAm Mock 282 228 3;4 82,21 69,20

Environmental 280 230 3;4 82,8 69,80

Kyo Mock 287 223 3;3 83,4 75,40

Environmental 278 232 2;3 80,1 75,10

Fwd: Forward; Rev: Reverse.
Maximum expected error corresponds, for a given read, to the mean maximum number of errors that
would be observed in a large collection of reads, where the error rate at each position is given by its
quality score and occurs independently [142]. Score corresponds to a value assigned at the trimming
parameters taking into account read retention values from which maximum expected errors values are
subtracted [143].

109
 Supplementary Table S4. Number (nb) of sequences for each species composing our local ITS2 database. The total number of sequences corresponds to the
sequences retrieved from the GenBank database. Number of GTAAm and Kyo amplicons are the in silico amplicons obtained with the GTAA182fm/526r and
ITS3/ITS4_KYO1 primer pairs. A total of 55 species and 71 species were represented in Kyo and GTAAm final databases respectively.
Kyo primers GTAAm primers
Total nb of
Nb of Nb of Nb of retained Nb of Nb of Nb of retained
Species retrieved
Classification amplicons unique amplicons for amplicons unique amplicons for
sequences
amplicons treesc amplicons treesc
Bionectriaceae Geosmithia flava 4 0 0 0 2b 1 1
Geo. lavendula 7 2 1 1 3b 1 1
Geo. morbida 3 2 1 1 3b 1 1
Botryosphaeriaceae Botryosphaeria dothidea 82 13 1 1 48 1 1
Diplodia gallae 8 0 0 0 2 1 1
D. mutila 33 12 5 5 22 5 2
D. seriata 74 22 2 2 43 4 3
Dothiorella iberica 47 15 2 2 33 6 2
Dot. omnivora 3 0 0 0 0 0 0
Dot. plurivora 5 1 1 1 2 2 2
Dot. sarmentorum 36 7 2 2 7 2 2
Dot. viticola 22 7 2 2 9 2 2
Lasiodiplodia citricola 5 0 0 0 1 1 1
L. mahajangana 6 0 0 0 4 2 2
L. pseudotheobromae 35 2 2 2 26 2 2
L. theobromae 96 51 2 2 76 4 4
Neofusicoccum hellenicum 5 0 0 0 5 1 1
N. luteum 47 3 2 1 38 3 2
N. mediterraneum 50 2 2 2 27 5 3
N. nonquaesitum 29 1 1 1 28 2 2
N. parvum 95 21 3 2 60 6 4
N. vitifusiforme 81 3 2 1 44 6 2
Neoscytalidium 4 2 2 16 4 2
54
dimidiatum

110
Supplementary Table S4. Continued.
Kyo primers GTAAm primers
Total nb of
Nb of Nb of Nb of retained Nb of Nb of Nb of retained
Species retrieved
Classification amplicons unique amplicons for amplicons unique amplicons for
sequences
amplicons treesc amplicons treesc
Diaporthaceae Diaporthe amygdali 210 5 3 3 16 4 4
Dia. australafricana 7 1 1 1 7 4 2
Dia. biguttulata 2 0 0 0 0 0 0
Dia. capsici 5 5 1 1 5 1 1
Dia. cynaroidis 5 1 1 1 3 1 1
Dia. eres 185 5 3 2 143 10 4
Dia. foeniculina 124 28 5 5 109 8 4
Dia. juglandicola 4 0 0 0 0 0 0
Dia. novem 52 11 4 2 33 7 4
Dia. rudis 79 20 3 1 68 7 2
Dia. shennongjiaensis 6 2 1 1 2 1 1
Didymellaceae Epicoccum nigruma 52 8 3 3 46 4 2
Glomerellaceae Colletotrichum acutatum 180 16 6 4 133 13 3
C. fioriniae 84 3 3 3 80 2 2
C. fructicola 92 32 2 1 85 3 2
C. gloeosporioides 126 6 2 1 74 8 3
C. godetiae 73 10 1 1 71 4 4
C. kahawae 7 0 0 0 7 2 2
C. nymphaeae 143 26 1 1 143 8 4
C. siamense 106 8 3 2 94 6 3
C. viniferum 33 8 3 3 19 7 3
Gnomoniaceae O. leptostyla 9 0 0 0 7 3 2
Juglanconidaceae Juglanconis appendiculata 7 7 2 2 7 2 2
J. juglandina 7 6 1 1 6 1 1

111
 Supplementary Table S4. Continued.
Kyo primers GTAAm primers
Total nb of
Nb of Nb of Nb of retained Nb of Nb of Nb of retained
Species retrieved
Classification amplicons unique amplicons for amplicons unique amplicons for
sequences
amplicons treesc amplicons treesc
Nectriaceae Fusarium avenaceum 26 11 3 3 20 4 2
F. chlamydosporum 11 2 2 1 6 4 1
F. culmorum 18 5 4 3 11 4 2
F. equiseti 22 9 2 2 21 3 2
F. graminearum 232 21 2 2 227 12 2
F. incarnatum 23 4 2 2 19 2 2
F. juglandicola 6 4 1 1 6 1 1
F. oxysporum 129 14 4 4 101 9 3
F. proliferatum 70 28 3 2 53 10 2
F. solani 212 26 4 4 59a 16 3
Plectosphaerellaceae Gibellulopsis nigrescensa 33 1 1 1 6 2 2
Pleosporaceae Alternaria alternata 138 5 3 3 132 7 4
A. arborescens 20 3 2 2 18 3 3
A. tenuissima 16 8 3 3 14 4 2
Togniniaceae Phaeoacremonium 0 0 0 1 1 1
3
cinereum
P. fraxinopennsylvanicum 12 0 0 0 5 2 2
P. italicum 0 0 0 0 0 0 0
P. minimum 55 2 1 1 37 11 2
P. parasiticum 15 4 3 3 11 3 2
P. sicilianum 3 0 0 0 1 1 1
P. tuscanum 2 0 0 0 2 1 1
P. viticola 10 1 1 0 7 2 1

112
Supplementary Table S4. Continued.
Kyo primers GTAAm primers
Total nb of
Nb of Nb of Nb of retained Nb of Nb of Nb of retained
Species retrieved
Classification amplicons unique amplicons for amplicons unique amplicons for
sequences
amplicons trees c amplicons treesc
Valsaceae Cytospora atrocirrhata 2 0 0 0 2 1 1
Cyt. californica 29 0 0 0 0 0 0
Cyt. ceratosperma 18 3 1 1 15 5 2
Cyt. chrysosperma 23 1 1 1 11 1 1
Cyt. cincta 3 0 0 0 3 3 3
Cyt. gigalocus 2 0 0 0 2 1 1
Cyt. joaquinensis 3 0 0 0 9 6 3
Cyt. nivea 18 0 0 0 0 0 0
Cyt. plurivora 17 0 0 0 0 0 0
a E. nigrum and G. nigrescens were the unique representative species of each genus ever isolated from environmental samples, so no other species of these genera

were added to the databases for phylogenetic construction.

b Amplicons obtained with 2 mismatches allowed anywhere on primer sequences. c To improve clarity of trees, only some of the sequences were randomly kept.

113
Supplementary Figure S1. Rarefaction curves of high-quality sequence reads for each mock
community replicate. A: ITS set. B: ITS1 set. C: GTAA set. D: GTAAm set. E: Kyo set.

114
CHAPITRE II - Etude de la diversité fongique associée aux
fruits et rameaux de noyer présentant des symptômes de
dépérissement et leurs interactions

115
116
I. Introduction des travaux
La mise au point méthodologique du séquençage métabarcoding présentée
précédemment a pu être mise en œuvre pour décrypter les communautés fongiques associées
aux symptômes de dépérissement du noyer et leurs interactions. Cette étude avait pour objectifs
(i) d’explorer la diversité fongique associée aux brous et rameaux de noyer présentant des
symptômes de dépérissement et aussi d’apparence saine à l’aide des analyses complémentaires
culture-dépendante et culture-indépendante, (ii) d’évaluer la pathogénicité des principales
espèces collectées suspectées d’être responsables des symptômes, (iii) d’étudier l’impact de
facteurs climatiques et pratiques agronomiques sur la structure de ces communautés, et (iv) de
déterminer de potentielles interactions entre les principales espèces suspectées d’être
pathogènes, ainsi qu’entre ces espèces et les autres espèces composant le phytomicrobiome.

Pour ce faire, 12 noyeraies sélectionnées sur la base de leur historique de dépérissement

évalué par les stations expérimentales, et réparties de manière équivalente entre les deux
principaux bassins de production français (bassin du Sud-Ouest et bassin du Sud-Est) ont été
échantillonnées lors de 4 campagnes de prélèvements. Ces parcelles étaient associées à
différentes variétés (Franquette et Serr), mais aussi différentes pratiques agronomiques (telles
que le recours ou non à l’irrigation, et l’application de traitements de types conventionnels ou
de type biologique essentiellement à l’aide de produits à base de cuivre). Les campagnes
consistaient à prélever des fruits symptomatiques avant la récolte (en septembre 2020 et
août 2021) ainsi que des rameaux pendant la période printanière avant la fructification (mai
2020 et 2021), périodes durant lesquelles les symptômes sont bien visibles sur chacun de ces
organes.

L’analyse de la composition des communautés fongiques a été réalisée à l’aide d’une

approche culturale, par la mise en culture des échantillons, et aussi à l’aide d’une approche
culture-indépendante par séquençage métabarcoding. L’isolement des espèces fongiques a
conduit à l’obtention d’une collection de plus de 2000 isolats, dont 1873 représentant la
collection de travail sur laquelle se basent les travaux présentés dans ce chapitre, composée
uniquement d’un représentant de chaque espèce par organe analysé. L’identification des
espèces sur la base du séquençage de la région ITS a été réalisée et le séquençage multigénique
de représentants des espèces majeures est encore en cours et ne sera pas présenté dans ce
manuscrit. Ces approches ont ainsi permis d’évaluer la prévalence des différentes espèces
(nombre d’organes infectés par une espèce par rapport au nombre total d’organes analysés)

117
ainsi que leur abondance relative. L’obtention de cette collection a aussi permis la réalisation
de tests de pathogénicité avec les principales espèces d’intérêt sur rameaux de 1 an détachés en
conditions contrôlées. De plus, l’impact de différents facteurs, tels que l’organe d’origine, la
région, l’année de prélèvement, la variété ou encore les données météorologiques a pu être
évalué sur la base de ces résultats.

Nous avons ensuite cherché à identifier des éventuelles interactions entre 2 taxons de
différentes façons, tout d’abord en étudiant les corrélations sur la base des données de
prévalence (corrélogrammes) et d’abondance relative (en générant des réseaux de co-
occurrence avec l’outil SparCC). Ces données ont permis de mettre en avant plusieurs
corrélations significatives positives et négatives entre nos espèces pathogènes, suggérant de
potentielles interactions de type antagoniste ou mutualiste. Pour aller plus loin, nous avons
également cherché à savoir si ces associations ou exclusions étaient retrouvées à l’échelle de
l’organe. Autrement dit, pour une corrélation positive mettant en jeu 2 taxons, nous avons
déterminé, à l’aide de tests du Khi-2, si cette association entre ces 2 taxons était effectivement
plus fréquemment retrouvée à l’échelle de l’organe que les deux taxons seuls, et inversement
pour les corrélations négatives. Cette exploitation des résultats a permis de mettre en évidence
des hypothèses que nous avons ensuite cherché à valider par des inoculations seules, mixtes et
séquentielles sur rameaux détachés en conditions contrôlées.

Ces travaux font l’objet d’un article en préparation, présenté en partie II du présent
chapitre.

Au moment de l’écriture de ce manuscrit, des expérimentations et analyses sont toujours en

cours afin d’amender les travaux présentement décrits. Tout d’abord, le séquençage de
plusieurs gènes barcodes spécifiques de chacune des 6 espèces est en cours de réalisation, afin
d’affiner l’identification taxonomique, actuellement basée exclusivement sur la région ITS. De
plus, des tests de pathogénicité sont en cours de réalisation auprès des stations expérimentales.
Ces tests sont réalisés sur fruits détachés et en vergers, et seront ajoutés à ce papier dès la fin
de leur réalisation. Ceux-ci permettront l’obtention d’une vision plus large et plus précise de
la pathogénicité des principales espèces. Enfin, pour les inoculations mixtes et séquentielles
sur rameaux détachés, nous avons fait le choix de détecter et de quantifier les espèces inoculées
par qPCR espèce- et genre-spécifique. Ainsi, les discussions et conclusions qui découlent des
travaux présentés dans ce chapitre sont faites sur la base des données disponibles.

118
II. Article en préparation

Belair M., Picot A., Masson C., Hébrard M.-N., Debled M., Morvant, L., Henri-Sanvoisin A.,
Tréguer S., Verhaeghe A., Laloum Y., Le Floch G., Pensec F. Etiology and epidemiology of
branch dieback and fruit blight and necrosis of English walnut associated with
Botryosphaeriaceae, Diaporthaceae, Glomerellaceae and Nectriaceae species in southern
France. Manuscript in preparation

119
Etiology and epidemiology of branch dieback and fruit blight and necrosis of English

walnut in France

Marie Belair1, Adeline Picot1, Cyrielle Masson2, Marie-Neige Hébrard3, Marie Debled3, Aude
Moronvalle4, Léa Morvant1, Amandine Henri-Sanvoisin1, Sylvie Tréguer1, Agnès
Verhaeghe2,4, Yohana Laloum4, Gaétan Le Floch1, Flora Pensec1

1
Univ Brest, INRAE, Laboratoire Universitaire de Biodiversité et Écologie Microbienne, F-
29280 Plouzané, France
2
Station d’expérimentation Nucicole Rhône Alpes, 38160 Chatte, France
3
Station Expérimentale de Creysse, Perrical 46600 Creysse, France
4
Centre Technique Interprofessionnel des Fruits et Légumes, Centre opérationnel de Lanxade,
24130 Prigonrieux, France

corresponding author : [Link]@[Link]

120
Abstract

English walnut (Juglans regia L.) is an economically-important fruit crop worldwide,

particularly in France, where it is the second most important fruit crop after apples in terms of
surface area. Walnut orchards are targeted by numerous diseases, but new symptoms have been
widely observed since 2015, consisting in typical branch dieback and fruit blight and necrosis.
The aims of this study were to (i) identify the main fungal species composing the pathobiome
using both culture-dependent and metabarcoding approach, (ii) test the pathogenicity of the
main suspected fungal species on detached twigs, (iii) explore the impact of climate and
agronomical practices on the structure of the pathobiome, and (iv) study the interactions
between pathogenic species and members of the phytomicrobiome. From 2020 to 2022, both
symptomatic and asymptomatic twigs and husks were collected from 12 commercial French
walnut orchards from the 2 main production areas located in the South of France. Isolates were
identified based on colony morphology and internal transcribed spacer region sequencing.
Botryosphaeriaceae, Colletotrichum, Diaporthe, and Fusarium species were consistently
isolated from symptomatic husks and twigs. Among these taxa, B. dothidea and C. godetiae
were significantly more associated with symptomatic husks, contrary to D. eres and F.
juglandicola, more isolated from symptomatic twigs, in agreement with a significant impact of
the organ type on the mycobiota structure based on ITS2 metabarcoding sequencing. The
analysis of the pathobiome by metabarcoding further revealed that sampling campaign and area
also significantly impacted its structure, either on twigs or husks (with R² varying from 5% to
6.1%) while the use of irrigation and chemical versus biological treatments had lower impact.
We also found that Botryosphaeria and Diaporthe were significantly more associated with
warm and dry years, unlike Colletotrichum. Pathogenicity tests performed on detached twigs
using mycelium plugs revealed that only Botryosphaeriaceae and Diaporthe species were
pathogenic of variety Franquette, with B. dothidea and N. parvum being the most pathogenic
species. Several significant positive and negative correlations were identified based on SparCC
co-occurrence networks and correlograms based on prevalence data. In particular, the positive
correlation between D. eres and F. juglandicola at the orchard and organ level was confirmed
by mixed and sequential coinoculations on detached twigs, suggesting a facilitative interaction
between these 2 species for symptom development. This work is the first comprehensive
etiological and epidemiological study of branch dieback and fruit blight and necrosis of English
walnut in France.

121
Keywords dieback disease, fungal communities, metabarcoding, pathogenicity, interactions,
Juglans regia

Introduction

English walnut (Juglans regia L.), or common walnut, is the most cultivated species of
the Juglans genus for its fruit production (Martínez-García et al. 2016). The worldwide
production of walnuts is estimated to reach approximately 3.5 million tons, of which 37,000
tons are produced in France (FAOSTAT 2021). The French walnut industry is mainly
concentrated in the south of France and is divided into two main production areas: the South-
East area (Auvergne-Rhône-Alpes region) and the South-West area (Nouvelle-Aquitaine and
Occitanie regions). Over the last thirty years, the walnut production area has increased by
148.8%, showing an increasing interest of the French producers in walnut cultivation
(FAOSTAT 2021). Walnut growers have to face many challenges, including the management
of pests and diseases, resulting in severe yield losses. Of these, the bacterial blight caused by
Xanthomonas campestris pv. juglandis and the anthracnose caused by
Ophiognomonia leptostyla have been historically encountered (Radix et al. 1994; Verhaeghe
2014). These challenges were further compounded by the development of a form of anthracnose
caused by species of the genus Colletotrichum and responsible for fruit losses of up to 70%,
since 2007 onwards (Da Lio et al. 2018). More recently, in 2015, emergent symptoms, rarely
observed so far in France, were reported at a nationwide level (Laloum et al. 2022). These new
symptoms were characterized by fruit necrosis and blight, twig and shoot necrosis further
leading to branch and even tree dieback associated with defoliation and dead buds, as well as
branch canker (Laloum et al. 2022).
In a previous survey conducted in the South-West of France in 2019, fungi isolated from
symptomatic walnut husks and twigs showing the latter symptoms were identified as belonging
mainly to the family Botryosphaeriaceae, including Botryosphaeria spp., Dothiorella spp. and
Neofusicoccum spp., and the genus Diaporthe (teleomorph of Phomopsis spp.), as well as to
the Colletotrichum and Fusarium genera to a lesser extent (Trouillas et al. 2023). The
symptomatology combined with the identification of species associated with symptoms
suggested that the “Botryosphaeria and Phomopsis canker and blight disease”, also known as
“Branch dieback and shoot blight disease”, was present in French walnut orchards, in
association with other phytopathogenic species. This disease is mainly known to be widespread
in California since the early 2000s (Chen et al. 2014), and has more recently been reported in

122
European countries such as the Czech Republic (Eichmeier et al. 2020) Spain (López-Moral et
al. 2020b), Italy (Gusella et al. 2021), Romania (Mihaescu et al. 2021), and Hungary (Zabiák
et al. 2023). These studies reported up to ten species of the family Botryosphaeriaceae and up
to two Diaporthe species, isolated from samples associated with dieback symptoms of English
walnut. Moreover, other species such as Alternaria alternata, Cadophora spp., Colletotrichum
acutatum, Cytospora spp., Fusarium spp., and Phaeoacremonium spp. were identified, but to a
lesser extent. Overall, these studies highlighted the frequent co-occurrence of species of
Botryosphaeriaceae and Diaporthe on symptomatic walnut organs.
Members of the Botryosphaeriaceae family and Diaporthe genus are considered to be
endophytes, saprophytes and pathogens. Their ability to develop in organs without developing
symptoms, leading to latent infection, and to switch to a pathogenic lifestyle is widely
acknowledged (Hilário & Gonçalves 2023; Slippers & Wingfield 2007). These species are
responsible for numerous diseases on a wide range of woody and herbaceous plants, such as
grapevine (Guerin-Dubrana et al. 2019), pistachio (López-Moral et al. 2020a) and oak (Batista
et al. 2020; Moricca et al. 2018), and are frequently found co-occurring on hosts, prompting
the determination of their aggressiveness in single or mixed inoculations (Agustí-Brisach et al.
2019; Wallis et al. 2022). Overall, B. dothidea and Diaporthe species were more often
associated with weak disease severity on walnut trees, whereas Lasiodiplodia and
Neofusicoccum species were frequently associated with a higher aggressiveness (Antony et al.
2023; Chen et al. 2014; Eichmeier et al. 2020; Gusella et al. 2021; Jiménez Luna et al. 2022a;
Li et al. 2016; López-Moral et al. 2020b).
Botryopshaeriaceae and Diaporthe were also often reported in association with
secondary genera, including Colletotrichum and Fusarium. The former genus is composed of
worldwide distributed pathogenic species responsible for numerous diseases (Cannon et al.
2012), including anthracnose on walnut trees. Moreover, it was also identified in walnut fruits
showing brown apical necrosis symptoms (Belisario et al. 2010; Wang et al. 2019), as well as
in apparently healthy walnut leaves (Wang et al. 2022b). As for the Fusarium genus, it is
composed of species considered as endophytes, saprophytes and pathogens. Some species have
already been identified as endophytes of apparently healthy walnut organs (Belisario et al.
2010; Wang et al. 2020, 2022b), but many of them were also collected from symptomatic
organs and associated with walnut diseases. This mainly includes the brown apical necrosis
(BAN) disease (Belisario et al. 2010; Moragrega & Özaktan 2010) and twig and stem canker
symptoms, mainly associated with F. solani (Chen & Swart 2000; Mulero-Aparicio et al. 2019;
Polat et al. 2020; Tuerdi et al. 2023).

123
 The emerging and widespread nature of these symptoms urged us to carry out an
etiological and epidemiological study of branch dieback and fruit necrosis of English walnut
on a larger scale in France. Furthermore, given the complexity of these diseases where several
pathogenic species are often co-occurring, we also focused on the whole pathobiome, taking
into account potential interactions. To do so, the objectives of this work were (i) to isolate and
identify the main fungal species associated with branch dieback and fruit necrosis of English
walnut based on morphological and molecular characterization, and evaluate their
pathogenicity on walnut twigs in single inoculations, (ii) to describe more extensively the fungal
pathobiome composition based on a metabarcoding approach, (iii) to study the climatic factors
and agronomic practices influencing the pathobiome based on culture-dependent and -
independent approaches, and (iv) to determine potential interactions between pathogenic
species and with members of the phytomicrobiome based on co-occurrence networks and
correlation analysis, before validation on detached twigs using single, mixed and sequential
inoculations.

Materials and methods

Sampling sites and sample collection

From late summer 2020 to early summer 2022, field surveys were conducted to study
the occurrence of branch dieback and fruit blight and necrosis of English walnut in southern
France. Twelve commercial orchards (P1 to P12) belonging to the Auvergne-Rhône-Alpes
region (South-East production area, P1 to P6, variety Franquette) and the Nouvelle-Aquitaine
region (South-West production area, P7 to P12, variety Franquette or cultivar Serr) were
surveyed (Table 1). In each orchard, symptomatic and asymptomatic walnut organs were
collected from different trees during four sampling campaigns. Walnut husks were collected in
September 2020 and August 2021, and twigs were collected in May 2021 and June 2022. In
each orchard, 5 symptomatic walnut husks were collected during September 2020, while 12
symptomatic and 3 asymptomatic walnut husks and the same number of twigs were collected
during the three other campaigns, when possible. The P7 orchard could not be sampled during
the sampling campaign of August 2021. All samples were stored at 4°C until analyzed within
one week.

124
 Table 1. Description of walnut orchards sampled for this study.

Orchard Variety/Cultivar Agricultural Irrigation Location Coordinates

system

P1 Franquette Conventional No Vinay 45.201437,

5.421654

P2 Franquette Conventional No Saint-Hilaire-du-Rosier 45.092966,

5.270988

P3 Franquette Conventional No Saint-Lattier 45.085187,

5.190457

P4 Franquette Conventional Yes Saint-Hilaire-du-Rosier 45.101075,

5.241277

P5 Franquette Organic No Rochechinard 45.043283,

5.256293

P6 Franquette Organic No Saint-André-en-Royans 45.082702,

5.342242

P7 Serr Conventional Yes Creysse 44.9007444,

1.6100139

P8 Franquette Organic No Floirac 44.9034389,

1.6474278

P9 Serr Conventional Yes Nojals-et-Clotte 44.7116472,

0.7712083

P10 Franquette Conventional Yes Saint-Cyprien 44.8467500,

1.0624222

P11 Franquette Organic Yes Martel 44.9540528,

1.6410972

P12 Franquette Conventional Yes Creysse 44.8873833,

1.6066278

Culture-dependent analysis

Collection of fungal isolates

Environmental samples were sterilized and cut into small pieces as described in
Belair et al. (2023) and 5 pieces of each sample were placed onto potato dextrose agar (PDA)
medium supplemented with 10 mL/L of a Penicillin-Streptomycin solution (10,000 units
penicillin and 10 mg streptomycin/mL, Sigma Aldrich, Saint-Louis, MO, USA). Fungal isolates
were collected on PDA medium and grown for an incubation period of 4 days at 25°C in the
dark followed by 3 days at room temperature under natural light.
The ratio of the number of organs contaminated with a species to the total number of
organs analyzed (i.e. the prevalence) was assessed for each species. A chi-squared test was used

125
to determine whether the prevalence of each species on symptomatic organs differed from that
on asymptomatic ones. Pairwise correlations between the prevalence of the 6 main species were
calculated for both symptomatic walnut husks and twigs regardless of the campaign using
Pearson’s correlation coefficient (PCC) and plotted using the corrplot R package (Wei & Simko
2021). Only significant correlations (p < 0.05) were plotted.
The beta-diversity analysis was performed with the species’ prevalence on the
symptomatic organs. Statistical analysis was performed with a Permutational Multivariate
Analysis of Variance (PERMANOVA) followed by a pairwise multilevel comparison using the
vegan and pairwise Adonis R packages (Arbizu 2023; Oksanen et al. 2022).

Molecular identification of fungal isolates

For DNA extraction, mycelium of fungal cultures was scraped directly from the medium
using a sterile scalpel. Extractions were performed using FastDNA™ SpinKit (MP
Biomedicals, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) following the manufacturer’s instructions.
The internal transcribed spacer (ITS) region was amplified using ITS4 and ITS5 primers and
following White et al. (1990) instructions. Sequencing of the obtained amplicons was
performed using the same primer pair by Eurofins Genomics platform (Cologne, Germany).
Contig assembly was performed using DNA Baser software and taxonomic assignment to the
closest known relatives was performed by comparing contigs with the GenBank database using
the “Basic Local Alignment Search Tool” for nucleotide sequences (BlastN;
[Link] (accessed on 5 September 2022); Altschul et al. 1990).

Culture-independent analysis

DNA extraction of environmental samples

For each collection campaign and for each of the 12 orchards, all samples with the same
symptomatology were pooled before being lyophilized and ground as described in Belair et al.
(2023), yielding a total of 282 samples (94 environmental samples × 3 replicates). Total DNA
extractions were performed in triplicate using FastDNA™ Spin Kit and following
manufacturer’s instructions. DNA solutions were quantified using a NanoDrop 1000
Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Extraction blanks were
prepared alongside the samples to check for potential contamination.

126
Metabarcoding sequencing and bioinformatic

To study fungal communities, primers ITS3 and ITS4_KYO1 were selected to amplify
the ITS2 region (Toju et al. 2012; White et al. 1990). This primer pair was previously evaluated
as the most appropriate for analyzing fungal communities associated with walnut samples due
to its taxonomic resolution and ability to amplify a wide range of fungal diversity (Belair et al.,
2023). Amplicon libraries and Illumina MiSeq PE 300 bp sequencing were performed in the
same run at the McGill University and Génome Québec Innovation Center (Montréal, Canada).
Adapter and amplification conditions were the same as described in Belair et al. (2023).
Similarly, the workflow used for sequence analysis in this study was the one defined as
the most appropriate for the analysis of fungal communities in walnut samples using this primer
pair in Belair et al. (2023).

Alpha- and beta-diversity analysis

The calculation of three alpha-diversity indexes (Observed richness, Shannon and

Simpson’s inverse) for all samples was based on a rarefied dataset at the smallest read counts
using the phyloseq R package (McMurdie & Holmes 2013). These indexes were further
compared within and between samples by performing an ANOVA and independent sample
[Link] analyses with the stat_compare_means function of the ggpubr R package (Kassambara
2023). In all cases, data were tested for equality and homogeneity of variances.
Relative abundances of taxa across samples were compared after a step of normalization
using the DESeq2 method (Love et al. 2014) as suggested by McMurdie & Holmes (2014).
Differences were expressed as log2 fold changes and their significance levels were tested using
Wald test with an alpha threshold set at 0.05 (Love et al. 2014). The normalized datasets were
used to produce distance matrices based on Bray-Curtis dissimilarity distance (Bray & Curtis
1957) to perform Principal Coordinates Analysis (PCoA) using ggplot2 R package (Wickham
2016). Statistical analyses were performed with a PERMANOVA followed by a pairwise
multilevel comparison using the vegan and pairwiseAdonis R packages (Arbizu 2023; Oksanen
et al. 2022).
Significant correlations between the relative abundance of the top 15 genera were
established for each organ type using Sparse Correlations for Compositional data algorithm
implemented in SparCC python module (Friedman & Alm 2012; Legorreta 2021). The co-
occurrences networks were plotted for each symptomatic organ, regardless of the campaign,
using the qgraph R package (Epskamp et al. 2012). Only correlations with a correlation strength

127
 absolute value greater than 0.3 (|coefficient correlation (=corr)| > 0.3) and p-value inferior to
0.05 were plotted.

Pathogenicity tests

Fungal isolates

Twenty-nine isolates in total were selected for pathogenicity tests on detached shoots (6
isolates of B. dothidea, F. juglandicola and N. parvum, 5 isolates of D. eres, and 3 isolates of
both C. fioriniae and C. godetiae). These isolates were selected from the list of isolates collected
from symptomatic walnut husks or twigs during the 4 collection campaigns (Table 2). All
isolates were grown on PDA at 25°C in darkness. Inoculations were carried out using mycelium
plugs obtained from the margins of actively growing colonies at least 2 days old.

Table 2. Fungal isolates used for the pathogenicity and interaction tests.

Species Isolate Organ Campaign Origin Date of collection

Botryosphaeriaceae

Botryosphaeria dothidea SHP1T12I2_2021 Twigs May 2021 Vinay 05/17/2021

SHP10T7I1_2021 Twigs May 2021 Saint-Cyprien 05/10/2021

CAP8T6I3_2021 Twigs May 2021 Floirac 05/10/2021

SHP5H1I2_2020 Husks September 2020 Rochechinard 10/12/2020

SHP3H5I2_2020 Husks September 2020 Saint-Lattier 10/12/2020

SHP1H10I2_2021 Husks August 2021 Vinay 09/02/2021

Neofusicoccum parvum SHP5T6I3_2021 Twigs May 2021 Rochechinard 05/17/2021

CAP3T15I3_2021 Twigs May 2021 Saint-Lattier 05/17/2021

CAP12T4I1_2021a Twigs May 2021 Creysse 05/17/2021

SHP4H4I1_2020 Husks September 2020 Saint-Hilaire-du-Rosier 10/12/2020

SHP7H1I1_2020 Husks September 2020 Creysse 10/09/2020

a
Isolates used for the in vitro evaluation of interactions.

128
 Table 2. Continued.

Species Isolate Organ Campaign Origin Date of collection

Botryosphaeriaceae

Neofusicoccum parvum SHP9H4I2_2021 Husks August 2021 Nojals-et-Clotte 08/11/2021

Diaporthaceae

Diaporthe eres SHP10T12I2_2021 Twigs May 2021 Saint-Cyprien 05/10/2021

SHP2T8I6_2021 Twigs May 2021 Saint-Hilaire-du-Rosier 05/17/2021

SHP5T15I4_2021a Twigs May 2021 Rochechinard 05/17/2021

SHP11H5I6_2020 Husks September 2020 Martel 10/09/2020

SHP4H4I5_2020 Husks September 2020 Saint-Hilaire-du-Rosier 10/12/2020

Glomerellaceae

Colletotrichum fioriniae SHP6T7I2_2021 Twigs May 2021 Floirac 05/10/2021

SHP10T10I1_2021 Twigs May 2021 Saint-Cyprien 05/10/2021

SHP1T1I5_2022 Twigs May 2021 Vinay 01/07/2022

C. godetiae SHP8T11I2_2021 Twigs May 2021 Floirac 05/10/2021

SHP11T14I2_2021 Twigs May 2021 Martel 05/10/2021

SHP3T11I9_2021 Twigs May 2021 Saint-Lattier 05/17/2021

Nectriaceae

Fusarium juglandicola SHP4T5I7_2021 Twigs May 2021 Saint-Hilaire-du-Rosier 05/17/2021

SHP6T6I8_2021 Twigs May 2021 Saint-André-en-Royans 05/17/2021

SHP10T7I3_2021a Twigs May 2021 Saint-Cyprien 05/10/2021

SHP12H2I6_2020 Husks September 2020 Creysse 10/09/2020

a
Isolates used for the in vitro evaluation of interactions.

129
 Table 2. Continued.

Species Isolate Organ Campaign Origin Date of collection

Nectriaceae

Fusarium juglandicola SHP2H2I5_2020 Husks September 2020 Saint-Hilaire-du-Rosier 10/12/2020

SHP8H13I2_2021 Husks August 2021 Floirac 08/11/2021

a
Isolates used for the in vitro evaluation of interactions.

Inoculation of detached twigs

One-year-old detached twigs of walnut variety Franquette were collected in February

2023 from an experimental orchard belonging to the walnut experimental station (SENuRA)
located in Chatte (Isère department, Auvergne-Rhône-Alpes region). Twigs approximately 1 m
long were stored at 4°C up to 15 days before being processed. To carry out the tests on fresh
wood only, the two ends were cut off (about 10 cm) to remove any potentially dried parts. Then,
segments of approximately 20 cm including 2 nodes were cut. Prior to inoculation, the bark
surface was disinfected with a 70% ethanol solution. A 6-mm-diameter drill bit was used to
drill segments down to the pith. Subsequently, they were inoculated with a 6-mm-diameter
mycelium plug which was deposited in contact with the pith, and the inoculated point was
immediately covered with petroleum jelly and wrapped with Parafilm. Both ends were sealed
with melted paraffin to prevent desiccation and segments were placed in humidity chambers
(plastic containers, 27 × 20.5 × 7 cm) filled with sterile filter paper (Grosseron, Couëron,
France) and 90 mL sterile distilled water. A total of thirteen segments were placed in each
humidity chamber, i.e. ten segments inoculated with one isolate and three control segments
including a drilled segment without a PDA plug and petroleum jelly, a drilled segment without
a PDA plug and covered with petroleum jelly, and a drilled segment inoculated with a PDA
plug and covered with petroleum jelly. The humidity chambers were incubated in a climatic
chamber (FitotronⓇ SGC 120, Weiss Technik France S.A.S., Eragny, France) at 25°C with a
constant humidity level of 40% and in darkness. The development of the lesion was checked
every 10 days in one twig segment and was recorded for all segments when the lesion was
almost as long as the segment in case of rapid development (10 days for B. dothidea, 11 days
for N. parvum and 12 days for D. eres), or after 31 days in the case of slow development
(Colletotrichum species and F. juglandicola). The size of the necrotic lesion was measured after
removing the outer bark along the entire length of the segment with a sterile scalpel. The lesion

130
length of controls was recorded at the same time as the segments of the species with which they
were incubated. The rate of lesion development per day was then calculated (mm/day). In order
to check for the presence of the inoculated isolates in the observed necroses, the margins of the
lesion were cut and placed onto PDA supplemented with antibiotics and incubated at 25°C in
the dark as described above. The percentage of reisolation for each isolate was then calculated.
In all cases, mean lesion rate were compared according to Tukey’s HSD test at ɑ = 0.05.
There were no significant differences between the necrosis rate of the three control treatments
based on Tukey’s HSD test (ɑ = 0.05), therefore these data were combined for statistical
analyses. Statistical comparisons were performed between all tested species and controls
(regardless of isolates) and then between all isolates of a species and controls.

Evaluation of interactions between fungal species in detached twigs

Interactions were assessed between D. eres and N. parvum and between D. eres and
F. juglandicola on 1-year-old detached twigs obtained from the same batch of twigs used for
pathogenicity tests. The inoculation and incubation processes were the same as described
previously. For inoculum preparation, all the isolates were grown on a sterile cellulose nitrate
membrane filter (pore size: 0.2 µm, Sartorius, Göttingen, Germany) placed on PDA at 25°C in
darkness, in order to facilitate the introduction of both species into the drilled segments.
Inoculations were performed using small pieces (4 × 4 mm) of filter covered with actively
growing mycelium. Inoculations involving either D. eres and N. parvum, or D. eres and F.
juglandicola isolates (Table 2), were conducted as follows: (i) single inoculations of one of the
2 isolates, (ii) inoculations with both isolates at the same time, and (iii) sequential inoculations
with the second isolate inoculated 4 days after the first one in the same hole and vice-versa.
Inoculations were performed on 10 segments for each condition. Ten control segments were
included and inoculated with a piece of non-inoculated sterile cellulose nitrate membrane filter.
All inoculation points were wrapped with Parafilm and both ends of the twig were sealed with
melted paraffin. All segments corresponding to the same treatment with the same isolates as
well as control segments were placed in humidity chambers filled with filter paper and 90 mL
sterile distilled water and incubated as described previously. The lesion length was recorded
after 8 days for all segments inoculated with D. eres and/or N. parvum and after 10 days for all
segments inoculated with D. eres and/or F. juglandicola and for controls.
The Kruskal-Wallis test followed by Dunn’s test were used to compare the lesion length
(mm) to determine the differences in aggressiveness between fungal species used for single-

131
and co-inoculations on detached twigs. The control segments were removed from the analysis
as no necrosis had developed.

Meteorological data

The meteorological data were retrieved from Meteo France (Meteo France 2023). The
mean daily temperature and rainfall were collected from the 6 weather stations closest to the
studied orchards (Table 3). Three stations were located in the Auvergne-Rhône-Alpes region,
in the South-East production area, while the three others were located in the Nouvelle-Aquitaine
region, in the South-West production area. The data were statistically compared using ANOVA
followed by Tukey’s HSD test.

Table 3. Description and location of weather stations used in this study.

Name INSEE number a Region Coordinates Associated

orchard

CHATTE_SAPC 38095001 Auvergne-Rhône- 45.1401, 5.306 P2, P3, P4

Alpes

SERRE-NERPOL_SAPC 38275002 45.2845, 5.353 P1

ST-JEAN-EN-ROYANS 26307001 45.0091, P5, P6

5.2925

LES-EYZIES-DE-TAYAC 24172001 Nouvelle-Aquitaine 44.9351, P10

1.0195

MONPAZIER 24280001 44.684, 0.8916 P9

SALIGNAC-EYVIGUES 24516002 44.9366, P7, P8, P11, P12

1.3646
a
INSEE: Institut National de la Statistique et des Études Économiques.

Results

Field surveys and fungal isolation

Samples with typical dieback symptoms were collected during the four sampling
campaigns and included blighted and necrosed fruits (mummified in some cases), and
defoliation and necrosis on shoots and twigs as well as cankers with internal discoloration
(Figure 1). Fungal cultures were obtained from all the 476 symptomatic samples (188 walnut
husks and 288 twigs), as well as 95 out of 105 asymptomatic samples (33 walnut husks and 72
twigs), yielded to a collection of 1873 fungal isolates excluding isolates from the same species
collected from the same organ. A total of 95% of isolates collected from symptomatic samples

132
were represented by 6 endophytic/pathogenic fungal genera and the Didymellaceae family. The
Diaporthe genus was the most collected one, representing 26.2% of the isolates, followed by
the Fusarium (24.5%) and the Colletotrichum genera (16.0%). The isolation of members of the
family Botryosphaeriaceae, represented by the two Botryosphaeria (8.9%) and Neofusicoccum
(9%) genera, was less significant. Finally, the Didymellaceae family and the Alternaria genus
represented 5.5% and 4.5% of the fungal collection, respectively (Figure 2A). The same 7 taxa
were also found predominant in asymptomatic samples (309 isolates out of 325). The most
represented genus was Diaporthe (32%), followed by the Didymellaceae family (16.6%),
Colletotrichum (14.5%), Alternaria (11.7%) and Fusarium (9.8%). Finally, the two
Botryosphaeriaceae genera were represented by only 10.5% of the collected isolates (Figure
2B).

Figure 1. Symptoms of branch dieback and fruit blight and necrosis of English walnut in southern
France. A. Walnut tree showing decayed branches and necrotic foliage. B. Typical symptoms of twig
blight on young twig and dead bud. C. Wood discoloration of blighted twig. D, E. Typical fruit necrosis
symptoms. F. Mummified fruit.

133
Figure 2. Distribution of species collected from symptomatic (A) and asymptomatic (B) twigs and husks
over the four sampling campaigns. Values indicate the total number of isolates assigned to each taxa.

Each genus was mainly represented by up to two species in both symptomatic and
asymptomatic organs, including A. alternata/tenuissima, B. dothidea, C. fioriniae and C.
godetiae, D. eres and D. foeniculina, F. juglandicola and F. solani, and N. parvum. C. godetiae
was the major species of the Colletotrichum genus (242 out of the 295 collected isolates), as
well as D. eres belonging to the Diaporthe genus (351 out of the 510 collected isolates), and F.
juglandicola belonging to the Fusarium genus (249 out of the 412 collected isolates).
Interestingly, B. dothidea and N. parvum were the only species belonging to the
Botryosphaeriaceae family. As the ITS region was insufficient to assign the major part of the
isolates belonging to the Didymellaceae family at the genus level, only the Boeremia and
Epicoccum genera were identified, representing 38.1% and 18% of the isolates, respectively.
Following these results, we chose to determine the aggressiveness of the 6 predominant
species (B. dothidea, N. parvum, D. eres, F. juglandicola, C. godetiae and C. fioriniae), which
are known for their pathogenicity either on wood and/or fruits, except for F. juglandicola for
which no information was available due to its recent characterization (Crous et al. 2021).

Pathogenicity tests

Single inoculation on detached twigs

After inoculation on 1-year-old detached twigs of the walnut cultivar Franquette, 20

isolates out of 29 (Table 2) were able to induce significantly longer necrotic lesions compared
to control (Figure 3). The SHP8T11I2_2021 and SHP3T11I9_2021 isolates of C. godetiae, and
the SHP10T7I3_2021 isolate of F. juglandicola were only reisolated from one single inoculated
segment out of 8 and 9 segments, respectively, thus invalidating Koch’s postulate. These

134
isolates were therefore removed from the analysis and lesion development rates were not
calculated. In addition, lesions caused by C. godetiae, one isolate of C. fioriniae and four
isolates of F. juglandicola, although reisolated, were not significantly different from controls.

Figure 3. Lesion rate (mm/day) of the isolates of Colletotrichum godetiae, C. fioriniae, Fusarium
juglandicola, Diaporthe eres, Botryosphaeria dothidea and Neofusicoccum parvum inoculated with
mycelium plugs on 1-year-old detached shoots of walnut variety Franquette under laboratory conditions.
Boxes with the same letter do not differ significantly according to Tukey’s HSD test (ɑ = 0.05). Upper
case letters correspond to comparisons at the species level regardless of isolates. Lower case letters
correspond to comparisons between isolates and the control within a species.

Among the considered pathogenic isolates (i.e. C. fioriniae SHP6T7I2_2021 and

SHP1T1I5_2022, F. juglandicola SHP8H13I2 and all isolates of D. eres, B. dothidea and N.
parvum), significant differences in aggressiveness in terms of necrotic lesion development were
observed within species, with mean lesion rate varying from 0.2 to 13.3 mm per day (see
Supplementary Table S1). Although significant differences could be found between isolates
of a species, the ranking by species or family was generally respected. Overall, the
Colletotrichum and Fusarium isolates induced the shortest lesions, similar to control conditions
(between 2 and 3.5 cm on average after 31 days of incubation, corresponding to a mean rate

135
between 0.2 and 1.3 mm/day), followed by D. eres isolates (mean lesion rate ranging from 6 to
13.3 mm/day) while the Botryosphaeriaceae isolates exhibited the significantly highest
aggressiveness (mean lesion rate ranging from 6 to 13.3 mm/day). All fungal isolates were
reisolated from the margins of the lesion, with a percentage of reisolation ranging from 44.4 to
100%. No positive reisolations were obtained from control segments (Table 4).

Table 4. Frequency of resiolation (%) of fungal isolates used in pathogenicity tests on 1-year-old
detached shoots of walnut variety Franquette under laboratory conditions.

Species Isolate Frequency of reisolation (%)

Botryosphaeriaceae

Botryosphaeria dothidea SHP1T12I2_2021 100

SHP10T7I1_2021 100

CAP8T6I3_2021 100

SHP5H1I2_2020 100

SHP3H5I2_2020 100

SHP1H10I2_2021 100

Neofusicoccum parvum SHP5T6I3_2021 100

CAP3T15I3_2021 100

CAP12T4I1_2021 100

SHP4H4I1_2020 100

SHP7H1I1_2020 100

SHP9H4I2_2021 100

136
Table 4. Continued.

Species Isolate Frequency of reisolation (%)

Diaporthaceae

Diaporthe eres SHP10T12I2_2021 100

SHP2T8I6_2021 55.5

SHP5T15I4_2021 100

SHP11H5I6_2020 44.4

SHP4H4I5_2020 100

Glomerellaceae

Colletotrichum fioriniae SHP6T7I2_2021 66.7

SHP10T10I1_2021 88.9

SHP1T1I5_2022 66.7

C. godetiae SHP11T14I2_2021 50

Nectriaceae

Fusarium juglandicola SHP4T5I7_2021 44.4

SHP6T6I8_2021 77.8

SHP12H2I6_2020 77.8

SHP2H2I5_2020 88.9

SHP8H13I2_2021 66.7

Control - 0

137
Factors impacting the prevalence of pathogenic species

The prevalence in husks and twigs as well as in symptomatic and asymptomatic samples
was determined for the 6 main endophytic/pathogenic species previously described, i.e. B.
dothidea, C. fioriniae, C. godetiae, D. eres, F. juglandicola and N. parvum. C. godetiae and C.
fioriniae, although associated with null or low aggressiveness on detached branches, were
nevertheless included as they are known pathogens on fruits. The prevalence of these species
significantly varied depending on the organ type and the campaign (Figure 4). C. godetiae and
B. dothidea were significantly more prevalent in symptomatic walnut husks (ranging from 40%
to 70% and 35% in both campaigns, respectively) than in twigs (around 30% and ranging from
17% to 33% in both campaigns; p = 1.95 × 10-10 and p = 0.02, respectively). Conversely, D.
eres and F. juglandicola were significantly more associated with symptomatic twigs (ranging
from 67% to 76% and from 53% to 68% in both campaigns, respectively) than with husks
(ranging from 44% to 53% and from 25% to 28% in both campaigns; p = 1.81 × 10-07 and
p = 4.22 × 10-13, respectively). N. parvum and C. fioriniae were equally associated with both
types of organ. Interestingly, when considering symptomatic and asymptomatic samples, the
prevalence of both F. juglandicola and N. parvum species differed, with significantly higher
values in symptomatic than asymptomatic organs whatever the organ type (Figure 5). The same
observation was made for C. godetiae but only in walnut husks while the prevalence did not
differ significantly between symptomatic and asymptomatic organs for the three other species
(Figure 5).

Figure 4. Heatmaps of the prevalence of the 6 main pathogenic species collected from symptomatic
walnut husks during September 2020 (A) and August 2021 (B) and from twigs during May 2021 (C)
and June 2022 (D) with the culture-dependent method.

138
Figure 5. Percentage of asymptomatic and symptomatic walnut husks (A) and twigs (B) contaminated
by the 6 main pathogenic species out of the total number of organs analyzed. Statistical comparisons
were performed per species and per organ type. “**” and “***” represent highly significant and very
highly significant differences based on chi-squares test (ɑ = 0.05).

The PERMANOVA, based on Bray-Curtis distance matrices of prevalence profiles of

the 6 species, showed a significant effect of, primarily, the organ type (Husk versus Twig; R2 =
14.7%, p = 1.0 × 10-4), followed by the sampling area (South-East versus South-West;
R² = 8.8%, p = 2.3 × 10-2). Conversely, the year of sampling did not impact significantly
prevalence profiles (p > 0.05).

Description of the fungal pathobiome by ITS2 metabarcoding

A total of 11,706,886 raw reads of ITS2 were obtained for 282 samples (12 orchards 𝗑
3 campaigns 𝗑 2 organs’ symptomatology 𝗑 3 replicates, and 11 orchards 𝗑 1 campaign 𝗑 2
organs’ symptomatology 𝗑 3 replicates). After read filtering, a large proportion of samples
associated with asymptomatic organs were removed from the dataset due to the absence of
fungal reads and a high number of plant reads (i.e. 48 asymptomatic samples preserved out of
141 samples). After this step, a total of 3,887,112 high-quality ITS2 fungal sequences were
obtained and clustered into 656 AVSs from 187 samples, including replicates.
Fungal communities of both symptomatic walnut husks and twigs were dominated by
Ascomycota (99.1% and 99.7%, respectively) followed by Basidiomycota. Although the
taxonomic resolution of ITS2 does not allow differentiating between Botryosphaeria and
Neoscytalidium (Belair et al. 2023), results of the culture-dependent analysis, with the unique
isolation of Botryosphaeria dothidea, strongly suggest that ASVs assigned to the

139
Botryosphaeria/Neoscytalidium genus very likely belong to Botryosphaeria and not
Neoscytalidium. The main endophytic/pathogenic genera (Botryosphaeria, Colletotrichum,
Diaporthe, Fusarium and Neofusicoccum), identified by culture-dependent approach, were also
found predominant by metabarcoding in symptomatic samples (Figure 6). These genera
represented between 20.9% and 99.3% of total reads in symptomatic walnut husks and twigs in
an orchard- and campaign-dependent manner (Figure 6). The Plectosphaerella genus also
belonged to the top 15 fungal genera in walnut husks even if associated with few orchards (four
orchards collected in 2020 and two collected in 2021, respectively), as well as Gibellulopsis
which was represented in the majority of orchards collected in both years by less than 1% to
75% relative abundance, and Vishniacozyma, represented by relatively low relative abundance
in all the orchards collected in 2020 (from less than 1% to 1.7% of relative abundance) and in
only four orchards collected in 2021 (P1, P2, P10 and P12). In symptomatic twigs, the Boeremia
and Angustimassarina genera were also abundant (from less than 1% to 57.3%, and less than
1% to 25.3%, respectively) in the majority of the orchards in both years. These genera, as well
as the major part of the less abundant genera (e.g. Cladosporium, Ophiognomonia and
Juglanconis) have never been collected with the culture-dependent method, or only to a very
small extent. Interestingly, when comparing relative abundances in symptomatic husks versus
twigs, Aureobasidium (log2 fold change |3|, p < 0.01), Botryosphaeria (log2 fold change |3|,
p < 0.001), Colletotrichum (log2 fold change |6|, p < 0.001), Gibellulopsis (log2 fold change |6|,
p < 0.001), and Vishniacozyma (log2 fold change |1|, p < 0.05) were significantly more abundant
in husks. Conversely, relative abundance was significantly higher in symptomatic walnut twigs
than in husks for Juglanconis (log2 fold change |10|, p < 0.001), Diaporthe (log2 fold change
|1|, p < 0.001), Boeremia (log2 fold change |7|, p < 0.001) and Angustimassarina (log2 fold
change |10|, p < 0.001). Noteworthy, the Colletotrichum genus also appeared to be significantly
more present in symptomatic walnut husks collected in August 2021 than in those collected in
September 2020 (log2 fold change |2|, p < 0.001). The analysis of the few asymptomatic
samples led also to the detection of Colletotrichum, Diaporthe and Ophiognomonia and
Vishniacozyma genera in husks and Angustimassarina, Boeremia, Botryosphaeria, Diaporthe,
Fusarium and Neofusicoccum in twigs (data not shown).

140
Figure 6. Relative abundance of the 15 predominant genera from symptomatic walnut husks (A) and
twigs (B) based on ITS2 metabarcoding. Alpha diversity indices of the combination of symptomatic
organ type (H: Husks, T: Twigs), sampling year and area calculated based on the rarefied dataset (C).
“ns”, “*”, “**” and “***” represent non-significant, significant, highly significant and very highly
significant differences based on independent [Link] (ɑ = 0.05).

141
 Alpha-diversity indices, that is, observed richness, Shannon and Simpson’s inverse
(InvSimpson), were significantly higher in symptomatic twigs compared to symptomatic husks,
regardless of sampling campaign or areas (Figure 6C). These indices were also significantly
different according to sampling campaigns and areas. In particular, walnut husks collected in
the South-West in September 2020 showed significantly higher richness, diversity and
equitability than those collected in the same region in August 2021 while twigs collected in
June 2022 showed significantly higher indices values than those collected in May 2021.
Overall, walnut husks or twigs were significantly more diverse and richer in the South East than
their counterparts collected in the South West, except for husks collected in September 2020
(Figure 6C).
The PERMANOVA, based on Bray-Curtis distances, showed that fungal communities
in symptomatic samples were first impacted by organ types (R² = 16.6%, p = 1.0 𝗑 10-4;
Figure 7A), followed by year of sampling (R2 = 11,6%, p = 1.0 𝗑 10-3) and sampling area
(R2 = 4.6%, p = 2.0 𝗑 10-4). Likewise, when analyzing symptomatic husks and twigs separately,
differences between sample composition were first explained by sampling campaigns (5.0%
and 6.1%, respectively; Figure 7B,C) then by sampling area (5.0%, p = 3.9 𝗑 10-3 and 2.0%,
p > 0.05, respectively).

Figure 7. Principal Coordinate Analysis (PCoA) of the dissimilarity of fungal community composition
between symptomatic walnut husks and twigs (A), and between the two sampling campaigns of walnut
husks (B) and twigs (C) based on Bray-Curtis distances. Statistical differences are based on a
PERMANOVA (ɑ = 0.05).

142
Effect of agronomic practices on fungal pathobiome composition and structure

A PERMANOVA was also used to determine the effect of agronomic practices such as
the cultivar/variety (Serr, Franquette), the agricultural system (organic, conventional) and the
use of irrigation (Table 1) on the composition and structure of fungal communities, using ITS2
metabarcoding data but also prevalence profile of the 6 main species, as determined by the
culture-dependent approach.
The cultivar/variety effect impacted the most the mycobiota composition and structure
in both symptomatic husks and twigs (R² = 13.1%, p = 1.0 𝗑 10-4; and R² = 7.2%,
p = 1.0 𝗑 10-4, respectively) based on the metabarcoding dataset (Table 5). For both organ types,
Colletotrichum and Botryosphaeria species were significantly more predominant in samples
collected from variety Franquette than from cultivar Serr (log2 fold change |6|, p < 0.001 and
log2 fold change |8|, p < 0.001 in husks, respectively; and log2 fold change |3|, p < 0.001 and
log2 fold change |2|, p < 0.05 in twigs, respectively). Among the cultivation practices studied,
cultivar/variety was the only one to have a significant effect on species’ prevalence profiles in
both organs (R2 = 22.2%, p = 1.0 𝗑 10-3 in symptomatic husks, and R2 = 26.4%, p = 5.0 𝗑 10-4
in symptomatic twigs). In particular, C. godetiae and B. dothidea were significantly more
prevalent in Franquette (p < 0.01 and p < 0.001 respectively) while, N. parvum showed a
significantly higher prevalence in symptomatic organs collected from cultivar Serr (p < 0.001).
In husks, the use of irrigation accounted for 10.3% dissimilarity between fungal communities
(p = 1.0 𝗑 10-4), associated with a significantly higher predominance of Diaporthe genus in
samples collected from irrigated orchards (log2 fold change |2.3|, p > 0.001), while the impact
of irrigation on mycobiota composition was reduced by 2-fold in twigs (4.8%, p= 3.0 𝗑 10-4;
Table 5). Agricultural systems (conventional versus organic) weakly impacted the mycobiota
composition either in husks or twigs (R² = 5.6%, p = 1.8 𝗑 10-3; and R2 = 6.5%, p = 1.0 𝗑 10-4;
Table 5).

143
Table 5. PERMANOVA and pairwise Adonis analyses (α = 0.05) on metabarcoding data of symptomatic walnut husks and twigs. The categories are detailed in Tables 16 and
17.

Factor Variables Organ type R2 (p) Comparisons between R2 (p) Differentially-abundant genera of interest
temperature or rainfall (log2 fold change; p)
categories

Variety/cultivar Franquette vs Walnut husks 13.1% ***

Serr

Twigs 7.2% ***

Agricultural system Conventional vs Walnut husks 5.6% **

Organic

Twigs 6.5% ***

Irrigation Irrigation_Yes vs Walnut husks 10.3% ***

Irrigation_No

Twigs 4.8% ***

Median monthly April-May 2020 vs Walnut husks 5.0% ** A vs B Colletotrichum (2; **); Diaporthe (-2; **);
temperature April-May 2021 Fusarium (-2; **)

June 2020 vs Walnut husks 4.6% ** A vs B Diaporthe (2; **); Fusarium (2; **)
June 2021

July-August 2020 Walnut husks 4.6% ** A vs B Colletotrichum (1.5; *); Diaporthe (-2; **);
versus July-August 2021 Fusarium (-2; **)

April-May 2021 vs Twigs 6.1% *** A vs B Colletotrichum (1.3; **); Diaporthe (-1; ***)
April-May 2022

Monthly cumulative April 2020 vs April 2021 Walnut husks 14.5% *** A vs B 8.0% * -
rainfall A vs C 7.7% -
A vs D 16.0% * -
B vs C 5.6% -
B vs D 8.0% * -
C vs D 21.5% -
‘***’: p-value < 0.001; ‘**’: p-value < 0.01; ‘*’: p-value < 0.05; ‘’: p-value > 0.05

144
Table 5. Continued.

Factor Variables Organ type R2 (p) Comparisons between R2 (p) Differentially-abundant genera of interest
temperature or rainfall (log2 fold change; p)
categories

Monthly cumulative May (2020/2021) Walnut husks 10.6% *** A vs B 7.3% -

rainfall A vs C 12.3% * Diaporthe (3; **)
A vs D 9.2% * -
B vs C 6.1% -
B vs D 3.8% -
C vs D 4.1% -

June-July-August 2020 Walnut husks 10.6% *** A vs B 6.7% * -

vs A vs C 7.0% -
June-July-August 2021 A vs D 10.0% ** Botryosphaeria (-4; ***)
B vs C 5.0% -
B vs D 5.8% -
C vs D 6.6% -

April 2021 vs April 2022 Twigs 14.3% *** A vs B 10.0% * Colletotrichum (3; ***)
A vs C 8.0% -
A vs D 12.9% ** Colletotrichum (-3.2; ***); Diaporthe (-1.1; *)
B vs C 10.0% * Colletotrichum (2; ***)
B vs D 6.8% -
C vs D 11.9% ** Colletotrichum (-2.5; ***)

May 2021 vs May 2022 Twigs 15.7% *** A vs B 6.5% -

A vs C 15.0% ** Botryosphaeria (6; ***); Colletotrichum (-3; ***)
A vs D 9.4% * -
B vs C 12.2% ** Botryosphaeria (5.4; ***); Colletotrichum (-2; **);
Diaporthe (1.2; **)
B vs D 8.8% * Diaporthe (1.2; **)
C vs D 12.9% ** Botryosphaeria (-5; ***); Colletotrichum (3; ***)
‘***’: p-value < 0.001; ‘**’: p-value < 0.01; ‘*’: p-value < 0.05; ‘’: p-value > 0.05

145
Effect of climatic factors on fungal pathobiome composition and structure

For meteorological data, daily temperatures and rainfall were retrieved from 6 weather
stations, evenly located in the South-East and in the South-West (Table 3). The data were
collected from March to September in 2020, 2021 and 2022, that is from early springs to late
summers. Since mean temperature or rainfall did not differ significantly between the three
weather stations within a production area, regardless of the month and year, data from the three
weather stations were combined. Overall, whatever the production area, April, May, July and/or
August were associated with significantly lower mean temperatures in 2021 than in 2020 or
2022, while June was significantly hotter in 2021 than in 2020. In addition, mean accumulated
rainfall was significantly higher in May and in July 2021 than in 2020 or 2022, regardless of
the production area (Figures S1 and S2 and Table 6). At the geographic level, mean
temperature and rainfall were generally higher in the South-West than in the South-East, with
significant differences in terms of mean temperature in April 2021, May 2020 and May 2022,
and mean rainfall in April 2020 (Table 6).

Table 6. Mean temperature (°C) and mean cumulative rainfall (mm) for each month from April to

August in 2020, 2021 and 2022 in both South-West (SW) and South-East (SE) production areas.

Month Year Area Mean temperature (°C) Mean cumulative rainfall (mm)

April 2020 SW 14.4a 87.9a

SE 13.2ab 49.6bc

2021 SW 11.2c 31.4c

SE 9.2d 81.3ab

2022 SW 11.7bc 71.9ab

SE 10.4cd 49.2bc
Statistical comparisons were performed to compare separately mean temperature and mean accumulated rainfall

of the year for each month. Lowercase letters indicate a significant difference at 0.05 threshold according to

Tukey’s HSD test.

146
Table 6. Continued.

Month Year Area Mean temperature (°C) Mean cumulative rainfall (mm)

May 2020 SW 17.6a 42.3bc

SE 15.6b 82.5b

2021 SW 13.5c 135.6a

SE 12.9c 149.1a

2022 SW 18.0a 38.2c

SE 17.3a 35.3c

June 2020 SW 17.6c 110.5a

SE 18.0c 104.7a

2021 SW 19.5b 136.6a

SE 19.6b 115.6ab

2022 SW 20.4ab 131.0ab

SE 21.5a 86.1b

July 2020 SW 21.8b 9.8b

SE 21.8b 35.6b

2021 SW 19.7c 43.5b

SE 19.6c 169.9a

2022 SW 23.1a 9.2b

SE 23.4a 2.0b

August 2020 SW 21.7b 68.3ab

SE 21.7b 77.3a

2021 SW 19.3c 34.8b

SE 19.0c 63.2ab

2022 SW 23.5a 53.8ab

SE 22.8ab 94.1a
Statistical comparisons were performed to compare separately mean temperature and mean accumulated rainfall

of the year for each month. Lowercase letters indicate a significant difference at 0.05 threshold according to

Tukey’s HSD test.

147
 To go further and assess a potential effect of climate on fungal communities, categories
of climate conditions were created: 2 classes based on the median for monthly temperatures and
4 classes based on quartiles (Q1, median, Q3 and maximum) for monthly cumulative rainfall,
regardless of sampling areas and years (Tables 7 and 8). The mean temperature of April-May,
June and July-August similarly impacted the fungal communities associated with husks and
twigs (Table 5). Among genera of interest, Colletotrichum was significantly predominant in
samples associated with lower mean temperature whatever the organ type (Table 5).
Conversely, Fusarium was significantly more predominant in husks collected in warmer
conditions. Botryosphaeria and Diaporthe genera were also significantly more abundant in
husks and twigs collected in such conditions (Table 5). The mean cumulative rainfall also
impacted similarly the fungal communities of both organs (Table 5). Interestingly,
Colletotrichum was significantly more abundant in samples associated with relatively high
rainfall, while Botryosphaeria and Diaporthe were more predominant in samples associated
with lower rainfall (Table 5).

Table 7. Categorization of mean temperatures for analysis of symptomatic walnut husks and twigs

according to median. Category A represents orchards associated with mean monthly temperature less

than or equal to the median; category B represents orchards associated with mean monthly temperature

greater than the median.

Median monthly Temperature Symptomatic

Months included Number of associated orchards (area/year)
temperature (°C) category organ type

from April to May 2020 A 5 (SW/2021) + 6 (SE/2021)

13.398 Walnut husks
and 2021 B 6 (SW/2020) + 6 (SE/2020)

A 6 (SW/2020) + 6 (SE/2020) + 1 (SE/2021)

June 2020 and 2021 19.00 Walnut husks
B 5 (SW/2021) + 5 (SE/2021)

from July to August 2020 A 5 (SW/2021) + 6 (SE/2021)

20.80 Walnut husks
and 2021 B 6 (SW/2020) + 6 (SE/2020)

from April to May 2021 A 6 (SW/2021) + 6 (SE/2021)

12.8 Twigs
and 2022 B 6 (SW/2022) + 6 (SE/2022)
SE: South-East production area; SW: South-West production area

148
 Table 8. Categorization of monthly cumulative rainfall for analysis of symptomatic walnut husks and

twigs according to 1st quartile (Q1), median, 3rd quartile (Q3) and maximum value (Max.).

Monthly
Rainfall Symptomatic
Months included cumulative Number of associated orchards (area/year)
category organ type
rainfall (mm)

Q1: 48.1 A 5 (SW/2021) + 1 (SE/2020)

April 2020 and Median: 62.7 B 4 (SW/2020) + 5 (SE/2020)
Walnut husks
2021 Q3: 78.8 C 4 (SE/2021)
Max.: 102.9 D 2 (SW/2020) + 2 (SE/2021)

Q1: 66.3 A 6 (SW/2020)

Median: 84.6 B 6 (SE/2020)
May 2020 and 2021 Walnut husks
Q3: 147.0 C 2 (SW/2021) + 3 (SE/2021)
Max.: 162.3 D 3 (SW/2021) + 3 (SE/2021)

Q1: 214.4 A 2 (SW/2020) + 4 (SW/2021) + 1 (SE/2020)

from June to August Median: 232.5 B 4 (SW/2020) + 3 (SE/2020)
Walnut husks
2020 and 2021 Q3: 273.9 C 1 (SW/2021) + 2 (SE/2020)
Max.: 391.0 D 6 (SE/2021)

Q1: 33.0 A 5 (SW/2021) + 1 (SE/2022)

April 2021 and Median: 71.2 B 1 (SW/2021) + 4 (SE/2022) + 1 (SW/2022)
Twigs
2022 Q3: 76.3 C 4 (SW/2022) + 2 (SE/2022)
Max.: 95.30 D 1 (SW/2022) + 5 (SE/2021)

Q1: 35.45 A 4 (SW/2022) + 2 (SE/2022)

Median: 89.45 B 2 (SW/2022) + 4 (SE/2022)
May 2021 and 2022 Twigs
Q3: 152.68 C 2 (SW/2021) + 4 (SE/2021)
Max.: 162.30 D 4 (SW/2021) + 2 (SE/2021)
SE: South-East production area; SW: South-West production area

Analysis of the co-occurrence and association patterns within the phytomicrobiome

Culture-dependent based analyses

First, pairwise Pearson’s correlations were calculated based on the prevalence of the 6
main species isolated from symptomatic husks and twigs. In both organs, N. parvum and D. eres
were significantly negatively correlated (PCC = -0.71 and PCC = -0.91, respectively;
Figure 8A,B) while C. godetiae and F. juglandicola were significantly positively correlated
(PCC = 0.73 and PCC = 0.63, respectively; Figure 8A,B) although we must bear in mind that
C. godetiae was not frequently isolated from twigs. Finally, a significant negative correlation
was evidenced between N. parvum and C. godetiae in symptomatic walnut husks (PCC = -0.68;
Figure 8A).

149
Figure 8. Correlograms representing Pearson’s correlation coefficient (PCC) between the 6 main
pathogenic species based on their prevalence on symptomatic walnut husks (A) and symptomatic twigs
(B). Only significant correlations (p < 0.05) are plotted.

Second, chi-square tests were computed to determine whether a species was more
frequently encountered alone or in association at the organ level. Interestingly, all the species
of interest were more frequently found in association with at least 1 species than alone (from 2
times to 16 times more in symptomatic organs and from 1 time to 14.5 times in asymptomatic
ones). In symptomatic husks, among all species, N. parvum was the most frequently species
isolated alone (33.3% of husks contaminated with N. parvum were uniquely contaminated with
this species), followed by C. godetiae (12.5%). In symptomatic twigs it was also the case for
N. parvum (30.3%), followed by D. eres (17.4%). Interestingly, B. dothidea and F. juglandicola
were detected alone in only 1.4% and 6.4% of symptomatic twigs associated with these species,
respectively. Furthermore, the most frequent dual association was that of C. godetiae and D.
eres in symptomatic husks (12.9% of husks were contaminated with C. godetiae and D. eres
exclusively), and that of F. juglandicola and D. eres in symptomatic twigs (13.8%). Moreover,
the latter association was significantly more detected in symptomatic twigs than in husks (51%
vs 21%, p = 2.5 𝗑 10-6), and, in symptomatic twigs, the two species were significantly more
associated with each other regardless of the presence of other species (51%) than without each
other (31% with D. eres and without F. juglandicola, p = 2.1 𝗑 10-4; and 18% with
F. juglandicola and without D. eres, p = 2.1 𝗑 10-13). Interestingly, the tripartite association of
D. eres, C. godetiae and F. juglandicola was also frequently encountered in symptomatic twigs,
this association represented in 8.2% of symptomatic twigs. The significant positive correlation
between C. godetiae and F. juglandicola in both twigs and husks detected based on prevalence

150
data (Figure 8A and B) was confirmed at the organ level for twigs only, meaning that the two
species were more frequently found associated with each other regardless of the presence of the
other species (34.7%) than C. godetiae without F. juglandicola (10.4%) on symptomatic twigs
(p = 3.1 𝗑 10-7). Likewise, the negative correlations between N. parvum and D. eres in twigs
and husks was confirmed at the organ level for husks only since D. eres (53.7%) and N. parvum
(34.6%) were significantly more found without than associated with each other (11.7%) on
symptomatic husks (p = 6.8 𝗑 10-12 and p = 2.4 𝗑 10-4, respectively). Finally, C. godetiae was
significantly more frequently found without N. parvum (58%) than in association with N.
parvum (16.7%) on symptomatic husks whatever the other species (p = 9.9 𝗑 10-13), confirming
the negative correlation between C. godetiae and N. parvum in symptomatic husks (Figure 8A).
Interestingly, N. parvum was significantly more frequently found alone in symptomatic husks
(33.3%) and twigs (30.3%) than in association with B. dothidea alone (3.2%, p = 9.7 𝗑 10-7 in
husks; and 2.1%, p = 7.1 𝗑 10-8 in twigs) or with B. dothidea and other species (8%, p = 1.4 𝗑
10-3 in twigs).

Culture-independent based analyses

In total, 6 positive and 6 negative significant correlations were evidenced between 9

genera out of the 15 top genera associated with symptomatic walnut husks (Figure 9A). No
positive or negative significant correlations were found between the main pathogenic genera of
interest (i.e. Colletotrichum, Diaporthe and Neofusicoccum). Nevertheless, a positive
significant correlation was highlighted between Neofusicoccum and Aureobasidium
(corr = 0.33), as well as a negative significant correlation between Neofusicoccum and
Vishniacozyma (corr = -0.31; Figure 9A).
In twigs, 13 out of 24 correlations were significantly positive (Figure 9B). Interestingly,
a positive significant correlation was detected between Colletotrichum and Fusarium
(corr = 0.43). Moreover, Colletotrichum was also significantly positively correlated with
Boeremia (corr = 0.64), while Diaporthe was significantly positively correlated with
Juglanconis (corr = 0.33; Figure 9B).

151
Figure 9. SparCC correlation networks observed between the main genera associated with symptomatic
walnut husks (A) and symptomatic twigs (B) based on metabarcoding sequencing. The relative
abundance of each genus was calculated by summing the abundance of each corresponding ASV. Nodes
correspond to genera, and connecting edges indicate correlation between them. Only nodes associated
with a correlation strength value greater than 0.3 (positive correlation, green edges) and less than -0.3
(negative correlation, red edges) were plotted. Only significant correlations (p < 0.05) were plotted.

Evaluation of interactions in detached twigs

Since we previously evidenced negative correlations between the prevalence of

N. parvum and D. eres in symptomatic twigs while F. juglandicola and D. eres, the predominant
species in twigs, were the most frequent pairwise associations, we further examined the nature
of their interactions, based on single, mixed and sequential inoculations on twigs, by
hypothesizing that N. parvum and D. eres were antagonistic, while F. juglandicola and D. eres
were mutualistic in twigs.
Considering the interaction between N. parvum and D. eres, single inoculations with
N. parvum, mixed inoculations with N. parvum and D. eres, and sequential inoculation when
N. parvum was inoculated first (i.e. 4 days before D. eres) caused the longest necrosis ranging
from 15.8 mm to 17.7 mm 8 days after inoculation. Conversely, single inoculations with
D. eres, and sequential inoculations with first D. eres and N. parvum 4 days later, induced the
shortest lesion length (7.1 mm and 6.5 mm, respectively; Figure 10A).
Single inoculation with F. juglandicola and the inoculation of D. eres 4 days after
F. juglandicola yielded the shortest lesion length. Interestingly, inoculation of F. juglandicola
4 days after D. eres caused longer necrosis length than single inoculation with D. eres and
mixed inoculation with both species (Figure 10B).

152
Figure 10. Length of necrosis (mm) 8 days (A) and 10 days (B) after inoculations with cellulose nitrate
membrane filters covered with mycelium on 1-year-old detached shoots of walnut variety Franquette
under laboratory conditions. Columns with common letters do not differ significantly according to
Dunn’s test (ɑ = 0.05).

Discussion

A total of 12 walnut orchards from the two main production areas in France, selected
on the basis of frequent observation of dieback symptoms on English walnut trees, were
surveyed during 4 sampling campaigns. The observed symptoms included defoliation of twigs,
dead buds and internal wood discoloration, as well as fruit necrosis, blight and mummification.
This research represents the first comprehensive study providing the etiology and analysis of
fungal communities and their interactions in walnut trees displaying these symptoms in France,
using both cultural and metabarcoding approaches.

153
 The major part of the isolates recovered from walnut husks and twigs, either
symptomatic or asymptomatic, were identified based on their morphological characteristics and
the sequencing of ITS region. Diaporthe and Fusarium isolates, mainly represented by D. eres
and F. juglandicola respectively, were consistently the most frequently isolated fungi from
symptomatic organs, followed by Colletotrichum isolates (mainly represented by C. fioriniae
and C. godetiae) and isolates from the Botryosphaeriaceae family, exclusively represented by
B. dothidea and N. parvum. These results were confirmed by metabarcoding, revealing the
presence of the same genera in both symptomatic walnut husks and twigs. This diversity of
fungal genera associated with the disease was also evidenced in Californian walnut orchards
(Michailides et al. 2013). However, only Botryosphaeriaceae and/or Diaporthe species were
reported in symptomatic walnut organs displaying the same symptoms in others studies
conducted in Australia (Antony et al. 2023), California (Agustí-Brisach et al. 2019; Chen et al.
2014), Chile (Jiménez Luna et al. 2022a), China (Li et al. 2016), Italy (Gusella et al. 2021) and
Hungary (Zabiák et al. 2023). Interestingly, a higher level of diversity was found in Spain where
Cytospora species were also isolated in addition to these two fungal groups (López-Moral et al.
2020b), as well as Diatrypaceae, Togniniaceae and Cadophora species in the Czech Republic
(Eichmeier et al. 2020). Moreover, most of these studies indicate that the Botryosphaeriaceae
isolates were more frequently collected than the Diaporthe ones (Antony et al. 2023; Chen et
al. 2014; Eichmeier et al. 2020; Jiménez Luna et al. 2022a; López-Moral et al. 2020b), unlike
what we found during the four collection campaigns in France. Additionally, in this study, only
two genera of Botryosphaeriaceae were identified with both culture-dependent and -
independent approaches. In contrast, a much higher level of diversity was found in California
where the disease was first observed in the early 2000s and where 6 genera are consistently
reported (Chen et al. 2014), and to a lesser extent in Spain (4 genera; López-Moral et al. 2020b).
The two Botryosphaeriaceae species as well as D. eres have been previously reported to cause
walnut branch dieback and fruit necrosis and blight worldwide (Chen et al. 2014; Eichmeier et
al. 2020; Gusella et al. 2021; López-Moral et al. 2020b; Novak et al. 2018; Yildiz et al. 2022;
Zabiák et al. 2023). The three other species reported in French walnut orchards were not
commonly associated with walnut dieback in other countries. The Colletotrichum species are
mainly associated with walnut anthracnose disease on fruits (Da Lio et al. 2018), but one recent
study has reported twig blight symptoms caused by C. godetiae in Hungary (Varjas et al. 2020).
F. juglandicola being a recently-described species isolated from walnut buds (Crous et al.
2021), no study has currently indicated its involvement in branch dieback and fruit necrosis and
blight of walnut trees.

154
 Among the six main species associated with the symptoms, only three were able to cause
bigger necrotic lesions than control when inoculated with mycelium plugs on detached shoots
under laboratory conditions. The Botryosphaeriaceae species were the most aggressive ones,
followed by D. eres, while necrosis caused by C. fioriniae, F. juglandicola and C. godetiae
were not significantly different from control except for three isolates. No significant difference
in aggressiveness was evidenced between B. dothidea and N. parvum, as obtained by López-
Moral et al. (2020b) by inoculating detached shoots. Nevertheless, numerous studies have
already shown that N. parvum is one of the most aggressive Botryosphaeriaceae species and B.
dothidea one of the least aggressive when inoculated in planta (Chen et al. 2014; Gusella et al.
2021; López-Moral et al. 2020b). In agreement with our results, Diaporthe are mainly
associated with less disease severity than Botryosphaeriaceae (Eichmeier et al. 2020; Jiménez
Luna et al. 2022a; López-Moral et al. 2020b). The study conducted by Varjas et al. (2020)
reported necrotic lesion length caused by C. godetiae between 12 and 17 mm after 14 days of
experimentation, i.e. between 0.8 and 1.2 mm per day, which is broadly of the same order of
magnitude as what we noticed. The pathogenicity tests suggest that the Botryosphaeriaceae and
Diaporthe species may participate the most to symptom development on twigs, although
pathogenicity tests performed in natura, i.e. under field conditions, are required to confirm this
assessment. All these species were collected from both symptomatic and asymptomatic organs,
highlighting a potential endophytic lifestyle and latent infection, as consistently reported by
many studies. The significantly higher prevalence on symptomatic than on asymptomatic
walnut husks of C. godetiae, F. juglandicola and N. parvum indicate that these species could
play a primary role in symptom development on husks. For example, Colletotrichum,
responsible for walnut anthracnose, could create lesions that would enable other species to
penetrate inside the fruit. In twigs, F. juglandicola and N. parvum were significantly more
prevalent in symptomatic than asymptomatic samples, although the lowest disease severity of
F. juglandicola likely suggests its secondary role in disease development. Concerning D. eres,
its prevalence of over 60% in both symptomatic and asymptomatic twigs in addition to its
moderate to high aggressiveness suggest a participation of this species to symptom development
in twigs as well as its potential endophyte lifestyle. The absence of significant difference of
prevalence in asymptomatic and symptomatic organs contaminated by B. dothidea associated
with a known moderate aggressiveness (although not evidenced under our experimental
conditions) rather suggest a moderate involvement in disease development.
Our study revealed that the main factor influencing the prevalence profile of the 6 main
species in symptomatic organs was the organ type. B. dothidea and C. godetiae were

155
significantly more associated with husks, while D. eres and F. juglandicola were more
frequently associated with twigs, in agreement with our metabarcoding-based results. The year
of sampling also contributed to the variation of mycobiota composition, based on both
prevalence and relative abundance. Although the experimental design of our study was not large
enough to reach clear-cut conclusions, the effect of some factors on the structure of fungal
communities was nevertheless assessed on the basis of information about the agricultural
system applied to each orchard. Thus the choice of specific varieties/cultivars (Franquette and
Serr, represented by 10 and 2 orchards respectively in this study) that could be differentially
sensitive to pathogens, may be an important factor explaining the differences in both prevalence
and relative abundance (although our experimental was not designed to study this effect in
particular). Indeed, it has been shown that the walnut cultivar Serr was part of the most sensitive
cultivars to Botryosphaeriaceae infections among the cultivars tested (i.e. Chandler, Fernette,
Hartley, Howard, Scharsch-Franquette, Serr Sundland and Tulare; López-Moral et al. 2022). In
our study, only N. parvum was significantly more prevalent on cultivar Serr than on variety
Franquette. It could be interesting to perform pathogenicity tests in planta with the variety
Franquette and the cultivar Serr to assess their sensitivity to Botryosphaeriaceae, but also
Diaporthe, Colletotrichum and Fusarium species under the meteorological conditions of
southern France and on both husks and twigs. Among the other factors evaluated, the use of
irrigation was shown to have a greater impact on mycobiota composition in husks than in twigs.
In particular, Diaporthe was significantly more associated with samples collected from irrigated
orchards.
The sampling area also showed an impact on fungal community structure, as well as
meteorological conditions, such as temperatures and rainfall. Thus, the terroir could also play a
role in the composition of fungal communities. Overall, the differences in meteorological
conditions between the three years studied highlighted a significantly higher relative abundance
of Diaporthe and Botryosphaeria in samples collected during warmer and dryer years, contrary
to Colletotrichum, in both organ types. It has been shown that infections caused by
Colletotrichum species generally occur in rainy, humid and warm weather (Estrada et al. 2000;
Hall et al. 2016; Kamle & Kumar 2016; Salotti et al. 2023). Interestingly, in other studies, the
Botryosphaeriaceae and Diaporthe species infections have also been associated with warm
temperatures and abundant rainfall (González-Domínguez et al. 2021; Moral et al. 2019).
However, the optimal growth temperature is reported to be generally lower for Diaporthe and
Colletotrichum than for Botryosphaeriaceae species, (Arciuolo et al. 2021; Chen et al. 2014;
López-Moral et al. 2020b; Salotti et al. 2022). Meteorological conditions are also known to

156
play a role in spore dissemination of Botryosphaeriaceae, Diaporthe and Colletotrichum
species, mainly via rail-disseminated spores (Moral et al. 2019; Penet et al. 2014), and to affect
plants’ physiological state, notably during hot periods, which could also facilitate the
development of pathogenic species and thus diseases (Velásquez et al. 2018; Zhao et al. 2020).
This study also highlighted potential interactions between the main fungal pathogenic
species. First, we found that the prevalence of N. parvum was negatively correlated to that of
D. eres in both symptomatic husks and twigs, suggesting that the presence of one of the species
may be unfavorable to the presence of the second one. This was also confirmed by the analysis
of species association at the organ level: D. eres and N. parvum were significantly more
frequently detected alone than in association with each other. However, we failed to clearly
demonstrate any competitive interaction on detached twigs. First, mixed inoculations of both
species or sequential inoculation of D. eres 4 days after N. parvum resulted in the same necrotic
lesion length than single inoculation with N. parvum, as if the presence of D. eres had no impact
whatsoever on N. parvum competitiveness. Second, sequential inoculations of N. parvum 4 days
after D. eres resulted in significantly lower necrosis than N. parvum alone (but similar to D.
eres alone) although the timing of our measurements does not allow to properly compare both
conditions given that N. parvum was incubated for 6 days in the former and 10 days in the latter.
It would nevertheless be interesting to estimate N. parvum and D. eres growth (by quantitating
DNA of each species using species-specific qPCR for instance) to determine whether D. eres
had a chance to grow in the presence of N. parvum or when N. parvum was inoculated 4 days
after D. eres. Interactions between one species of Neofusicoccum (N. mediterraneum) and one
species of Diaporthe (D. rhusicola, syn. D. foeniculina) was previously investigated by Agustí-
Brisach et al. (2019). The inoculation of N. mediterraneum 4 days after D. rhusicola resulted
in lower lesion length than N. mediterraneum alone or mixed inoculations, in agreement with
our observations. They demonstrated an inhibition of the germination of D. rhusicola spores by
the spores of N. mediterraneum and suggested that this phenomenon could partially be
responsible for this lower lesion length. In addition, they suggest that the development of D.
rhusicola, resulting in the death of plant tissues, could negatively affect the pathogenicity of N.
mediterraneum, lowering its aggressiveness to switch to a potentially preferential saprophytic
lifestyle. However, it would have been interesting to measure the necrosis length again 4 days
later in their study (as well as in ours), to have similar incubation time with the Neofusicoccum
strain. An additional negative correlation was highlighted between N. parvum and C. godetiae
on symptomatic walnut husks, in which the latter was significantly more frequently isolated
without N. parvum than in association. This negative correlation is indeed most likely explained

157
by climatic conditions favorable to Colletotrichum in 2021 and to Botryosphaeriaceae in 2020.
Finally, based on the fact that D. eres and F. juglandicola were significantly more frequently
associated with each other than without each other on symptomatic twigs, in vitro co-
inoculations of the two species were also performed. Surprisingly, the inoculation of F.
juglandicola 4 days after D. eres resulted in significantly longer lesions than single inoculation
of either of the two species, highlighting a potential facilitating interaction. Fusarium species
are commonly being described as saprophytic species, D. eres could then facilitate the
development of F. juglandicola on twigs. It would be interesting to investigate the interaction
at the microscopic level in order to understand why the association of these species seems to
facilitate symptom development in the wood. Given that the prevalence data also showed a
positive correlation between C. godetiae and F. juglandicola on both symptomatic walnut husks
and twigs, also highlighted on twigs by SparCC networks, we can also hypothesize that the
presence of one species facilitates the development of the other or that some specific conditions
may favor their simultaneous development.
Additional correlations were highlighted between the main pathogenic species and other
members of the pathobiome. Among them, a positive correlation was detected by the SparCC
network between Neofusicoccum and Aureobasidium genera on symptomatic walnut husks.
This positive correlation could be explained by two main hypotheses. First, given that the genus
Aureobasidium, in particular the endophytic species Aureobasidium pullulans, has proven
useful as a biocontrol agent against many fungal pathogens such as Botrytis cinerea (Iqbal et
al. 2023), Colletotrichum acutatum (Iqbal et al. 2023) and Diplodia seriata (Pinto et al. 2018),
this positive correlation could be due to an increase in the growth of Aureobasidium in response
to infection by Neofusicoccum. A transcriptomic study conducted on liquid co-cultures of A.
pullulans and Fusarium oxysporum highlighted the up-regulation of many genes of A. pullulans
potentially involved in a biocontrol activity in response to F. oxysporum presence according to
the authors (Rueda-Mejia et al. 2021). Secondly, Aureobasidium could also play a role in
symptom development, as hypothesized by Nerva et al. (2022). Analysis of transcriptomes in
grapevine wood evidenced an up-regulation of genes involved in carbohydrate degradations
and in transporters together with a high abundance of N. parvum and A. pullulans, which could
suggest an involvement of these two species in symptom development (Nerva et al. 2022). A
negative correlation was also highlighted between Neofusicoccum and Vishniacozyma in
symptomatic walnut husks, potentially associated with the antagonistic effect of Vishniacozyma
already demonstrated against phytopathogenic fungi (Gorordo et al. 2022; Nian et al. 2023). In
symptomatic walnut twigs, positive correlations were detected between Colletotrichum and

158
Boeremia, as well as between Diaporthe and Juglanconis. These positive correlations involved
the main genera of our study, and secondary pathogens, identified with the culture-independent
method. Indeed, Boeremia species (family Didymellaceae), mainly B. exigua, was already
reported as responsible for branch blight (Cai et al. 2021) and leaf spot (Wang et al. 2022a; b).
In the same way, Juglanconis species, mainly J. juglandina, were also reported as walnut-
canker associated pathogens (Ma et al. 2019; Pourfaraj et al. 2019). Thus, the development and
infections caused by some pathogens of walnut trees could facilitate the development of others,
as illustrated previously. These results highlight how crucial it is to deepen our knowledge of
the interactions between members of the pathobiome, this disease resulting from a complex of
fungal pathogenic species.

Conclusion
To our knowledge, this study is the first to explore the fungal pathobiome associated
with branch dieback and fruit blight and necrosis of walnut trees using complementary cultural
and metabarcoding approaches. The 6 main species B. dothidea, C. fioriniae, C. godetiae, D.
eres, F. juglandicola and N. parvum were identified as associated with these symptoms,
although only Botryosphaeriaceae and Diaporthaceae species were able to induce symptoms on
detached twigs. Based on a comprehensive analysis of observation data under field conditions,
this study also provides first clues towards a better understanding of the meteorological
conditions enhancing fungal development as well as the interactions between members of the
fungal pathobiome.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.

Funding

M.B. PhD fellowship is financed by the French Brittany region (ARED Grant #1797
SHERWOOD project) and the French ministry of Higher Education, Research and Innovation
(2020 CDE EGAAL). This project was also supported by the French ministry of Agriculture
and Food under CASDAR funds (AAP RT 2020 CARIBOU project coordinated by the CTIFL
and AAP “Connaissances” 2022 MAGIC project coordinated by the SENuRA).

Acknowledgements

We would like to thank the growers who have agreed to include their orchards in this project.

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167
Figures supplémentaires

Supplementary Figure S1. Summary of the meteorological data (rainfall and temperature) from the meteorological
station of CHATTE_SAPC (A), SERRE-NERPOL_SAPC (B) and ST-JEAN-EN-ROYANS (C). The meteorological
data are represented from March to September in 2020, 2021 and 2022.
168
Supplementary Figure S2. Summary of the meteorological data (rainfall and temperature) from the meteorological
station of LES-EYZIES-DE-TAYAC (A), MONPAZIER (B) and SALIGNAC-EYVIGUES (C). The meteorological
data are represented from March to September in 2020, 2021 and 2022

169
Supplementary Table S1. Mean lesion length (mm) for each isolates of B. dothidea, C. fioriniae, C.

godetiae, D. eres, F. juglandicola and N. parvum inoculated on 1-year-old detached shoots of walnut

variety Franquette under laboratory conditions and the respective experimental timescales (days) for

each species.

Species Isolate Duration of experiment (days) Mean lesion length (cm)

Botryosphaeriaceae

Botryosphaeria dothidea SHP1T12I2_2021 10 12.5

SHP10T7I1_2021 10 13.2

CAP8T6I3_2021 10 7.0

SHP5H1I2_2020 10 13.2

SHP3H5I2_2020 10 10.1

SHP1H10I2_2021 10 6.0

Neofusicoccum parvum SHP5T6I3_2021 11 11.4

CAP3T15I3_2021 11 13.3

CAP12T4I1_2021 11 11.8

SHP4H4I1_2020 11 9.6

SHP7H1I1_2020 11 14.6

SHP9H4I2_2021 11 12.3

Diaporthaceae

Diaporthe eres SHP10T12I2_2021 12 7.3

SHP2T8I6_2021 12 8.8

SHP5T15I4_2021 12 9.4

SHP11H5I6_2020 12 3.4

SHP4H4I5_2020 12 6.7

170
Supplementary Table S1. Continued.

Species Isolate Duration of experiment (days) Mean lesion length (cm)

Glomerellaceae

Colletotrichum fioriniae SHP6T7I2_2021 31 3.8

SHP10T10I1_2021 31 3.6

SHP1T1I5_2022 31 3.1

C. godetiae SHP11T14I2_2021 31 2.1

Nectriaceae

Fusarium juglandicola SHP4T5I7_2021 31 2.2

SHP6T6I8_2021 31 0.8

SHP12H2I6_2020 31 2.9

SHP2H2I5_2020 31 0.7

SHP8H13I2_2021 31 4.1

171
172
CHAPITRE III - Etude de la diversité intraspécifique des
populations de B. dothidea et N. parvum

173
174
I. Introduction des travaux
Comme expliqué dans la partie introductive de ce manuscrit, le dépérissement du noyer,
à l’échelle mondiale, est principalement associé aux espèces de la famille des
Botryosphaeriaceae. Dans le chapitre II, nous avons montré que ces champignons, représentés
quasi-exclusivement par deux espèces (N. parvum et B. dothidea), contribuaient, en partie, aux
symptômes causés sur rameaux et sur brous dans les noyeraies en France. Malgré une
prévalence moyenne de ces deux espèces plus faible que celle de D. eres dans les rameaux
(51 % versus 71 %), nos résultats tendent à démontrer qu’elles sont plus agressives sur rameaux
détachés. Par ailleurs, N. parvum, est également associée au dépérissement d’autres hôtes
ligneux en France, en particulier la vigne depuis de nombreuses années et est également
prédominante dans les noyeraies d’autres pays à climat méditerranéen, à commencer par la
Californie et l’Espagne. Nous avons donc fait le choix d’étudier la génétique des populations
de cette espèce et de la comparer avec une espèce proche dont l’implication dans le
dépérissement semblait moindre (B. dothidea). Les objectifs de cette étude étaient donc (i)
d’étudier la diversité génétique et génotypique et le mode de reproduction majeur des
populations de B. dothidea et N. parvum isolées de noyers en France, (ii) de s’intéresser aux
facteurs influençant la structure de ces populations, et (iii) de comparer les populations de
noyers françaises avec d’autres populations provenant de divers hôtes (amandier, noyer, vigne)
et zones géographiques (Californie, Espagne, France) afin de mieux comprendre l’origine et le
potentiel de dissémination de N. parvum et B. dothidea,, acteurs importants de cette maladie en
France.

Pour ce faire, une collection de 181 isolats de B. dothidea et de 200 isolats de N. parvum
obtenue à l’aide de la mise en culture des échantillons environnementaux prélevés en 2020 et
2021 a été utilisée afin de réaliser un génotypage par le séquençage de régions microsatellites.
La recherche de régions microsatellites dans le génome de chacune des espèces, le design des
amorces, l’amplification des séquences, le séquençage et enfin l’obtention des génotypes ont
été réalisés à la Plateforme Génome Transcriptome de Bordeaux. La définition des populations
a été basée sur l’origine des isolats (Sud-Est et Sud-Ouest de la France).

Ces travaux font l’objet d’un article en préparation, présenté en partie II du présent
chapitre.

175
II. Article en préparation

Belair M., Picot A., Lepais O., Masson C., Hébrard M.-N., Moronvalle A., Comont G., Gabri
Martin V. M., Tréguer S. Laloum Y., Corio-Costet M.-F., Michailides T. J., Le Floch G.,
Pensec, F. Genetic diversity and population structure of Botryosphaeria dothidea and
Neofusicoccum parvum on English walnut (Juglans regia L.) in France. Manuscript in
preparation

176
Genetic diversity and population structure of Botryosphaeria dothidea and Neofusicoccum

parvum on English walnut (Juglans regia L.) in France

Marie Belair , Adeline Picot , Olivier Lepais , Cyrielle Masson , Marie-Neige Hébrard , Aude
1 1 2 3 4

Moronvalle , Gwénaëlle Comont , Victor M. Gabri Martin , Sylvie Tréguer , Yohana Laloum ,
5 6 7 1 5

Marie-France Corio-Costet , Themis J. Michailides , Gaétan Le Floch , Flora Pensec

6 7 1 1

1
Univ Brest, INRAE, Laboratoire Universitaire de Biodiversité et Écologie Microbienne, F-
29280 Plouzané, France
2
Univ. Bordeaux, INRAE, BIOGECO, 33610 Cestas, France
3
Station d’expérimentation Nucicole Rhône Alpes, 38160 Chatte, France
4
Station Expérimentale de Creysse, Perrical 46600 Creysse, France
5
Centre Technique Interprofessionnel des Fruits et Légumes, Centre opérationnel de Lanxade,
24130 Prigonrieux, France
6
INRAE, UMR Santé et Agroécologie du Vignoble, ISVV, Labex Cote, CS 20032, 33882
Villenave d’Ornon, France
7
University of California Davis, Department of Plant Pathology, Kearney Agricultural
Research and Extension Center, Parlier, CA, 93648, USA

corresponding author : [Link]@[Link]

177
Abstract

Botryosphaeriaceae species are known to cause many diseases on a wide host range worldwide.
Of these, Botryosphaeria dothidea and Neofusicoccum parvum are the main
Botryosphaeriaceae species associated with walnut dieback in France. Due to the recent
emergence of this disease in France, little is known about the diversity of pathogenic
populations, their structure, origin and dispersion in walnut orchards. Genetic diversity of a
total of 381 isolates of both species collected from asymptomatic and symptomatic walnut
husks and twigs during three sampling campaigns in the two main French walnut production
regions were analyzed using recently developed sequence-based microsatellite genotyping
(SSR-seq) method. Our results demonstrated a low genetic diversity and a high rate of clonality,
consistent with the clonal mode of reproduction commonly described for these species. The
genetic similarity observed among populations regardless of the organ type and the presence of
symptoms provides additional support for the hypothesis that these pathogens can move
between fruits and twigs and display both endophytic and pathogenic lifestyles. The genetic
differentiation of B. dothidea populations according to French regions indicates putative
distinct origins, possibly shared with populations from French grapevines, in particular in the
South-West of France. Comparison with populations of N. parvum from Californian and
Spanish almond and walnut orchards evidenced a globally distinct genetic pattern, suggesting
that there is no conclusive evidence for pathogen transmission from infected materials but rather
from French grapevines which N. parvum populations shared high genetic similarity with those
from French walnut orchards. Finally, this study provides important insight into the
epidemiology of two important pathogens involved in an emergent dieback disease in French
walnut orchards, including their distribution, potential to mate, putative origin and disease
pathways.

Keywords: Botryosphaeriaceae, Juglans regia, microsatellites, genetic diversity, emerging

disease

178
Introduction
Botryosphaeriaceae is a large family of fungi that are either saprophytes, endophytes or
pathogens and mainly associated with woody hosts (Slippers & Wingfield 2007). Presently,
based on their morphological and genetic characteristics, 23 genera and over 100 species belong
to the Botryosphaeriaceae family (Dissanayake 2016; Slippers et al. 2017). Within this family,
most genera (notably Botryosphaeria, Diplodia, Dothiorella, Guignardia, Lasiodiplodia,
Neofusicoccum, and Pseudofusicoccum) can develop within plants as latent pathogens,
infecting healthy tissues and remaining dormant before being able to switch to a pathogenic
lifestyle leading to symptom development. This behavior shift has been described to be mainly
caused by biotic and/or abiotic stress conditions such as environmental changes, wounds caused
by humans or insects as well as disease development caused by other microorganisms
(Manawasinghe et al. 2016; Marsberg et al. 2017; Slippers & Wingfield 2007). Species
belonging to the Botryosphaeriaceae family show a worldwide distribution as well as low host-
specificity (Batista et al. 2021; Slippers & Wingfield 2007), and are responsible for diseases in
both forest and agricultural environments, in particular in woody plants because of their
pathogenesis arsenal (reviewed in Belair et al. 2022). Some species are known to be highly
ubiquitous, such as B. dothidea which is associated with 500 different host species, D. sapinea
(128) and D. seriata (158), Dot. sarmentorum (114), L. pseudotheobromae (161) and L.
theobromae (788), Macrophomina phaseolina (551), N. australe (110), N. parvum (294) and
N. ribis (273) (Batista et al. 2022). Zlatković et al. (2018) further identified 10
Botryosphaeriaceae species associated with 47 species of ornamental and forest trees belonging
to Gymnosperms and Angiosperms in Western Balkans (Zlatković et al. 2018). In
agroecosystems, Botryosphaeriaceae affect numerous economically-important fruit and nut
trees, such as citrus (Bezerra et al. 2021), mango (Aiello et al. 2022), litchi (Aiello et al. 2022),
apple (Díaz et al. 2022), cocoa (Huda-Shakirah et al. 2022), vine (Úrbez-Torres 2011),
pistachio (Gusella et al. 2022), almond (Inderbitzin et al. 2010), olive (Hernández-Rodríguez
et al. 2022) and walnut trees (Chen et al. 2014; Laloum et al. 2022).
English walnut (Juglans regia L.) is the most widely cultivated species in the world for
nut production (Martínez-García et al. 2016). It was historically cultivated in Central Asia but
the crop is now broadly cultivated in all continents, mainly in Asia, America and Europe
(McGranahan & Leslie 2012). The top three largest producers in the world are China, followed
by the United-States and Iran. With a production of 37,740 tons associated with about 27,000
hectares in 2021, French walnut culture belongs to the top three European countries
(FAOSTAT 2021). French walnut orchards are historically affected by walnut blight,

179
anthracnose and brown apical necrosis diseases, caused by Xanthomonas campestris pv.
juglandis, Ophiognomonia leptostyla and a fungal complex of Alternaria spp. and Fusarium
spp. respectively (Belisario et al. 2002; Giraud et al. 2007; Giraud & Verhaeghe 2015).
Nevertheless, during the past 10 to 15 years, new fungal diseases targeting walnut trees have
been frequently reported in France, associated with significant yield losses, most probably
related to the twofold increase of dedicated areas since the 2000s and climate change, reflected
by the unusual succession of hot summers in France (European Environment Agency 2023;
FAOSTAT 2021; Singh et al. 2023; World Meteorological Organization 2022). In particular,
walnut dieback symptoms were extensively reported in France since 2015 (Bressolier 2021;
Giraud & Verhaeghe 2015; Laloum et al. 2022) including twig necrosis, defoliation and cankers
as well as fruit necrosis and blight up to complete host dieback already described in
Mediterranean-climate areas, such as California, Spain or Italy (Gusella et al. 2021; López-
Moral et al. 2020; Moral et al. 2019b). While Botryosphaeriaceae and Diaporthe species are
mainly reported in symptomatic samples in these regions, in France fungal isolations from
symptomatic walnut fruits and twigs resulted in the identification of a fungal complex, primarily
represented by Diaporthe and Botryosphaeriaceae species, along with Colletotrichum and
Fusarium (Laloum et al. 2022). These emergent symptoms and causal agents, although
widespread in tree nut orchards abroad as well as in other French crops such as vineyards,
encouraged us to explore the source and pathways of such biological invasion, which is a key
to understanding the origin of the pathogen (Robert et al. 2012). Human-mediated introduction
of pathogen agents in new environments as well as host jump are one of the main causes for
disease emergence (Billones-Baaijens et al. 2015; Dunn & Hatcher 2015; Frankel et al. 2020;
Na et al. 2022; Thines 2019), which is even more likely for these species considering their wide
host range and low host specificity (Mehl et al. 2017; Thines 2019). In order to try to identify
origin and pathways of biological invasion, population genetics appears as a useful tool to
provide relevant insights into the diversity and origin of Botryosphaeriaceae populations newly
isolated from French walnut trees.
Several recent molecular markers have been used so far to study the genetic diversity
and structure of B. dothidea and N. parvum populations from many hosts, including inter-simple
sequence repeats (ISSR; Slippers et al. 2004; Zhou et al. 2001) and simple sequence repeats
(SSR; Manawasinghe et al. 2018; Mehl et al. 2017; Nagel et al. 2020; Pavlic-Zupanc et al.
2015; Sakalidis et al. 2013; Zlatković et al. 2019). Microsatellite markers, or SSR, are powerful
genetic markers widely used in fungal population genetic studies. These ubiquitous DNA
sequences of eukaryotic genomes are highly polymorphic, co-dominant and their sequencing is

180
highly reproducible (Jarne & Lagoda 1996; Tautz & Renz 1984). Overall, these studies
consistently revealed low genetic diversity of B. dothidea and N. parvum populations in
cultivated hosts while fairly high levels of genetic diversity could be found when isolates
originated from native hosts. Populations from native hosts tend to have greater genetic
diversity, as well as populations that have been well developed for a long time on cultivated
hosts (Manawasinghe et al. 2018; Pavlic-Zupanc et al. 2015), than emergent and introduced
populations (Mehl et al. 2017; Nagel et al. 2020; Sakalidis et al. 2013; Zlatković et al. 2019).
In this study, microsatellite markers were developed and genotyped using microsatellite
sequencing (SSR-seq; Lepais et al. 2020) for both B. dothidea and N. parvum species. Our
objectives were to (i) assess the diversity of the main Botryosphaeriaceae populations newly
isolated from French walnut orchards, (ii) compare with populations originated from countries
and crops characterized by a moderate (Spanish walnut orchards) to a long history of disease
implantation, including Californian walnut and almond orchards as well as French vineyards
and, (iii) study genetic differentiation of populations according to geographic location, host and
disease development stage.

Materials and methods

Collection of fungal isolates

Symptomatic and asymptomatic walnut organs were collected from different trees in 12
French orchards (P1 to P12) during September 2020 and August 2021 for husks, and during
May 2021 for twigs. A total of 6 orchards were surveyed in the South-East (SE; P1 to P6, mainly
Auvergne-Rhône-Alpes region) and 6 orchards in the South-West (SW; P7 to P12, mainly
Nouvelle-Aquitaine region; Figure 1). Two orchards were cultivated with the cultivar Serr (P7
and P9) while the remaining orchards were cultivated with the variety Franquette. Symptoms
targeted on walnut husks were characterized by blights and necrosis, while symptomatic twigs
showed necrosis, defoliation and cankers. In each orchard, 5 symptomatic husks were sampled
during September 2020, while 24 symptomatic and 6 asymptomatic husks and the same number
of twigs were sampled during the two other campaigns when possible. All samples were stored
at 4°C until analyzed.

181
Figure 1. Sampling location of B. dothidea and N. parvum isolates from French walnut orchards
in the South-East (green) and in the South-West (orange) walnut-producing areas.

Environmental samples were sterilized and cut as described in Belair et al. (2023) and
5 pieces of each sample were placed onto potato dextrose agar (PDA) supplemented with 10
mL/L of a Penicillin-Streptomycin solution (10,000 units penicillin and 10 mg
streptomycin/mL, Sigma Aldrich, Saint-Louis, Missouri, USA). Fungal isolates were collected
on PDA medium and grown for a 4-day incubation period at 25°C in the dark and a 3-day
incubation period at room temperature under natural light.
Botryosphaeriaceae isolates were identified based on internal transcribed spacer (ITS)
sequencing. DNA extractions were performed using KingFisher Duo Prime System (Thermo
Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) and Mag-Bind Universal Pathogen DNA
Ⓡ

extraction kit (Omega Bio-Tek Inc., VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA)
following the manufacturer’s instructions. DNA solutions were quantified with a NanoDrop
1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). PCR amplifications were performed with
ITS5/ITS4 primer pair and following White et al. (1990) instructions. Sanger sequencing was
performed by Eurofins Genomics platform (Cologne, Germany). Contig assembly and
taxonomic assignment was performed with Geneious Prime 2021.1.1.
In order to compare the prevalence (defined as the percentage of husks or twigs
contaminated by a given species out of the total number of organs analyzed) of the two species

182
between the two types of organs and the two sampled areas as well as between asymptomatic
and symptomatic organs, a chi-squared test was performed using the [Link]() R function to
compare the equality of proportions (R Core Team 2022).

Fungal isolates purification and DNA extraction

All isolates were single-thallus purified from 14 day-old cultures. Mycelial suspensions
were produced by scraping surface mycelium with sterile rakes and 5 mL of a solution of sterile
distilled water and Tween® 80 (2 drops of Tween® 80 for 1 L of solution; Sigma Aldrich). Serial
dilutions in sterile distilled water and Tween® 80 down to 10 were performed before surface-
-3

plating (100 µL of 10 and 10 mycelial solutions) onto PDA medium. Petri dishes were
-2 -3

incubated at 25°C in the dark and single-thallus growth was observed using binocular loupe
after 24 hours of incubation and then collected and isolated onto a new PDA medium and
incubated at 25°C in the dark for 7 days. Of our collection of 300 N. parvum isolates, 200
isolates were further selected for SSR-sequencing, by covering the range of origin and using
the same number of isolates for each sampling condition. Also, if an organ was infected with a
high number of isolates, two to four randomly-selected isolates were genotyped (Table 1).
Fungal isolates from French vineyards from UMR SAVE (Santé et Agroécologie du
Vignoble) as well as from Californian walnut and almond trees and Spanish walnut trees from
Kearney Agricultural Research and Extension Center were added to the analysis and were
purified as described previously.
DNA extractions of purified isolates were performed as described previously before
being diluted to a final concentration of 15 ng/µL for SSR-sequencing.

Table 1. Number of isolates of B. dothidea and N. parvum collected from French walnut orchards,
genotyped using SSR-seq and used in the population study after manual clone-correction of datasets as
described in SSR quality filtering.

B. dothidea isolates N. parvum isolates

Sampling
(nb of samples)
Collected Genotyped Population study Collected Genotyped Population study

South-East 124 124 94 96 69 49

2020 18 18 15 14 10 7

Husk 18 18 15 14 10 7

- Symptomatic (30) 18 18 15 14 10 7

183
Table 1. Continued.

B. dothidea isolates N. parvum isolates

Sampling
(nb of samples)
Collected Genotyped Population study Collected Genotyped Population study

South-East 124 124 94 96 69 49

2021 106 106 79 82 59 42

Husk 79 79 61 50 40 30

- Asymptomatic (15) 16 16 12 4 4 3

- Symptomatic (68) 63 63 49 46 36 27

Twig 27 27 18 32 19 12

- Asymptomatic (15) 5 5 3 2 1 1

- Symptomatic (72) 22 22 15 30 18 11

South-West 58 57 39 227 131 107

2020 9 8 6 34 21 19

Husk 9 8 6 34 21 19

- Symptomatic (30) 9 8 6 34 21 19

2021 49 49 33 193 110 88

Husk 20 20 16 54 35 27

- Asymptomatic (15) 1 1 1 0 0 0

- Symptomatic (60) 19 19 15 54 35 27

Twig 29 29 17 139 75 61

- Asymptomatic (15) 0 0 0 5 5 5

- Symptomatic (72) 29 29 17 134 70 56

Total isolates 182 181 133 323 200 156

184
Sequence-based microsatellite genotyping
Microsatellite markers genotyping, from whole-genome microsatellite detection to
primer design as well as microsatellite sequencing and bioinformatic analyses, were performed
at the Genome Transcriptome Facility of Bordeaux (PGTB, Bordeaux, France). Global
description of the workflow is available in the publication of Lepais et al. (2020). Briefly, the
QDD v3.1 pipeline (Meglécz et al. 2014) was used to detect microsatellites and design
associated primer pairs based on genome sequences retrieved from NCBI (accession number in
National Center for Biotechnology Information: GCA_011503125.2 for B. dothidea and
GCA_020912385.1 for N. parvum; [Link] (accessed on 08 April 2022).
A total of 60 microsatellite primer pairs were tested for amplification in a simplex PCR, before
the amplification of the successful locus in a multiplex PCR. Amplicons were indexed and
sequenced in a portion of a P1 flowcell of an Illumina NextSeq 2000 sequencer in a paired-end
2 x 150 pb configuration. Then, data analyses were performed using a bioinformatic pipeline
(Lepais et al. 2020) integrating the FDSTools analysis toolkit (Hoogenboom et al. 2017),
leading to complete genotypic profiles for each strain integrating allelic polymorphism of 35
loci and 34 loci for N. parvum and B. dothidea respectively. Moreover, sequences of 95 strains
of each species were amplified and sequenced twice to ensure reproducibility of sequenced
SSR, estimate allelic error rate and compute the overall missing data rate for each locus.

SSR quality filtering

First, loci with more than 20% missing data and/or more than 3% allelic error were
discarded. In addition, since both species are haploid, loci with more than 20% heterozygosity,
suggesting a sequencing error, were also discarded. Genotypes of strains that were repeated
were compared and a representative was conserved for further analyses provided that both
genotypes were identical. If genotypes were not identical (due to heterozygous loci), the
homozygous genotype was retained. Strains with more than 20% heterozygosity or missing data
were also discarded. Finally, isolates from French walnut orchards were clone-corrected by
discarding strains isolated from the exact same organ with the same multilocus genotype (MLG)
in order to retain only one representative per sample (hereafter uncorrected datasets; Table 1).

Population genetic diversity

GenAlEx v6.503 (Peakall & Smouse 2012) was used to determine characteristics of
each dataset and population, e.g. unbiased haploid genetic diversity (uh) and percentage of
polymorphic loci (%P), as well as Mantel test (Mantel 1967). Moreover, the allelic richness
(AR) at the smallest population size across combinations of populations and locus were

185
assessed using the PopGenReport v3.0.7 R package (Adamack & Gruber 2014). The poppr
v2.9.4 R package (Kamvar et al. 2015) was also used to assess complementary estimators such
as the number of multilocus genotypes (MLG), the number of expected MLGs (eMLG) at the
smallest sample size, Shannon (H; Shannon 1948) and corrected Simpson’s indices (λc;
Simpson 1949), and the evenness of MLGs (E.5, which corresponds to MLGs distribution
among populations; Pielou 1975). Simpson’s corrected index was calculated by multiplying by
N/(N-1), N representing the total number of individuals of the given population. Shannon index
and the evenness were estimated with a bootstrap value of 1000 and a rarefaction at the smallest
population size as indicated in Grünwald et al. (2003). Clone-correction was applied for each
population using poppr to retain only one representative strain for each MLG in each population
(hereafter clone-corrected datasets). Linkage disequilibrium was estimated using the index of
association and its standardized form (Ia; Brown et al. 1980, and rbarD; Agapow & Burt 2001),
respectively), for both uncorrected and clone-corrected datasets, with 999 permutations.
Genotype accumulation curves were produced to ensure that loci used in the analysis were
sufficiently numerous and discriminative to assess the genotypic diversity of B. dothidea and
N. parvum populations with a resampling without replacement value of 1000.

Population structure and differentiation

Analyses of MOlecular VAriance (AMOVA) were performed using the ade4 R package
(Dray & Dufour 2007) implemented in poppr on both uncorrected and clone-corrected datasets.
Minimum spanning networks were performed based on Bruvo’s distance (Bruvo et al. 2004)
using the two R packages poppr and magrittr v2.0.3 (Bache & Wickman 2022). Discriminant
Analyses of Principal Components (DAPC) were conducted with the adegenet v2.1.10 R
package in poppr (Jombart et al. 2010; Jombart & Ahmed 2011). The optimal number of
principal components (PCs) was assessed using a cross-validation with the xvalDapc() function.
Dendrogram of genetic distance among populations of N. parvum was constructed using
unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) method and Nei’s distance (Nei
1972, 1978) with poppr and adegenet R packages. The number of bootstrap was set to 1000
and missing data were treated using the “mean” method.

186
Results

Distribution of B. dothidea and N. parvum isolates in walnut orchards from the two main
French production regions

A total of 182 B. dothidea and 323 N. parvum isolates were collected from 326 walnut
husks and 315 twigs from the two French production regions during three sampling campaigns,
including a few isolates that originated from the same organ. Prevalence of N. parvum was
significantly higher in the South-West than in the South-East (p = 0.003), contrary to B.
dothidea, regardless of the campaigns (p < 0.001; Table 2). Considering organs, B. dothidea
was significantly more prevalent in walnut husks than in twigs, regardless of campaigns and
production areas (28.5% versus 11.1% in total, respectively, p < 0.001; Table 2) while N.
parvum infected husks and twigs similarly (26.1% in husks and 21.9% twigs in total, p = 0.25)
(Table 2). Interestingly, B. dothidea was similarly prevalent in symptomatic and asymptomatic
organs whatever the organ type while N. parvum was significantly more prevalent in
symptomatic samples (Table 2).

Table 2. Prevalence of B. dothidea and N. parvum species in the two geographical areas and the two
organ types in 2020 and 2021. Prevalence in symptomatic and asymptomatic organs was only evaluated
in 2021.

Criterion Condition B. dothidea (%) N. parvum (%)

Geographical origin South-East 31.7a 18.1b

South-West 10.8b 28.6a

Organ type Husks 28.5a 26.1a

Twigs 11.1b 21.9a

Presence of symptoms on husks (2021) Asymptomatic husks 22.2a 7.4b

Symptomatic husks 28.3a 25.9a

Presence of symptoms on twigs (2021) Asymptomatic twigs 4.8a 11.1b

Symptomatic twigs 12.7a 24.6a

Lowercase letters indicate significant differences at 0.05 threshold based on chi-squared test. Statistical
comparisons were performed between conditions of the same criterion by species.

187
Genetic diversity and genotypic variations of French populations of B. dothidea and
N. parvum

A total of 11 and 27 loci and 138 and 223 strains were respectively retained for B.
dothidea and N. parvum population analysis (Table 3). B. dothidea isolates were divided into
a priori populations based on French production areas, leading to two distinct populations,
namely Bd_SW for the South-West production area (N = 39) and Bd_SE for the South-East
production area (N = 94). The N. parvum population was similarly divided (Np_SW, N = 107;
and Np_SE, N = 49). Descriptive statistics and diversity indices are summarized in Table 3.
Among the 11 SSR loci used for B. dothidea population analysis, the number of alleles
ranged from 1 to 4 with an average of 2.272 alleles per locus (regardless of production area),
with 3 monomorphic loci in the Bd_SE population and 4 in the Bd_SW one. Overall, the two
populations showed a high level of polymorphic loci, and similar allelic richness values.
Moreover, they showed low levels of genetic diversity, unevenly distributed among MLGs,
although the distribution was more homogeneous in the southwestern population than in the
southeastern one (E = 0.61 and 0.42, respectively; Table 3). The rate of clonality (percentage
5

of strains that share a MLG) within the two populations ranged from more than 75% (Bd_SW)
to 86% (Bd_SE), further illustrating a relatively moderate genotypic diversity and equitability
although still slightly higher in the former than in the latter population (H = 1.54 and 0.92, and
λc = 0.69 and 0.38, respectively; Table 3). Indeed, more than 75% isolates belonged to only
one MLG in the Bd_SE versus two MLGs in the Bd_SW population. Interestingly, no MLG
was found to be shared by strains of the two populations, indicating that the 10 and 12 MLGs
associated with Bd_SW and Bd_SE populations were uniquely associated with a production
area.
N. parvum isolates were genotyped based on 27 SSR loci with allele counts ranging
from 1 to 5 (mean number of alleles per locus of 2.815, regardless of production area). The
Np_SW population showed a higher rate of polymorphic loci (23 loci vs 10 loci, respectively)
and a higher allelic richness (AR = 2.59 vs 1.54; Table 3). Overall, the number of isolates
belonging to MLGs was much more evenly distributed in the Np_SW than in the Np_SE
population (E = 0.73 and 0.39, respectively), further confirmed by a considerable higher
5

unbiased haploid genetic diversity and λc values in the Np_SW population (uh = 0.148 and
0.040; and λc = 0.91 and 0.29, respectively; Table 3). Indeed, the same MLG was shared by 41
out of 49 strains of the Np_SE population, whereas 86 out of 107 strains from the Np_SW
population belonged to 12 different MLGs (from 2 strains to 19 strains per MLG). The Np_SE

188
population was represented by more than 85% clonal strains, highlighted by relatively low
diversity indices (H = 0.73). The second population was much more diverse (H = 2.68) and thus
associated with a lower rate of clonal strains (69%; Table 3). Interestingly, two MLGs were
shared by the two production regions but were only shared by one isolate from the other
population.

B. dothidea population analysis revealed partial sexual reproduction although clonality

was high for both species

Linkage disequilibrium was explored to assess the extent of clonal versus sexual
reproduction within both populations. In addition to the uncorrected dataset, the clone-corrected
dataset was also taken into account to correct for the clonality effect caused by a high rate of
clonal strains for each MLG. As shown by the high number of isolates sharing the same MLG
for most of the populations, clonality was hypothesized to be the main reproduction mode for
both B. dothidea and N. parvum.
Considering B. dothidea, the uncorrected dataset showed significant p-value for the two
IA and rbarD indices for both SW and SE populations, but not the clone-corrected ones, thus
failing to reject the null hypothesis of random mating. This may evidence a potential sexual
reproduction within the two populations (Table 3). Note that negative values were obtained for
the Bd_SE population with the clone-corrected dataset. These values indicated that the observed
variance of the distance between strains was lower than the expected variance under the
assumption of panmixia.
Conversely, N. parvum populations all showed clonal reproduction as the main mode of
reproduction regardless of the dataset, highlighted by relatively high rbarD values and
significant p-values at a threshold of 0.05 (Table 3).

189
 Table 3. Descriptive statistics and indices of genetic diversity of B. dothidea and N. parvum populations collected from the two main French walnut production regions.

Uncorrected dataset Clone-corrected dataset

Species Population Nb of individuals Nb of loci AR uh (s.d.) %P MLG eMLG H λc E5
IA rbarD IA rbarD

Bd_SW 39 2.08 0.142 (0.060) 63.64 10 10 1.54 0.71 0.61 1.08a 0.20a 0.44b 0.07b
B. dothidea 11
Bd_SE 94 1.62 0.077 (0.028) 72.73 12 7.35 0.92 0.39 0.42 1.34a 0.26a -0.15b -0.03b

Np_SW 107 2.59 0.148 (0.034) 85.19 33 20.58 2.68 0.92 0.73 1.14a 0.09a 1.35a 0.10a
N. parvum 27
Np_SE 49 1.64 0.040 (0.012) 37.04 7 7 0.73 0.30 0.39 2.96a 0.35a 1.35a 0.15a

s.d.: standard deviation; AR: allelic richness; uh: unbiased haploid genetic diversity; %P: % of polymorphic loci; MLG: number of observed multilocus genotypes; eMLG: number of multilocus
genotypes expected at the smallest sample size; H: Shannon-Wiener index; λc: corrected Simpson’s index; E5: Evenness; IA: Index of association; rbarD: standardized index of association.
a
p-value < 0.05; b p-value > 0.05.

190
Geographical origin impacted the structure of B. dothidea populations but not that of N.
parvum populations

The AMOVA performed on the uncorrected and clone-corrected datasets for B.

dothidea populations led to opposite results. The uncorrected dataset showed that the genetic
differentiation was more structured according to regions (64.66%) than to strains (35.34%),
while the opposite was found for the clone-corrected dataset (79.26% of the genetic diversity
was associated with strains vs 20.74% with regions; Table S1). Nonetheless, the impact of the
geographical origin was further evidenced with the DAPC (Figure 2) and the Mantel test that
detected significant association between genetic and geographic distances of B. dothidea
isolates (R2 = 0.42 and p = 0.01). This was consistent with the absence of shared MLGs between
the two populations, as described previously.
The AMOVA performed on N. parvum populations based on geographical origin
indicated that the genetic diversity was mainly explained by strains (77.69% of variation with
the uncorrected data set and 93.39% of variation with the clone-corrected one; Table S1). For
this species, no significant relationship between genetic and geographic distances was noticed
and was confirmed by both the Mantel test (R2 = 0.0004 and p = 0.250) and the DAPC, showing
a relatively high genetic proximity between MLGs from the two production areas (Figure 2).

Figure 2. Discriminant Analysis of Principal Components of B. dothidea (A) and N. parvum (B)
populations based on geographical origin (South-West -SW and South-East -SE), organ (Husk -H and
Twig -T) and symptoms (Asymptomatic -A and Symptomatic -S). The SW_HA population of B.
dothidea and SE_TA population of N. parvum were not represented because they were represented by
only one individual.

191
Population structure was not impacted by the organ type, the presence of symptoms or
over time

Further analyses were conducted to compare MLGs associated with isolates from walnut
husks (H) and twigs (T) in the two production areas for both B. dothidea and N. parvum species,
as well as isolates from asymptomatic (A) and symptomatic (S) organs.
Overall, husk-associated populations displayed more MLGs than twig-associated ones
(Table S2). Minimum spanning networks showed that the majority of the MLGs associated
with husks were also identified in twigs for the two species in both regions (Figure 3). This
was consistent with the low percentage of variation observed between organs with the AMOVA
analysis (Table S3) and the overlap of ellipses between twig and husk populations as shown by
the DAPC (Figure 2). The number of MLGs was higher in twigs than in husks in the Np_SW
population (Figure 3C and Table S2). All the MLGs that were shared between husks and twigs-
based populations were predominant for both species in the two areas (Figure 3). Unlike the
South-East, a few MLGs from the South-West were uniquely isolated from twigs (3 out of 10
MLGs for B. dothidea and 16 out of 33 MLGs for N. parvum). Unbiased genetic diversity values
(uh) were relatively low, indicating that all organ-based populations displayed relatively uneven
and heterogeneous MLGs repartition and high level of clonality (Table S2).
Concerning the distribution of populations associated with symptomatic and
asymptomatic husks and twigs, isolates from both species sharing the same MLG could be
isolated from both types of organs. In addition, MLGs from symptomatic and asymptomatic
organs were genetically closely-related (Figure 2). Interestingly, for both species, the four SE
populations (based on organs and symptoms) shared the same predominant MLG; it was also
the case for the three South-West [Link] populations while Np_SW were more
genotypically differentiated. Interestingly, one highly represented MLG from N. parvum strains
collected from symptomatic husks and twigs was not present in asymptomatic samples in the
South-West. Conversely, two MLGs, represented by only one individual each, were only found
in asymptomatic twigs of the Np_SW population.
Moreover, comparisons between isolates collected from walnut husks in 2020 and 2021
showed that these populations were relatively close. More than 60% B. dothidea isolates from
walnut husks in 2020 and 2021 in the South-West shared the same two MLGs, versus more
than 75% in the South-East. These similarities between populations were confirmed by the
DAPC (Figure S1A,B). Likewise, more than 40% N. parvum isolates from walnut husks in
2020 and 2021 in the South-West shared the same two MLGs, versus more than 80% in the

192
South-East. This higher similarity between isolates from the southeastern French production
region over time was also confirmed by the DAPC (Figure S1C,D).

Figure 3. Minimum-spanning networks based on Bruvo’s distance of MLGs of B. dothidea (Bd) and N.
parvum (Np) populations. The networks were generated for the southwestern (SW) and southeastern
(SE) production areas, as well as for walnut husks (H) and twigs (T). A: Bd populations in the South-
West; B: Bd populations in the South-East; C: Np populations in the South-West; D: Np populations in
the South-East. MLGs are represented by nodes (circle) and edges (lines) representing genetic distance
between individuals. The size of the nodes corresponds to the number of individuals sharing the same
MLG.

Comparison of B. dothidea and N. parvum populations from French walnut orchards

with populations from other countries and/or crops

Populations of B. dothidea and N. parvum from French walnut orchards were compared
with other populations from different geographical and host origin: B. dothidea and N. parvum
populations isolated from grapevines in France (Bd_GRA, N = 5 individuals; and Np_GRA, N
= 43 individuals, respectively), and N. parvum populations isolated from walnut trees in
California (Np_CAL_W, N = 5 individuals) and in Spain (Np_SPA, N = 5 individuals), and
from almond trees in California (Np_CAL_A, N = 14 individuals). Geographical and plant
origin of these populations is listed in Table S4 and Table S5.

193
 Surprisingly, a certain level of genetic proximity was found between Bd_SW and
Bd_GRA populations, as illustrated in the DAPC where the SW and GRA populations were
clustered together at the opposite side of the SE one (Figure 4). Despite this higher genetic
similarity between Bd_SW and Bd_GRA, only one MLG was shared between these two
populations while one MLG was also shared between Bd_SE and Bd_GRA (Figure S12A).

Figure 4. Discriminant Analysis of Principal Components for B. dothidea populations from

French walnut-producing regions (South-West -SW and South-East -SE) and French vineyards
(GRA).

The UPGMA dendrogram based on Nei’s genetic distance highlighted an even stronger
genetic proximity between Np_SW, Np_SE and Np_GRA populations than that reported above
with B. dothidea (Figure 5). Indeed, the Np_SE and Np_SW populations, respectively, shared
3 and 5 MLGs with the Np_GRA population (Figure S2B). Altogether, these observations
further supported the lack of differentiation according to geographical origin of N. parvum
populations. Interestingly, among the individuals collected from grapevines in France (see
Table S4 for geographical origin), those that corresponded to the shared MLGs between
Np_SW/Np_SE and Np_GRA populations were all collected in the South-West (Nouvelle-
Aquitaine and Occitanie regions) while grapevine isolates from the North-East (Grand Est
region) did not share any MLGs with the French walnut populations. On the other hand, the
population collected from walnut trees in Spain displayed a low genetic proximity with the
Np_SW, Np_SE and Np_GRA populations on the UPGMA dendrogram, and no MLGs among
the 5 from this Spanish population were common with the previous ones (Figures 5 and S2B).
The same was true for the populations collected from walnut (CAL_W) and almond (CAL_A)

194
trees in California. This was confirmed by the UPGMA which highlighted a higher proximity
between the Californian and Spanish populations than between the other three (Figure 5).

Figure 5. UPGMA dendrogram based on Nei’s distance between four N. parvum populations from
southwestern and southeastern French regions (SW and SE respectively), grapevines in France (GRA)
and walnut (CAL_W) and almond (CAL_A) trees in California and walnut trees in Spain (SPA).
Bootstrap values above 50 are displayed at nodes.

Discussion

In the current study, we documented the genetic diversity and distribution of B. dothidea
and N. parvum populations associated with walnut dieback in the two main French walnut
production areas. Interestingly, walnut dieback symptoms have been associated with the
presence of ten Botryosphaeriaceae species in addition to two species of Diaporthe in California
at the beginning of the 2010s (Chen et al. 2014), while six different species have been associated
with dieback symptoms in France (Belair et al. 2023; Laloum et al. 2022), among which B.
dothidea and N. parvum were the only representatives of the Botryosphaeriaceae family. The
emergence of this disease in France led us to investigate the genetic and genotypic diversity
and population structure of B. dothidea and N. parvum from organs showing walnut dieback
symptoms as well as asymptomatic ones.
Analysis of both B. dothidea and N. parvum populations from South-West and South-
East of France showed relatively low genetic diversity, which is consistent with the emerging
nature of the disease in France. The same conclusions were also obtained from previous studies
using different methods such as RAPD to study B. dothidea populations from blackberry,

195
eucalyptus, pecan, pistachio, walnut and willow in California (Ma et al. 2001) or UP-PCR to
study N. parvum populations from vineyards in New-Zealand (Baskarathevan et al., 2012),
although these markers are much less resolutive than SSR (Sunnucks 2000). Interestingly, the
genetic diversity of both species isolated from different hosts and countries was also reported
from moderate (Mehl et al. 2017; Zlatković et al. 2019) to relatively high (Manawasinghe et
al. 2018; Pavlic-Zupanc et al. 2015; Sakalidis et al. 2013) based on microsatellite markers
genotyping. Reproduction mode is known to contribute to the level of genetic diversity, with
populations undergoing sexual reproduction more likely to exhibit higher genetic diversity
(McDonald & Linde 2002). In this study, B. dothidea and N. parvum populations were
associated with a dominant clonal reproduction pattern. Indeed, it is known that
Botryosphaeriaceae species tend to display relatively low levels of sexual reproduction and
primarily rely on asexual reproduction in field conditions (Slippers & Wingfield 2007).
Likewise, both B. dothidea and N. parvum were reported to be represented by a high number
of individuals sharing the same MLG and to have a low genetic diversity (Ma et al. 2001; Mehl
et al. 2017; Pavlic-Zupanc et al. 2015; Zlatković et al. 2019), suggesting an important role of
clonal reproduction (McDonald & Linde 2002). Both sexual and asexual reproduction modes,
associated with high and low genetic diversity, respectively, were detected based on linkage
disequilibrium by Sakalidis et al. (2013) who studied the diversity of N. parvum populations
collected in different countries, highlighting the species’ ability to reproduce in both ways.
However, in our B. dothidea clone-corrected dataset, significant linkage equilibrium was
observed, suggesting the presence of recombinations or sexual reproduction such as
homothallic mating type (Xu 2006). This is consistent with previous observations of B. dothidea
populations from grapevines in China (Manawasinghe et al. 2018) as well as the presence of
homothallic mating types in these two species, as revealed by their genome analysis (Lopes et
al. 2017; Marsberg et al. 2017; Nagel et al. 2018). The predominance of clonal strains is also
characteristic of the emergence of a disease, as shown by Ma et al. 2001 on individuals
associated with recent panicle and shoot blight disease in pistachio in California. Moreover,
Botryosphaeriaceae species appear to exhibit higher genetic diversity in native hosts and
environments, such as N. parvum isolated from Syzygium cordatum in South-Africa (Pavlic-
Zupanc et al. 2015). Further investigations on the presence of reproduction structures on the
surface of walnut branches could give more information about the reproduction mode of these
species in walnut orchards in France, but taken together our observations are consistent with
the recent emergence of the disease in France (Laloum et al. 2022).

196
 Comparisons between strains associated with walnut husks and twigs revealed a high
percentage of identity between MLGs of the two types of organs and a relatively low genetic
distance. These connections between walnut husks and twigs support the hypothesis raised by
(Michailides et al. 2013) that the walnut dieback disease often originates in fruits, with pathogen
agents transferring from fruits to twigs through the peduncle. A second hypothesis would be
that infection can also initiate directly in twigs through wounds and scars caused by the fall of
fruits and leaves from walnut trees or even pruning wound, although practices requires less
pruning on walnut trees than on grapevines (Michailides et al. 2013; Moral et al. 2019a).
Actually, pruning wounds are identified as the primary entry point for infection of twigs and
branches by Botryosphaeriaceae species in other hosts like vines (Rosace et al. 2023), and in
walnut trees, wounds were shown to remain susceptible to Botryosphaeriaceae infection for at
least 4 months (Michailides et al. 2016). These different wounds could either constitute a breach
for exogenous infections of Botryosphaeriaceae or generate abiotic and biotic stresses that could
lead to the behavioral shift of Botryosphaeriaceae species from endophytes (that is, present in
the plant before wounds occurred) to pathogens. In order to consider this endophytic lifestyle,
we additionally collected isolates from asymptomatic organs. Results evidenced that, for both
species, populations isolated from symptomatic and asymptomatic husks and twigs were
genetically similar, indicating that strains exhibiting endophytic lifestyle in asymptomatic
organs were the same that had a pathogenic lifestyle in symptomatic ones. It was evidenced that
Botryosphaeriaceae species are capable of causing latent infections on young walnut trees in
nurseries (Moral et al. 2019b), further supporting the hypothesis that these species can remain
latent for extended periods and switch to a pathogenic lifestyle under specific conditions, when
resources become limited, and defense responses become weaker in a stressed plant
(Manawasinghe et al. 2016; Rai & Agarkar 2016; Slippers & Wingfield 2007). The first
observation of dieback symptoms occurred in August 2003 in France concurrently with the
occurrence of a severe heatwave before dieback symptoms were reported again from 2015
onwards, corresponding to an unusual succession of hot summers (Bressolier 2021; European
Environment Agency 2023; Laloum et al. 2022; World Meteorological Organization 2022).
This temporal link between occurrence of dieback symptoms and summer heatwaves could be
explained by the following two hypotheses: (i) environmental stresses have an impact on the
activation of latent infections by Botryosphaeriaceae species, and (ii) higher temperatures
increase the sporulation and growth of Botryosphaeriaceae that have a high optimal growth
temperature (Moral et al. 2019b). In addition, we found that the majority of strains isolated
from symptomatic walnut husks sampled in 2020 were also detected in 2021, for both species,

197
suggesting a certain stability, at least over a year of experiment. Further investigations on
individuals collected during multiple years could give additional information about the
spatiotemporal structure of the populations of the two species. It could also provide more
information on the stability of populations over time and potential changes in these populations,
as shown in B. dothidea populations from pistachio in California (Ma et al. 2003).
We also found that the structure of N. parvum populations did not depend on
geographical origin, nor on organ type or presence of symptoms, indicating a lack of genetic
differentiation based on these factors. This observation would imply a possible dispersion of
individuals between the two regions through wind or insects (Moral et al. 2019b) which allowed
for longer distance dispersal than spore dispersal by rain-splash. In addition, our results clearly
showed a significantly higher level of N. parvum genotypic diversity in the South-West. This
fact, together with a significantly higher prevalence of the species in the South-West, also
suggest that origin of contamination may be older and/or environmental conditions as well as
agronomic practices may favor the implanting of N. parvum compared to the South-East. Past
observations in France may support the hypothesis that walnut trees in the South-West are more
subject to abiotic stress and thus more prone to fungal diseases. In fact, the first observations of
fungal walnut dieback caused by Phytophthora species were reported during the 1990s only in
the South-West production region (Herman et al. 1995), despite the fact that the “intensive”
cultivation of walnut trees has been going on for longer in the South-East (i.e. at the beginning
of the 1900s; Letonnelier 1930) than in the South-West (around the 1950s; Laugénie 1965).
Moreover, a reduction of production due to unhealthy, unproductive and/or lacking vigor trees
was reported in the South-West in the early 1980s, while at the same time the South-East was
seen as the best area to grow walnut trees (Ramos & Doyle 1984). Conversely, B. dothidea
populations based on geographical origin were genetically significantly different when
analyzing the uncorrected dataset, and no MLG was shared between the two populations.
Therefore, the emergence of B. dothidea on walnut trees may result from separate inoculum
sources between the South-West and the South-East of France.
Interestingly, B. dothidea and N. parvum populations collected from French walnut trees
showed differences in behavior and structure that could be the result of several parameters such
as host specificity, the mechanisms of spore dispersal, the age of introduction or pathogenicity
criteria such as aggressiveness. In their study, Marsberg et al. (2017) highlighted that on the
one hand, the low host specificity, displayed by Botryosphaeriaceae, would contribute to a lack
of spatial differentiation as observed for N. parvum populations in France while on the other
hand,the dispersal of Botryosphaeriaceae spores by rain and water on relatively short distances

198
may lead to geographic-based genetic structure, like the one observed for B. dothidea
populations. Additionally, considering that reproduction mode plays an important role in
population structure (Pavlic-Zupanc et al. 2015), the highlighted traces of sexual reproduction
displayed by B. dothidea populations could also explain their specific structure. Furthermore, a
recently-introduced population is more likely to have no particular structure (Zlatković et al.
2019), and some studies hypothesized that introduction of B. dothidea may be older originating
from Europe (Marsberg et al. 2017), which could be a second partial explanation. The
difference in aggressiveness between the two species is also likely to explain the differences
observed. Indeed, it has been shown that N. parvum is more aggressive than B. dothidea (Chen
et al. 2014; Gusella et al. 2021; López-Moral et al. 2022; Sohrabi et al. 2020), and a higher
aggressiveness involved longer and more numerous lesions as well as a higher level of
reproduction (Dyakov 2007). A higher aggressiveness may also reflect a greater ability to
colonize the host. Altogether, this could also partially explain the higher number of collected
N. parvum individuals compared to B. dothidea. This higher occurrence of N. parvum in walnut
orchards displaying dieback symptoms has also been demonstrated in surveys carried out in
California (Chen et al. 2014), Croatia (Novak et al. 2018) and Turkey (Yildiz et al. 2022). It
has been shown that some cryptic species, such as N. parvum and N. ribis, are better invaders
due to their better adaptation to colonize non-native and human-disturbed environments
(Pavlic-Zupanc et al. 2015).
Furthermore, the analyses revealed that N. parvum populations not only exhibited
genetic similarity between the two walnut production regions, but also showed proximity to
strains collected from French vineyards in the southwestern regions. In contrast, N. parvum
populations were clearly different from Californian and Spanish ones. Interestingly, some
individuals from French walnut trees and vineyards even shared identical MLGs. Shared MLGs
were also evidenced between the B. dothidea population from the South-West (Bd_SW) and
French southwestern vineyards. Thus, B. dothidea and N. parvum populations infecting walnut
trees could share common origin with the population collected from vineyards or originate from
them, the two species are indeed commonly associated with grapevine trunk diseases in France
(Batista et al. 2022). This hypothesis is also supported by the fact that viticulture is historically
older than walnut orchards cultivation in the French regions studied (Laugénie 1965;
Letonnelier 1930) As described previously, climate change could play a significant role in
causing abiotic stresses on plants, leading to disease onset as well as facilitating the
geographical and host expansion of pathogenic agents, as predicted by Batista et al. (2023). A
second possible transmission pathway is the human-mediated transmission specifically through

199
introduction of infected material. In the history of walnut cultivation, English walnut (Juglans
regia L.), which found its origins in Central Asia, was exported to North-America primarily as
rootstock to enhance the characteristics and cultivation of walnut and to improve species
crossbreeding (Preece & McGranahan 2015). Initially, the major part of Californian walnut
trees was grafted on Juglans nigra rootstocks, an endemic species (McGranahan & Leslie
1991). Currently, scions grafted on Juglans nigra rootstock are still produced in Californian
nurseries and exported to different regions including France (Delbos et al. 1983). Thus, some
French walnut producers are cultivating J. regia × J. nigra hybrids. However, the lack of
genetic proximity between strains of French and Californian walnut trees does not confirm this
origin of infection and indicates that may have had separate origins or, alternatively, have
undergone distinct evolution processes, although additional samplings would be needed in
walnut-producing countries to confirm or not this result. N. parvum strains from Spain were
also genetically distant from French ones. Nevertheless, implantation and evolutionary pressure
of these populations are likely to be quite similar between those two regions, considering that
walnut dieback was, like in France, more recently observed in Spain than it was in California
(López-Moral et al. 2020). Further isolations and investigations of B. dothidea and N. parvum
populations from other hosts and countries should help to shed light into the emergence of
walnut dieback in France.

Conclusion

Overall, the present study aimed at exploring the genetic diversity and population structure of
B. dothidea and N. parvum isolates collected from walnut trees using SSR-sequencing. The
results showed relatively low genetic diversity and a main clonal reproduction pattern, although
B. dothidea French populations displayed traces of sexual reproduction. Unlike N. parvum, B.
dothidea populations from the two production areas did not share any MLG and showed a
geographic-based genetic structure. Some strains collected from symptomatic organs could also
be isolated from asymptomatic ones, further confirming the ability of both species to switch
from endophytic to pathogenic lifestyles. Genetic similarity of N. parvum and B. dothidea
walnut populations from the South-West of France with French grapevines populations
indicates a possible host jump from grapevine to walnut. In addition, the observed genetic
distance between French and Spanish N. parvum populations as well as with Californian ones
rather suggested that introduced contaminated materials are less likely to be an important source
of inoculum here. This study provides important insight into the epidemiology of two important

200
pathogens involved in an emergent dieback disease in French walnut orchards, including their
distribution, potential to mate, putative origin and disease pathways.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.

Funding

This work, which was conducted in the framework of the CARIBOU project, was funded by
the French ministry of Agriculture and Food under CASDAR funds (AAP RT 2020 CARIBOU
project coordinated by the CTIFL). This project was also funded by the French Brittany region
(ARED Grant #1797 SHERWOOD project) and the French ministry of Higher Education,
Research and Innovation (2020 CDE EGAAL).

Acknowledgments

We would like to thank the growers who have agreed to include their orchards in this project.
We are also grateful to the Genome Transcriptome Facility of Bordeaux
(doi:10.15454/1.5572396583599417E12) for performing sequence-based microsatellite
genotyping, with the help of Emilie Chancerel, Zoé Delaporte and Erwan Guichoux.

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207
Figures supplémentaires

Figure S1. Discriminant Analysis of Principal Components of B. dothidea (A and B) and N. parvum (C
and D) populations based on geographical origin (South-West -SW and South-East -SE) and the year of
sampling (2020 and 2021) of walnut husks (H).

Figure S2. Minimum spanning networks based on Bruvo’s distance of MLGs of B. dothidea (Bd) and
N. parvum (Np) individuals based on the southwestern (SW) and southeastern (SE) French walnut-
producing areas, the French vineyard population (GRA), the Californian walnut (CAL_W) and almond
(CAL_A) trees and the Spanish walnut trees (SPA) populations.

208
 Table S1. Analysis of molecular variance (AMOVA) for B. dothidea and N. parvum isolates among and
within regions.

Uncorrected dataset Clone-corrected dataset

Source of
Species
variation
Sum of Variance % of Sum of Variance
Df Df % of variation
squares components variation squares components

Between
1 107.81 1.93 64.66 1 8.58 0.58 20.74
regions

Between
B. dothidea individuals
131 138.63 1.06 35.34 20 44.51 2.23 79.26
within
orchards

Total 132 246.44 2.99 100 21 53.09 2.81 100

Between
1 62.82 0.89 22.31 1 7.94 0.31 6.61
regions

Between
N. parvum individuals
154 476.42 3.09 77.69 38 165.97 4.37 93.39
within
orchards

Total 155 539.24 3.98 100 39 173.91 4.68 100

209
Table S2. Descriptive statistics and indices of genetic diversity of B. dothidea and N. parvum
populations based on organ type (Husk -H and twig -T) in the two French production areas.

Species Population Nb of individuals AR uh (s.d.) %P MLG eMLG

B. dothidea Bd_SW_H 22 2.1 0.102 (0.043) 54.55 7 6.05

Bd_SW_T 17 2.0 0.083 (0.031) 45.45 5 5

Bd_SE_H 76 1.7 0.087 (0.032) 72.73 12 4.55

Bd_SE_T 18 1.5 0.030 (0.016) 27.27 4 3.83

N. parvum Np_SW_H 46 2.3 0.179 (0.037) 85.19 17 7.44

Np_SW_T 61 3.2 0.124 (0.033) 51.85 24 9.15

Np_SE_H 37 1.6 0.041 (0.014) 37.04 7 3.17

Np_SE_T 12 1.4 0.037 (0.014) 22.22 2 2.00

s.d.: standard deviation; AR: allelic richness; uh: unbiased haploid genetic diversity; %P: % of polymorphic loci;
MLG: number of observed multilocus genotypes; eMLG: number of multilocus genotypes expected at the smallest
sample size.

Table S3. Analysis of molecular variance (AMOVA) for B. dothidea and N. parvum isolates among and
within organs.

Uncorrected dataset Clone-corrected dataset

Source of
Species
variation
Sum of Variance % of Sum of Variance % of
Df Df
squares components variation squares components variation

Between
1 4.55 0.05 2.76 1 1.03 -0.11 -4.81
organs

Between
B. individuals
dothidea 131 241.89 1.85 97.24 26 61.00 2.35 104.81
within
organs

Total 132 246.44 1.90 100 27 62.03 2.24 100

210
Table S3. Continued.

Uncorrected dataset Clone-corrected dataset

Source of
Species
variation
Sum of Variance % of Sum of Variance % of
Df Df
squares components variation squares components variation

Between
1 8.30 0.06 1.78 1 2.27 -0.10 -2.21
organs

Between
N. individuals
parvum 154 530.95 3.45 98.22 46 215.96 4.70 102.21
within
organs

Total 155 539.25 3.51 100 47 218.23 4.60 100

Table S4. Geographical origin of isolates collected from French vineyards according to region.

Nb of isolates

French region
B. dothidea N. parvum

Grand Est 1 10

Nouvelle-Aquitaine 3 26

Occitanie 1 7

Total 5 43

Table S5. Geographical and plant origin of isolates of N. parvum collected from Californian almond
and walnut trees and Spanish walnut trees.

Nb of N. parvum isolates

Country
Walnut trees Almond trees

USA (California) 5 14

Spain 5 -

Total 10 14

211
212
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES

213
214
 Les symptômes de dépérissement du noyer, caractérisés principalement par des nécroses
et chancres au niveau des branches, des décolorations internes du bois, une défoliation et la
mort des bourgeons sur les jeunes pousses, ainsi que des nécroses et brûlures au niveau des
fruits n’ont été que récemment observés et étudiés en Europe. L’Espagne a ainsi été le premier
pays européen faisant l’objet d’une étude après l’observation de ces symptômes de
dépérissement en 2017 au sein de ses noyeraies (López-Moral et al. 2020b). Par la suite, de
nombreuses études de ces symptômes dans d’autres pays européens ont vu le jour, toutes faisant
état d’une maladie émergente liée à des symptômes nouvellement décrits. Les dommages
importants provoqués par ces symptômes et les fortes pertes qui peuvent en découler, comme
en témoignent des études menées en Californie où ces symptômes sont largement répandus
depuis le début des années 2000 (Michailides et al. 2012; Michailides & Hasey 2010), illustrent
la menace qui pèse sur les noyeraies. L’observation de ces symptômes en France dès 2015, et
l’augmentation de leur occurrence constatée en 2018 ont conduit à la réalisation de ce travail.

Dans ce contexte, cette thèse a porté sur l’étude étiologique et épidémiologique du

dépérissement du noyer dans les principales zones de production de noix françaises. La stratégie
de recherche a consisté à étudier la diversité fongique associée aux organes (noix et rameaux)
présentant des symptômes de dépérissement, et à étudier les facteurs, en lien avec les pratiques
culturales et les conditions météorologiques, pouvant impacter cette diversité. Dans un second
temps, ce travail s’est aussi intéressé à la diversité génétique des espèces de Botryosphaeriaceae
majoritaires associées à ces symptômes afin d’évaluer leur distribution sur le territoire français
et les facteurs pouvant être associés à leur introduction et dissémination au sein des noyeraies
françaises.

L’ensemble des analyses réalisées durant la thèse a permis de dégager 6 résultats-clés

discutés ci-après :

 Séquençage métabarcoding : l’utilisation d’échantillons contrôles s’avère

indispensable

Le séquençage métabarcoding est une technique de séquençage massif à grande échelle

appartement aux techniques dites de nouvelle génération (NGS, Next-Generation Sequencing).
Elle est actuellement fréquemment utilisée pour l’analyse d’échantillons de types
environnementaux et pour étudier les communautés microbiennes associées, aussi bien
bactériennes et virales que fongiques (Ruppert et al. 2019). Les nombreux biais pouvant
survenir durant la réalisation de cette approche impliquent une méthodologie précise et la

215
nécessité de contrôles afin d’évaluer le plus précisément possible les erreurs et biais introduits
durant l’amplification de l’ADN, le séquençage des amplicons, mais aussi durant l’analyse
bioinformatique des séquences. L’analyse d’échantillons contrôles fait partie des contrôles
préconisés. Ces contrôles peuvent être aussi bien externes qu’internes, et avoir un caractère
positif, négatif, voire même étranger (contrôles “alien”).

L’utilisation de communautés synthétiques de composition et de concentration connues,

autrement appelées mock, a permis durant ces travaux d’évaluer l’efficacité (la spécificité et la
sensibilité) de différentes paires d’amorces et de plusieurs paramètres d’outils bioinformatiques
dans l’analyse des séquences et l’identification des principales espèces ciblées. Ce contrôle
positif, bien que de plus en plus recommandé (Lebas & Massart 2020; Tedersoo et al. 2022),
n’est encore actuellement que peu utilisé. Le recours aux mocks a permis de comparer
différentes paires d’amorces, et outils bioinformatiques afin de choisir par la suite les amorces
et le pipeline à appliquer pour le séquençage métabarcoding des échantillons environnementaux
et l’analyse des communautés fongiques associées. Un second objectif était d’évaluer la
résolution taxonomique des amorces afin d’éviter une surinterprétation des résultats. En effet,
comme pour l’analyse d’échantillons d’ADN purs, l’amplification et le séquençage d’un seul
barcode s’avère souvent insuffisant pour identifier précisément l’isolat à l’échelle de l’espèce,
voire parfois du genre.

Cinq paires d’amorces ciblant les régions ITS (amorces ITS), ITS1 (amorces ITS1) et
ITS2 (amorces GTAA, GTAAm et KYO) ont été comparées vis-à-vis de leur capacité à
amplifier les espèces introduites dans les mocks, l’abondance relative obtenue par rapport à
celle attendue, et leur résolution taxonomique. Les régions ITS et ITS1 se sont avérées être les
moins adéquates quant à l’amplification des espèces d’intérêt introduites dans les mocks, les
abondances relatives obtenues n’étant pas significativement corrélées à celles attendues.
Précisément, les genres Fusarium, Epicoccum et Gibellulopsis étaient fortement sur-estimés,
tandis que les espèces de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe étaient fortement sous-estimées.
De plus, l’amplification par les amorces ITS1 était fortement hétérogène entre les réplicats des
mocks contenant le plus d’espèces, certains genres (Botryosphaeria, Lasiodiplodia,
Neofusicoccum, et Diaporthe) n’étant pas toujours détectés par les amorces au sein des trois
réplicats. Nous avons ensuite déterminé que les amorces KYO et GTAAm ciblant la région
ITS2 étaient les deux paires les plus performantes, les amorces GTAA ne permettant pas
l’amplification des séquences de C. godetiae.

216
 Concernant le pipeline d’analyse, l’intérêt d’une étape d’extraction de séquence via
l’outil ITSx a été évalué sur les jeux de données amplifiés à l’aide des amorces GTAAm et
KYO. Enfin, en testant des combinaisons d’amorces/pipeline d’analyse, nous avons mis en
évidence que pour notre pathosystème, l’utilisation de la paire d’amorces KYO sans
l’application de l’outil ITSx a permis d’obtenir une meilleure résolution taxonomique des
espèces d’intérêt.

Ainsi, les résultats obtenus durant ces travaux ont mis en avant l’importance de l’analyse
de communautés synthétiques afin de s’assurer de la bonne amplification des espèces d’intérêt
par les amorces envisagées, ainsi que pour évaluer les potentielles sur-estimations (notamment
des espèces du genre Fusarium) ou sous-estimations (notamment des espèces de
Botryosphaeria, Diaporthe et Lasiodiplodia) des abondances relatives. De plus, l’évaluation de
la résolution taxonomique s’est avérée indispensable, permettant ainsi de s’assurer du niveau
d’identification possible par les amorces, et ainsi de ne pas se fier exclusivement aux
identifications obtenues lors de l’étape d'assignation taxonomique. Durant ces travaux, de
nombreuses espèces introduites dans les communautés synthétiques ne pouvaient ainsi pas être
identifiées à l’échelle de l’espèce par les amorces KYO sélectionnées mais essentiellement à
l’échelle du genre. C’est le cas pour D. eres et F. juglandicola, identifiée à l’échelle du genre,
ainsi que pour B. dothidea, identifiée à l’échelle du genre et non différenciable de
Neoscytalidium (Botryosphaeria/Neoscytalidium). Colletotrichum godetiae, C. fioriniae et N.
parvum étaient quant à elles identifiées à l’échelle de l’espèce.

 Le dépérissement à Botryosphaeriaceae et Diaporthe du noyer est une maladie

complexe et fréquemment retrouvée en co-occurrence avec d’autres maladies dont
les symptômes sont similaires

L’étude des communauté fongiques associées aux symptômes de dépérissement à

Botryosphaeriaceae et Diaporthe du noyer à l’aide des approches culture-dépendante et culture-
indépendante a mis en avant la présence d’un complexe d’espèces phytopathogènes, dont
certaines responsables d’autres maladies. Les principaux acteurs du dépérissement du noyer ont
été identifiés à l’aide des deux approches à la fois dans les brous et dans les rameaux. Ainsi,
B. dothidea, N. parvum, appartenant toutes deux à la famille des Botryosphaeriaceae, et D. eres
sont les trois espèces majoritaires associées à ces symptômes en France. D’autres espèces
phytopathogènes, telles que C. fioriniae et C. godetiae, espèces responsables de l'anthracnose
sur fruits du noyer, et F. juglandicola ont elles aussi été fréquemment isolées. L’identification

217
commune des principaux genres pathogènes du noyer par les deux types d’approches, ainsi que
la mise en évidence de la présence d’autres genres du pathobiome peu voire pas isolés lors de
l’analyse culturale, tels que Cladosporium, Juglanconis, Ophiognomonia et Plectosphaerella,
met bien ici en avant la complémentarité de ces deux méthodes et l’apport de l’une par rapport
à l’autre dans l’analyse globale des communautés fongiques.

Peu d’études font état de l’identification conjointe d’espèces de Botryosphaeriaceae et

de Diaporthe avec d’autres espèces phytopathogènes à partir d’organes présentant des
symptômes de dépérissement. Ainsi, les études menées en Australie, Californie, Chine,
Hongrie, Italie et au Chili ne rapportent que la présence de ces deux groupes fongiques
(essentiellement des genres Botryosphaeria, Diplodia, Dothiorella, Lasiodiplodia,
Neofusicoccum et Neoscytalidium parmi la famille des Botryosphaeriaceae et des espèces D.
amygdali, D. australafricana, D. cynaroidis, D. eres, D. foeniculina, D. juglandina et D.
cynaroidis appartenant au genre Diaporthe ; Antony et al. 2023; Chen et al. 2014a; Gusella et
al. 2021; Jiménez Luna et al. 2022a; Li et al. 2016; Zabiák et al. 2023), tandis que l’étude
menée en Espagne rapporte aussi la présence d’espèces du genre phytopathogène Cytospora
(López-Moral et al. 2020b), et une étude préliminaire menée en Californie rapporte
l’identification d’espèces des genres Alternaria, Colletotrichum et Fusarium (Michailides et al.
2013). Comme décrit dans la partie introductive de ce manuscrit, les symptômes sur fruits de
l’anthracnose provoquée par Colletotrichum présentent des similarités avec les nécroses et
brûlures associées au dépérissement du noyer. Ces espèces additionnelles, pourtant peu
agressives sur rameaux, pourraient donc aussi être des actrices de l’état de dépérissement des
noyers en créant des voies d’entrée pour d’autres agents pathogènes ou en affaiblissant l’arbre.

Les espèces B. dothidea et N. parvum ont été les seules deux espèces de la famille des
Botryosphaeriaceae collectées et identifiées aussi bien à l’aide de l’approche culturale que du
séquençage métabarcoding. Du fait de la diversité des espèces de Botryosphaeriaceae mise en
avant dans d’autres études menées sur le noyer (10 espèces en Californie; Chen et al. 2014a) et
6 espèces en Espagne; López-Moral et al. 2020b), mais aussi sur d’autres hôtes tels que la vigne
(plus de 25 espèces; Larignon 2016), ces résultats sont apparus comme étonnants. Nous
pouvons ainsi émettre l’hypothèse que la diversité des espèces de Botryosphaeriaceae associées
au noyer en France pourrait augmenter au fur et à mesure du développement et de l’installation
de la maladie dans les vergers. De même, l’espèce de Diaporthe majoritairement collectées au
cours de ces travaux s’avère être D. eres, suivie par D. foeniculina mais collectée dans une bien
moindre mesure (61 % et 22 % des isolats appartenant au genre Diaporthe, respectivement).

218
Ces deux espèces semblent, en fonction du pays, et donc potentiellement aussi en fonction des
variétés majoritairement cultivées dans un pays donné, se partager la place d’espèce majoritaire
sur noyers présentant des symptômes de dépérissement. Alors que D. eres est l’espèce de
Diaporthe majoritairement collectée lors d’études menées en Hongrie (Zabiák et al. 2023) et
en République Tchèque (Eichmeier et al. 2020), à partir de cultivar/variété non renseignés, D.
foeniculina est l’espèce majoritairement collectée en Espagne à partir des cultivars Chandler,
Hartley, Serr, Tulare et Vina (López-Moral et al. 2020b), et en Californie à partir de cultivars
non renseignés (Chen et al. 2014a).

La présence de chacune de ces espèces dans des échantillons asymptomatiques a aussi

été mise en avant par le biais de l’analyse culture-dépendante, suggérant de potentielles
infections latentes. L’analyse des échantillons asymptomatiques grâce au séquençage
métabarcoding n’a pas été concluante, du fait d’une profondeur de séquençage trop faible,
entraînant principalement l’amplification de l’ADN de la plante plutôt que de l’ADN fongique.
Ceci indique principalement une très faible abondance d’ADN fongique dans ces échantillons
par rapport aux échantillons symptomatiques. L’objectif de cette analyse était d’apporter des
informations supplémentaires concernant la composition du phytomicrobiome d’échantillons
d’apparence saine. La quantification relative des principales espèces du pathobiome aurait
permis d’apprécier leur dominance dans ces échantillons. Aussi, cela aurait pu permettre
d’évaluer la diversité des espèces fongiques autres que celles correspondant aux agents
pathogènes d’intérêt et les différences de composition des communautés fongiques entre des
échantillons asymptomatiques et symptomatiques, comme cela a été réalisé dans l’étude de
Wang et al. (2022). L’analyse comparative d’échantillons de feuilles de noyers
asymptomatiques et de feuilles présentant des symptômes d’anthracnose a permis de mettre en
avant la présence des genres pathogènes Alternaria, Colletotrichum, Diaporthe et Fusarium
dans les deux types d’échantillons. De plus, les espèces du genre Vishniacozyma étaient plus
abondamment présentes dans les échantillons asymptomatiques que symptomatiques. Cette
étude a aussi permis de mettre en avant une plus grande richesse et diversité dans les
échantillons symptomatiques que dans les échantillons asymptomatiques, et ce quelles que
soient les dates de prélèvement. Les échantillons associés à la richesse et la diversité les plus
élevées étaient les échantillons symptomatiques prélevés le plus tardivement, présentant donc
un stade d’avancement de la maladie plus important. Ce phénomène déjà démontré auparavant
est une caractéristique du pathobiome d’échantillons présentant un stade avancé de maladie.

219
  Des espèces fongiques majoritaires à pathogénicité variable

Les analyses menées au cours de ces travaux ont permis de mettre en avant des degrés
d’agressivité différents, aussi bien inter- qu’intra-spécifiques. Premièrement, les espèces B.
dothidea et N. parvum de la famille des Botryosphaeriaceae ont été identifiées comme les
espèces les plus agressives sur rameaux détachés en conditions contrôlées. Les espèces
C. fioriniae et F. juglandicola ne se sont révélées pathogènes que pour un nombre réduit
d’isolats, caractérisés comme très faiblement agressifs, tandis que C. godetiae n’apparaissait
pas comme un agent pathogène dans les rameaux, les nécroses provoquées n’étant pas
significativement différentes de celles mesurées sur les témoins. Enfin, D. eres présentait une
agressivité inférieure à celle des espèces de Botryosphaeriaceae, mais supérieure à celles des 3
espèces les moins agressives. La diversité de l’agressivité a aussi été constatée à l’échelle
intraspécifique, associée parfois à d’importants écarts. C’était notamment le cas pour
F. juglandicola, dont le taux moyen d’évolution de la nécrose variait entre 0,2 mm et 1,3 mm
par jour en fonction des isolats. Diaporthe eres, N. parvum et B. dothidea présentaient des
différences entre isolats entre 1,5 et plus de 2 fois supérieures, tandis que les espèces de
Colletotrichum étaient les plus homogènes. Ces différenciations de la pathogénicité des isolats
se sont aussi reflétées par le biais des taux de réisolement des espèces inoculées à partir des
nécroses provoquées. Les espèces les plus pathogènes étaient associées à un taux de réisolement
de 100 % pour chacun des isolats testés (soit B. dothidea et N. parvum), tandis que les taux
diminuaient globalement à mesure que l’espèce était moins pathogène, mettant en doute le
caractère réellement pathogène de ces espèces sur ce modèle. Sur cette base, un isolat de
F. juglandicola et deux de C. godetiae, réisolés à partir de seulement 10% des rameaux
inoculés, n’ont donc pas été inclus dans l’analyse finale.

De nombreuses études visent à caractériser la pathogénicité des espèces de

Botryosphaeriaceae (notamment des genres Botryosphaeria, Diplodia, Lasiodiplodia,
Neofusicoccum et Neoscytalidium) et de Diaporthe, et font l’état d’une agressivité plus marquée
de la part de ces premières sur noyers, notamment de Lasiodiplodia citricola, Neofusicoccum
parvum, N. mediterraneum et Neoscytalidium dimidiatum (Eichmeier et al. 2020; Jiménez Luna
et al. 2022a; López-Moral et al. 2020b). Le pouvoir pathogène plus important de la famille des
Botryosphaeriaceae a aussi été démontré à partir de l’analyse d’isolats provenant d’autres hôtes,
tels que le pistachier (López-Moral et al. 2020a; Nouri et al. 2019), l’amandier (Holland et al.
2021b), le pommier (Martino et al. 2023) ou encore la myrtille (Guarnaccia et al. 2020). Les
espèces de Colletotrichum étant les principaux agents pathogènes responsables de l’anthracnose

220
du noyer sur fruits et sur feuilles, leur pathogénicité a principalement été évaluée sur ces
modèles (Da Lio et al. 2018; Varjas et al. 2019; Yang et al. 2021; Zhu et al. 2015), et très peu
d’études ont permis de caractériser leur pathogénicité sur rameaux. Sur fruits et sur feuilles, les
espèces C. fioriniae et C. godetiae se sont révélées être pathogènes, provoquant des nécroses
jusqu’à plus de 3 cm de diamètre sur fruits en conditions contrôlées après 19 jours
d’expérimentation (Da Lio et al. 2018), et recréant sur feuilles détachées en conditions
contrôlées les symptômes observés en vergers (Yang et al. 2021; Zhu et al. 2015). Sur rameaux,
seuls Varjas et al. (2020) ont évalué la pathogénicité de C. godetiae. Après 14 jours
d'expérimentation sur rameaux âgés de deux ans en vergers, des nécroses entre 12 et 17 mm de
longueur ont été relevées (taux moyen de développement de nécrose d’environ 1 mm par jour),
soit des résultats globalement similaires à ceux obtenus durant ces travaux. Comme expliqué
dans la partie suivante, la variété Franquette semble peu sensible aux infections provoquées par
les espèces de Colletotrichum et de F. juglandicola sur rameaux. Bien qu’aucune information
ne soit à ce jour disponible concernant le cultivar Milotai 10 utilisé dans l’étude de
Varjas et al. (2020), celui-ci semble présenter une sensibilité similaire à celle de la variété
Franquette à l’infection de C. godetiae. Enfin, aucune étude n’a à ce jour permis d’évaluer la
pathogénicité de C. fioriniae et F. juglandicola sur rameaux de noyers, cette dernière étant une
espèce nouvellement décrite en 2021 (Crous et al. 2021).

 La sensibilité variétale, les pratiques culturales et les conditions météorologiques

contribuent à façonner le phytomicrobiome et le pathobiome

L’analyse de l’impact de ces différents facteurs sur la composition du phytomicrobiome

et du pathobiome a reposé sur les résultats obtenus par les deux approches culturale et culture-
indépendante.

La variété Franquette et le cultivar Serr sont les deux types de noyers à avoir été
échantillonnés durant ces travaux. De plus, une partie des parcelles était irriguées, certaines
étaient traitées chimiquement tandis que d’autres étaient traitées à l’aide de produits utilisables
en agriculture biologique. Nous avons démontré que ces trois facteurs ont une contribution à
hauteur de moins de 15 % sur la composition et l’abondance des différentes espèces composant
les communautés fongiques associées aux organes symptomatiques. L’étude menée par López-
Moral et al. (2022) a démontré que le cultivar Serr était particulièrement sensible aux
symptômes provoqués par certaines espèces de Botryosphaeriaceae (B. dothidea,
N. mediterraneum et N. parvum) lors d’inoculations artificielles à partir de plug mycéliens sur

221
branches détachées en conditions contrôlées ainsi qu’en vergers. Cette sensibilité importante
du cultivar peut donc partiellement expliquer la prévalence importante de N. parvum (62.8%
des échantillons de cultivar Serr) sur les parcelles concernées par rapport aux parcelles cultivées
avec la variété Franquette (23.4% des échantillons de variétés Franquette), bien qu’aucune
donnée ne soit actuellement disponible concernant la sensibilité de cette variété. De plus, les
genres Botryosphaeria et Colletotrichum étaient associés à une prévalence significativement
supérieure dans les échantillons de variété Franquette (33,0% versus 5,7%, et 45,2% versus
21,4%, respectivement). Toutefois, le plan d’échantillonnage basé sur 10 parcelles cultivées en
Franquette contre 2 en Serr ne permet pas de tirer des conclusions solides sur la plus grande
sensibilité de Serr.

La contribution de l’irrigation sur la structure des communautés fongiques à hauteur de

maximum 10 % peut s’expliquer par le fait que l’eau, sous forme de gouttes provenant de la
pluie ou de l’irrigation par aspersion, est une voie importante de transmission des spores des
espèces de Botryosphaeriaceae, Diaporthe, Colletotrichum et Fusarium à travers la canopée
(Moral et al. 2019b; Palmero et al. 2011; Penet et al. 2014). Par exemple, pour contrôler cette
dispersion, la réduction de l’angle d'aspersion des asperseurs dans les vergers de pistachiers a
permis de réduire de plus de 70 % les clusters infectieux en Californie (Michailides et al. 2017).
Dans notre étude, de façon surprenante, seule la prévalence du genre Diaporthe était
significativement supérieure dans les parcelles irriguées.

Le système de culture des parcelles étudiées (de type conventionnel ou biologique)

semble impacter à hauteur de maximum 6,5 % la structuration des communautés fongiques
dans les brous et rameaux des parcelles concernées. La principale différence de traitement entre
ces parcelles était l’application de fongicides synthétiques lors d’une conduite conventionnelle,
tandis que des traitements au cuivre sont appliqués quel que soit le type de conduite. Les
parcelles traitées uniquement à l’aide de produits utilisables en agriculture biologique, soit
principalement à l’aide de produits à base de cuivre, étaient donc moins traitées que les parcelles
en conduite conventionnelle. Ces différentes conduites peuvent expliquer une différence dans
la composition du phytomicrobiome et du pathobiome de par la régularité et l’efficacité des
traitements bien que l’effet reste mineur. Il a en effet été démontré que l’application de produits
à base de cuivre, notamment l’oxychlorure de cuivre, permettait de ralentir l’apparition et le
développement des symptômes d'anthracnose causés par C. godetiae sur oliviers de 3 ans en
serre, de 14 jours pour les fruits et de 3 semaines pour le dépérissement des branches, avec un
indice de sévérité de la maladie sur plants traités à l’oxychlorure de cuivre significativement

222
inférieurs à celui des plants non traités (63,2 % et 93,6 % respectivement) (Moral et al. 2018).
De plus, les différents produits à base de cuivre testés présentaient une efficacité mitigée dans
l'inhibition de la croissance de cette même espèce in vitro. Ces traitements entraînaient en
général une moindre inhibition de la germination des spores en comparaison avec les références
chimiques, et l’effet était dépendant des isolats testés, indiquant de plus une résistance au
traitement isolat-dépendante (Moral et al. 2018). En outre, il a été démontré par séquençage
métabarcoding que l’application de produits fongicides dits de synthèse ou de produits
utilisables en agriculture biologique avaient un effet significativement différent sur la richesse
et la diversité des communautés fongiques associées aux pommes (Abdelfattah et al. 2016).
Dans cette étude, plusieurs taxons fongiques de faible abondance relative (entre 1 % et 6,3 %)
ont été exclusivement identifiés dans les échantillons de fruits traités à l’aide de produits
organiques. Les taxons les plus abondants ne présentaient quant à eux pas de différence
significative en termes d’abondance relative. Les traitements fongicides de synthèse semblent
ainsi avoir un impact modéré sur la composition du phytomicrobiome (Abdelfattah et al. 2016).
Parmi les espèces pathogènes d’intérêt, seules celles du genre Colletotrichum ont été détectées
comme significativement plus abondantes dans les parcelles associées à un traitement
conventionnel que dans celles traitées essentiellement au cuivre. Cependant, l’expérimentation
n’étant initialement pas conçue dans l’objectif de comparer ces effets, il s’avère que la quasi-
totalité des parcelles de variétés Franquette sont traitées en suivant l’itinéraire technique
conventionnel, pouvant ainsi biaiser les résultats.

Les conditions météorologiques, telles que la température et les précipitations, sont

aussi des facteurs influençant la composition du phytomicrobiome. Ces travaux ont
particulièrement mis en évidence une différence significative dans la composition du
pathobiome en fonction des températures et des précipitations moyennes. Globalement, il est
ressorti de cette étude que les genres Botryosphaeria et Diaporthe étaient significativement plus
abondants dans les échantillons associés à des températures plus élevées et des précipitations
plus faibles, contrairement à Colletotrichum. Les infections provoquées par les espèces de
Botryosphaeriaceae, Colletotrichum et Diaporthe ont souvent lieu lors de périodes pluvieuses,
humides et chaudes (Moral et al. 2019b; Salotti et al. 2023), cependant, les températures
optimales de croissance de ces différents taxons diffèrent. La température optimale de
croissance de B. dothidea et N. parvum (entre 25°C et 30°C; Chen et al. 2014a; López-Moral
et al. 2020b) est en effet plus élevée que celle de D. eres et C. godetiae (entre 20°C et 25°C;
Arciuolo et al. 2021; Salotti et al. 2022; Thomidis & Michailides 2009). Ces différences

223
peuvent ainsi partiellement expliquer une différence d’abondance relative de ces espèces en
fonction des températures en vergers. De plus, les conditions météorologiques peuvent affecter
négativement l’état de santé de l’hôte, notamment lors de périodes de sécheresse. Ces stress
abiotiques font partie des facteurs suspectés d’être déclencheur du comportement pathogène
des Botryosphaeriaceae et des Diaporthe lorsque ceux-ci se développent de manière endophyte
dans l’hôte (Hilário & Gonçalves 2023; Slippers & Wingfield 2007).

 Le développement du pathobiome est aussi façonné par des interactions entre ses
membres ainsi qu’avec les autres espèces composant le phytomicrobiome

L’analyse des interactions entre genres ou espèces, issue des données culturales et non
culturales, a permis de mettre en évidence des corrélations positives et négatives entre les
différents membres du pathobiome. Les résultats interprétés à l’aide de corrélogrammes et de
réseaux de SparCC ont permis l’identification de corrélations positives et négatives différentes,
mais aussi communes, mettant une nouvelle fois en avant l’apport complémentaire de ces deux
méthodes dans l’analyse du pathobiome.

Les principales corrélations négatives mises en avant entre certaines des principales
espèces d’intérêt souligne la complexité des relations entre ces espèces associées au
dépérissement du noyer. Ainsi, bien que les espèces N. parvum, B. dothidea et D. eres aient été
démontrées comme pathogènes du noyer sur rameaux détachés, elles semblent avoir un rôle
différent dans le développement des symptômes. Par exemple, les corrélations négatives entre
N. parvum et D. eres, et N. parvum et C. godetiae, identifiées via les corrélogrammes basés sur
les données de prévalence des espèces, illustrent de potentielles interactions compétitives ou
antagonistes entre ces espèces. Ces interactions ont été confirmées à l’échelle de l’organe,
N. parvum et D. eres étant significativement plus retrouvées seules qu’en association l’une avec
l’autre, de même que C. godetiae par rapport à N. parvum. Les interactions entre N. parvum et
D. eres ont aussi été évaluées à l’aide d’inoculations de ces espèces (seules, conjointes et
séquentielles) sur rameaux détachés en conditions contrôlées. Ces expérimentations ont permis
de garder plausible l’hypothèse d’interactions antagonistes entre ces espèces, les résultats
obtenus étant identiques à ceux de Agustí-Brisach et al. (2019) qui ont mis en avant des
interactions antagonistes entre N. mediterraneum et D. rhusicola.

Bien qu’aucune interaction n’ait été mise en avant entre D. eres et F. juglandicola par
les analyses in silico, le fait que les deux espèces soient significativement plus fréquemment
retrouvées en association dans les rameaux que seules nous a poussés à réaliser des co-

224
inoculations conjointes et séquentielles de ces espèces sur rameaux détachés. Ceci a permis de
mettre en avant de potentielles interactions facilitatrices entre ces deux espèces, en particulier
le comportement opportuniste et saprophyte du genre Fusarium pouvant profiter des lésions
causées par D. eres pour se développer dans le rameau. La biomasse fongique de D. eres et F.
juglandicola va être estimée à l’aide d’une approche qPCR afin de vérifier les postulats de
Koch, mais aussi d’étudier si les co-inoculations des deux espèces sont associées à une
meilleure colonisation de l’une voire des deux espèces par rapport aux inoculations seules. Ce
comportement des espèces du genre Fusarium pourrait ainsi aussi expliquer la corrélation
positive entre F. juglandicola et C. godetiae, cette dernière pouvant faciliter le développement
de la première.

D’autres corrélations mises en avant entre les principales espèces d’intérêt et d'autres
espèces du phytomicrobiome illustrent aussi les interactions entre ces différentes espèces et leur
rôle potentiel dans le développement des symptômes. Par exemple, l’abondance du genre
Vishniacozyma, correspondant à une levure endophyte, est négativement corrélée avec
l’abondance de Neofusicoccum. Ceci pourrait laisser penser que ces espèces endophytes
pourraient jouer un rôle dans le ralentissement du développement des symptômes, et pourraient
ainsi être de potentiels agents de lutte biologique contre cette maladie.

L’identification de corrélations entre espèces doit être réalisée avec précaution, car les
résultats obtenus via les données des approches culturales et non culturales peuvent être
interprétées différemment. Enfin, l’identification de ces corrélations apporte des informations
supplémentaires dans la compréhension du développement des symptômes du dépérissement
du noyer, montrant que leur apparition met en jeu les relations des principales espèces
pathogènes entre elles, mais aussi avec autres espèces du phytomicrobiome, principalement les
espèces endophytes du noyer, illustrant ainsi la définition du pathobiome (Bass et al. 2019) et
l’évolution récente du postulat de Koch dans sa version écologique : un microbiote
dysfonctionnel, une maladie (Vonaesch et al. 2018).

 Une différenciation génétique des populations de B. dothidea et N. parvum

particulière à chaque espèce et des hypothèses sur les sources d’introduction et de
dissémination

L’étude de la génétique des populations de B. dothidea et N. parvum par la méthode des

microsatellites a permis d’approfondir les connaissances concernant la répartition et la diversité
génétique de ces espèces émergentes sur le noyer en France.

225
 Les populations de B. dothidea se sont révélées partiellement façonnées par l’origine
géographique des prélèvements, à l’inverse des populations de N. parvum qui ne présentent
aucune différenciation génétique en fonction des deux bassins de production. De plus, des traces
de reproduction sexuée ont été mises en avant dans les populations de B. dothidea, alors que
seul le mode de reproduction clonal a été identifié dans les populations de N. parvum. Les
différences génétiques entre les deux populations de B. dothidea selon le bassin de prélèvement
pourraient ainsi s’expliquer par les différences que présentent ces deux bassins, en termes de
conditions météorologiques, mais aussi de variétés/cultivars de noyers cultivés, ainsi que les
autres principales cultures entourant les noyeraies et pouvant jouer le rôle de réservoir
d’individus, entre autres. Ces différences pourraient aussi être la résultante de multiples
introductions d’individus de B. dothidea en France, introductions mettant en jeu des individus
génétiquement différents. Ainsi, il est possible d’émettre l’hypothèse selon laquelle les
individus du bassin du Sud-Ouest pourraient provenir d’introductions depuis l’Espagne, tandis
que les individus du bassin du Sud-Est pourraient provenir d’introductions depuis l’Italie, par
exemple. De plus, ces différences pourraient aussi partiellement s’expliquer de par la
reproduction sexuée identifiée chez ces populations. L’étude menée pendant ma thèse n’ayant
pas permis d’approfondir cet aspect, ces hypothèses restent à creuser et à démontrer. A
l’inverse, l’homogénéité des populations de N. parvum sur les deux bassins de production
suggère la présence d’une large population non influencée par des facteurs géographiques. Ceci
pourrait potentiellement s’expliquer par le mode de reproduction exclusivement clonal de ces
individus ou encore une dissémination facilitée entre les deux bassins par les insectes et/ou le
vent. Bien que nos tests de pathogénicité sur rameaux détachés aient montré un niveau
d’agressivité similaire entre ces 2 espèces avec les isolats testés et dans nos conditions
expérimentales, les études tirées de la bibliographie concordent toutes vers un pouvoir
pathogène de N. parvum supérieur à celui de B. dothidea in planta (cf Tableau 4 de la partie
introductive du manuscrit). Par ailleurs, dans le chapitre II, nous avons montré une prévalence
de N. parvum significativement plus forte dans les échantillons symptomatiques par rapport aux
asymptomatiques, contrairement à B. dothidea, tandis que N. parvum était significativement
plus fréquemment retrouvé seul par rapport à B. dothidea, ce qui va dans le sens d’un meilleur
pouvoir pathogène et compétitif de N. parvum sur B. dothidea. De même que précédemment,
ces hypothèses restent à approfondir pour améliorer la compréhension de la répartition de ces
populations au sein des noyeraies françaises.

226
 Des différences entre ces populations ont donc été mises en avant à l’échelle de la
France, mais aussi des points communs. Les populations des deux espèces ne sont pas apparues
comme génétiquement influencées par l’organe d’origine (rameau brou) ni par l’état
symptomatologique de celui-ci (asymptomatique ou symptomatique). Ces derniers résultats
viennent faire écho aux potentielles infections latentes de ces espèces, ainsi qu’à leur
changement de comportement, d’un mode de vie endophyte vers un mode de vie pathogène/ou
de pathogène latent à actif. Ainsi, l’absence de différenciation génétique dans ce contexte laisse
penser que ce sont bien les mêmes individus qui évoluent d’un comportement à un autre en
réponse à des stress externes ou internes. De plus, ces résultats renforcent l’hypothèse selon
laquelle l’infection par les espèces de Botryosphaeriaceae débuterait par le fruit et se
propagerait au rameaux à travers le pédoncule (Moral et al. 2019b). Cependant, ces résultats ne
permettent pas non plus d’écarter l’hypothèse selon laquelle l’infection pourrait aussi se
propager des rameaux vers les fruits.

La comparaison des individus collectés de noyers en France avec d’autres individus

collectés de vignes en France a mis en avant une forte proximité génétique entre ces
populations. Les populations de noyer de N. parvum des deux bassins de production étaient
génétiquement proches de celle de vignes, tandis que la population de B. dothidea du Sud-Ouest
était la plus proche de celle de vignes. Ces points communs permettent d’émettre deux
hypothèses principales. Premièrement, les individus des deux cultures partageraient une origine
commune, c’est-à-dire proviendraient d’un hôte commun ayant permis la transmission vers ces
deux cultures. Deuxièmement, les vignobles pourraient être un réservoir d’individus qui
présentent la capacité d’être transmis vers les noyers. Ces deux hypothèses restent donc
actuellement à être vérifiées. Les populations de N. parvum ont aussi été comparées avec des
individus collectés à partir de noyers en Californie et en Espagne, ainsi qu’à partir d’amandiers
en Californie. Les populations espagnoles et californiennes se sont avérées génétiquement plus
proches les unes des autres que des populations françaises de noyers. Une des hypothèses
émanant de ces résultats est qu’une transmission des espèces entre les vignobles et les noyeraies
françaises semble plus probable qu’une introduction par le biais de matériel infectés provenant
de ces pays. Cet aspect reste aussi à approfondir.

227
  Perspectives

Les résultats obtenus durant ma thèse ouvrent la voie à plusieurs axes de recherche afin
d’approfondir la compréhension du pathobiome associé au dépérissement du noyer et des
populations associées.

1. Approfondir le cycle d’infection des principaux membres du pathobiome

Puisque les résultats obtenus durant la thèse mettent en évidence l’impact de la

météorologie sur la composition des communautés microbiennes des brous et noix, la
réalisation de nouvelles campagnes de prélèvement similaires serait intéressante pour confirmer
les effets observés. Cela permettrait également de poursuivre l’identification des espèces
composant le pathobiome et le phytomicrobiome, de manière plus large, à l’aide des deux
approches culture-dépendante et -indépendante. De plus, il serait intéressant de comparer la
composition, la diversité et la richesse des communautés fongiques dans des prélèvements de
fruits et de rameaux réalisés aux mêmes périodes. Cela permettrait d’évaluer la charge en agents
pathogènes dans les rameaux à l’époque où les noix présentent des symptômes (vers la fin de
l’été), mais aussi dans les fruits à l’époque où les rameaux présentent des symptômes (vers la
fin du printemps). De plus, une étude de l’évolution de la composition du pathobiome pourrait
être conduite à l’aide de la réalisation de prélèvements réguliers tout au long de la période de
croissance et de maturation des fruits. Le prélèvement de bourgeons, asymptomatiques et
symptomatiques, apporterait aussi des informations supplémentaires à ces analyses, les
bourgeons pouvant aussi présenter des nécroses, comme cela a été réalisé par Da Lio et al.
(2018) concernant l’anthracnose à Colletotrichum. De plus, l’analyse des échantillons pourrait
apporter des informations quant au cycle d’infection des principales espèces pathogènes, les
fleurs pouvant être une porte d’entrée pour les spores, au même titre que les plaies de taille et
les blessures sur fruits. Enfin, la réalisation de prélèvements sur des parcelles supplémentaires,
associées à d’autres variétés/cultivars et types de conduite permettrait d’approfondir les
potentielles différences dans la composition du phytomicrobiome en fonction de ces différents
facteurs.
Il serait aussi intéressant d’approfondir l’étude de la transmission des agents
pathogènes, du fruit vers le rameau, ou du rameau vers le fruit. Pour ce faire, il pourrait être
envisagé de réaliser des inoculations sur fruits, et de mettre en culture par la suite des
échantillons de brou, de pédoncules et des rameaux auxquels sont attachés les fruits, idéalement
en vergers, afin de vérifier l’hypothèse d’une transmission du fruit vers le rameau, mise de

228
nouveau en avant par les travaux de López-Moral et al. (2023). Enfin, les mêmes
expérimentations peuvent être mises en place, en inoculant cette fois-ci les rameaux, pour
évaluer une potentielle transmission des rameaux vers les fruits.
La capacité d’infection des différentes espèces est aussi étroitement liée à l’état de
maturité des fruits (López-Moral et al. 2023; Moral et al. 2019b). La sensibilité des fruits aux
infections des espèces de Botryosphaeriaceae augmente à mesure que le fruit approche de la
maturité, tandis qu’il a été démontré que l’agressivité de D. foeniculina était constante quel que
soit le stade de développement des fruits (López-Moral et al. 2023). La réalisation de tests
d’infection sur des fruits en vergers à différents stades de développement apporterait ainsi des
informations cruciales concernant le cycle de vie des principales espèces pathogènes en France,
notamment de D. eres, à propos de laquelle peu d’informations sont disponibles.
La compréhension du cycle d’infection des noyers par les principales espèces
pathogènes pourrait aussi être approfondie par la mise en place de spore-trapping au sein des
vergers. Cette technique permet de capturer les spores transitant dans les vergers par le vent et
la pluie, et d’évaluer quelle est la charge en agents pathogènes, et quelles sont les espèces qui
semblent le plus présentes/le plus facilement transmises par la voie aérienne. Cette technique
est donc complémentaire à la mise en culture d’échantillons symptomatiques pour élucider le
cycle d’infection, et peut constituer un outil de prédiction des potentielles infections. L’étude
menée par Jiménez-Luna et al. (2022b) a permis de mettre en avant des différences dans la
composition du pathobiome d’amandiers et de noyers en fonction des conditions
météorologiques, de l’âge des vergers et du type de verger (amandiers et noyers) par association
d’une approche de spore-trapping et de mise en culture d’échantillons symptomatiques. Par
exemple, Urbez-Torres et al. (2010) ont mis en évidence que la dispersion des spores de
Botryosphaeriaceae était positivement corrélée avec les évènements pluvieux et l’irrigation, et
que la charge en spores était ainsi plus importante après le passage de précipitations dans les
vignobles de Californie, ce qui a également été démontré dans des vergers d’amandiers et de
noyers concernant les Botryosphaeriaceae et les Diaporthaceae (Jiménez Luna et al. 2022b).
L’analyse de la concentration sporale toute les 3 à 4 semaines dans une noyeraie en Californie
entre les mois d’avril et septembre a révélé une plus forte présence d’espèces de Phomopsis
(anamorphe de Diaporthe) au début de la saison (avril), et une absence presque totale dans les
mois suivants. A l’inverse, les spores des principaux genres pathogènes associés au
dépérissement en Californie (soit Botryosphaeria, Lasiodiplodia et Neofusicoccum) étaient
globalement présentes de manière équivalente durant chaque mois (Michailides et al. 2016).
Cette concentration moins importante de spores de Diaporthe en été pourrait être en lien avec

229
une plus faible prévalence de ce genre dans les brous que dans les rameaux symptomatiques,
résultats obtenus lors de ces travaux concernant l'espèce D. eres.

L’évaluation de l’effet des conditions météorologiques sur le développement et la

sévérité d’une maladie est complexe et implique de multiples facteurs pouvant présenter des
effets synergiques mais aussi antagonistes. Durant ces travaux, l’analyse des conditions
météorologiques a été réalisée sur la période d’avril à septembre, mois durant lesquels se
développent les fruits et les symptômes sur ces derniers. Il serait intéressant d’effectuer ces
analyses aussi sur la période de propagation des spores au sein des vergers, soit durant les
périodes humides et pluvieuses de septembre à avril. Des analyses en conditions contrôlées
pourraient aussi apporter des éléments supplémentaires quant aux facteurs impactant le plus le
développement des symptômes, tels que la réalisation d’inoculations/de co-inoculations sur
plants en pot et l’évaluation du développement des lésions nécrotiques à différentes
températures et humidité relatives. Cela pourrait ainsi permettre de générer des modèles de
prévision du risque en fonction des conditions climatiques.

De plus, la compréhension du cycle d’infection passe aussi par l’évaluation des

différentes structures reproductrices présentes dans les vergers. En Californie, des structures de
type pycnide ont été observées dans les noyeraies californiennes pour la majorité des espèces
de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe, conduisant à la formation de spores asexuées
(conidies), ainsi que des structures de reproduction sexuée (périthèces) de B. dothidea et de
D. foeniculina (Michailides et al. 2013). Actuellement, la recherche de ces structures dans les
noyeraies françaises n’a pas été effectuée, mais il semble indispensable de réaliser ces
recherches par la suite afin d’approfondir la compréhension du cycle d’infection des principales
espèces pathogènes dans le sud de la France.

Enfin, il serait intéressant de poursuivre l’étude des populations de B. dothidea et N.

parvum via l’isolement d’individus de ces deux espèces à partir d’autres vergers et cultures
étant des hôtes de ces espèces, ainsi qu’à partir de plantes non cultivées présentes autour des
noyeraies. Celles-ci peuvent en effet constituer un réservoir d’individus de ces espèces de par
leur diversité microbienne souvent supérieure à celle des espèces cultivées
(Campisano et al. 2015; Pérez-Jaramillo et al. 2018; Putra et al. 2015). En outre, la
comparaison des individus collectés de noyers en France avec des individus collectés du même
hôte en Espagne et en Italie pourrait aussi apporter des informations concernant l’introduction
de ces espèces, en particulier concernant B. dothidea.

230
2. Approfondir la contribution des membres du pathobiome dans le développement de la
maladie

Les tests de pathogénicité ayant été uniquement réalisés sur rameaux détachés en
conditions contrôlées, une meilleure évaluation de la pathogénicité pourrait être réalisée par la
mise en place de ces tests en vergers, aussi bien sur fruits que sur rameaux, dans les conditions
environnementales dans lesquelles se développent naturellement les symptômes. De plus, la
réalisation de tests de pathogénicité à l’aide d’une seule espèce ne rend pas compte de la
complexité de la maladie et de la diversité des espèces pathogènes impliquées, comme expliqué
dans la partie introductive de ce manuscrit. Ainsi, la réalisation de tests de pathogénicité à l’aide
d’inoculations conjointes de différentes combinaison d’espèces pourrait apporter des
informations primordiales concernant la sévérité des symptômes provoqués par différents
consortium d’espèces, mais aussi les interactions entre ces différentes espèces, tel que réalisé
pour D. eres, N. parvum et F. juglandicola durant ces travaux. La réalisation de ces tests à l’aide
de solution de spores, idéalement de faible concentration, permettrait aussi de se rapprocher des
conditions naturelles d’infection, contrairement aux inoculations réalisées à l’aide de plugs
mycéliens.

L’espèce F. juglandicola étant une espèce nouvellement décrite récemment, les seules
informations concernant sa potentielle pathogénicité sont les résultats obtenus durant ces
travaux concernant les rameaux de noyer. La pathogénicité pouvant aussi être partiellement
appréhendée à l’échelle moléculaire par l’étude des facteurs de pathogénicité, l’analyse de
génomes étant une étape supplémentaire et complémentaire aux précédentes. Cette
expérimentation est un projet que je souhaite mener prochainement au sein du LUBEM grâce
au séquençage du génome d’une souche F. juglandicola, préalablement caractérisée et
maintenue dans la collection UBOCC (Culture Collection de l’Université de Bretagne
Occidentale).

D’autres méthodes d’analyse pourraient être appliquées sur les échantillons, afin
d’obtenir une identification plus approfondie des espèces fongiques, telle que des analyses de
type métagénomique, ou encore obtenir des informations plus fonctionnelles concernant la
participation des différents agents dans le développement des symptômes, telles que des
analyses de type métatranscriptomique. Le couplage d’une analyse culture-dépendante,
métagénomique et métatranscriptomique concernant les communautés fongiques associées à
des échantillons symptomatiques de vigne a mis en avant une complémentarité entre ces trois

231
approches, bien que les deux dernières suggèrent une complexité d’espèces fongiques
supérieures à l’analyse culture-dépendante (Morales-Cruz et al. 2018). L’analyse du
transcriptome a révélé que les CAZymes (Carbohydrate-Active Enzymes) et les transporteurs
étaient globalement les fonctions associées à la pathogénicité les plus exprimées par tous les
agents pathogènes étudiés, résultats aussi obtenus par Nerva et al. (2022), mais avec des profils
d’expression variant en fonction des types de symptômes (Esca, Eutypiose et symptômes de
chancres sans symptômes foliaires). Ainsi, Morales-Cruz et al. (2018) sont parvenus à mettre
en avant que les différentes espèces associées à la même maladie semblaient exprimer des
fonctions de virulence similaires et à des niveaux d’expression comparables. L’étude menée
par Nerva et al. (2022) s’est intéressée à la comparaison d’échantillons de vigne présentant des
symptômes d’Esca et des échantillons d’apparence saine par une analyse de
métatranscriptomique. Ils n’ont pas seulement cherché à identifier et évaluer les profils
d’expression des espèces fongiques, mais se sont aussi intéressés à une fraction plus large du
phytomicrobiome par l’étude des bactéries et virus, et leurs profils d’expression dans le cas
d’échantillons symptomatiques. Les principales espèces pathogènes présentaient globalement
des profils d’expression similaires, soit une expression plus importante des gènes associés aux
transporteurs dans les échantillons symptomatiques, et des gènes associés aux CAZymes et au
métabolisme secondaire dans les échantillons asymptomatiques. L’espèce
Aureobasidium pullulans, espèce endophyte connue de la vigne, a présenté un profil
d’expression de CAZymes et de transporteurs particulièrement élevé dans les échantillons
symptomatiques, tandis que le niveau d’expression dans les échantillons asymptomatiques était
particulièrement faible. Ces résultats suggèrent une potentielle action d’A. pullulans, soit dans
le développement des symptômes, soit dans la lutte contre les agents pathogènes. Certaines
bactéries de la classe des Actinomycetes se sont avérées être plus présentes dans les échantillons
d’apparence saine que symptomatiques, suggérant la possibilité d’une action de lutte par ces
bactéries contre les agents pathogènes ou simplement, leur capacité à proliférer en l’absence
des pathogènes. Enfin, l’analyse du virome a révélé une richesse et une diversité de virus
significativement plus importante dans les échantillons symptomatiques, et notamment les virus
Botryosphaeria dothidea fusavirus 1 et Grapevine associated mitovirus 1, suggérant un impact
de l’état physiologique des plantes sur la composition du virome (Nerva et al. 2022). La
réalisation de telles analyses permettrait d’évaluer de manière plus approfondie le rôle des
différentes espèces pathogènes et des autres espèces du phytomicrobiome dans le
développement des symptômes de dépérissement. Ces résultats encouragent aussi fortement à
ne pas limiter l’analyse du pathobiome et du phytomicrobiome aux communautés fongiques,

232
mais aussi aux autres communautés microbiennes pouvant impacter le développement des
symptômes.

3. Explorer les interactions et le potentiel d’agents de biocontrôle

Ce projet de thèse a permis de mettre en évidence des corrélations positives ou négatives

entre différentes espèces du pathobiome, il serait intéressant de comprendre les mécanismes
impliqués dans ces interactions à l’aide d’expérimentations in vitro, telles que l’évaluation de
la compétition pour l'espace et les nutriments ainsi que de l’effet sur la germination des spores
ou encore l’étude des métabolites produits. Par la confrontation de suspensions de spores,
Agustí-Brisach et al. (2019) ont mis en avant une inhibition de la germination des spores de D.
rhusicola par la présence de spores de N. mediterraneum, pouvant partiellement expliquer le
développement de lésions nécrotiques moins importantes lors de co-inoculations simultanées
des deux espèces sur rameaux détachés.

Il semble important, au vu des dégâts causés par cette maladie, de trouver des solutions
pour limiter son développement et sa sévérité. La recherche de méthodes de lutte fait partie des
solutions envisagées, en particulier via la recherche d’agents de biocontrôle. Il peut être
intéressant dans un premier temps de pratiquer les essais à l’aide de certaines espèces déjà
identifiées comme potentiels agents de lutte de type biocontrôle, telles que Trichoderma spp. et
A. pullulans. Ensuite, l’analyse des communautés fongiques ayant mis en évidence de potentiels
taxons répresseurs, il serait important de tenter de les isoler, puis de tester leur capacité à limiter
le développement des agents pathogènes in vitro puis in planta. Par ailleurs, l’analyse des
communautés fongiques dans les échantillons asymptomatiques fait partie des étapes
permettant de renforcer l’identification de potentiels taxons répresseurs, du fait que leur
présence n’a pas permis le développement d’agents pathogènes par exemple. Dans le cadre de
ma thèse, l’analyse des données de séquençage métabarcoding n’a pas été possible dans ce type
d’échantillons. La réalisation de nouvelles campagnes de prélèvements permettrait d’obtenir
ces informations et de s’intéresser de manière plus approfondie aux différences dans la
composition du phytomicrobiome et du pathobiome entre des échantillons asymptomatiques et
symptomatiques.

Le projet MAGIC, présenté dans la partie introductive de ce manuscrit, a pour objectif

de poursuivre l’étude des communautés fongiques associées au dépérissement du noyer, et

233
permettra de réaliser une partie des expérimentations présentées dans ces perspectives. De
nouvelles campagnes de prélèvements sont programmées sur un plus grand nombre de
parcelles, dont celles échantillonnées pour la réalisation de ces travaux. L’évaluation de la
pathogénicité des principales espèces d’intérêt sera aussi réalisée sur fruits détachés et en
vergers. L’analyse de la charge en agents pathogènes par la mise en place de spore-trapping est
aussi un des objectifs de ce projet, de même que l’évaluation de la sensibilité des fruits aux
infections de Botryosphaeriaceae et de Diaporthe à différents stades phénologiques du fruit.
Enfin, l’évaluation de méthodes de lutte est aussi un axe de ce projet, par l’évaluation in vitro
et en vergers de l’efficacité de produits utilisables en agriculture biologique et de produits de
biocontrôle déjà homologués, ainsi que par la recherche de nouveaux candidats et leur
potentielle application en vergers. Certains isolats collectés durant ce projet de thèse pourront
faire l’objet de tests dans le cadre de cet axe de recherche, tels que A. pullulans, Epicoccum
nigrum, Trichoderma spp. et Trichothecium roseum.

 Conclusion générale

Ces travaux de thèse ont permis d’identifier les principales espèces pathogènes
associées à l’émergence du dépérissement du noyer en France ainsi que les principaux genres
composant le phytomicrobiome de rameaux et de fruits symptomatiques jusqu’alors peu
étudiés.
A travers cette étude, les résultats obtenus ont confirmé l’intérêt de recourir aux deux
approches culture-dépendante et -indépendante afin de décrire le plus précisément possible les
communautés fongiques associés au dépérissement du noyer. Par ailleurs, ces deux méthodes
se sont avérées efficaces pour mener une large étude des principales espèces pathogènes mais
aussi des autres espèces du phytomicrobiome, des interactions entre ces différentes espèces et
des facteurs pouvant influencer leur répartition.
Enfin, la collection d’isolats des espèces de B. dothidea et N. parvum a permis le
génotypage d’un large nombre d’individus pour mener à bien l’analyse de ces deux populations
dans les bassins de production nucicoles français et entamer le processus de compréhension de
leur émergence dans les noyeraies.

234
 ANNEXES

235
I. Annexe 1 - Revue publiée dans Pathogens

Belair, M., Grau, A. L., Chong, J., Tian, X., Luo, J., Guan, X., Pensec, F. Pathogenicity Factors
of Botryosphaeriaceae Associated with Grapevine Trunk Diseases: New Developments on
Their Action on Grapevine Defense Responses. Pathogens 2022, 11, 951. doi:
10.3390/pathogens11080951.

236
237
238
239
240
241
242
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244
245
246
247
248
249
250
VALORISATIONS SCIENTIFIQUES

251
252
Publications
Belair, M., Grau, A. L., Chong, J., Tian, X., Luo, J., Guan, X., Pensec, F. Pathogenicity Factors
of Botryosphaeriaceae Associated with Grapevine Trunk Diseases: New Developments on
Their Action on Grapevine Defense Responses. Pathogens 2022, 11, 951. doi:
10.3390/pathogens11080951.

Belair, M., Pensec, F., Jany, J.-L., Le Floch, G., Picot, A. Profiling Walnut Fungal Pathobiome
Associated with Walnut Dieback Using Community-Targeted DNA Metabarcoding. Plants
2023, 12, 2383. doi: 10.3390/plants12122383.

Publications en préparation

Belair, M., Picot, A., Masson, C., Hébrard, M.-N., Debled, M., Morvant, L., Henri-Sanvoisin,
A., Tréguer, S., Verhaeghe, A., Laloum, Y., Le Floch, G., Pensec, F. Etiology and epidemiology
of branch dieback and fruit blight and necrosis of English walnut associated with
Botryosphaeriaceae, Diaporthaceae, Glomerellaceae and Nectriaceae species in southern
France. Manuscript in preparation

Belair, M., Picot, A., Lepais, O., Masson, C., Hébrard, M.-N., Moronvalle, A., Comont, G.,
Gabri Martin, V. M., Tréguer, S. Laloum, Y., Corio-Costet, M.-F., Michailides, T. J., Le Floch,
G., Pensec, F. Genetic diversity and population structure of Botryosphaeria dothidea and
Neofusicoccum parvum on English walnut (Juglans regia L.) in France. Manuscript in
preparation

Publication technique

Laloum, Y., Verhaeghe, A., Moronvalle, A., Masson, C., Hébrard, M.-N., Picot, A., Pensec, F.,
Belair, M. Projet CARIBOU : Élancer la recherche pour cerner le dépérissement du noyer.
Infos CTIFL. 2022, 386, 48-58.

253
Communications orales

Belair M., Picot A., Masson C., Hébrard M.-N., Laloum Y., Verhaeghe A., Le Floch G., Pensec
F. Qui sont les responsables du dépérissement du noyer en France ? Webinaire de l’Institut
Brestois Santé-Agro-Matière, Plouzané, France, 5 octobre 2021.

Belair M., Picot A., Masson C., Hébrard M.-N., Laloum Y., Verhaeghe A., Le Floch G., Pensec
F. Qui sont les responsables du dépérissement du noyer en France ? Journées nationales des
maladies du bois de la vigne, Bezannes, France, 17 & 18 novembre 2021.

Belair M., Picot A., Masson C., Hébrard M.-N., Laloum Y., Verhaeghe A., Le Floch G., Pensec
F. Qui sont les responsables du dépérissement du noyer en France ? Journées Jean Chevaugeon,
13e Rencontres de Phytopathologie - Mycologie, Aussois, France, 12 - 16 septembre 2022.

Communications affichées

Belair M., Picot A., Masson C., Hébrard M.-N., Laloum Y., Verhaeghe A., Le Floch G., Pensec
F. Botryosphaeriaceae and Diaporthe species are the main species associated with walnut
dieback in France. Journées scientifiques de l’Ecole Doctorale EGAAL, Rennes, France, 30
juin & 1er juillet 2022. (poster)

Pensec F, Belair M., Masson C., Labour A., Lindé C., Le Floch G., Picot A. Occurrence of
Colletotrichum species, causal agents of anthracnose on walnuts, in France by cultural and
metabarcoding approaches during ripening. 16th European Conference on Fungal Genetics,
Innsbruck, Austria, 5-8 March 2023. (poster).

Belair M., Pensec F., Masson C., Hébrard M.-N., Morvant L., Tréguer S., Laloum Y.,
Verhaeghe A., Le Floch G., Picot A. Insights into the fungal pathobiome associated with walnut
dieback in France. 10th Congress of European Microbiologists - FEMS, Hamburg, Germany, 9
- 13 July 2023. (poster)

254
Belair M., Picot A., Lepais O., Masson C., Hébrard M.-N., Moronvalle A., Comont G., Gabri
Martin V. M., Tréguer S., Laloum Y., Corio-Costet M.-F., Michailides T. J., Le Floch G.,
Pensec F. Genetic structure and population diversity of Botryosphaeriaceae associated with
recent walnut dieback in France. 12th International Congress of Plant Pathology, Lyon, France,
20-25 August 2023. (poster)

255
256
257
258
259
260
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Titre : Les agents du dépérissement des noyers en France : écologie, diversité et cycle de vie

Mots clés : dépérissement du noyer, pathobiome fongique, génétique des populations

Résumé : Depuis 2015, les nuciculteurs B. dothidea, N. parvum, D. eres, F.

français font face une forte occurrence de juglandicola, C. godetiae et C. fioriniae.
symptômes jusqu’alors peu constatés, tels que Puis, les conditions météorologiques
des brûlures, nécroses et/ou décoloration sur favorisant leur présence ainsi que les
rameaux, jeunes pousses et/ou fruits. Décrits interactions entre ces espèces et avec
dans la littérature depuis le début des années d’autres espèces du phytomicrobiome ont
2000 en Californie, ces symptômes sont été décrites, montrant à la fois des
caractéristiques de la maladie du interactions compétitives, mettant en jeu N.
dépérissement du noyer et principalement parvum, et facilitatrices entre F. juglandicola
associés à des espèces de et D. eres. Dans un second temps, l’étude de
Botryosphaeriaceae, retrouvées en co- la diversité et de la structure des populations
occurrence avec des espèces de Diaporthe. des deux espèces pathogènes de
Afin de mieux comprendre l’étiologie et Botryosphaeriaceae à l’aide de marqueurs
l’épidémiologie de cette maladie, cette thèse microsatellites a mis en évidence leur mode
visait à étudier le pathobiome fongique français, de reproduction majoritairement clonal et
via une double approche culturale et par une différenciation géographique des
séquençage métabarcoding. Après avoir mis au populations de B. dothidea. L’exploration de
point une méthode d’analyse des échantillons l’origine de l’introduction de ces espèces sur
de noyers par séquençage métabarcoding, noyers a révélé une forte proximité
l’étude approfondie de brous et de rameaux de génétique avec des isolats provenant de
noyers a permis de mettre en évidence un vignes françaises, à la différence des
cortège de six principales espèces pathogènes: populations californiennes ou espagnoles.

Title : Walnut dieback pathogens in France : ecology, diversity and life cycle

Keywords : walnut dieback, fungal pathobiome, population genetic

Abstract : New unseen symptoms have B. dothidea, N. parvum, D. eres, F.

been frequently noticed in French walnut juglandicola, C. godetiae and C. fioriniae. The
orchards since 2015, i.e. twig, shoot and/or meteorological conditions favouring their
fruit blight, necrosis and/or wood presence and the interactions between these
discoloration. These symptoms, which have species and with other species of the
been described in the literature since the phytomicrobiome were then described,
early 2000s in California, are typical of showing both competitive interactions involving
walnut dieback disease and are mainly N. parvum, and facilitative interactions between
associated with Botryosphaeriaceae species, F. juglandicola and D. eres. Secondly, a study
often co-occurring with Diaporthe species. To of the diversity and population structure of the
gain better insight into the etiology and two pathogenic species of Botryosphaeriaceae
epidemiology of this disease, the aim of this using microsatellite markers highlighted a
PhD thesis was to explore the French fungal predominant clonal mode of reproduction and a
pathobiome based on a dual approach of geographical differentiation of B. dothidea
cultivation and metabarcoding sequencing. populations. Exploring the origin of the
After the development of a metabarcoding introduction of these species on walnut trees
approach applied to walnut samples, the in- revealed a strong genetic proximity with
depth study of walnut husks and twigs isolates form French vineyards, in contrast to
highlighted 6 main pathogenic species: Californian or Spanish populations.