Département: Biologie et Physiologie Animale Faculté: SNV Université: Sétif 1

CHAPITRE IV: METHODES DE SEPARATION

4. 1. Filtration

I) Définition de la séparation
La séparation est la purification de substances chimiques dans le but de décontaminer des
substances.
II) Les méthodes de séparation
Il existe plusieurs moyens de séparation.
2.1. La filtration
La filtration est une méthode mécanique utilisée pour séparer un solide d’un liquide en
faisant passer le mélange par une membrane ou un chiffon fin, par l’aide d’un entonnoir.
La filtration est un procédé de séparation permettant de séparer les constituants d’un
mélange qui possède une phase liquide et une phase solide au travers d’un milieu poreux. Le liquide
ayant subi la filtration se nomme filtrat, et ce que le filtre retient se nomme un résidu (aussi
communément appelé "gâteau" ou rétentat).
2.1.1. Principe de la filtration
La filtration est en principe un tamisage (une séparation d’après le diamètre des particules
solides de différentes tailles et aussi quelquefois de différentes compositions qui sont dispersées
dans le liquide). Une différence de pression force le liquide à passer à travers le filtre pendant que
les particules solides sont retenues à la surface.
La filtration est souvent accompagnée de deux phénomènes:
 Le colmatage: est provoqué par des particules qui se déposent à la surface du filtre mais
surtout par leur pénétration dans les interstices [petits espaces vides entre les parties du filtre]
de la matière filtrante. Ce colmatage modifie totalement la porosité et ralentie la filtration.
 L’adsorption: La matière filtrante possède une certaine charge électrique. Ainsi, certains
produits peuvent être retenus bien que leurs dimensions permettent leur passage à travers les
pores du filtre.
2.1.2. Matériel de filtration
[Link]. Les filtres
Ils sont variés et dépendent de la qualité et la quantité du matériel à filtrer.

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Il existe deux sortes de filtre, les filtres en profondeur (d’épaisseur ou épais) et les filtres de
surface (écran ou membrane). Ils peuvent être utilisés séparément ou ensemble, selon les besoins.
a) Filtres en profondeur
Ils sont constitués de substances fibreuses (papier, amiante, cellulose, coton, fibre de verre,
etc.) ou de substances agglomérées (verre fritté, sable, charbon, etc.). L’efficacité d’un filtre en
profondeur augmente avec son épaisseur par contre elle diminue lorsque la pression appliquée sur le
filtre augmente.
b) Filtres de surface
Les plus utilisées sont les membranes millipores. Ce sont des feuilles très minces constituées
de polymère de cellulose comportant un très grand nombre de pores rigoureusement calibrés. Les
dimensions de ces pores varient selon les filtres de 0.025 μm à 8 μm alors que l’épaisseur du filtre
est de 0.15 mm. Ces filtres résistent pendant 30 minutes au moins à la fois à des températures de
125 C° et à des pressions élevées. Ce qui permet leur stérilisation par l’autoclave.
NB: Les filtres doivent être inerte chimiquement et physiquement vis-à-vis du liquide à filtrer;
Insolubles et ne subissent aucun changement d’état physique (gonflement, rétrécissement,
distorsion).
[Link]. Les entonnoirs
Les entonnoirs sont des instruments de forme coniques destinés à recevoir le matériel
filtrant. On distingue deux types d’entonnoirs:
a) Les entonnoirs ordinaires: en verre, porcelaine ou en polycarbonate.
b) Les entonnoirs spéciaux: qui peuvent être en verre ou en porcelaine avec une plaque de fond
percée de trous, sur laquelle on dépose une rondelle de papier filtre qui recouvre exactement ce
fond. On distingue dans cette catégorie les entonnoirs de BUCHNER, lorsqu’on filtre des quantités
assez importantes de solide et les entonnoirs de HIRSCH, pour la récupération de petites quantités
de solide.
2.1.3. Les différents procédés de la filtration au laboratoire
On distingue différents procédés de filtration:
[Link]. Filtration par gravité
On utilise dans cette méthode un filtre et un récipient pour recevoir le filtre. Le dispositif le
plus simple de cette méthode est l’entonnoir simple équipé d’un papier filtre disposé sur un
erlenmeyer pour récupérer le filtrat. Ce type de filtration présente quelques inconvénients:
 Filtration assez lente.
 Difficulté de récupération de la phase solide isolée, surtout lorsqu’elle est peu abondante (elle
est dispersée sur une assez grande surface de papier filtre, auquel les grains collent).

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 Séparation incomplète: le solide retient une quantité non négligeable de liquide.

[Link]. Filtration sous vide
On augmente la vitesse de filtration en provoquant une dépression en aval du matériau
filtrant. Pour réaliser une filtration sous vide, on utilise des entonnoirs spéciaux que l’on adapte sur
une "fiole à succion", dans laquelle on crée une dépression. L’adaptation de l’entonnoir sur la fiole
se fait généralement par l’intermédiaire d’un cône en caoutchouc, qui "collera" à la fiole et
l’entonnoir lorsqu’on établira la dépression.
[Link]. Filtration sous pression
On augmente la vitesse de filtration en exerçant une pression sur le liquide à filtrer en amant
du matériel filtrant représenté par une membrane filtrante. Ce système de filtration sous pression
avec membranes filtrantes existe également sous forme de cartouches filtrantes (millipore)
adaptable sur une seringue pratique pour la filtration des petits volumes de solution à filtrer.

4. 2. Centrifugation
4. 2. 1. La centrifugation
La centrifugation est une technique permettant de séparer les composés d’un mélange en
fonction de leur densité en les soumettant à une force centrifuge. Le mélange à séparer peut être
constitué soit de deux phases liquides, soit de particules solides en suspension dans un fluide. C’est
une technique de séparation qui permet de récupérer un précipité (culot) et un surnageant.
4. 2. 2. Principe de la centrifugation
La centrifugation permet de séparer des constituants de taille et de masse très variables
contenus dans un liquide, depuis des molécules jusqu’à des cellules entières. Tous les constituants
contenus dans un échantillon sont soumis à la gravité, force qui s’exerce du haut vers le bas, et à la
poussée d’Archimède, force qui s’exerce du bas vers le haut.
4. 2. 3. Matériel de centrifugation
L’appareil utilisé pour la centrifugation est une machine tournante à grande vitesse appelée
centrifugeuse. La centrifugeuse est équipée d’un axe de rotation enfermé dans une enceinte.
Excepté pour les centrifugeuses de paillasse dont la vitesse de rotation et le temps typique
d’utilisation sont relativement limités, il est nécessaire d’empêcher l’échauffement des échantillons.
Pour cela, l’enceinte est réfrigérée et souvent soumise à un vide poussé pour éviter les frottements.
L’expérimentateur doit équilibrer les échantillons qu’il va centrifuger. Pour cela, il faut
équilibrer les tubes deux à deux, chaque couple de tubes devant être placé symétriquement par
rapport à l’axe de rotation.

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4. 2. 4. Type de centrifugeuses
La principale limite qui détermine la vitesse de rotation du rotor est évidemment la force du
moteur qui le fait tourner. Plus le rotor est lourd et volumineux, plus l’effort que doit fournir le
moteur est grand. Une gamme d’appareils a été développée en fonction des besoins expérimentaux,
particulièrement au niveau des accélérations requises, des volumes de matériel à centrifuger, de la
température de travail, etc.:
 Centrifugeuses de table: Les modèles les plus simples, souvent appelées centrifugeuses
cliniques, permettent d’atteindre de faibles accélérations (1000 à 3000 g) à des vitesses de
rotation relativement basses (moins de 3000 rpm). Certains modèles sont réfrigérés.
 Centrifugeuses au sol: Ces appareils sont un peu plus complexes. Elles permettent d’obtenir
des vitesses de rotation de l’ordre de 30 000 rpm, donnant pour les plus petits rotors des
accélérations d’environ 20 000 g. Tous les modèles sont réfrigérés. Ces centrifugeuses
permettent de centrifuger des volumes relativement gros. Certains rotors peuvent même
contenir quatre ou six bouteilles de 250 ml.
 Ultracentrifugeuses: Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent d’atteindre
des accélérations très élevées (jusqu’à 300 000 g) en faisant tourner des rotors très rapidement
(50-85 000 rpm). Tous les modèles sont réfrigérés. Les volumes sont quelques peu limités,
généralement on ne trouve pas de rotors pouvant contenir plus d’une dizaine de tubes de 40 ml.
 Microcentrifugeuses: Ce sont des centrifugeuses spécialement conçues pour les micro-
volumes très souvent employés en biochimie moderne. Les microtubes à centrifuger sont des
petits tubes coniques généralement de 1.5 ml fait de polypropylène. Les centrifugeuses de ce
type peuvent être réfrigérées et atteindre des accélérations de l’ordre de 12-15 000 g. Les
modèles les moins couteux n’ont pas de contrôle de vitesse et ne sont pas réfrigérés.
Selon l’axe de rotation, il existe trois catégories de machines à centrifuger:
 Les centrifugeuses à axe horizontal, appelées communément décanteurs centrifuges (avec un
bol cylindroconique qui tourne sur un axe horizontal et une vis disposée à l’intérieur du bol
permettant l’évacuation des sédiments).
 Les centrifugeuses à axe vertical, appelées communément clarificateurs ou séparateurs
centrifuges (avec un bol à assiettes ou à chambre qui tourne sur un axe vertical).
 Les centrifugeuses à axe oblique: La centrifugeuse satellitaire à axe oblique, fonctionne selon le
principe satellitaire générant un mouvement de rotation autour d’un axe horizontal composé
également avec un mouvement latéral (en 8). Les pièces à traiter sont mises en contact avec des
médias en céramique, porcelaine, plastique ou métallique ainsi qu’avec des additifs chimiques.

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4. 2. 5. Les types de centrifugation

Il existe deux principaux types de centrifugation.
a) La centrifugation différentielle
Dans ce type de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le plus
souvent à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante. Dans une première
centrifugation à faible accélération, les éléments les plus massifs vont sédimenter et former un culot
au fond du tube. Tous les autres éléments (pour lesquels l’accélération a été trop faible pour
contrebalancer les effets de l’agitation moléculaire, ou pour lesquels le temps de centrifugation a été
trop court) vont rester dans la fraction liquide appelée alors surnageant. On récupère alors
séparément le surnageant et le culot ce qui revient à avoir séparé les constituants qui les composent.
Cette méthode est par exemple couramment utilisée pour récupérer les éléments figurés (les
cellules) du sang qui sédimentent pour des accélérations très faibles (quelques dizaines de g).
Au besoin, on peut recommencer un second cycle de centrifugation avec le surnageant
précédent, mais avec une accélération plus importante.
Exemple: Isolement des organites cellulaires. Tout d’abord au cours d'une première centrifugation,
on isole les constituants les plus lourds. Puis, en augmentant la vitesse de sédimentation on sépare
les constituants de densité croissante.
Tableau. Valeurs indicatives des conditions de sédimentation de quelques constituants cellulaires.
Constituant cellulaire Conditions de sédimentation

Noyau 10 minutes à 500 g

Mitochondries, lysosomes, peroxysomes 10 minutes à 5000 g

Réticulum endoplasmique, appareil de Golgi 1 heure à 100000 g

Ces valeurs peuvent varier en fonction du matériel utilisé, la composition des membranes
pouvant en particulier modifier la densité des constituants. On constate que des constituants
différents sédimentent approximativement dans les mêmes conditions. Pour pouvoir les séparer il
faut d’autres méthodes.
b) La centrifugation en gradient de densité
On peut accentuer les méthodes de séparation en faisant la centrifugation dans un gradient
de densité. En effet, un des facteurs qui influence la vitesse de sédimentation est la différence entre

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la densité de la particule et celle du solvant. On peut donc moduler cette vitesse en faisant varier de
façon cette différence de densité en créant un gradient de densité.
 Si la densité de la particule est plus grande que celle du milieu, elle sédimentera. Plus la
différence de densité est grande plus la sédimentation est rapide.
 S’il n’y a aucune différence de densité, il n’y aura aucune sédimentation, quelle que soit
l’accélération.
 Si la particule est moins dense que celle du milieu, celle-ci s’élèvera dans le tube jusqu’à
atteindre un niveau de densité égal à la sienne ou jusqu’à flotter à la surface.
Pour obtenir des solutions de densités différentes, la méthode la plus classique est d’utiliser
des solutions de concentration croissante en saccharose, mais on utilise aussi du chlorure de césium.
Il existe deux types de gradients:
1. Les gradients discontinus
Ils sont constitués d’un empilement de solutions de moins en moins dense. Les différents
éléments s’accumulent aux interfaces entre les solutions de densité différentes. Au dessus, leur
densité étant plus élevée, ils migrent vers le bas, et au dessous, leur densité étant plus faible ils
migrent vers le haut. Il arrive de limiter le gradient à deux densités seulement avec une solution
inférieure très dense.
2. Les gradients continus
Ce sont des gradients pour lesquels la variation de densité est continue. Les différents
constituants vont alors migrer jusqu’à atteindre le point précis où leur densité est égale à celle du
solvant formant des bandes parfois visibles à l’œil nu.
Exemple de gradient discontinu Exemple de gradient continu

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Les gradients les plus utilisés sont:

A) Le saccharose (sucrose)
Il est très souvent employé. Il permet d’atteindre des densités assez élevées, de l’ordre de 1.3
g/ml avec du saccharose 2.5 M. Ce produit a l’avantage d’être peu coûteux, électriquement neutre et
plutôt inerte pour la plupart des fractions cellulaires.
B) Le chlorure de césium (CsCl)
Il est utilisé, particulièrement dans la séparation des acides nucléiques. Ce sel peut atteindre
une densité très élevée, de l’ordre de 1.9 g/ml à 7.5 M. Cette possibilité d’atteindre des densités si
élevées en solution aqueuse est son principal avantage. Son coût et le fait qu’il s’agisse d’un sel,
donc de molécules chargées, réduisent son champ d’application. D’autres sels de césium peuvent
aussi être employés comme le sulfate de césium (CsSO4).

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4. 3. La chromatographie
I) Définition
La chromatographie est une méthode de séparation des constituants présents dans des
mélanges variés. Elle sert en analyse pour identifier et quantifier des composés au sein
d’échantillons divers. Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui apparaissent
lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases non miscibles. En chromatographie, l’une,
dite stationnaire, est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support et l’autre, dite mobile,
se déplace au contact de la première. Si plusieurs composés sont présents, ils se trouvent entraînés à
des vitesses différentes, provoquant leur séparation.

Solvant: Eluant ou phase mobile

Mélange à séparer

Phase fixe ou stationnaire

Fig. Chromatographie d’élution sur colonne.

II) Le chromatogramme
Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps d’un
paramètre relié à la concentration instantanée du soluté en sortie de colonne.
III) Divers types de chromatographie
Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon le support de la phase
stationnaire:
- La chromatographie sur colonne (HPLC, CPG, et les colonnes de silice).
- La chromatographie sur surface (CCM, chromatographie sur papier).
La chromatographie sur colonne regroupe la chromatographie d’exclusion stérique, la
chromatographie d’affinité et la chromatographie échangeuse d’ions. La chromatographie sur
surface regroupe la chromatographie sur couches minces et la chromatographie sur papier.

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On peut aussi classer les divers types de chromatographie selon la nature de la phase mobile:
- La chromatographie en phase gazeuse (CPG).
- La chromatographie en phase liquide (CPL):
 Chromatographie sur couche mince (CCM).
 Chromatographie de partage centrifuge (CPC).
 Chromatographie liquide haute pression (ou performance) (HPLC).
Suivant le type de chromatographie, elle peut servir à identifier (CCM, HPLC, CPG),
séparer ou purifier les composés d’une réaction (chromatographie sur colonne, HPLC). Cette
technique peut également, grâce à un témoin, permettre de quantifier un produit (CPG, HPLC).
Le choix de l’une ou l’autre de ces techniques dépend de la nature des composés à séparer
et en fonction de celle-ci, le choix de la phase stationnaire que l’on utilise.
3. 1. Chromatographie sur colonne
C’est une méthode de séparation des constituants d’un mélange par migration dans un
dispositif constitué de deux phases: - La phase stationnaire: Un support solide.
- La phase mobile: Un solvant.
La colonne peut être en verre, en plastique ou en inox (forte pression), la dimension est
variable (5 cm-1 m). C’est le support qui porte la phase stationnaire (gel ou résine). A travers ce gel,
la phase mobile passe.
A) Principe
La phase mobile permet aux composés du soluté de se déplacer dans la colonne selon une
vitesse différente, en fonction de:
 L’affinité à la phase stationnaire (une substance qui a une affinité à la phase stationnaire, elle
sera fixée et donc le déplacement dans la colonne est très lent).
 La solubilité dans la phase mobile (une substance qui est très soluble dans la phase mobile, elle
déplace dans la colonne très vite).
Ce qui donne des vitesses de déplacement différentes, et ça permet la séparation des composés.
B) Equipement chromatographique
L’équipement de la chromatographie comporte les éléments suivants: Le soluté ou l’extrait
brut, la phase mobile, la colonne, la pompe, le détecteur, le collecteur de fractions et l’enregistreur.
 Le soluté ou l’extrait brut: Solution qui contient les différents constituants cellulaires qu’on
veut purifier.
 La phase stationnaire: c’est la phase fixe ou le gel (constituée de microbilles ou granules) se
trouve dans une colonne, ces granules:
- Peuvent être poreuse.

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- Portent une charge ionique.

- Portent un site d’affinité.

Fig. Les différents types de phase stationnaire.

 La phase mobile: C’est un liquide ou tampon qui passe et se déplace à travers la phase
stationnaire, en entraînant les constituants du soluté. Elle doit être soluble et ne doit pas
interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les constituants du soluté.
 La colonne: Elle peut être en verre, en plastique ou en inox (forte pression), de diverses
dimensions. C’est le support qui porte la phase stationnaire (gel ou résine). A travers ce gel, la
phase mobile passe.
 La pompe: Elle permet de régler le débit de la phase mobile à travers la colonne.
 Le détecteur: A la sortie de la colonne, les composés rencontrent un élément essentiel qui est
appelé le détecteur. Cet élément évalue la quantité de chacun des constituants séparés. Le
détecteur envoie un signal électronique vers un enregistreur.
 L’enregistreur: Il dessinera les pics en fonction de leur intensité. L’ensemble des pics est
appelé chromatogramme.
 Le collecteur de fractions: C’est un appareil qui permet de collecter les différentes fractions
du soluté (par exp. Une fraction de 2 ml/tube).
C) Mode opératoire
 Préparation du gel.
 Remplissage de la colonne.
 Equilibration de la colonne (tampon A).
 Injection de l’échantillon.
 Elution (tampon B).

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 Récupération des fractions.

 Analyse du chromatogramme.
 Régénération du gel (tampon de régénération).
3. 1. 1. Chromatographie d’exclusion stérique (filtration sur gel ou tamisage moléculaire)
C’est une méthode de chromatographie en phase liquide qui permet de séparer des
molécules en fonction de leur poids moléculaire et de leur forme. Suivant la nature des deux
phases en présence, elle est encore désignée par chromatographie sur gel perméable (GPC pour Gel
Permeation Chromatography) ou par filtration sur gel (GFC pour Gel Filtration Chromatography).
La phase fixe est un solide poreux dont la dimension des pores est voisine de celle de certaines
molécules à séparer. C’est une chromatographie dont la colonne est remplie d’un gel poreux. Les
grosses molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores sont exclues et donc élués en
premier. Les petites molécules et les molécules de taille moyenne sont éluées plus tardivement, elles
pénètrent dans les pores du gel (sont inclus dans le gel), leurs migration est donc retardée.

Fig. Tamisage moléculaire.

A) Les caractéristiques des gels

Les gels sont caractérisés par leur intervalle de séparation (limite de séparation), cet
intervalle est dicté par la porosité du gel. Ces gels sont caractérisés par:
 La porosité: Détermine le pouvoir filtrant (microporeux ou macroporeux).
 L’inertie chimique: Pas de pouvoir adsorbant vis-à-vis des solutés ni d’interaction avec la
phase mobile.
 La stabilité physico-chimique: Résistance à la température et à la pression.
 La granulométrie: La taille des granules du gel (10-120 µm: pour les particules plus ou
moins grosses, <40µm: particules fines).
 La forme: qui assure un écoulement uniforme de la phase mobile est la forme sphérique.
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 La nature: Les gels peuvent être en dextran, en polyachrylamide ou en agarose.

Fig. Chromatographie d’exclusion stérique.

B) Les applications
 Dessalage.
 Purification.
 Détermination du poids moléculaire.
Il existe une relation linéaire entre le logarithme de la masse moléculaire (PM) et le volume
d’élution: log PM = f (Ve).

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Le volume d’élution ou de rétention du soluté = volume de la phase mobile nécessaire pour

entraîner le soluté jusqu’à la sortie de la colonne. C’est le volume de la phase mobile qui s’est
écouler entre le moment de l’injection et celui correspondant au sommet du pic. VR = tR. D
D: C’est le débit de la phase mobile.
tR: C’est le temps de rétention d’un constituant retenu par la phase stationnaire. C’est le temps
écoulé entre l’injection et le moment où le constituant sort de la colonne.
3. 1. 2. Chromatographie sur échangeur d’ion
C’est une technique où la séparation est en fonction de la charge électrique. La phase
stationnaire est un échangeur d’ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés
négativement ou positivement, exerçant des interactions électrostatiques (ioniques) avec des
protéines ionisées.
Il s’agit d’une séparation des composés basée sur des interactions ioniques réversibles entre:
 Une phase stationnaire appelée échangeur d’ion.
 Des contres ions échangeables ou mobiles.
 Un soluté ou protéine chargé.
La phase stationnaire est constituée d’une matrice (résine ou gel) sur laquelle sont fixés des
groupements chargés.
La matrice insoluble porte des charges ioniques qui retiennent les molécules de charges
opposées. Les matrices généralement utilisées pour séparer des protéines sont le
DiEthylAminoEthyl Cellulose (DEAE-Cellulose) qui est chargé positivement (+) et la
CarboxyMéthyl Cellulose (CM-Cellulose) et la Phosphocellulose qui sont chargées négativement
(-). Le premier cas donne lieu à une chromatographie échangeuses d’anions. Le second cas
correspond à une chromatographie échangeuse de cations. Les échangeurs d’ions sont des
macromolécules insolubles portant des groupements ionisables ayant la propriété d’échanger de
façon réversible certains de leurs ions au contact d’autres ions provenant d’une solution.

Résine échangeuse Ions fixés Charges électriques résine

d’anions (-), exemple: DEAE-cellulose anions (-) positives (+)

de cations (+), exemple: CL-cellulose

cations (+)
négatives (-)

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La force d’association entre les molécules chargées et la matrice dépend de la force ionique
et du pH de la solution d’élution. Le passage sur la colonne d’une solution éluante, plus chargée que
la résine entre en compétition avec la résine. Ceci permet de décrocher les éléments fixés.
Ainsi, pour la chromatographie des acides aminés, ceux ci seront séparés en fonction de leur
charge électrique. Les élués (non fixés à la colonne) seront ceux de même charge que la résine.
Tandis que ceux de charge opposée seront fixés. Plus l’acide aminé a un pHi éloigné du pH du
milieu, plus il sera acide ou basique par rapport à celui-ci, donc d’autant plus chargé. Il sera le
premier à être élué ou fixé, s’il est ou n’est pas de même charge que la résine, respectivement.

Fig. Principe de la chromatographie échangeuse d’ion.

Fig. Les différents éléments nécessaires pour une chromatographie échangeuse d’ions.

A) Les différents types d’échangeurs

Il existe deux grands groupes de résines utilisées dans ce type de chromatographie:
1. Les résines échangeuses de cations dont la phase stationnaire possède des groupements
fonctionnels de nature anionique. Elles se classent en fonction de leur aptitude à l’ionisation en:
 Résines cationiques fortes: Résines sulfoniques (très fortement ionisées quelque soit le pH).
 Résines cationiques intermédiaires: Résines phosphoriques.
 Résines cationiques faibles: Résines carboxyliques (non ionisées en milieu acide fort).
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 Résines cationiques très faibles: Résines phénoliques (ionisées en milieu basique uniquement).
2. Les résines échangeuses d’anions dont la phase stationnaire possède des groupements
fonctionnels de nature cationique. Elles se classent en fonction de leur aptitude à l’ionisation en:
 Résines anioniques fortes (résines à amine quaternaire).
 Résines anioniques faibles (résine à amine secondaire).

Echangeurs cationique Echangeur anionique

B) Mode opératoire
1. Choix du gel.
2. Choix de la phase mobile.
3. Conditions de travail.
4. Remplissage de la colonne.
5. Equilibration de la colonne (fixation des contres ions).
6. Injection de l’échantillon (l’étape de fixation ou adsorption des protéines).
7. Elution (étape de désorption par la Fi ou pH).
8. Récupération des fractions.
9. Analyse du chromatogramme.
10. Régénération du gel.
L’élution est réalisée en modifiant le pH ou en augmentant la force ionique. Le pH influe sur
la charge nette de la protéine (caractère amphotère):
 Si le pH est supérieur au Pi: La protéine est chargée négativement; Pour éluer cette protéine, il
est nécessaire de diminuer le pH. La protéine sera chargée positivement, elle décrochera de la
résine.
 Si le pH est inférieur au Pi: La protéine est chargée positivement: Pour éluer cette protéine, il
est nécessaire d’augmenter le pH. La protéine sera chargée négativement, elle décrochera de la
résine.

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La force ionique exerce un effet de compétition (déplace la molécule fixée par un autre ion
qui est fortement chargé et de concentration plus élevée (exp. Cl-, HO-, Na+, H+...).
3. 1. 3. Chromatographie d’affinité
Elle est basée sur les interactions entre un ligand, lié par covalence à un support inerte qui
constitue la phase fixe et son partenaire d’affinité en solution. Le ligand est fixé sur une matrice
(résine) directement ou indirectement à l’aide d’un bras espaceur.

 La matrice ou la résine: Peut-être en dexran, en agarose ou en polyachrylamide. Ce sont des

particules uniformes. Elle permet la fixation chimique du ligand (directement ou
indirectement).
 Le bras espaceur: C’est une chaîne polycarbonnée (C6-C8) intercalée entre la matrice et le
ligand.
 Le ligand: C’est la molécule fonctionnelle, fixée directement ou indirectement sur la matrice.
Mode opératoire
1. Choix de la phase mobile.
2. Remplissage de la colonne.
3. Equilibration de la colonne.
4. Injection de l’échantillon.
5. Lavage de la colonne pour éliminer les substances non adsorbées.
6. Elution des substances adsorbée ou fixée:
 Elution non spécifique: C’est l’augmentation de la concentration en sels (Fi), ou le
changement de pH.
 Elution spécifique: L’utilisation d’un tampon d’élution qui contient un compétiteur «ligand
non fixé»
7. Récupération des fractions.
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8. Analyse du chromatogramme.
9. Régénération du gel.
La première opération consiste à préparer le gel d’affinité, en fixant le ligand sur le support.
Une colonne est remplie de ce gel d’affinité. On y fait passer la solution aqueuse contenant la
substance à purifier. Celle-ci est retenue, alors que les contaminants en solution passent librement.
Des lavages successifs permettent d’éliminer toute trace de produits indésirables. Enfin, on élue la
substance retenue en décomposant le complexe. Pour cela, en modifiant les conditions de milieu:
changement de pH, augmentation de la force ionique (élution non spécifique) ou on fait passer une
solution contenant un ligand libre ayant, pour la macromolécule retenue, plus d’affinité que le
ligand fixe (élution spécifique).
3. 1. 4. Autres types de chromatographie sur colonne
A. Chromatographie d’interaction hydrophobe
Le gel de chromatographie d’interactions hydrophobes porte un groupement hydrophobe tel
qu’un noyau phénol à l’extrémité d’une chaîne carbonée.
Dans la figure suivante, les parties hachurées représentent les régions de caractère
hydrophobe en surface de la protéine.

B. Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC)

Dans cette technique, l’échantillon est injecté dans une colonne remplie d’une phase
stationnaire de fine granulométrie (les "grains" sont de très petite taille 2-5 µm). Le débit
d’écoulement de la phase mobile est élevé (augmentation de la pression). Ce débit élevé diminue le
temps nécessaire pour séparer les composants. La fine granulométrie de la phase stationnaire permet
une meilleure séparation des composants. Les pics obtenus sont plus étroits donc la résolution est
améliorée (les pics sont bien séparés, on peut bien les différencier). La combinaison de la rapidité et
de la résolution élevées - conduit à l’appellation «haute performance».
C. Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

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La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique qui permet de séparer des
molécules d’un mélange très complexe. Elle s’applique principalement aux composés gazeux ou
susceptibles d’être volatils par chauffage. Elle est basée sur le partage de l’analyte entre une phase
gazeuse mobile et une phase liquide immobilisée sur la surface d’un support inerte.
3. 2. Chromatographie sur surface
3. 2. 1. Chromatographie sur couches minces
Elle est basée sur des phénomènes d’adsorption. La phase mobile ou l’éluant est un solvant
ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de
verre ou sur une feuille semi-rigide.
A) Principe
La CCM permet d’analyser l’avancement d’une réaction. Il existe différentes plaques CCM.
C’est un support solide déposé sur une grande surface plane (aluminium, verre, plastique) de façon
homogène. Elles peuvent être fabriquées au laboratoire, mais pour un usage analytique régulier, on
utilise des plaques commerciales (gel de silice 60 sur plaque d’aluminium). Lors du découpage des
plaques, il faut couper les angles et raboter légèrement les côtés pour ne pas avoir d’effet de bord.
La hauteur doit être suffisante pour avoir une bonne migration, environ 6 cm.
Avant d’effectuer le dépôt de produit sur la plaque, il est conseillé de tracer une ligne droite,
parallèle au bord inférieur et d’y placer les marques des futurs dépôts, espacés d’un minimum de 0.5
cm. Il faut ensuite identifier chacune de ces marques.
Le dépôt de produit doit être effectué de façon homogène à l’aide d’un capillaire sans
creuser le support solide. Il ne doit pas être trop concentré. Le dépôt se fait plus haut que la hauteur
du liquide de la cuve. Dans la mesure du possible, il faut déposer le brut réactionnel accompagné de
la matière première et/ou de la référence avec entre chaque, un mélange des deux.
La plaque est déposée dans un récipient en verre fermé contenant l’éluant (l’éluant ou le
solvant monte à travers la phase stationnaire) et un morceau de papier filtre pour avoir une
atmosphère saturée du solvant souhaité. Si l’atmosphère est homogène, elle se rapproche de la
concentration qu’il y a sur la colonne avec le solvant souhaité.
Chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du
solvant. Cette vitesse est en fonction de:
 L’affinité à la phase stationnaire.
 La solubilité dans la phase mobile.
Après migration, il doit rester 1 cm en haut de la plaque. Il convient alors de marquer la
limite de solvant de migration (front de solvant), de sécher la plaque et de la révéler.
B) Les principaux éléments d’une séparation par CCM

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 La cuve chromatographique: un récipient en verre, fermé par un couvercle étanche.

 La phase stationnaire: une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre.
 L’éluant (un solvant pur ou un mélange): il migre lentement le long de la plaque en entraînant
les composants de l’échantillon.
 L’échantillon: quelques microlitres.

Fig. Les principaux éléments de la séparation par CCM.

C) Révélation
Il y a plusieurs façons d’identifier les endroits où se trouvent les produits ainsi séparés:
 Les produits sont colorés, il n’y a rien de spécial à faire.
 Les produits sont fluorescents, on peut les identifier sous une lampe ultraviolette : en traçant les
contours des taches au crayon. Cela ne révèle que les produits absorbant la lumière UV à la
longueur d’onde utilisée, 254 nm le plus souvent. Ceci exclu un grand nombre de molécules
non aromatiques.
 Avec l’iode: On place la plaque séchée dans une enceinte renfermant des vapeurs d’iode. Dans
un bécher contenant des cristaux d’iode ou contenant un mélange de silice et d’iode. Les
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produits forment des taches brunes. L’iode peut être éliminé de la plaque en la chauffant
légèrement au pistolet thermique. Il est alors possible d’effectuer un autre test coloré.
 Sinon, il faudra utiliser un révélateur qui réagira chimiquement avec les produits (en les
détruisant) et dont le résultat sera coloré.
Il existe un grand nombre de révélateurs colorés utilisés en fonction de la nature des
composés à révéler. En règle générale, la plaque CCM est vaporisée ou trempée dans les solutions
et chauffée au pistolet thermique pour révéler les taches.
D) Les révélateurs les plus utilisés et leur mode de préparation
 Le dichromate de potassium/acide sulfurique (mélange sulfochromique): est un réactif
universel des composés organiques. Cette technique permet de carboniser tous les composés
organiques. La solution est composée de 5 g de dichromate de potassium dans 100 ml d’acide
sulfurique concentré.
 L’acide phosphomolybdique: est utilisé pour la détection de composés réducteurs, par
exemple alcools, acides biliaires, lipides, acides gras et stéroïdes. Une solution est faite avec
250 mg d’acide phosphomolybdique dans 50 ml d’éthanol. Le traitement aux vapeurs
d’ammoniaque permet d’obtenir un fond de plaque incolore. Le réactif est stable pendant une
dizaine de jours.
 La solution de vanilline: est un réactif pour la détection d’un grand nombre de fonctions. Elle
est constituée par 8.6 g de vanilline dans 250 ml d’éthanol absolu et 2.5 ml d’acide sulfurique
concentré.
 La solution d’anisaldéhyde: permet de révéler diverses fonctions surtout oxydées. Elle est
préparée avec 10 ml de para-anisaldéhyde dans 180 ml d’éthanol absolu et 10 ml d’acide
sulfurique concentré.
 Le réactif de Dragendorff: sert pour la détection des composés azotés, des alcaloïdes, des
surfactants…etc. Il est nécessaire de préparer trois solutions. La première est composée de 0.85
g de nitrate de bismuth basique et 10 g d’acide tartrique dans 40 ml d’eau, la seconde de 16 g
d’iodure de potassium dans 40 ml d’eau et la dernière de 10 g d’acide tartrique dans 50 ml
d’eau. Il faut tout d’abord mélanger les deux premières solutions, puis mélanger la troisième
solution avec 5 ml de la solution précédente.
 Le réactif de la ninhydrine: sert pour la détection des acides aminés, d’amines, de sucres
aminés. Une solution est faite avec 0.2 g de ninhydrine dans 100 ml d’éthanol.
 Le phtalate d’aniline: est un réactif à vaporiser pour la détection de sucres réducteurs,
d’oxoacides et d’halogènes. Les taches des différentes substances présentent différentes

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couleurs sur un fond incolore dans la plupart des cas. La solution est constituée de 0.93 g
d’aniline et de 1.66 g d’acide phtalique dans 100 ml de butan-1-ol.
E) Le rapport frontal
Pour l’évaluation qualitative, le paramètre le plus utilisé est le rapport au front R f (distance
parcourue de migration) ou encore sa valeur multipliée par 100, notée h Rf. La valeur de Rf est
définie par la relation: Rf = distance parcourue par l’échantillon / distance parcourue par le solvant
Les valeurs de Rf sont donc comprises entre 0 et 1 et de préférence entre 0.1 et 0.8 (h R f
entre 10 et 80).
Remarque: Ce n’est pas parce qu’il y a une seule tache qu’il y a un seul produit. Pour vérifier, il
est possible de changer les polarités des éluants pour bien séparer les produits. On peut faire une
plaque bidimensionnelle, c’est-à-dire de faire une CCM avec un premier système de solvants, puis
une seconde avec le même système de solvants ou un second système différent de solvants dans
une direction perpendiculaire à la première.
3. 2. 2. Chromatographie sur papier
C’est une technique de chromatographie en phase liquide. Pour effectuer une telle
séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d’une bande
de papier de chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par le papier; ce qui signifie que les
molécules interagissent avec ce dernier et qu’elles auront tendance à rester au même endroit. Le
papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un mélange eau/éthanol et placé dans un
récipient fermé. Pendant que le solvant monte le long du papier par capillarité, il rencontre
l’échantillon et l’entraîne. Les différentes substances constituant l’échantillon migrent à différentes
vitesses selon qu’elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier.

Fig. Chromatographie sur papier.

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La chromatographie sur papier demande un certain temps (généralement plusieurs heures).

Une fois l’opération terminée, généralement quand le front de solvant est presque arrivé en haut du
papier, le papier est retiré de la cuve et on laisse évaporer le solvant. Le résultat est appelé
chromatogramme.
Le chromatogramme est utilisé pour comparaison avec d’autres analyses effectuées sur des
substances connues et prises dans des conditions identiques, pour identifier les substances de
l’échantillon. Les substances peuvent être identifiées en calculant la valeur R f qui peut être
comparée à celles se trouvant dans les tables. Il y a plusieurs façons d’identifier les endroits où se
trouvent les produits ainsi séparés:
1. Les produits sont colorés, il n’y a rien de spécial à faire.
2. Les produits sont fluorescents, on peut les identifier sous une lampe ultraviolette.
3. Sinon, il faudra utiliser un révélateur qui réagira chimiquement avec les produits (en les
détruisant) et dont le résultat sera coloré.
Pour séparer des mélanges complexes de substances similaires, il peut être utile d’employer
la chromatographie à deux dimensions. Celle-ci s’effectue en deux étapes entre lesquelles on
change de solvant et on tourne le papier de 90°. Les interactions développées par le nouveau solvant
seront différentes, ce qui modifiera la séparation dans cette deuxième dimension et permettra une
meilleure séparation globale.
La chromatographie sur papier peut aussi constituer une technique micro-préparative: pour
récupérer les produits ainsi séparés, les portions du papier où ils se situent sont découpées et
redissoutes ensuite. Les quantités récupérables sont de l’ordre du milligramme ou moins.

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4. 4. L’électrophorèse
C’est une des nombreuses techniques de séparation et d’analyse de particules chargées par
migration différentielles sous l’action d’un champ électrique.
Des particules chargées sont donc placées dans un champ électrique créé par une tension
continue et se déplacent vers le pôle de signe opposé à leur charge à une vitesse proportionnelle à
cette charge. Si on dépose une espèce anionique (chargée négativement), elle migrera vers l’anode
(+) et une espèce cationique (chargée positivement) du côté de la cathode (-).
Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le support de ce champ
est constitué par un tampon de pH dont les ions conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce
support peut être liquide: on parle alors d’électrophorèse en veine liquide. Dans une large majorité
des cas, on utilise un support poreux stabilisant la phase liquide: on parle alors d’électrophorèse sur
support ou d’électrophorèse de zones. Le mélange à séparer est déposé sur un support poreux
imprégné de tampon. Ce support peut être du papier, un dérivé de cellulose, de l’amidon, de
l’agarose, du polyacrylamide (PAGE)…etc. Le support doit être homogène et inerte.
Les particules à séparer par électrophorèse peuvent être de nature et de taille très différentes:
des composés organiques ou minéraux, de la taille d’une cellule ou de celle d’un ion. Cette méthode
est souvent utilisée pour séparer des acides nucléiques, des petits peptides ou des protéines.
Elle peut être en des conditions non dénaturantes ou en des conditions dénaturantes (SDS-
PAGE).
Electrophorèse en des conditions non Electrophorèse en des conditions dénaturantes
dénaturantes (SDS-PAGE)
- Les molécules sont séparées dans leur état - Les molécules sont soumises à un
le plus proche possible de leur état natif. traitement dénaturant avant la séparation
- La vitesse de migration dépendra de: électrophorétique, détruisant la structure
 La charge native de la molécule. tridimensionnelle native.
 La structure tridimensionnelle. - La séparation est fonction du PM.
- Les agents de dénaturation: SDS (sodium
dodécyl sulfate) et β-mercaptoéthanol.

A) Appareillage d’électrophorèse
 Générateur du courant.
 Cuve d’électrophorèse (horizontale ou verticale).
 Accessoires (support de polymérisation + peigne).

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Fig. Appareillage d’électrophorèse.

B) Mode opératoire
 Préparation du gel de concentration et du gel de séparation.
 Le gel de séparation est coulé entre des plaques de verre fixées sur un support suivi par le gel
de concentration, un peigne est déposé entre ces plaques.
 Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant des puits.
 Dépôt de l’échantillon et des marqueurs de PM dans les puits.
 Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont placées dans une cuve d’électrophorèse.
 Remplissage de la cuve avec le tampon de migration.
 Mise en marche du générateur de courant.
 Enlèvement du gel à partir des plaques à la fin de la migration.
 Coloration puis décoloration.
 Analyse du gel.
 Préparation du gel
Deux gels peuvent être préparés: gel de séparation (des pores sérés) et gel de concentration
(des pores lâches). En fonction du taux de l’acrylamide, de bis-acrylamide, du TEMED et du
persulfate d’ammonium, la porosité du gel varie. Le gel de polyacrylamide est un gel réticulé
(poreux), obtenu par polymérisation d’acrylamide qui forme des chaînes et de bis-acrylamide qui
ponte les chaînes d’acrylamide. Le persulfate et le TEMED catalysent la réaction de polymérisation.

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Fig. Le gel de polyacrylamide.

Plus le pourcentage d’acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est élevée et les
mailles du réseau sont serrées. En conséquence: plus le pourcentage d’acrylamide est élevé, moins
les molécules volumineuses peuvent migrer. Plus le poids moléculaire de la protéine est élevé, plus
la migration est lente.
 Le gel de séparation et le gel de concentration
Les gels de séparation permettent la séparation de la solution protéique. Le gel de
concentration est coulé en haut du gel de séparation pour permettre une entrée homogène de
l’échantillon dans le gel de séparation.

 Solution (échantillon): Un mélange de protéines est bouilli en présence de:

 β-mercaptoéthanol (réduction des ponts disulfure).
 Sodium dodécyl sulfate (SDS).
 Glycérol (sert à augmenter la densité du soluté et son maintient dans les puits).
 Bleu de bromophénol (suivre la migration depuis le début jusqu’à la fin).
En conséquence:
 Les protéines sont dénaturées: elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native.
 Les protéines n’ont plus de ponts disulfures: elles sont sous une forme monomérique.
 Les marqueurs de PM: Une solution qui contient des protéines standards de poids moléculaire
connue est appelée marqueurs de poids moléculaire.

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 Tampon de migration: Le tampon de migration contient des électrolytes qui sont responsables
du transport du courant électrique (conducteur). Si la concentration de ces électrolytes est
faible, la totalité du courant est transportée par le soluté et une faible proportion est transportée
par les électrolytes, ce qui entraine la migration des protéines et donc la séparation. Le tampon
d’électrophorèse est constitué de glycine qui joue le rôle de conducteur de courant.
 Coloration: Après migration, le gel est démoulé. Les protéines sont révélées par une coloration
(par exemple avec le bleu de Coomassie).
 Décoloration: Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui contient du méthanol
et de l’acide acétique.
C) Applications
 Vérification de la pureté d’une fraction chromatographique.
 Détermination du poids moléculaire d’une protéine: Le poids moléculaire des protéines est
déterminé à l’aide de marqueurs qui sont des protéines standards de poids moléculaire connu.
Il faut déterminer: Rapport frontal (Rf)=distance de migration d’un composé/ front de
migration (fm) puis tracer la droite: log (PM) = f (Rapport frontal) qui permet de déterminer le
poids moléculaire d’une protéine inconnue.

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Autres types d’électrophorèse

Il existe d’autres types d’électrophorèse:
 Electrophorèse bidimensionnelle.
 Focalisation isoélectrique (Isoélectrofocalisation: IEF, électrophorèse dans un gradient de
pH).
 Electrophorèse en champ pulsé.
 Immuno-électrophorèse (pour la détection d’une interaction antigène-anticorps).
1. Electrophorèse bidimensionnelle
C’est un type d’électrophorèse utilisée pour analyser des protéines. La séparation peut se
faire en fonction du pI (IEF) et de la masse moléculaire. Il s’agit donc de la combinaison d’une IEF,
qui sépare selon le pI, suivie d’une électrophorèse SDS-PAGE, séparant selon le poids moléculaire.
Elle permet en général, de visualiser et de comparer entre 500 et 1500 spots (Selon les espèces, le
tissu et la méthode de coloration).

1. Dans un premier temps, on sépare donc le mélange selon le pI dans un gel cylindrique.
Ensuite on récupère le cylindre de gel.
2. On dépose ensuite cette bande horizontalement sur un autre gel. L’électrophorèse permettant
une séparation selon le poids moléculaire.
2. Isoélectrofocalisation (IEF)
C’est une méthode permettant de séparer des protéines qui ne diffèrent que par une seule
charge. Elle est utilisée notamment lors de l’électrophorèse bidimensionnelle, après avoir séparé les
protéines en fonction de leur charge électrique globale dans un gradient de pH en absence de
laurylsulfate de sodium (solvant conférant aux protéines une charge négative).

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C’est une électrophorèse où on établie un gradient de pH en utilisant des ampholytes

(molécules amphotères introduites lors de la préparation du gel). Ces ampholytes peuvent balayer
un domaine de pH (gamme large: 3-10, gamme étroite:4-5 ou 5-6.5):
 On peut créer un tel gradient de pH avec des ampholytes portant un certains nombre de
groupes ionisables positivement ou négativement (amines, carboxyles ou sulfates).
 Si on soumet ces ampholytes à un champ électrique, ils migreront et se distribueront par
ordre de pI (un gradient continu de pH).
 L’échantillon protéique est déposé dans un large puits au centre du gel. Les protéines
migreront dans une direction ou dans l’autre jusqu’à ce qu’elles rencontrent leur point
isoélectrique, point où elles cessent de migrer.

L’échantillon protéique est déposé dans un large puits au centre du gel. Les protéines
migreront dans une direction ou dans l’autre jusqu’à ce qu’elles rencontrent leur point isoélectrique,
point où elles cessent de migrer.
Mode opératoire
1. Préparation du gel de polyacrylamide 6 % (de forte porosité pour que la taille n’influence
pas la migration).
2. Le gel de séparation est coulé entre des plaques de verre fixées sur un support.
3. Déposer l’échantillon et les marqueurs de pI.
4. Le gel polymérisé est placé dans une cuve de séparation.
5. Mettre en marche le générateur de courant (les protéines sont plus grosses que les
ampholytes, elles migreront beaucoup plus lentement).
6. A la fin de migration, enlever le gel à partir des plaques.

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7. Avant la coloration, il faut éliminer les ampholytes car elles peuvent se colorer en mettant le
gel dans une solution de lavage.
8. Faire une coloration ensuite une décoloration.
9. Analyse du gel.
Détermination du pI: Le pI est déterminé en utilisant des témoins avec pI standards connues puis
on trace la courbe: pI témoin=f(Rf).

3. Electrophorèse en champ pulsé

Elle a été développée par Schwartz et Cantor en 1984 afin de séparer les grandes molécules
d’ADN (> 50 kb) que l’électrophorèse classique en gel d’agarose ne permet pas de résoudre, même
en diminuant au maximum la concentration d’agarose (en dessous de 0.4 %, les gels sont
impossibles à manipuler). La porosité d’un gel d’agarose classique est inférieure au micron alors
que la longueur d’une molécule d’ADN de 50 kb complètement étirée est d’environ 18 microns.
Elle consiste à alterner l’orientation du champ électrique au cours du temps. Chaque changement de
champ électrique réoriente la molécule d’ADN dans le gel augmentant ainsi la probabilité que la
molécule d’ADN soit orientée de façon à passer à travers les mailles du gel. Cette probabilité
dépend de la taille de la molécule. La vitesse de migration d’un fragment d’ADN dans le gel varie
dans le sens inverse de sa taille. Elle permet ainsi de séparer des fragments d’ADN d’une taille
allant de moins de 1 kb à une dizaine de mégabases.
4. Immunoélectrophorèse
C’est une méthode de séparation et d’identification des protéines de l’organisme par
électrophorèse (déplacement de particules chargées sous l’effet d’un champ électrique) puis par
diffusion d’un sérum dont les anticorps forment un précipité avec les antigènes dont ils sont
spécifiques. Elle permet la mise en évidence et le typage des immunoglobulines monoclonales.
Immunoélectrophorèse de Grabar et Williams
Les étapes sont les suivantes:
1. Une lame de microscope est recouverte d’agarose et percée de deux puits.

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2. Des protéines sont séparées grâce à un courant électrique (ex: électrophorèse de sérum
humain).
3. Une gouttière est découpée au milieu de la lame.
4. L’anti-sérum polyclonal animal (anti-sérum humain) reconnaissant pratiquement toutes les
protéines du sérum humain est versé dans la gouttière.
Après diffusion, différents arcs de précipitation qui peuvent être colorés et comparés sont obtenus.
La même chose peut être faite avec un seul anticorps. Cette technique est surtout appliquée dans
l’analyse des liquides biologiques: Liquide céphalorachidien (LCR), urine, sérum, plasma… etc.

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