Méthodes d’étude des Biofilms

Méthodes d’étude des Biofilms

• l’étude de biofilms par le développement d’approches innovantes sur le plan expérimental en utilisant des outils
adaptés,

• Le choix de la méthode à utiliser doit tenir compte de la problématique posée, de la relevance du modèle, de la
facilité ou encore de son coût.

I. Formation de biofilm sur microplaques

• La formation de biofilm en microplaque est la méthode la plus utilisée.

 • Selon le protocole adéquat, la quantification du biofilm se fait alors sur l’anneau formé sur le bord des puits.

• Généralement, les microorganismes sessiles adhérés aux puits sont mises en évidence par coloration.

• La quantification du biofilm formé se fait par simple lecture d’absorbance.

Formation des biofilms sur microplaques
 Choisir la plateforme expérimentale (support) pour la formation
des biofilms détermine quel type de données pouvons nous avoir
La microplaque

• La formation de biofilm dans les microplaques est la méthode la plus

couramment utilisée

• Les puits sont vidés et lavés pour éliminer les cellules planctoniques avant
de colorer la biomasse attaché à la surface des puits.
Dispositif de biofilm Calgary
• Le biofilm formé sur les piquets ne résultent pas de la sédimentation cellulaire mais
seulement de l’attachement des cellules sessile.

• Dans ce système, la quantification de la biomasse implique généralement la

récupération de cellules bactériennes des piquets par sonication, qui a certaines
limites
Biofilm Ring Test

Une méthode conçue spécifiquement pour

étudier les premiers stades de développement
du biofilm

basé sur la capacité des bactéries à immobiliser

les microbilles lors de la formation d'un biofilm
à la surface

Plus il y a de biofilm, moins les billes peuvent

bouger lorsqu'un champ magnétique est
appliqué .
Robbins device

• L'appareil Robbins est basé sur la conception de Jim Robbins et Bill McCoy, et plus tard
breveté dans une version révisée par la Shell Oil Company (Salanitro & Hokanson,
1990).

• Il se compose d'un tuyau avec plusieurs trous filetés où des coupons sont montés à
l'extrémité de vis placées dans le flux de liquide .

• Les coupons sont alignés parallèlement au flux de fluide et peuvent être retirés
indépendamment.

• L'appareil Robbins original a été utilisé pour surveiller la formation de biofilm sous
différentes vitesses de fluide dans une installation d'eau potable simulée .
• Cela a ensuite été adapté pour être utilisé dans des expériences de laboratoire à plus
petite échelle et est devenu un système modèle établi pour étudier divers aspects de
la formation de biofilm dans des conditions contrôlées .
Drip flow biofilm reactor

• Le réacteur à biofilm goutte à goutte a été développé par Darla Goeres et ses collègues du
Center for Biofilm Engineering, Montana State University (Goeres et al., 2009).

• Le réacteur à biofilm goutte à goutte actuel consiste en un dispositif à quatre chambres

parallèles avec des couvercles ventilés .

• Chaque chambre contient un coupon (par exemple une lame de microscope standard) où
le biofilm peut se former.

• Le milieu de croissance microbienne ou la suspension cellulaire entre dans chaque

chambre par une aiguille de jauge
 • . Pendant le fonctionnement, le réacteur s'incline 10 par rapport à l'horizontale et le fluide

traverse la longueur des coupons

Rotary biofilm reactors

 Le réacteur à biofilm rotatif (RBR) consiste en une série
de disques circulaires montés sur un arbre horizontal.
Lors de la fermentation, le micro-organisme forme un
biofilm sur les disques en rotation, qui sont à moitié
immergés dans le milieu.
Ces réacteurs utilisent des surfaces de coupons
récupérables où les biofilms se développent et
permettent une vaste gamme d'analyses chimiques et
biochimiques ainsi que l'observation microscopique des
biofilms
Le réacteur a été utilisé avec succès pour simuler des
biofilms qui se produisent dans les systèmes d'eau potable,
les écosystèmes fluviaux, les coques de navires Chambres
d'écoulement
• L'utilisation de chambres d'écoulement permet une étude microscopique directe de la
formation de biofilm.

• Les biofilms dans les chambres à circulation se développent dans des conditions
hydrodynamiques, et l'environnement peut être soigneusement contrôlé et
facilement modifié.
Biofilm microfluidic devices

Les canaux microfluidiques peuvent être conçus pour élucider les effets combinés de plusieurs
facteurs d'influence sur la formation de biofilm. Et développer des formules mathématiques
Dispositif Application Avantages Limitations

Microplaques Etude de la capacité de • Peu coûteux • Le cellules faiblement

formation de biofilm • Pas besoin attaché peuvent être
Tester des composés anti- d'équipement de pointe détaché pendant le
biofilm en dehors du lecteur de lavage
plaque • Sensible à la
• Possibilité de sédimentation
microscopique • Épuisement de
nutriments
• Inspection directe
difficile
• Etude à court terme
• Interférence liquide-air-
contamination
• Reproductibilité parfois
médiocre
• Évaluation possible
uniquement à une
densité cellulaire
suffisamment élevée
• Ne convient pas pour
Microscopy Techniques Applied to Biofilm Imaging

• Les microscopes optiques ont bénéficié des avancées technologiques en

matière notamment de fabrication de lentilles afin de repousser toujours plus
loin les limites de l’observation à petite échelle.

• L’observation directe des objets grâce à la lumière fait la force principale de la

microscopie optique, mais c’est également sa plus grande faiblesse.

• À l’échelle où les objets atteignent une taille proche de la longueur d’onde de la

lumière incidente apparaissent des phénomènes de diffraction qui rendent
l’observation de détails de moins de quelques centaines de nanomètres difficile.
2.1. Light Microscopy (LM)

• La microscopie optique est une technique d'imagerie de base qui est utile pour fournir le
identification visuelle de la présence de biofilm et a également une valeur pronostique
significative.

• Il peut être utilisé pour l'évaluation quantitative de la biomasse du biofilm, étant facile et peu
coûteux à effectuer .

• Cependant, la microscopie optique a un grossissement et une résolution limités, elle ne peut

donc pas être appliquée pour décrire les détails les plus fins de la morphologie cellulaire du
biofilm.

2.2. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) permet l'évaluation quantitative des
paramètres structuraux comme le biovolume (volume global des cellules dans le champ
d'observation), épaisseur et rugosité.

• Dans un microscope confocal à balayage laser (CLSM), la lumière émise par les
régions de l'objet autres que le plan focal est éliminée grâce à un diaphragme
(pinhole) placé sur le trajet optique.

• Cette technique permet ainsi de réaliser des coupes optiques à travers les objets
examinés.

L'analyse du biofilm CLSM a des limites le signal de l'intérêt pourrait être caché par
l'interférence de la fluorescence intrinsèque du biofilm avec celle de l'enquête.
Le CLSM offre plusieurs avantages :
 (1) amélioration de la résolution latérale et axiale,

(2) visualisation simultanée deplusieurs techniques

d'observation, fluorescence, réflexion, transmission,

(3)observation simultanée de double ou triple marquage,

(4)acquisition de coupes optiques sériées permettant des

reconstructions en trois dimensions et une analyse
quantitative.

2.3. Atomic Force Microscopy (AFM)

L’AFM permet d'analyser une surface point par point grâce à un balayage par une
sonde constituée d’une pointe fine, ce qui constitue sa différence principale avec
les microscopes usuels et en fait un outil remarquable pour l’observation d’objets à
très petite échelle.

L’AFM permet d'analyser une surface point par point grâce à un balayage par
une sonde. Cette dernière est constituée d’une pointe très fine, positionnée à
l'extrémité d'un micro-levier flexible.

Ce type de microscopie fonctionne en mesurant l'interaction attractive ou

répulsive entre les atomes constituant la pointe nanométrique et les atomes
surfaciques d'un échantillon.
 3. Scanning Electron Microscopy Techniques Applied to Biofilm Study

• Pour la visualisation des biofilms microbiens dans leurs moindres détails la

microscopie électronique est incontournable.

• Cependant, la préparation des échantillons les protocoles, la sélection des

instruments et les paramètres d'acquisition doivent être finement réglés et
personnalisé à l'échantillon spécifique.

Ce qui suit sont les techniques de la microscopie électronique utilisées dans l'étude
• des biofilms :
3.1. Conventional Scanning Electron Microscope (SEM) Field emission scanning electron
microscopy (FE-SEM)
• Les méthodes SEM et FESEM conventionnelles sont les meilleures pour la visualisation de biofilms si
un grossissement élevé et des images à haute résolution sont nécessaires pour décrire avec précision
l a morphologie du biofilm

• Les avantages incontestés de SEM et FESEM consistent en la capacité combinée l'image • avec une
large gamme d'agrandissements (20 à 30 000) couplés à une haute résolution (de 50 à 100 nm) et la
profondeur de champ.

• Le logiciel d'analyse d'images 3D permet l'extraction de données et la quantification de résultats

morphologiques détaillés.

• Inconvénients : Déshydratation et revêtement avec un matériau conducteur

• Cela peut provoquer un effondrement de l'Eps et un rétrécissement global du biofilm

• Les limitations SEM et FESEM classiques peuvent être surmontées en utilisant des protocoles
hautement adaptés pour le biofilm ou en utilisant des modalités de SEM alt ernatives telles que VP-
SEM, cryo-SEM et Environmental-SEM (ESEM)
3.1. Conventional Scanning Electron Microscope (SEM)

La microscopie électronique à balayage (SEM) fournit des informations

topographiques et élémentaires à des grossissements utiles de 10x à 100
000x,

La microscopie électronique à balayage à émission de champ (FESEM)

fournit des informations topographiques et élémentaires à des
grossissements de 10x à 300 000x, avec une profondeur de champ illimitée.

Par rapport à la microscopie électronique à balayage conventionnelle (MEB),

la MEB à émission de champ (MEF) produit des images plus claires, moins
déformées électrostatiquement avec une résolution spatiale allant jusqu'à 1
1/2 nanomètre - trois à six fois mieux .
.
3.2. Variable Pressure Scanning Electron Microscopy (VP-SEM)

Cette technique permet la visualisation d'un échantillons avec

peu ou pas de procédures de préparation des échantillons .

VP-SEM, au lieu de cela, nécessite pas de déshydratation et de

séchage et, si elle est associée à une fixation appropriée, suivie
d'une coloration aux métaux lourds qui améliore le contraste et
la résolution,
 Cryo-MEB
• La cryofixation du biofilm est une procédure rapide qui permet l'observation
d'échantillons "figés dans le temps".

• Un biofilm congelé peut être fracturé pour exposer sa structure interne, observer les
cellules bactériennes et leurs Cryo-scanning electron microscopy of Aspergillus interconnexions.
niger
biofilms developed on polyester

• Cryo-SEM peut être associé à congélation à haute pression. Combiner ces deux
techniques de pointe pour l'analyse du biofilm permet une visualisation détaillée
des relations entre les cellules microbiennes et la matrice.
 • Cryo-SEM nécessite un équipement très coûteux et hautement spécialisé ainsi que
des techniciens hautement qualifiés, c'est pourquoi il a eu une utilisation limitée
dans les études sur les biofilms.

Environmental Scanning Electron Microscopy (ESEM)

• Le MEB environnemental permet l'observation de biofilms sans aucun

prétraitement, sauvant ainsi leur intégrité, telles qu'elles étaient à l'état naturel.

• L'échantillon est directement mis en la chambre du microscope, dont les valeurs

de pression sont proches de la valeur environnementale

• Cependant, le manque de conductivité diminue la résolution,

 • L'échantillon peut facilement être
endommagé sous le faisceau
d'électrons focalisé lorsqu'un
grossissement d'environ 10 kX est
atteint, comme un le revêtement
métallique conducteur est absent.

Microscopie électronique à balayage

atmosphérique (ASEM)

Les biofilms peuvent être cultivés, fixés et

imagés dans la boîte à échantillons
spécialisée (boîte ASEM)
Le long traitement préliminaire des échantillons biologiques, y compris la
déshydratation et le séchage, n'est plus nécessaire, ce qui permet d'obtenir
une imagerie à haut débit.

Faisceau d'ions focalisé-SEM (FIB-SEM)

Le faisceau d'ions focalisé-SEM est une technique sophistiquée de pointe

pour l'imagerie du biofilm.

Une visualisation SEM standard est couplée à un fraisage FIB pour obtenir
Reconstructions 3-D par un procédé dit « slice and view ».
Les tranches d'image obtenues sont ensuite empilés par un logiciel pour
reconstruire le volume 3-D .

Le MEB utilise un faisceau d'électrons focalisés pour faire l'image d'un

échantillon, la "FIB" utilise un faisceau d'ions focalisés, généralement du gallium.
Résonance plasmonique de surface (SPR)

• La résonance plasmonique de surface (SPR pour Surface Plasmon Resonance)

est une technique optique permettant la détection d’un ligand (molécule
organique, biologique, micro-organisme, …) se fixant à un récepteur immobilisé
sur une surface.
• Elle ne nécessite aucun marquage préalable des molécules cibles, permet une
détection en temps réel, les capteurs SPR peuvent être régénérés par injection
d’une solution dite de régénération.
Le SPR standard a été utilisé pour étudier l'adhérence de Pseudomonas aeruginosa sur des surfaces
d'or .

Les résultats de ces expériences ont montré que les différences de cinétique de liaison pouvaient
être distinguées. pour différentes surfaces et différentes souches de.

La SPR est utilisée pour déterminer les mécanismes de liaison des espèces bactériennes en testant
leur cinétique d'adhésion à divers matériaux naturels et synthétiques.

L'identification des espèces bactériennes présentes dans un échantillon de fluide a été très
récemment démontrée en utilisant la surface d'une puce SPRi avec anticorps.
 Images de P. aeruginosa PAO1
après avoir été cultivées pendant la
nuit dans un milieu de croissance LB.
( a ) Image SPRi après croissance
pendant la nuit. La flèche à droite de
(a) pointe vers la zone indiquée en
(b) et (c). La flèche au centre de (a)
pointe vers la zone indiquée en (d).
(b) Image de fluorescence filtrée GFP
du côté droit du biofilm séché sur la
surface du capteur. (c) Image SEM
du côté droit du biofilm. (d) Image
SEM du centre de la chambre.

Microbalance à cristaux de quartz

Le principe de la microbalance à cristaux de quartz (en anglais QCM) repose
sur la mesure de la fréquence d’un cristal de quartz sur la surface duquel
une fine couche rigide de matière est déposée.

La variation de la fréquence est directement proportionnelle à la variation

de masse due aux molécules adsorbées sur la surface. Elle est également
proportionnelle à la densité et à la viscosité du liquide en contact avec le
quartz.
Microbalance à cristaux de quartz

Cela permet une observation en temps réel du processus de formation du biofilm

Les variables difficiles à contrôler ou à modifier avec d'autres techniques, telles

que le débit, la température, la force ionique et la concentration en nutriments,
peuvent être facilement grâce a cette technique

Le QCM est une technique très sensible avec la capacité de détecter des
changements de masse aussi petits que 0,5 ng

La sensibilité du QCM permet de détecter les changements qui se

produisent en quelques secondes ou minutes , mais cette technique
peut être utilisé sur de très longues échelles de temps, jusqu'à des jours
ou des semaines.
Mesure de la biomasse
Crys
tal
Viol
et
(CV
) La technique de coloration au crystal violet mesure la quantité de biomasse à l’intérieur du biofilm.

• Le crystal violet se lie aux molécules extracellulaires chargées négativement, tels que les molécules de la surface
cellulaire ou les polysaccharides de la matrice exopolymérique des biofilms.
•
Mesure de la biomasse

Syto9 green fluorescent nucleic acid stain

• Le Syto9 est un colorant vert

fluorescent qui diffuse passivement à
travers les membranes cellulaires et se
 lie à l’ADN présent à la fois chez les bactéries vivantes et chez les bactéries mortes, ainsi qu’à la
matrice extracellulaire.

• Il permet une quantification de la biomasse du biofilm.

Mesure de la viabilité cellulaire

Sels de tétrazolium (XTT)

• Le XTT est un composé jaune pouvant être réduit par les bactéries et les levures métaboliquement actives en
formasan, un colorant orange.

• Le formasan est soluble dans l’eau et peut être directement quantifié par spectrophotométrie

Soluble dans les solvants organiques

•
MTT
La méthode colorimétrique au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium
(MTT) est un outil utile pour évaluer l'activité métabolique cellulaire.

Le principe du test MTT est basé sur la réduction d'un sel de tétrazolium jaune en un formazan
violet insoluble dans l'eau par des enzymes redox cellulaires
Le bleu Alamar

Il s'agit d'une procédure simple en une étape, dans laquelle l'activité métabolique entraîne la
réduction chimique de l'AB.

Le bleu Alamar émet une fluorescence et change de couleur en réponse à la réduction enzymatique,
et l'étendue de la conversion reflète la viabilité cellulaire.

Le bleu Alamar est soluble dans l'eau, de sorte que les étapes de lavage/fixation/extraction requises
dans d'autres tests de prolifération cellulaire couramment utilisés ne sont pas nécessaires.

.
Le bleu Alamar est également non toxique, facilement éliminé et moins susceptible d'interférer avec le
métabolisme normal des cellules.
Le AB est stable, donc de longues incubations sont possibles, tout comme les études cinétiques.

Triphényltétrazolium (TTC)

La coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC) est une

technique peu coûteuse adaptée à l'analyse des biofilms, permettant
une imagerie simple et rapide des cellules métaboliquement actives

Le chlorure de tétrazolium est un indicateur redox qui permet de

différencier les céllules vivantes grâce à la réduction du TTC en
1,3,5triphénylformazan,
Il en résulte une coloration rouge des tissus vivants, tandis que les tissus
morts ne sont pas colorés.
Mesure de la matrice

DMMB (1,9-dimethyl methylene blue)

• Le DMMB forme un complexe insoluble en présence des polysaccharides sulfatés de la matrice du biofilm.

• Le taux de colorant libéré après ajout d’une solution de décomplexation est mesuré par un spectrophotomètre : la
densité optique est proportionnelle au taux de polysaccharides sulfatés présents dans la matrice.