REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCINETIFIQUE

UNIVERSITE ABDELHAMID BENBADIS

Faculté des sciences de la Nature et de la vie

Filière : Sciences Biologiques
Option: Microbiologie appliquée

THESE
PRESENTEE POUR L’OBTENTION DE DIPLOME DE
DOCTORAT ES- SCIENCES

Par

BOUZNAD AHCENE

Isolement et caractérisation des rhizobactéries libres et endophytes (Bacillus

sp et Pseudomonas sp): Etude de leur pouvoir protecteur vis-à-vis de Fusarium
oxysporum f. sp lycopersici et leur caractères liés à la promotion de la
croissance des plantes.

MEMBRES DE JURY

Youcef-Benkada Mokhtar Professeur Université Mostaganem Président

Bellahcene Miloud Professeur, C.U. Ain-Témouchent Directeur de thèse

Belabid Lakhdar Professeur, Université Mascara Examinateur

Michel Nicole Directeur de recherche I.R.D Montpellier Examinateur

Mekhaldi Abdelkader Professeur, Université Mostaganem Examinateur

Djibaoui Rachid Maitre de conférences, Université Mostagenem Examinateur

Année universitaire 2015/2016

Travail réalisé dans le laboratoire de microbiologie et biologie végétale, Mostaganem

 Avant Propos
Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Microbiologie et Biologie

Végétale (LMBV) à l’université de Mostaganem. Tout d’abord, je tiens à

remercier tous les directeurs qui se sont succédé à la tête du laboratoire ainsi que

tous les membres fondateurs avec j’ai eu souvent des moments très agréables.

Le travail a été réalisé sous la direction du Professeur BELLAHCENE

Miloud. Je tiens à lui exprimer ma profonde gratitude pour m’avoir encadré

toutes ses années durant, pour sa patience, pour ses corrections et ses conseils

constructifs tout au long de ce parcours. Je lui suis aussi reconnaissant pour sa

disponibilité et ses encouragements quand la volonté et le souffle de continuer

me font défaut. J’ai énormément appris à son contact.

Mes remerciements vont également à Monsieur MICHEL Nicole,

directeur de recherche à l’IRD de Montpellier, pour son accueil chaleureux

ainsi que sa disponibilité durant ma visite à son laboratoire.

J’exprime également toute ma gratitude et mes remerciements à

Monsieur YOUCEF-BENKADA Mokhtar, Professeur à l’université de

Mostaganem, pour m’avoir fait l’honneur de présider mon jury.

Je remercie Monsieur BELABID Lakhdar, Professeur à l’université de

Mascara, pour le temps qu’il m’a consacré pour examiner ce travail. Mes

remerciements s’adressent également à mes collègues MEKHALDI Abdelkader,

professeur à l’université de Mostaganem et Monsieur DJIBAOUI Rachid, maitre

de conférences à l’université de Mostagenem, pour leurs encouragements et

leurs remarques pertinentes.

Etant donné qu’un travail de recherche ne se fait jamais seul, je tiens à

adresser un grand remerciement également aux membres du laboratoire de

microbiologie végétale, à tous les étudiants du département de biologie auprès

desquels parfois j’ai retrouvé le courage pour continuer ce parcours : Hakim,

Hiba, Imène, Amina et tous les autres.

En fin un grand bisou à tous mes enfants (quatre), mon épouse et mes

frères et sœurs.
 DEDICACES

Je remercie allah le généreux pour m’avoir guidé

vers la lumière de la science.

A la mémoire mes très chers parents

A la mémoire de mon très cher ami Bouleknafet

Ahmed.

A ma chère épouse

A mes enfants : Amine, Nafaa, Bahaeddine et….

Farès.

A tous mes professeurs

Je dédie ce travail

Ahcene
 TABLE DES MATIERES
Avant propos
Table des matières
Liste des abréviations
Index des figures
Index des tableaux
Résumé
Introduction

Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

I.1. Rhizosphère.......................................................................................................................... 4
I.2. Microorganismes et rhizosphère .......................................................................................... 5
I.2.1. les Bactéries épiphytes (de surface des racines) .......................................................... 5
I.2.2. Bactéries endophytes .................................................................................................... 6
I.2.2.1. Modes de pénétration des bactéries endophytes au sein de la plante .................... 7
I.3 Rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes (RPCP) ou (PGPR): ................... 8
I.3.1. Les Pseudomonas ........................................................................................................ 9
I.3.1.1. Définition ............................................................................................................... 9
I.3.1.2. Taxonomie du Pseudomonas : Historique et outils d’identification ..................... 9
I.3.1.3. Habitat des Pseudomonas ................................................................................... 12
I.3.1.4. Activité des espèces de Pseudomonas dans la lutte biologique .......................... 13
I.3.2. Les Bacillus ................................................................................................................ 15
I.3.2.1. Caractères bactériologiques du genre Bacillus ................................................... 16
I.3.2.2. Habitat des Bacillus ............................................................................................. 17
I.3.2.3. Activité des espèces de Bacillus dans la lutte biologique .................................... 18

Chapitre II : Mécanismes d’action

II.1. Mécanismes d’actions des bactéries impliquées dans la lutte biologique .................... 19
II.1.1. La compétition .......................................................................................................... 20
II.1.2. Antibiose .................................................................................................................... 22
II.1.2.1. Production des antibiotiques par les rhizobactéries ................................................ 22
II.1.3. Hyperparasitisme ....................................................................................................... 25
II.1.4. Induction de la résistance de la plante hôte ............................................................... 27
II.2. Mécanismes d’action impliqués dans la promotion de la croissance de l´hôte ............ 28
II.2.1. Solubilisation du phosphate inorganique ................................................................... 28
II.2.2. Production des phytohormones ................................................................................. 30
II.2.2.1. Production de l’acide indole acétique (AIA): ........................................................ 30

Chapitre III : Plante hôte

III.1. Historique et Origine de la tomate .............................................................................. 32

III.2. Etymologie .................................................................................................................. 32
III.3. Classification botanique .............................................................................................. 32
III.4. Description botanique.................................................................................................. 33
III.4.1. L’appareil végétatif .................................................................................................. 34
III.4.2. L’appareil reproducteur de la tomate ....................................................................... 34
III.5. Culture et importance alimentaire de la tomate........................................................... 36
III.6. Importance alimentaire et économique de la tomate ................................................... 36
III.6.1 Valeur nutritionnelle de la tomate ............................................................................. 36
III.6.2. Importance économique de la tomate dans le monde............................................... 37
III.6.3. Importance économique de la tomate en Algérie ..................................................... 38
III.7. Les maladies de la tomate ........................................................................................... 40
III.7.1. Maladies d’origine bactérienne (les bactérioses) ..................................................... 40
III.7.2. Maladies d’origine virale ......................................................................................... 41
III.7.3. Maladies cryptogamiques ......................................................................................... 42
III.7.4. Stratégies de lutte ..................................................................................................... 46

Chapitre IV : L’agent pathogène

IV.1. L’agent pathogène: Fusarium oxysporum [Link] lycopersici ......................................... 48

IV.1.1. Taxonomie du Fusarium oxysporum ...................................................................... 49
IV.1.2. Biologie de F. oxysporum ....................................................................................... 50
IV.1.3. Cycle de vie du champignon Fusarium oxysporum ................................................ 51
IV.1.4. Pathogénie du Fusarium oxysporum ....................................................................... 54
IV.1.4.1. Les enzymes ........................................................................................................ 54
IV.1.4.2. Les toxines .......................................................................................................... 55
IV.2. Maladies causées par F. oxysporum chez la plante de tomate .................................... 57
IV.2.1. La fusariose de la tomate ......................................................................................... 57
IV.2.1.1. Le flétrissement vasculaire de la plante de tomate .............................................. 57
IV.2.1.2. La pourriture de la racine et du collet de la tomate ............................................... 58
IV.3. Méthodes de lutte (Moyens de lutte) contre la fusariose de la tomate ........................ 59
IV.3.1. Moyens de lutte culturaux ........................................................................................ 59
IV.3.2. Moyens de lutte chimiques ...................................................................................... 59
IV.3.3. Moyens de lutte génétiques ou résistance variétale ................................................. 60
IV.3.4. Lutte physique .......................................................................................................... 60
IV.3.5. lutte intégrée ............................................................................................................. 60
IV.6.5. Lutte biologique (« biological control » ou « biocontrol ») ..................................... 61

Chapitre V : Matériel et Méthodes

V.1. Méthodes d’isolement des rhizobactéries libres et endophytes .................................... 63

V.1.1. Echantillonnage ......................................................................................................... 63
[Link] des souches rhizobactériennes à partir de l’ectorhizosphère.................... 63
[Link] des souches bactériennes (épiphytes) à partir de rhizoplane ..................... 64
V.1.4. Isolement des bactéries endophytes à partir de l’endorhizosphère .......................... 65
V.1.4.1. Stérilisation de la surface des racines ..................................................................... 65
V.1.4.2. Macération des tissus de racines ........................................................................... 65
V.1.4.2. Isolement des bactéries endophytes culturables ..................................................... 65
V.1.5. Purification des isolats bactériens ............................................................................ 65
V.1.6. Caractérisation des isolats par étude des caractères microscopiques et biochimiques66
V.1.7. Conservation des isolats bactériens ........................................................................... 66
[Link]. Isolement et caractérisation de l’agent pathogène ....................................................... 66
[Link].1. Prospection et évaluation de l’importance de la fusariose de la tomate dans la zone
d’étude. ................................................................................................................................. 66
[Link].1.2. Collecte des échantillons ....................................................................................... 66
[Link].2. Caractérisation de l’agent pathogène ........................................................................ 67
[Link].2.1. Isolement de l’agent phytopathogène .................................................................... 67
[Link].2.2. Purification de l’agent pathogène .......................................................................... 67
[Link].2.3. Préparation d’une culture monospore .................................................................... 67
[Link].2.4. Identification macroscopique et microscopique du pathogène .............................. 68
[Link].3. Estimation du pouvoir pathogène des isolats de F. oxysporum ................................ 68
[Link].3.1. Evaluation de la pathogénie des isolats de F. oxysporum in planta ...................... 68
V.3. Etude de l’activité antagoniste in vitro des isolats bactériens vis-à-vis de F. oxysporum
f. sp lycopersici .................................................................................................................... 71
V.3.1. production des substances diffusibles (Antibiose) .................................................... 71
V.3.2. Production des substances volatiles et l’acide cyanhydrique (HCN) ....................... 71
V.3.2.1. Test de la production des substances volatile ......................................................... 71
V.3.2.2. Test de la production de l’acide cyanhydrique (HCN) : ........................................ 72
V.3. 3. Production des sidérophores ..................................................................................... 72
V.3.4. Production d’enzymes hydrolytiques ........................................................................ 72
V.3.4.1. Production de l’amylase ......................................................................................... 72
V.3.4.2. Production de la protéinase .................................................................................... 73
V.3.4. 3. Production de la cellulase ...................................................................................... 73
V.3.4.5. Production de la pectinase ...................................................................................... 73
V.4. Etude des propriétés associées à l'action des isolats sur la promotion de la croissance de
la plante tomate .................................................................................................................... 74
V.4.1. Solubilisation des phosphates inorganiques .............................................................. 74
V.4.2. Production d’acide indole acétique (AIA) ................................................................. 74
V.4.2.1. Effet de la concentration du tryptophane sur la production de l’acide indole acétique
(AIA) .................................................................................................................................... 75
V.4.3. Production de l’ammoniaque (NH3) ......................................................................... 75
V.5. Evaluation in vivo de la capacité des souches microbiennes pré-sélectionnées pour la
promotion de la croissance de plants de tomate ................................................................... 76
V.5.1. Protocole de désinfection des graines de tomate ...................................................... 76
V.5.2. Préparation de l’inoculum bactérien (antagoniste) .................................................... 76
V.5.3. Préparation du sol ...................................................................................................... 77
V.5.4. Détermination du taux de germination et l’index de vigueur .................................... 77
V.5.5. Evaluation de l’effet de l’inoculation par les isolats bactériens sur la promotion de la
croissance des plants de tomate ............................................................................................ 78
V.6. Evaluation de l’effet protecteur des plants de tomate par des isolats bactériens vis-à-vis
de l’agent pathogène (F. oxysporum f. sp lycopersici) ........................................................ 79
V.6.1. Préparation de l’inoculum fongique (agent pathogène) : ......................................... 79
V.6.2. Préparation du sol infecté avec [Link] f. sp lycopersici ................................. 79
V.6.3. inoculation des plantules de tomate ........................................................................... 79
V.6.4. Lecture des résultats .................................................................................................. 80
V.7. Analyses statistiques..................................................................................................... 80

Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.1. Isolement des rhizobactéries libres et endophytes à partir de la rhizosphère des plantes
de tomate .............................................................................................................................. 81
[Link] ................................................................................................................. 85
VI.2. Agent pathogène ......................................................................................................... 88
VI.2.1. Résultats des prospections et importance de la maladie : ........................................ 88
VI.2.2. Symptomatologie de la maladie : ............................................................................. 88
VI.2.3. Caractérisation morphologique et identification de l’agent pathogène .................. 88
VI.2.3.1. L’identification macroscopique ............................................................................ 88
VI.2.3.2. L’identification microscopique ............................................................................. 90
VI.2.3.3. Détermination des morphotypes ........................................................................... 91
VI.2.4. Test du pouvoir pathogène des isolats de F. oxysporum ......................................... 93
VI.2.5. Ré-isolement de l’agent pathogène .......................................................................... 95
[Link] ................................................................................................................. 96
VI.3. Etude de l’activité antagoniste in vitro des isolats bactériens vis-à-vis de F. oxysporum
f. sp lycopersici .................................................................................................................... 98
VI.3.2. Activité antagoniste des rhizobactéries isolées à partir de la rhizoplane ............... 100
VI.3.3. Activité antagoniste des rhizobactéries (endophytes) isolées à partir des tissus
internes des racines ............................................................................................................. 101
VI.3.4. Effet du milieu de culture sur l’activité antagoniste .............................................. 102
VI.3.5. Inhibition par les substances volatiles et production de l’acide cyanidrique (HCN)
............................................................................................................................................ 103
VI.3.6. Production des sidérophores (Pyoverdines) ........................................................... 105
VI.3.7. Activités enzymatiques lytiques des isolats rhizobactériens .................................. 106
VI. 3.8. Discussion ............................................................................................................. 112
VI.4. Etude des propriétés associées à l'action des isolats sur la promotion de la croissance de
la plante tomate .................................................................................................................. 116
VI.4.1. Solubilisation des phosphates inorganiques ........................................................... 116
[Link] d’acide indole acétique (AIA) .............................................................. 120
VI.4.3. Production de l’ammoniaque (NH3) ...................................................................... 121
VI.4.4. Discussion .............................................................................................................. 124
VI. 5.1. Sélection des isolats utilisés dans l’évaluation in vivo ......................................... 127
VI.5.2. Effet de la bactérisation des semences de tomate sur le taux de germination et l’index
de vigueur ........................................................................................................................... 128
VI.5.3. Effet de la bactérsisation sur la promotion de la croissance de la plante ............... 129
VI. 5.3.1. Promotion de la longueur et poids des racines ................................................... 129
VI. 5.3.2. Promotion de la longueur et le poids de la tige .................................................. 132
VI.5.3. Discussion .............................................................................................................. 135
VI.6. Evaluation de l’effet protecteur des plants de tomate par des isolats bactériens vis-à-vis
de l’agent pathogène (F. oxysporum f. sp lycopersici) ...................................................... 138
VI.6.1. Evaluation de l’effet de protecteur des isolats antagonistes sur l’incidence de la
maladie ............................................................................................................................... 138
 VI.6.2. Evaluation de l’effet de protecteur des isolats antagonistes sur les paramètres de
croissance des plantules de tomate ..................................................................................... 139
VI.6.2.1. Effet sur la longueur de la tige et des racines ..................................................... 139
VI.6.2.2. effet sur le poids sec de la tige et des racines ..................................................... 140
[Link] ............................................................................................................... 141
Conclusion et perspective …………………………………………………………….…....143
Référence bibliographique ……………………………………………………………...…147
Annexes ………………………………………………………………………………….….178
Publication
 Abbréviations

AIA : acide indole acétique

BSP : Bactéries solubilisant le phosphate

CMC : carboxy methyl cellulase

FOL : Fusarium oxysporum f. sp lycopersici

HCN : Hydro cyanidric acid

IAF : indice d’altération foliaire

ISP : Indice de solubilisation de phosphate

ISR : induced systemic resistance

IV : index de vigueur

PBS : Phosphate buffer saline

PDA : Potato dextrose agar

PGP : Plant Growth Promotion

PGPR : Plant growth promoting rhizobacteria

PVK : Pikovskaya

SAR : systemic acquired resistance

TCP : Tricalcique phosphate

 INDEX DES FIGURES
FIGURE PAGE
Figure I.1 : Coupe longitudinale de la racine montrant les différents 4
composants de la rhizosphère
Figure I.2 : Illustration des sites possibles d’infection et de colonisation des 7
racines par des bactéries endophytes présentés par une section longitudinale et
transversale d’une racine.
Figure II.1. Schéma représentant les mécanismes possibles des PGPR 19
impliqués dans la lutte biologique.
Figure II.2. Structures des Sidérophores : (A) : hydroxamate ; (B) : 21
Ferrichrome ; (C): Triacetylfusarinine C. (D): Ferrioxamine.
Catecholate Enterobactin.
Figure II.3. Structure de quelques métabolites secondaires produits par 23
Pseudomonas sp impliqués dans le contrôle biologique des maladies des
plantes.
Figure II.4. Schéma général des voies de mobilisation et immobilisation du 29
phosphore dans le sol par les bactéries.
Figure II.5. Aperçu des différentes voies de biosynthèse de l’AIA par les 31
bactéries (Les noms de voies sont indiquées par des mots soulignés).
Figure III.1. Coupe d’une fleur de tomate. 35
Figure III.2. Coupe transversale d’un fruit de tomate. 35
Figure III.3. Evolution de la superficie de culture de la tomate en Algérie de 39
2001à 2010.
Figure III.4. Evolution de la production de la tomate en Algérie de 2001 à 2010. 39
Figure III.5. Symptômes de maladies d’origine bactérienne affectant la tomate 41
Figure III.6. Symptômes de certaines maladies cryptogamiques de la tomate. 44
Figure IV.1. Les types de fructifications (spores assexuées) rencontrés chez F. 51
oxysporum
Figure IV.2. Cycle de la maladie de flétrissement vasculaire causée par 53
[Link] f. sp lycopersici chez la tomate.
Figure IV.3. Structure chimique de quelques toxines produites par Fusarium 56
sp.
Figure IV.4. Symptômes du flétrissement de la tomate causé par F. oxysporum 58
f. sp lycopersici.
Figure V.1. Carte de la localisation géographique des points de prélèvement 63
des échantillons de plantes et de sol dans la wilaya de Mostaganem.
Figure V.2. Dispositif expérimentale pour l’étude de la pathogénie des isolats 70
fongiques.
Figure V.3. Culture des plantules de tomate dans plaques alvéoles. 80
Figure VI. 1: Répartition des différents groupes de microorganismes isolés en 83
fonction de ;
Figure VI. 2 : Répartition des différents isolats en fonction du type de paroi 83
parmi les trois sites d’isolement
Figure VI.3 : Répartition et identification des espèces microbiennes 84
appartenant au groupe des bacilles Gram positif isolées à partir de la
rhizosphère des solanacées.
Figure VI.4 : Répartition et identification des espèces microbiennes 84
appartenant au groupe des bacilles gram négatif isolées à partir de la
rhizosphère des solanacées.
Figure VI.5. Aspect macroscopique des colonies de Fusarium oxysporum sur 90
milieu PDA.
Figure VI.6. Macroconidies et microconidies observés au microscope optique 90
(x400)
Figure VI.7. Les différents morphotypes de Fusarium oxysporum f. sp 92
lycopersici sur milieu PDA.
Figure VI.8. Schéma générale montrant les différentes étapes pour la 94
détermination de l’indice de l’altération foliaire.
Figure VI.9. Aspect macroscopique de certains agents pathogènes après ré- 95
isolement sur milieu PDA.
Figure VI.10. Résultats des tests de confrontation directs préliminaire pour la 98
sélection des isolats inhibiteurs de la croissance de FOL (trois isolats bactériens
différents par boite).
Figure VI.11. Pourcentages d’inhibition de la croissance de FOL par les 99
isolats bactériens isolés à partir de l’ectorhizosphère.
Figure VI.12 Pourcentages d’inhibition de la croissance de FOL par des 100
isolats bactériens isolés à partir de la rhizoplane.
Figure VI.13. Pourcentages d’inhibition de la croissance de FOL par les isolats 101
bactériens endophytes isolés à partir des tissus internes des racines.
Figure VI.14. Effet du milieu de culture sur l’activité antagoniste des isolats 102
bactériens vis-à-vis du FOL.
Figure VI.15. Effet des substances volatiles produites par les isolats inhibiteurs 104
de la croissance de FOL.
Figure VI.16. Mise en évidence de la production de l’acide cyanidrique (HCN) 104
Figure VI.17. Production de la pyoverdine (sidérophore) par les différents 105
isolats (A : croissance en absence de FeCl3 ; B : Croissance en présence de
FeCl3)
Figure VI.18. Mise en évidence de l’activité enzymatique chez les différents 107
isolats après culture sur milieux gélosés spécifiques (A : CMCase ; B :
Protéase ; C : Pectinase : D : Lipase).
Figure VI.19. Répartition générale des activités enzymatiques parmi les 108
souches microbiennes isolées à partir de différents sites de la rhizosphère des
plantes de tomates.
Figure VI.20 : Répartition des différentes activités enzymatiques par rapport 108
aux origines des souches microbiennes.
Figure VI.21. Halos de solubilisation du phosphate inorganique sur milieu 117
PVK.
Figure VI.22 Index de solubilisation du phosphate chez les rhizobactéries 118
isolées à partir de l’ectorhizosphère.
Figure VI.23. Index de solubilisation du phosphate chez les rhizobactéries 118
isolées à partir de la rhizoplane.
Figure VI.24. Index de solubilisation du phosphate chez les rhizobactéries 119
isolées à partir de l’endorhizosphère.
Figure VI.25. Evolution de l’index de solubilisation des isolats en fonction du 119
temps d’incubation.
Figure VI.26. Effet de la concentration du tryptophane sur la production de 123
l’acide indole acétique par les rhizobactéries isolées de: A : l’ectorhizosphère,
B : l’endorhizosphère , C : la rhizoplane.
Figure VI.27. Effet de l’inoculation des plantules de tomates par les isolats sur 131
certains sur la croissance des racines.
Figure VI.28. Effet de l’inoculation des plantules de tomates par les isolats 133
sélectionnées sur la croissance de la tige.
Figure VI.29. Effet du traitement par les agents antagonistes sur l’incidence de 138
flétrissement des plantules de tomates.
Figure VI.30. Effet du traitement par des isolats antagonistes sur la longueur de la 139
tige et des racines des plantules de tomates.
Figure VI.31. Effet du traitement par des isolats antagonistes sur le poids sec de la 140
tige et des racines des plantules de tomates
 INDEX DES TABLEAUX

TABLEAU PAGE
Tableau I.1. Quelques exemples récents d’agents de contrôle biologiques à 14
base de Pseudomonas spp. fluorescents (depuis 2004).
Tableau I.2. Nombre des espèces attribuées au genre Bacillus dans les 15
différents éditions du Manuel de Bergey jusqu’au 1974.
Tableau I.3 : Position taxonomique du genre Bacillus 16
Tableau II. 1: les principaux antibiotiques produits par certaines espèces de 26
Bacillus et leur spectre d’action.
Tableau III.1. Composition chimique du fruit cru de tomate (moyenne pour 37
100g de fruit).
Tableau III.2. Production mondiale de la tomate en 2007. 38
Tableau III.3. Différentes maladies virales de la plante de tomate. 42
Tableau III.4. Synthèse des principales stratégies de lutte contre les 47
maladies de la tomate.
Tableau IV.1. Quelques exemples de souches de Fusarium oxysporum et 49
leurs plantes hôtes spécifiques.
Tableau IV.2. Position systématique du Fusarium oxysporum. 50
Tableau IV.3. Symptômes de la pourriture de la racine et du collet causée 58
par F. oxysporum f. sp radicis-lycopersici.
Tableau V.1. Echelle d’évaluation de l’altération foliaire. 68
Tableau VI.1. Origine et caractères macroscopiques des isolats de F. 89
oxysporum.
Tableau VI.2 : Indice d’altération foliaire des isolats de F.O.L. 93
Tableau VI.3. Concordance entre l’Activité hydrolytiques et l’activité 109
inhibitrice des différentes souches microbiennes isolées à partir de
l’ectorhizophere des racines de tomates.
Tableau VI.4. Concordance entre l’activité hydrolytiques et l’activité 110
inhibitrices des différentes souches microbiennes isolées à partir de la
rhizoplane des racines de tomates.
Tableau [Link] entre l’activité enzymatiques hydrolytiques et 111
l’activité inhibitrices des différentes souches microbiennes isolées à partir de
l’endorhizosphère des racines de tomates.
Tableau VI.6. Production de l’indole acétique et l’ammoniaque par les différentes 122
espèces des rhizobactéries isolées des trois sites de la rhizosphère de la tomate.
Tableau VI.7. Caractéristiques des isolats sélectionnés pour l’étude de l’effet 128
in planta
Tableau VI.8. Effet de la bactérisation sur le pouvoir de germination des 129
graines de tomates
Tableau VI.9. Analyse statistique des effets de l’innoculation des plantules 134
de tomate par les différents isolats sélectionnés
 Abstract
The plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) are commonly inoculated to
improve growth and yield of agricultural crops. They are developed to be effective plant
growth promoting and successful bioconrtol agents by diverse set of traits. The present study
focuses on screening of PGPR isolates showing biocontrol to phytopathogenic fungi and
promotion of plants growth. 109 strains belonging to Pseudomonas and Bacillus genera have
been isolated from rhizosphere and endosphere of tomato roots from Mostaganem region.
Among which, 46.79% have been isolated from ectorhizospheric region, 35.78% isolated
from the rhizoplane and 17.43% from the endorhizosphere. They were screened initially via
their in vitro antagonistic activity against F. oxysporum f. sp lycopersici by dual culture
inoculation on plate assay. 54.12% of the tested isolates demonstrated a variable inhibition
rate of the phytopathogenic agent growth. The production ability of volatiles substances
(HCN), siderophores and hydrolytic enzymes (pectinase, CMcellulase, protease and amylase)
has also been detected.
These isolates were then tested in vitro for specific PGPR traits such as the production
of phosphate solubilizing enzymes, Indole Acetic Acid (IAA) and ammonia. Among the
tested strains, 41% were able to solubilize the inorganic P, 69% were able to produce AIA and
the all isolates were ammonia producers.
Inoculation of tomato seedlings with seven different isolates has significantly
enhanced seed germination, seedling vigor index, plant height, fresh weight and dry weight in
comparison with control. Biocontrol activity of the seven (07) bacterial isolates has been also
evaluated under greenhouse conditions. The results indicated that these Plant growth-
promoting rhizobacteria (PGPR) strains provided a significant increase in shoot and root
length, and shoot and root biomass over the uninoculated control.
These results also indicate that the tested PGPR improved growth parameters in
tomato plants and contribute towards biocontrol of the tomato wilt pathogen.

Key words : PGPR, rhizosphere, plant promotion, biocontrol, F. oxysporum f. sp lycopersici

 RESUME
Le développement d'un inoculant PGPR efficace nécessite la conjugaison d'un
ensemble de caractères diversifiés qui peuvent contribuer fortement à la promotion de la
croissance et la protection des plantes. Ainsi, la présente étude se concentre sur le dépistage
des isolats PGPR porteurs de multiples caractères liés à la lutte biologique la promotion de la
croissance des plantes. 109 souches appartenant aux genres Pseudomonas et Bacillus ont été
ainsi isolées à partir de la rhizosphère et l’endosphère des plantes de tomate dans la région de
Mostagane (Nord-Ouest, Algérie), parmi lesquelles 46.79 % rhizosphériques, 35.78%
épiphytes et 17.43 % endophytes. Le test d’antagonisme direct vis-à-vis du FOL a montré
que 54,12% des isolats ont exercé des taux d'inhibition variable de la croissance de l'agent
phytopathogène. La capacité des isolats à produire des substances volatiles (HCN), des
sidérophores et des enzymes hydrolytiques (pectinase, CMcellulase, la protéase et d'amylase)
ont également détectées.
Ces isolats ont ensuite été testés in vitro pour leurs traits spécifiques à la promotion de
la croissance des plantes tels que la solubilisation de phosphate, la production de l'acide
indole acétique (AIA) et de l'ammoniac. Parmi les souches testées, 41% étaient capables de
solubiliser le P inorganique, 69% étaient en mesure de produire de l'AIA et la totalité des
isolats étaient producteurs d'ammoniac.
L’inoculation des plantules de tomate avec les sept isolats sélectionnés a
considérablement amélioré la germination des graines, l’indice de vigueur, la longueur des
racines, la hauteur de la tige et le poids sec des racines et da la tige en comparaison avec le
témoin. L’activité de protectrice des sept (07) isolats bactériens a été également évaluée dans
des conditions en pots sous serre. Les résultats indiquent que ces rhizobactéries favorisant la
croissance des plantes en provoquant une diminution de l’incidence de la maladie chez les
plantes infectées ainsi qu’une une amélioration significative du poids sec et de la longueur des
tiges, et la longueur et la biomasse racinaire par rapport aux témoins non inoculés.
Ces résultats indiquent que le PGPR testé améliorée dans les paramètres de croissance
des plants de tomate et de contribuer à la lutte biologique de l'agent pathogène tomate
flétrissement.
Mots clés : PGPR, rhizosphère, endorhizosphere, promotion des plantes, biocontrôle.
 ‫امللخص‬
‫ًخطلب جحظير البكخيرًا املحفصة لىمو الىباجاث ‪ PGPR‬مً الجروز الجمع بين مجموعت مً‬
‫الصفاث املخىوعت التي ًمكً أن حساهم إلى حد كبير في حعصيص همو وحماًت الىباجاث‪ .‬جم التركيز في هره‬
‫الدزاست على فحص عصالث مً ال‪ PGPR‬جحمل سماث مخعددة ذاث صلت باملكافحت البيولوجيت و‬
‫حعصيص همو الىباث‪ 901 .‬ساللت بكخيرًت جيخمي إلى جيس ‪ Pseudomonas‬و ‪ Bacillus‬كلها معصولت مً‬
‫املىطلت الخازجيت و الداخليت لجروز هباجاث الطماطم املصزوعت بمىطلت مسخغاهم (شمال غسب‬
‫الجصائس)‪ .‬مً بين مجموع هده العصالث‪ ٪46.79 ,‬معصولت مً املىطلت الخازجيت للجروز‪٪87.53 ،‬‬
‫معصولت مً مىطلت سطح الجروز و ‪ ٪95.78‬مً السالالث عصلذ مً ألاوسجت الداخليت للجروز‪.‬‬
‫أعهس اخخباز الخظاد مع فطس الفيزازيوم )‪ (Fusarium‬املسبب ملسض الربول عىد الطماطم أن‬
‫‪ ٪77.95‬مً العصالث كد حسببذ في جثبيط همو الفطسوبمعدالث محصوزة بين ‪ 0.9%‬و ‪ .55.53%‬كما‬
‫جم الكشف أًظا علي كدزة هره العصالث عل إهخاج املواد الطيازة‪ (HCN‬والسيدزوفوزاث و اهصيماث‬
‫الحلمهت مً هوع البكخيىاشو السليالش و البروجياش وألاميالش‪.‬‬
‫ومً جهت أخسى جم اخخباز خصائص العصالث املحفصة لىمو الىباث مثل اللدزة على إذابت‬
‫الفوسفاث املعدوي و إهخاج حمع إلاهدول أسديك )‪ (IAA‬و ألاموهيا ‪ .‬وكد أعهسث الىخائج املخحصل‬
‫عليها أن ‪ ٪41‬مً السالالث املخخبرة كاهذ كادزة على إذابت الفوسفاث غير العظوي و‪ ٪69‬كاهذ مىخجت‬
‫لل ‪ IAA‬بيىما جميع العصالث كاهذ مىخجت لألموهيا‪.‬‬
‫إن جطعيم شخالث طماطم بسبعت مً العصالث ذاث خصائص مخعددة أدى إلى جحسً في‬
‫وسبت إهباث البروز بشكل ملحوظ ‪ .‬كما شاد أًظا في كوة املؤشس و طول الجروز وازجفاع الساق وكرا‬
‫الوشن الجاف لكل مً الساق و الجروز ملازهت بالشاهد ‪.‬‬
‫أما فيما ًخص دوز السالالث البكخيرًت السبعت في وكاًت شخالث الطماطم طد مسض الربول‬
‫الوعائي في جسبت ملوثت بالعامل املمسض‪ .‬فلد أشازث الىخائج إلى أن هره العصالث أدث إلى حعصيص الىمو‬
‫مً خالل الخلليل في جأثير املسض في الىباجاث املصابت وشيادة كبيرة في الوشن الجاف)الكخلت الحيويت(‬
‫وطول الساق و الجرز ملازهت مع الشاهد املصاب غير املعامل‪.‬‬
Introduction
générale
 INTRODUCTION GENERALE
Les maladies des plantes sont souvent à l’origine de grandes pertes dans les
rendements de différentes cultures et représentent ainsi une menace chronique à la sécurité
alimentaire pour la population de nombreuses régions du monde. Les méthodes actuelles de
lutte contre les maladies affectant ces cultures sont basées principalement sur les fongicides et
les bactéricides chimiques comme une méthode fiable pour maintenir la stabilité économique
de la production agricole. Les engrais chimiques sont utilisés pour fournir suffisamment de
nutriments pour optimiser les rendements des cultures. Cependant, le recours exclusif à
l'utilisation de pesticides et d'engrais chimiques de synthèse crée souvent des inquiétudes chez
les populations autour de questions de développement de la résistance des agents pathogènes
aux pesticides, la pollution de l'environnement, la contamination des eaux de surface et
souterraines et les effets secondaires sur les humains, les microorganismes bénéfiques du sol,
les insectes, les oiseaux et les poissons (Waard et al., 1993). Ainsi, les préoccupations du
public à propos de l'environnement a accru la nécessité d'élaborer et de mettre en œuvre des
approches alternatives de contrôle pour la protection des cultures. L’utilisation rhizobactéries
favorisant la croissance végétale (PGPR) comme des biopesticides et des engrais biologiques
peut être une de ces alternatives (Banerjee et al., 2005; Chandler et al., 2011).
Les PGPR (plant growth promotion rhizobacteria) ou rhizobactéries favorisant la
croissance des plantes (RFCP) est un terme introduit par Kloepper et Schroth (1978) pour
désigner les bactéries colonisant la rhizosphère des plantes capables aussi bien de stimuler la
croissance de leur hôtes, que de réduire les attaques par les agents phytopathogènes (Van
Loon et al., 1998 ; Bowen and Rovira, 1999 ; Beneduzi et al., 2012). Les mécanismes par
lesquels ces microorganismes exercent leurs effets bénéfiques sont encore mal déterminés.
Comme agents de lutte biologique, Les PGPR agissent par deux mécanismes majeurs : un
mécanisme direct par antagonisme direct de l’agent pathogène et survient le plus souvent par
la production d’antibiotiques (Gupta et al., 2015), l’acide cyanohydrique (HCN) (Flaishman
et al., 2001) ou sidérophores (Scher and Baker, 2006) et un mécanisme indirect par induction
de la résistance systémique chez la plante. Comme agent biofertilisants les PGPR agissent
principalement par : (i) la production ou amélioration de la production de certains régulateurs
de croissance chez les plantes e.g. Acide indole acétique ou acide gibbérellique (Arshad and
Frankenberger, 1992) (ii) fixation asymbiotique de l’azote atmosphérique ou l’éthylène
(Boddey and Dobereiner, 2000) (iii) solubilisation des phosphates inorganiques (De Freitas et
al., 2007).
1
 Une large variété de microorganismes est considérée comme des PGPR, parmi les
quels on retrouve les espèces appartenant aux genres : Pseudomonas, Azospirillum,
Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligens, Arthrobacter, Burkholderia, Bacillus, etc.
(Kloepper et al., 1989; Glick, 1995). Les souches appartenant aux genre Bacillus et
Pseudomonas sont largement exploités (Roopa et al., 2012; Shau et Sindhu, 2011). Beaucoup
de recherches se sont concentrées sur ces deux types de bactéries parce qu´ils sont des
habitants communs de la rhizosphère et possèdent une grande activité dans le contrôle
biologique de maladies liées au sol. Ils ont la capacité de produire de nombreux antibiotiques
et ils sont faciles à cultiver in vitro ou et à être manipulés au laboratoire. De plus, les bacillus
offrent un avantage par rapport aux autres bactéries en raison de leur capacité à former des
endospores résistantes au changement des conditions du milieu avantage aussi pour la
formulation du produit (Raaijmakers et al. 2002; Cavaglieri et al. 2005).

Les PGPR peuvent être aussi classés comme des PGPR extracellulaires (existant dans
les différentes parties de la rhizosphère) et des PGPR intracellulaire (existant dans des
structures nodulaires, principalement les bactéries fixatrices d’azote) (Berg, 2009 ; Ahmed et
Kibret, 2014). Le premier groupe est un groupe hétérogène et qui rassemble des germes
appartenant aux différents niveaux de la rhizosphère. On distingue ainsi les PGPR endophytes
qui colonisent les tissus internes des racines, les PGPR épiphytes souvent restent attachés à la
surface des racines après éliminations des particules du sol et les PGPR rhizosphériques
(libres) qui appartiennent à la partie externe de la rhizosphère (Joseph et al. 2007).
Contrairement aux PGPR intracellulaires, les PGPR extracellulaires peuvent interagissent
avec une large variété de plantes hôtes sans nécessité à former des structures spécifiques
(nodules) chez la plante hôte (Lugtenberg and Kamilova, 2009; Drogue et al., 2012).
L’application de ces microorganismes et leurs interactions avec les plantes sont largement
rapportés comme biofertilisants ou agents de lutte biologique pour par différentes études
(Sivasakthi et al., 2014 ; Hassan et Bano, 2015 ).

En Algérie, la culture de la tomate occupe une place privilégiée parmi les cultures
maraîchères et joue un rôle socio-économique important dans le développement du pays. Elle
occupe jusqu’à 63% de surface agricole cultivée en Algérie. En même temps la quantité
annuelle produite est relativement faible, elle ne représente que 8.33% de la production
nationale en cultures maraichères (Anonyme, 2009). Les mauvaises pratiques de culture ou
l’attaque par une multitude de microorganismes pathogènes sont autant de facteurs qui
peuvent être à l’origine de cette situation.
2
 La fusariose de la tomate, causée par F. oxysporum f. sp lycopersici, est parmi les
maladies responsables de la destruction de grandes superficies de cultures dans le monde
entier (Beckman, 1987). Sa présence en Algérie a été rapportée par plusieurs auteurs (Henni
et al., 1994, Henni ,1998; Hamini, 2011 ; Benaouali et al., 2014). La disponibilité actuelle de
variétés résistantes à l’agent causal ainsi que le recours aux produites phytosanitaire n’ont pas
pu contribuer à l’éradication totale de la maladie. Considérant les potentialités multiples des
rhizobactéries libres et endophytes, l’objectif de ce travail est d’essayer d’apporter une
contribution dans le domaine de lutte biologique par la mise en application de
microorganismes capables d’agir directement sur l’agent pathogène en même par action
indirecte par leur capacité à promouvoir la croissance de la plante hôte. La stratégie suivie
durant cette étude consiste à :

 Isoler des rhizobactéries libres et endophytes appartenant aux genres Pseudomonas et

Bacillus à partir de la rhizosphère des plantes de tomates.
 Prospections et isolement de l’agent causal du flétrissement de la tomate dans la
région de Mostaganem..
 Evaluer de la capacité des isolats à inhiber la croissance de Fusarium oxsporum f. sp
lycopersici in vitro et étude des modes d’action possibles impliqués dans cette
inhibition.
 Caractériser les isolats exerçant un effet inhibiteur contre F. oxysporum f. sp
lycopersici par étude de leurs caractères biochimiques et mophologiques.
 Déterminer la capacité des isolats sélectionnés à produire certains métabolites
impliqués dans la promotion de la plantes.
 Evaluer la capacité des souches sélectionnées à promouvoir in vivo la croissance des
plantes de tomate dans un sol stérile.
 Evaluer la capacité des souches sélectionnées à protéger la culture des plantes dans un
sol infecté par F. oxysporum f. sp lycopersici.

3
 Chapitre I :
Rizhobactéries
Libres et
endophytes
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

I.1. Rhizosphère
Le mot "Rhizosphère" a été défini par Lorenz Hiltner (1904), “Rhizo” vient du grec
“rhiza,” signifiant “racine”, “Sphère” est le champ d'action ou d'influence. Aujourd‟hui, ce
terme rhizosphère correspond à une définition plus générale : ‘c’est le volume de sol soumis à
l’influence de l’activité racinaire’ (Darrah, 1993). Ce volume de sol varie avec la nature des
plantes, la densité du système racinaire et ses propriétés de surface et les propriétés physico-
chimiques du sol (Abhilash and Singh, 2009). Globalement, il existe trois composantes
distinctes reconnues dans la rhizosphère, rhizosphère en soi (le sol: ectorhizosphere), la
rhizoplane, et la racine elle-même (endorhizosphère). La rhizosphère est donc la zone de sol
influencée par les racines grâce à la libération de substrats qui affectent l'activité microbienne.
La rhizoplane est la surface de la racine, y compris les particules de sol adhérant fortement.
La racine elle-même (endorhizosphère) est une partie du système racinaire, parce que certains
micro-organismes endophytes sont capables de coloniser les tissus racinaires internes (Bowen
et Rovira, 1999) (Figure I.1).

Figure I.1 : Coupe longitudinale de la racine montrant les différents composants de la

rhizosphère

La rhizosphère et la rhizoplane sont des termes utilisés aujourd‟hui pour la description

de la zone externe des racines (Botelho et Mendoca-hagler, 2006).
Les plantes, comme la plupart des êtres vivants, vivent au contact de nombreux micro-
organismes. Le contact entre plantes et micro-organismes est permanent. Il s'établit dès que la
graine tombe au sol, se poursuit et se développe lors de la germination et de la croissance du
végétal, et se termine à la mort de celui-ci. Ce contact est aussi étroit puisque l'on peut
détecter plus de 106 bactéries/g de feuille et de 109 /g de racine (Gobat et al., 2003).

4
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

Un grand nombre d‟organismes microscopiques tel que les bactéries, protozoaires et les
algues coexistent dans la rhizosphère. Les bactéries sont largement les plus abondants dans
cette partie de l‟environnement de la plante, il est fort probable qu‟ils influencent grandement
la physiologie de la plante.
I.2. Microorganismes et rhizosphère
La rhizosphère est riche en micro-organismes, notamment en bactéries et champignons
microscopiques, qui se nourrissent des cellules et des substances sécrétées par la plante dans
un processus appelé rhizo-déposition, impliquant une grande quantité de protéines, sucres et
autres sécrétions racinaires. De nombreuses symbioses et synergies sont observées entre
plantes, bactéries et virus du sol (Hinsinger et al., 1996).
Les interactions entre les bactéries et les plantes sont dynamiques et complexes, elles
peuvent être classées en trois catégories: neutre, négatif ou positif (Whipps, 2001). La plupart
des rhizobactéries associées aux plantes sont commensaux, dans ce cas les bactéries
établissent une interaction inoffensif, qui n'a aucun effet visible sur la croissance et la
physiologie de la plante (Beattie, 2006). D‟autre part la rhizosphère contient également des
rhizobactéries qui influencent négativement la croissance et la physiologie de la plante tel que
les phytopathogènes, un troisième groupe de microorganismes stimulent la croissance des
plantes par la production d‟hormones et d‟autres éléments favorisant directement la croissance
de la plante ou indirectement par la production de substances capables de supprimer ou
ralentir la croissance et le développement des agents phyto-pathogènes (Beattie,2006). En
plus de ces classifications fonctionnelles, les microorganismes de la rhizosphere peuvent aussi
être regroupées selon les compartiments de la plante qu'ils occupent, dans telle classification
on distingue: (I) les bactéries vivant dans le sol près des racines (rhizosphère), utilisant des
métabolites libérés par les racines comme sources de carbone et d‟azote pour leur croissance
(II) bactéries colonisant la rhizoplane (surface radiculaire), (III) les bactéries qui résident dans
les tissus des racines, qui habitent les espaces entre les cellules corticales (endophytes) et
enfin, (IV) des bactéries vivant à l'intérieur des cellules dans les structures profondes
spécialisées (les nodules : bactéries fixatrices d‟azote) (Gray and Smith, 2005).
I.2.1. les Bactéries épiphytes (de surface des racines)
La surface de la racine de la plante est revêtue d'une couche composée par le mucilage
végétal, les cellules bactériennes, les produits métaboliques, les colloïdes organiques et les
éléments minéraux. Le mucilage végétal est libéré par les racines sous forme d‟exsudats et
sécrétions. Les exsudats contiennent des acides aminés, des sucres, des acides organiques, des
protéines et des polysaccharides et d‟élément favorisant la croissance des microorganismes.

5
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

Les bactéries épiphytes sont des bactéries qui sont capables de vivre (c'est-à-dire de se
multiplier) sur les surfaces des différentes parties de la plante (racines et feuilles) (Hirano et
Upper, 1991; Leben, 1965). Contrairement à ceux qui sont considérés comme des endophytes,
les bactéries épiphytes peuvent être éliminées à partir de feuilles par lavage (Leben, 1965), ou
tués par irradiation UV ou par une désinfection chimique de la surface des racines (Henis et
Basan, 1986).
Toute fois dans ce groupe de bactéries, on distingue ceux qui sont le plus souvent
associées à la surface de la feuille et dénommées : phyllobacteries (Beattie et Lindow, 1999)
et ceux qui sont appelées : rhizobactéries epiphytiques, utilisé pour désigner toutes les
bactéries associées à la racine des plantes.
I.2.2. Bactéries endophytes
Les bactéries endophytes ont été définies comme des micro-organismes qui pourraient
être isolés à partir de la surface des organes végétaux désinfectées (Hardoim et al., 2008). En
agronomie, ce concept a été encore élargi pour englober toutes les bactéries qui peuvent être
isolées à partir de la surface des tissus végétaux stérilisés et ne nuisent pas visiblement aux
plantes hôtes (Hallmann et al., 1997). Conformément à leurs stratégies de vie, les bactéries
endophytes peuvent être classées comme «obligatoire» ou «facultatif». Les bactéries
endophytes obligatoires ou strictes sont strictement dépendantes de la plante hôte pour leur
croissance et leur survie et la transmission à d'autres plantes se produit à la verticale ou par
des vecteurs. Les bactéries endophytes facultatives ont au moins un stade de leur cycle de vie
dans lequel ils existent en dehors des plantes hôtes (Baldani et al., 1997 ).
Le cycle de vie des endophytes peut être caractérisé comme un cycle biphasique, en
alternant leur présence entre les plantes et l'environnement (principalement des sols). La
grande majorité des micro-organismes qui peuvent prospérer à l'intérieur des plantes ont
probablement une prédisposition à ce mode de vie biphasique. En fait, la diversité des
microorganismes observés à l'intérieur des plantes pourrait s'expliquer par la capacité de ces
endophytes d'entrer et de persister dans les tissus de la plante (Rosenblueth et Martinez-
Romero, 2006). Ces endophytes proviennent souvent de la terre, d'abord elles infectent la
plante hôte en colonisant, par exemple, les fissures qui se sont formées dans les jonctions des
racines latérales, puis en se répandant rapidement dans les espaces intercellulaires des tissus
racinaires (Chi et al., 2005).
Bien que d'autres sites d'entrée existent chez la plante (par exemple les blessures
causées par des nématodes ou les phytopathogènes microbiens ou les stomates trouvées dans
tissus de la feuille), les fissures profondes sont reconnues comme les principaux points de
6
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

prédilection pour la colonisation bactérienne (Sørensen et Sessitsch, 2006). Par conséquent,

pour être écologiquement efficace, les endophytes qui infectent les plantes dans le sol doivent
être colonisateurs compétents des racines de la plante hôte.
I.2.2.1. Modes de pénétration des bactéries endophytes au sein de la plante
D‟après la littérature, la colonisation endophytique des rhizobactéries au niveau
racinaire peut se réaliser de différentes façons (Figure I.2). Tout d‟abord, la zone d‟émergence
des racines secondaires constitue une ouverture naturelle permettant l‟entrée des
rhizobactéries à l‟intérieur de la plante (Reinhold-Hurek et Hurek, 1998). Ensuite, les
blessures provoquées par des facteurs biotiques, comme les bio-agresseurs, peuvent
également permettre l‟entrée des bactéries (Lodewyckx et al., 2002). Une autre possibilité
consiste en la sécrétion par ces micro-organismes d‟enzymes dégradant les parois cellulaires
de la plante telles que des cellulases, des endoglucanases, des polygalacturonases et des
xylanases (Hallman, 2001; Gyaneshwar et al., 2001; Lodewyckx et al., 2002). Cette sécrétion
enzymatique est cependant de faible intensité et n‟est pas une sécrétion continue qui détruirait
les tissus de la plante. Elle permet ainsi juste à certaines PGPR endophytes d‟entrer à
l‟intérieur de leur hôte végétal (Reinhold-Hurek et Hurek, 1998)

Figure I.2 : Illustration des sites possibles d‟infection et de colonisation des racines par des
bactéries endophytes présentés par une section longitudinale et transversale d‟une racine (Reinhold-
Hurek et Hurek, 1998).

7
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

I.3 Rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes (RPCP) ou (PGPR):

La rhizosphère, définit comme la partie du sol situé au voisinage immédiat des racines
des plantes, contient plus d'un million de micro-organismes par gramme de sol et l'activité
microbienne est particulièrement intense dans cette zone sous influence des racines des
différents espèces végétales (Favre- Bonte et al., 2005).
Une partie des bactéries présente dans cette rhizosphère peuvent être impliquée dans
l‟amélioration de la croissance des plantes par divers mécanismes. L‟effet stimulateur de ces
espèces microbiennes est connus depuis des décennies et elles ont été introduites dans le sol,
sur semences ou dans les racines afin d'améliorer la croissance des plantes et de les protéger
vis-à-vis des maladies (Raaijmakers et al., 2002). Le genre Rhizobium, un exemple parmi les
microorganismes favorisant la croissance, est le groupe le plus largement connu. Il a été
commercialisé avec succès avec de nombreuses applications dans l'agriculture pour le
développement de la symbiose avec les plantes.
Le terme rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR) a été initialement
utilisé pour décrire uniquement le groupe microbien impliqué dans la lutte biologique
(Kloepper et al., 1980). Ce terme a ensuite été élargi pour englober toutes les bactéries
bénéfiques associées aux plantes. Les rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes
sont généralement classés en deux grands groupes : (I) bactéries favorisant la croissance des
plantes par le bio-contrôle des agents pathogènes (Biocontrol PGPR) et (II) bactéries
favorisant la croissance des plantes (PGPB) (Bashan et Holguin, 1998).
Les PGPR (plant growth promoting rhizobacteria) forment un groupe hétérogène de
bactéries qui peuvent être trouvées dans la rhizosphère, à la surface des racines et en
association avec les racines, qui peuvent améliorer, directement ou indirectement, la qualité
de croissance de la plante.
Les PGPR sont majoritairement composées à partir des espèces du genre Bacillus,
Streptomyces, Burkholderia, et Pseudomonas et sont considérés comme inoffensifs pour la
plante hôte, la densité de leurs population est souvent très élevés (108 bactéries / g des
racines) (Weller 1988; Lugtenberg et al. 2001).
La plupart des souches bactériennes exploitées comme agent de contrôle biologique
(biocontrol BGPR) appartiennent aux genres Agrobactérium, Bacillus et Pseudomonas (Haas
et Défago, 2005). Beaucoup de recherches se sont concentrées sur ces deux derniers types de
bactéries parce qu'ils sont des colonisateurs communs de la rhizosphère et possèdent une
grande activité dans le contrôle biologique de maladies causées par les microorganismes du
sol. Ils ont aussi la capacité de produire de nombreux antibiotiques et sont faciles à cultiver ou
8
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

à manipuler en laboratoire. De plus, les Bacillus offrent un avantage par rapport aux autres
bactéries en raison de leur capacité à former des endospores résistantes aux conditions
défavorables du milieu (Raaijmakers et al., 2009; Cavaglieri et al., 2005).
I.3.1. Les Pseudomonas
I.3.1.1. Définition
Les Pseudomonas est un genre appartenant au groupe des gamma proteobacteria, ils
forment un large groupe colonisant le sol, les plantes et l‟eau. Ces bactéries Gram négatives,
non sporulantes, sont aérobies obligatoires, à l‟exception de certaines souhes pouvant utiliser
le NO3 comme accepteur final d‟électrons. Leur mobilité est assurée par plusieurs flagelles
polaires, et elles ont un métabolisme mésophile et chimioorganotrophe, la plupart étant
saprophytes (Bossis et al., 2000). Quelques espèces comme P. syringae, sont
phytopathogènes et certaines peuvent causer des infections chez l‟être humain,
particulièrement P. aeruginosa, reconnu comme pathogène opportuniste et causant des
infections pulmonaires mortelles chez les patients atteints de fibrose kystique (Mavrodi et al.,
2001). Plusieurs études ont souligné le degré de diversité au sein de P. fluorescens, ce qui a
mené à la subdivision de cette espèce en différents biovars (Bossis et al., 2000).
Les différentes espèces de Pseudomonas qui colonisent la rhizosphère possèdent
plusieurs caractéristiques intrinsèques qui les rendent particulièrement intéressantes pour une
utilisation comme agents de lutte biologique. Premièrement, leur capacité à coloniser les
racines et à y maintenir une forte densité de population est remarquable (Haas et Keel, 2003).
Cette grande rhizo-compétence vient sans doute de leur taux de croissance plus élevé que
celui de la plupart des autres rhizobactéries et de leur capacité à métaboliser efficacement
plusieurs composés des exsudats racinaires (Chin-A-Woeng et al., 2003). De plus, ces
bactéries sont très faciles à isoler et à cultiver au laboratoire et se prêtent aisément aux
manipulations génétiques (Fenton et al., 1992 ; Chin-A-Woeng et al., 2001).
I.3.1.2. Taxonomie du Pseudomonas : Historique et outils d’identification
Le genre Pseudomonas a été décrit par Migula (1894). Ses membres sont très répandus dans
les habitats naturels tels que le sol, les plantes, les animaux et l'eau (Palleroni, 1984). Les
études nutritionnelles de Stanier et al. (1966) ont montré que la capacité des souches de
Pseudomonas pour utiliser différents composés comme seule source de carbone et de
l'énergie fournit l‟essentiel pour la caractérisation phénotypique du genre. Les groupes
d'espèces diffèrent considérablement dans leur exigence nutritionnelle.
La classification du genre Pseudomonas a servi de référentiel pour des bâtonnets
droits, strictement aérobies, de couleur crème, Gram-négatifs et souvent mobiles par un ou
9
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

plusieurs flagelles polaires. Cette classification a subi de multiples réévaluation sur la base
des caractéristiques physiologiques, moléculaires et phénotypiques (Sneath et al., 1981),
hybridation de l'ADN (Palleroni, 1984), similarité dans le séquence du gène de l'ARNr 16S
(Anzai et al, 2000) et données chimio-taxonomiques (Oyaizu et Komagata, 1983; Vancanneyt
et al, 1996).
[Link]. La classification phénotypique
Des décennies durant, les bactéries ont été caractérisées, regroupées ou identifiées sur
la base de caractères phénotypiques : morphologie, pigmentation, réaction vis-à-vis de
certains colorants, formation de spores, production d‟acide par la dégradation de sucres ou
résistance à certains inhibiteurs (Bossis et al., 2000). Ces méthodes simplifiées de
caractérisation demeurent encore la base des systèmes d‟identification et de classification des
espèces du Pseudomonas.
Les études de Jensen (1965), qui a classé une grande collection de Pseudomonas
fluorescents en 82 biotypes, et ceux de Lelliot et al. (1966), Stanier et al. (1966) ont
contribué dans l‟amélioration de la classification de ce groupe et sa subdivision en espèces et
biotypes. La classification du genre Pseudomonas sur des bases phénotypiques a été reprise
même dans l‟édition du Bergey‟s manual of determinative bacteriology (1974) avec
l‟introduction du G+C comme caractère génétique.
Bossis et al. (2000) ont proposé une clé dichotomique pour l‟identification des
Pseudomonas fluorescents en se basant sur des caractères phénotypiques tels que la
fluorescence, l‟oxydase, la capacité de réduire la gélatine, le tréhalose et bien d‟autres
caractères. Cette clé dichotomique permet de discriminer entre les deux principaux groupes de
ces Pseudomonas à savoir P. fluorescens et P. putida.
La découverte plus tard du caractère de renaturation de l‟ADN a permis de confirmer
la classification phénotypique des Pseudomonas, par les essais d‟hybridation ADN/ADN ce
qui a permet à Palleroni et al. (1973) de classer le groupe en cinq sous classes d‟ARNr.
Néanmoins l‟éloignement phénotypique des différents groupes d‟ARNr a conduit Peix et al.
(2009) à établir que seules les espèces du groupe ARNr I appartiennent au genre
Pseudomonas.
[Link]. La classification phéno-génétique
Les premiers changements majeurs dans la taxonomie de Pseudomonas fussent
apportés par Woese et al. (1984) qui ont proposé une nouvelle classification de ces espèces
sur la base de leurs ARN ribosomaux. Toutefois ce nouveau schéma d‟identification n‟a pas
été pris en considération dans l‟édition 1994 du Bergey‟s Manual. Plus tard Kersters et al.
10
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

(1996) ont repris les propositions de Woese et al. (1984) dans leur rapports pour classer les
proteobactéries sur la base del‟ARNr 16s en 15 genres.
A partir de 1990, le séquençage de l‟ARNr 16s est appliqué pour l‟ensemble des
bactéries nouvellement isolées. Partiel au début pour être ensuite appliqué sur l‟ensemble du
génome. Le séquençage du gène codant l‟ARNr 16S et le développement des modèles
mathématiques des arbres représentant les similitudes des séquences ont permis une
classification phylogénétique des procaryotes (Peix et al., 2009).
Les résultats des études de similarité d'ARNr chez le genre Pseudomonas ont été très
frappantes, car ils ont clairement indiqué que genre était en fait une entité multi-génériques
qui pourrait être divisée en au moins cinq groupes lointainement apparentés et qui méritent
d‟être classés en genre indépendants (et éventuellement en famille ou ordre) (Palleroni et al.
1973).
En analysant les séquences du gène codant pour l‟ARNr de 128 espèces de
Pseudomonas Peix et al. (2009) ont conclu que 57 seulement appartenaient aux groupe des
Pseudomonas sensu stricto; la comparaison de 1073 nucléotides les a subdivisées en 7 classes
(Mezaache, 20112):
-Le groupe des P. syringae.
-Le groupe des P. chlororaphis.
-Le groupe des P. fluorescens.
-Le groupe des P. putida.
-Le groupe des P. stutzeri.
-Le groupe des P. aeruginosa.
-le groupe des P. pertucinogena.
[Link]. La classification chemio-taxonomique
Les études taxonomiques polyphasiques et l‟analyse de la séquence du gène de l‟ARNr 16S
ont largement contribué à la stabilisation de la taxonomie de Pseudomonas. Toutefois, la
valeur de la chimio-taxonomie pour aider à délimiter les taxons est encore largement négligée.
Plusieurs paramètres chimiques et biochimiques ont été utilisés pour la différenciation entre
les espèces de Pseudomonas. C‟est ainsi que Janse et al. (1992), avaient analysé les acides
gras d‟une collection de phytopathogènes opportunistes, pour clarifier la position
taxonomique de souches de P. marginalis incluses dans le groupe de P. fluorescens. De même
que Meyer et al. (2002) ont utilisé le siderotypage des Pseudomonas fluorescents et non
fluorescents ce qui a conduit à la mise en évidence de pyoverdines spécifiques aux espèces.

11
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

Actuellement, les techniques les plus modernes d‟analyse des biomolécules sont
appliquées pour la taxonomie des Pseudomonas. En effet, l‟empreinte génétique par
spectroscopie à fluorescence (spectres d‟émission de fuorophores intrinsèques: NADH,
tryptophane et un complexe d‟acides aminés aromatiques et d‟acides nucléiques), a permi une
discrimination entre les genres Pseudomonas, Burkholderia, Xanthomonas ou
Stenotrophomonas avec une grande sensibilité. Mais aussi, entre les espèces de P.
chlororaphis, P. lundensis, P. fragi, P. taetrolens et P. stutzeri groupé séparément de P.
putida P. pseudoalcaligenes et P. fluorescens (Mezaache, 2012).
I.3.3.4. Les espèces de Pseudomonas
Les espèces de Pseudomonas sont omniprésentes dans l‟environnement et sont répandus
dans la rhizosphère et phyllosphère. Un sous-groupe particulier, les Pseudomonas
fluorescents a fait l‟objet de nombreuses études dans le domaine de la lutte biologique. Ces
bactéries se distinguent par la formation d‟un pigment diffusible, jaune-vert résultat de la
production d‟un sidérophore, pyoverdine (pseudobactine) (Meyer et Abdallah, 1978). Les
Pseudomonas fluorescents sont composés d‟une gamme d‟espèces telles que Pseudomonas
syringae, Pseudomans fluorescens, Pseudomans aeruginosa et Pseudomonas putida.
 Pseudomonas syringae: phytopathogène se caractérise par une croissance lente sur les
milieux de culture usuels, par l'absence d'arginine dihydrolase et une réaction positive au test
d'hypersensibilité des feuilles de tabac. Ils sont également oxydases négatives.
 Pseudomonas fluorescens: A l‟inverse de P. aeruginosa, elle est très hétérogène et se
subdivise en biotypes ou biovars sur la base de critères taxonomiques divers. Palleroni
(2010) précise qu'aucune de ces subdivisions n'est entièrement satisfaisante, l'exemple le
plus représentatif est la description de l'espèce psychotrophe isolée de viande P. lundensis,
préalablement d'écrite comme groupe bien défini au sein d'un des biovars.
 Pseudomonas putida : espèce fluorescente saprophyte et gélatinase négative, a été divisée
par Stanier et al. (1972) en deux biovars: le biovars A et biovars B, ce dernier présent un
phynotype plus proche de P. fluorescens que de celui de P. putida biovars A (Freney et al.,
2000).
I.3.1.3. Habitat des Pseudomonas
Les Pseudomonades ont souvent une versatilité nutritionnelle très large, ce qui leur
permet de vivre dans des niches écologiques naturelles très diverses. A cause de la richesse de
leurs voies métaboliques, elles sont souvent capables de résister à de nombreuses conditions
environnementales ce qui favorise la sélection de certaines espèces dans certains milieux
particuliers.
12
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

Dans le sol, les Pseudomonas représentent une grande fraction de la communauté

microbienne partageant leur milieu avec des commensaux représentant principalement les
genres Bacillus et Actinomyces. On les retrouve particulièrement sur les systèmes racinaires
des plantes, P. brassicacearum et P. thivervalensis ont été isolés respectivement de plants
d‟ail et de riz (Achouak et al., 2000). P. rhizosphaerae, P. lutea et P. argentinensis isolé de la
rhizosphère de l‟herbe (Peix, 2005), d‟autres ont été isolées à partir de la phyllosphère des
plantes le cas de P. lurida de la phyllosphère de l‟herbe (Behrendt et al., 2007) alors que
d‟autres peuvent même coloniser les tissus internes des plantes (Ramesh et Joshi, 2009).
Les bactéries de cette famille sont relativement rares au contact de l‟homme ; on les
retrouve très rarement sur la peau ou les muqueuses, et plus souvent dans la flore intestinale.
Elles vivent principalement dans l‟eau douce et dans le sol (souches dulçaquicoles). Des
souches marines existent aussi, certaines halophiles stricts et d‟autres halophiles facultatives,
qui appartiennent à diverses espèces dulçaquicoles, en particulier du groupe fluorescent (Le
Minor et Véron, 1982).
Elles peuvent aussi grâce au caractère psychotrope de nombreuses souches, détériorer
des denrées alimentaires, des médicaments ou des réactifs biologiques conservés au froid
(Leminor et Véron, 1982).
I.3.1.4. Activité des espèces de Pseudomonas dans la lutte biologique
L‟intérêt pour Pseudomonas en lutte biologique a débuté dans les années 1970 par des
recherches à l‟Université de Californie, Berkeley, ou des souches de Pseudomonas ont été
appliquées sur la pomme de terre, betteraves à sucre et les grains de radis pour l‟amélioration
de la croissance des plantes (Schoth et Hancock, 1982). Des études ultérieures se sont axées
sur le rôle des composés chélateurs de fer ou les sidérophores dans la suppression des agents
pathogènes (Kloepper 1980; Schroth et Hancock, 1982). Bien que la production
d'antibiotiques de Pseudomonas a été démontrée in vitro, la première preuve expérimentale
qu'un antibiotique de Pseudomonas était responsable de la suppression de la maladie sur une
plante hôte a été démontrée en 1988 par Thomashow et Weller. Leur expérience a clairement
démontré que l‟antibiotique d‟acide pénazine 1-carboxylique (PCA), produit par
[Link] 2-79 a été capable de supprimer le piétin-échaudage, maladie causée par
Gaeumannomyces graminis var. tritici sur le blé (Thomashow et Weller, 1988). Peu après,
une autre étude a été publiée décrivant l‟activité antagoniste d‟une autre souche, [Link]
CHAO. La souche P. fluorescens 2-79 a été isolé de la rhizosphère du blé. P. fluorescens
CHAO a été isolé du sol naturellement suppressif au pourriture des racines du tabac. Ces deux
espèces ont été émergées comme des organismes de lutte biologique modernes et une pléthore
13
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

d‟antibiotiques produits par ces dernières et d‟autres isolats ont été identifiés. Pseudomonas
chlororaphis souche MA342 en traitement de semences de pois a été également testé pour
lutter contre les maladies causées par Ascochyta pisi, Mycosphaerella pinodes et Phoma
medicaginis var. pinodella (Voisard et al., 1989) .

Tableau I.1. Quelques exemples récents d‟agents de contrôle biologiques à base de

Pseudomonas spp. fluorescents (depuis 2004) (Amkraz, 2013)

14
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

I.3.2. Les Bacillus

L‟histoire du genre Bacillus est longue et chevauche avec l‟histoire de la bactériologie.
„Vibrio subtilis’ – actuellement Bacillus subtilis - a été décrit par Ehrenberg en 1835 et en
1864 Davaine attribut le nom „Bacteridium‟ au microorganisme associé à l‟anthrax.
Finalement, le genre Bacillus a été proposé pour la première fois par Cohn en 1872 (Berkeley,
2002).
En 1872, Ferdinand Cohn, un élève de Robert Koch, reconnut et nomma la bactérie Bacillus
subtilis. L'organisme a été fait pour représenter un grand nombre et diversifié d‟espèces de
Bacillus, et il a été ensuite placée dans la famille des Bacillaceae. La Caractéristique
distinctive de la famille est la production d'endospores, qui n‟est pas une structure de
reproduction, mais plutôt une forme de survie et de résistance en dormance. Depuis ce temps,
les membres du genre Bacillus sont caractérisés comme des bacilles, gram-positif, aérobies et
anaérobies facultatives, formant des endospores (Todar, 2005).
Depuis la découverte (création) du genre Bacillus, la systématique du genre a connu
des changements massifs. Le tableau I.2 donne un aperçu numérique des espèces attribuées au
genre Bacillus dans les huit premières éditions de Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology révisées par Gordon (1981) (Berkeley, 2002).

Tableau I.2. Nombre des espèces attribuées au genre Bacillus dans les différents éditions du
Manuel de Bergey jusqu‟au 1974 (Gordon, 1981).
Manuel de Bergey Année Nombre des espèces

1ere édition 1923 75

2eme édition 1925 75
3eme édition 1930 93
eme
4 édition 1934 95
5eme édition 1938 146
6eme édition 1948 33
7eme édition 1954 25
8eme édition 1974 Groupe I : 22
Groupe II : 26

15
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

I.3.2.1. Caractères bactériologiques du genre Bacillus

Les espèces du genre Bacillus sont des bacilles pratiquement rectilignes, à extrémités
carrées ou arrondies, de taille variable (de 0.5 x 1.2 µm jusqu‟à 2.5 x 10 µm), sporulés, à
Gram positif ou à Gram variable (fréquemment, la coloration de Gram n‟est positive que chez
les très jeunes cultures). Généralement, mobiles grâce à une ciliature péritriche (Bacillus
anthracis et Bacillus mycoides sont immobiles et pour les espèces mobiles, la mobilité est
variable selon les souches), parfois capsulés (Bacillus anthracis, Bacillus licheniformis,
Bacillus megaterium et Bacillus subtilis peuvent élaborer une capsule formée d‟un polymère
d‟acide glutamique), aérobies ou aéro-anaérobies, le plus souvent catalase positive, donnant
une réponse variable au test de l‟oxydase.
La culture de ces germes peut s'avérer difficile car certaines espèces exigent de nombreux
facteurs de croissance. L'aspect des colonies obtenues sur milieu gélosé est extrêmement
variable et les phénomènes de dissociation sont fréquents. Lorsque les conditions deviennent
défavorables, les Bacillus sporulent et donnent des spores (une seule spore par cellule
végétative) souvent très résistantes dans le milieu extérieur. Le phénomène de sporulation,
n'est pas inhibé par l'oxygène. La sporulation dépend des conditions de culture et, in vitro,
certaines espèces ne sporulent que dans des milieux spécifiques (Euzéby, 2004). Chez
certaines espèces la formation des spores n‟a pas été détectée (B. infernus, B. subterraneus,
and B. thermoamylovorans ) (Logan et Allen, 2008 ).

Tableau I.3 : Position taxonomique du genre Bacillus (Maheshwari, 2010)

Domaine Bacteria

Embranchement Firmicutes

Classe III Bacilli

Ordre I Bacillales

Famille I Bacillaceae

Genre Bacillus

16
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

Traditionnellement, les espèces du genre Bacillus sont réparties en trois groupes selon la
morphologie de la spore et du sporange (Euzéby, 2004).
 Le groupe I est constitué des bacilles à Gram positif, présentant une spore centrale
ou terminale, sphérique ou ovoïde, ne déformant pas la cellule. Ce groupe est divisé
en 2 sous-groupes :
-Le sous-groupe IA constitué par des bacilles d‟un diamètre supérieur à 1 µm et
contenant des inclusions de poly-bêta-hydroxybutyrate (Bacillus anthracis, Bacillus
cereus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus
thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis) .
-Le sous- groupe IB rassemblant des bacilles d‟un diamètre inférieur à 1 mm et
dépourvus d‟inclusions de poly-bêta-hydroxybutyrate (Bacillus coagulans, Bacillus
firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus...).
 Le groupe II est constitué des espèces à Gram variable, présentant une spore ovoïde,
centrale ou terminale, déformante (Bacillus circulans, Bacillus stearothermophilus…).
 Le groupe III est caractérisé par des bacilles à Gram variable et présentant une
spore sphérique, déformante, terminale ou sub-terminale (Bacillus fusiformis,
Bacillus globisporus, Bacillus insolitus, Bacillus sphaericus...)
I.3.2.2. Habitat des Bacillus
Les Bacillus sont des germes de l'environnement dont l'habitat principal est le sol où ils
joueraient un rôle dans les cycles du carbone et de l'azote. La résistance des spores et la
diversité physiologique des formes végétatives en font des bactéries très ubiquistes que l‟on
peut isoler à partir des différents types de sol allant des sols acides aux sols alcalins en passant
par les sols neutres du sol, de l‟eau de mer, de l‟eau douce ou de denrées alimentaires. Quatre-
vingt-cinq pour cent des bacilles Gram positif du sol appartiennent au genre Bacillus. Les 5%
restants appartiennent au genre Arthrobacter et Frankia.
Plusieurs facteurs sont connus pour affecter la formation des endospores chez les
Bacillus (température de croissance, pH de l'environnement, l'aération, la présence de certains
minéraux et les sources d'azote et du carbone, du phosphore et leurs concentrations), mais
deux types de facteurs environnementaux, l‟épuisement des éléments nutritifs et la densité de
population sont d'une importance particulière dans l'induction de la sporulation. Les
endospores sont métaboliquement inertes et cette dormance est la clé de leur résistance à de
nombreux agents, notamment la chaleur, les rayonnements et les produits chimiques ce qui
leur assure une survie sur de longues périodes (Logan et Halket, 2011).

17
Chapitre I : Rhizobactéries libres et endophytes

I.3.2.3. Activité des espèces de Bacillus dans la lutte biologique

Les spores de Bacillus sp ont un niveau élevé de résistance à la sécheresse, cette
capacité de résistance offre les Bacillus sp comme les meilleurs candidats pour le
développement des biopesticides efficaces. Les espèces du genre Bacillus sont souvent
considérés comme des usines microbiennes pour la production d‟une vaste gamme des
molécules biologiquement actives; ces molécules inhibent la croissance des phytopathogènes,
comme les Kanosamines ou Zwittermycine A de Bacillus cereus (Emmert et Handelsman,
1999).
L‟espèce Bacillus subtilis est très connue dans le contrôle biologique notamment dans la
lutte de la pourriture de la racine de tomate causée par Fusarium oxysporum (Makoto, 2000);
dont, 4% à 5% de son génome est orienté vers la synthèse des antibiotiques (Stein, 2005).
Il a été démontré que Bacillus subtilis produit plusieurs types d‟antibiotiques:
bacillomycine, mycosubtiline et mycobaciline qui sont impliqués dans le bio-contrôle
(Makoto, 2000).
Fiddman et Rossal (1993) ont démontré que Bacillus produit des composés volatiles
qui sont des antifongiques contre Rhizctonia solani et Pythium ultimum. La croissance de ces
deux champignons a été sévèrement diminuée par la présence de ces composés volatiles, ainsi
que des anomalies physiologiques du mycélium ont été observées incluant leur déformation et
vacuolisation (Anandhakummar, 2006).
Bacillus cereus synthétise une enzyme chitinolytique qui est utilisé dans le biocontrole
contre Rhizoctonia solani. L‟espèce Bacillus mycoides induit la résistance de betterave à sucre
par production des enzymes (peroxydases, chitinases et β 1 ,3 glucanase).
Les Surfactins et lichenysins ont été isolés à partir de Bacillus coagulans (Huszcza et
Burczyk, 2006), Bacillus pumilus et Bacillus lichennformis (Peypoux et al.,1999).
La production des fengycins a été identifiée chez Bacillus cereus (Tsuge et al., 1999),
Bacillus thuringieus (Kim et al.,2004), Bacillus subtilis (Jacques et al.,1999) et Bacillus
amyloliquefaciens (Koumoutsi et al.,2004).

18
Chapitre II :
Mécanismes
d’action
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

II.1. Mécanismes d’actions des bactéries impliquées dans la lutte biologique

La lutte biologique est définie par l’OILB (Organisation Internationale de Lutte
Biologique et intégrée contre les animaux et les plantes nuisibles) (1971) comme étant
« l’utilisation d’organismes vivants ou de leurs produits pour prévenir ou réduire les dégâts
causés par des ravageurs aux productions végétales ». Cette définition a été ensuite élargie
pour considérer comme agents de lutte biologique les microorganismes (bactéries,
champignons, virus), les composés organiques tels que les extraits de plante ainsi que les
substances minérales d’origine naturelle qui permettent le contrôle d’agents pathogènes. Le
contrôle biologique offre une alternative prometteuse pour suppléer ou compléter les
méthodes conventionnelles de lutte contre les maladies des plantes (Duffy et al., 2003).
La lutte biologique au moyen de microorganismes non pathogènes s’appuie sur un ou
plusieurs mécanismes d’actions. Ces bactéries peuvent agir directement sur l’agent pathogène,
par antibiose, compétition ou parasitisme, ou bien indirectement par stimulation des réactions
de défense de la plante conduisant à leur tour à la mise en place d’une résistance systémique
vis-à vis de l’agent pathogène(fig. II.1) (Magnin-Robert, 2007). Selon Guetsky et al. (2002),
l'efficacité de la lutte biologique peut être parfois insuffisante et la variabilité dans les
résultats peut être élevée. Pour surmonter ce problème et améliorer l'efficacité de la lutte
biologique, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le bio-contrôle est
nécessaire.

Figure II.1. Schéma représentant les mécanismes possibles des PGPR impliqués dans la
lutte biologique (Lotta, 2008).

19
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

II.1.1. La compétition
Droby et Chalutz (1994) définissent la compétition comme le chevauchement des
niches, où on enregistre une demande simultanée par deux ou plusieurs populations
microbiennes pour les mêmes ressources nutritives. Tous les micro-organismes ont besoin
d'éléments nutritifs pour leur développement et leur multiplication, la concurrence pour les
éléments nutritifs sur les surfaces des plantes ou dans la rhizosphère peut être un mécanisme
important de la lutte biologique contre les agents pathogènes qui dépendent des nutriments
externes pour le développement de leur population (Shtienberg et al., 2001). Basé la
démonstration que l’addition du glucose aux sols suppressifs les transforme en sols conducifs,
il a été admis que la compétition pour le carbonne est un des mécanismes de la suppression
des agents pathogènes dans le sol suppressif. De leur part Lemanceau et al. (1993) ont
démontré in vitro que la compétition pour le carbonne est un mécanisme principale par le quel
la souche Fo47 inhibe la croissance de F. oxysporum f. sp dianthi WCS816. La compétition
trophique s’exerce essentiellement pour les exsudats racinaires et pour le fer.
Un cas particulier de la compétition pour les éléments nutritifs repose sur la
compétition pour le fer. En effet, ce dernier élément bien qu’abondant dans le sol, s’y trouve
essentiellement sous forme oxydée (Fe3+) non assimilable par les micro-organismes
telluriques. Certains micro-organismes ont la capacité de synthétiser des molécules chélatrices
du fer nécessaire à leur croissance. Ces composés, appelées sidérophores, ont une grande
affinité pour le Fe3+ (Figure II.2). En s´appropriant les ions ferriques présents dans la
rhizosphère, les microorganismes rendent ainsi le fer non disponible pour l’agent pathogène,
ce qui provoque un ralentissement de sa croissance. Kloepper et al. (1980) ont été les
premiers à prouver la synthèse d’un sidérophore (Pseudobactin) par une souche de P. putida.
Ces auteurs ont pu démontrer la corrélation entre la synthèse de cette molécule et le potentiel
antagoniste de cette souche contre les pathogènes; ceci grâce à l’utilisation de souches
mutantes dont le gène responsable de la synthèse de Pseudobactin a été supprimé (Amkraz,
2013).
Dans certains cas, la réduction de la maladie peut être associée à une colonisation
importante des racines par les bactéries bénéfiques, ce qui réduit le nombre de sites habitables
pour les microorganismes pathogènes et par conséquence, leur croissance (Reyes et al. 2004).
Cependant, cette corrélation entre l’importance de la population de PGPR sur les racines et la
protection observée n’est dans certains cas pas vérifiée et ne peut donc pas être considérée
comme une règle générale. Selon Elad et Stewart (2004). La réduction de la concentration en
nutriments dans le milieu conduit généralement à un taux réduit de spores germées de l’agent
20
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

pathogène et à un ralentissement de sa croissance mycélienne, limitant ainsi l’infection et

l’expansion des lésions.
Une illustration de l’effet de la compétition pour l´espace concerne la lutte
biologique contre le Fusarium oxysporum , agent de flétrissement des plantes, par l’utilisation
de Fusarium oxysporum non pathogène (Alabouvette, 1990) ou par Trichoderma sp. Il est à
noter que les mycorhizes sont aussi considérés comme des colonisateurs d’espaces (Haupt,
2007). Mandeel et Baker (1991) rapportent que le nombre de sites d’infection à protéger par
l’agent non pathogène est limité et que le contrôle de l’agent pathogène ne nécessite pas une
concentration élevée de l’inoculum par contre un rapport non pathogène/pathogène élevé est
nécessaire pour un effet protecteur efficace.

Figure II.2. Structures des Sidérophores : (A) : hydroxamate ; (B) : Ferrichrome ; (C):
Triacetylfusarinine C. (D): Ferrioxamine. Catecholate Enterobactin (Leong et Winkelmann.
1998).

21
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

II.1.2. Antibiose
L'antibiose est probablement le mécanisme le plus connu et peut-être le plus utilisé par
les PGPR pour limiter l'invasion de pathogènes dans les tissus de la plante hôte (Jacobsen,
2006). Il s’agit de la production par un microorganisme de métabolites secondaires toxiques
pour l’agent pathogène qui vont inhiber la germination, la croissance mycélienne et/ou la
sporulation des agents pathogènes (Montesinos et al., 2009). Des substances responsables de
l'antibiose ont pu être caractérisées chez plusieures souches appartenant à diverses espèces
d'agents de lutte biologique (notamment Bacillus subtilis, Serratia plymuthica, Pseudomonas
fluorescens), et les gènes impliqués dans la production de certaines de ces substances ont été
identifiés (Duffy et al., 2003; Raaijmakers et al., 2002).
II.1.2.1. Production des antibiotiques par les rhizobactéries
Au cours des 20 dernières années, de nombreuses études ont démontré sans équivoque
que plusieurs métabolites, y compris les antibiotiques, les enzymes et des substances volatiles
produits par les bactéries antagonistes jouent un rôle clé dans le contrôle biologique des divers
agents phytopathogènes (Weller 1988; Whipps, 1997).
Un antibiotique est défini comme une substance d'origine biologique ou synthétique,
agissant spécifiquement sur une étape essentielle du métabolisme des bactéries (agent
antibactérien) ou des champignons (agent antifongique). L’antibiotique est capable d'inhiber
la croissance ou de détruire d’autres micro-organismes (Le Minor et Véron, 1989). Les
antibiotiques englobent un groupe de composés organiques hétérogènes, de faible poids
moléculaire produit par les microorganismes. A faibles concentrations, les antibiotiques sont
délétères pour la croissance ou l'activité métabolique d'autres microorganismes (Fravel, 1988).
La production des antibiotiques est un phénomène très répandu dans la nature, un grand
nombre de microorganismes sont reconnus comme producteurs d’antibiotiques in vitro et
peuvent avoir un rôle dans le contrôle d’un certains nombre de maladies (Droby and Chalutz
1994). Dans les dernières décennies, de nombreux antibiotiques ont été isolées à partir de
différentes souches agents de lutte biologique représentant différents genres bactériens.
Cependant il faut noter que la production des antibiotiques est souvent influencée par les
facteurs environnementaux (biotiques ou abiotiques), essentiellement les interactions avec la
microflore du sol, la composition en matière organique, le pH ou encore la température
(Toumatia, 2015).

22
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

II.[Link]. Les antibiotiques du genre Pseudomonas

La production d’antibiotiques par Pseudomonas est désormais reconnue comme un facteur
important dans le contrôle de plusieurs maladies. Ce genre bactérien produit une myriade de
composés présentant des activités antimicrobiennes, notamment; les phénazines, la
pyolutéorine, la pyrrolnitrine, la tropolone et le 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG). Leur
spectre d’action varie grandement d’une molécule à l’autre. Certains sont faiblement
spécifiques, telle la tropolone, qui pourrait entraver la croissance d’organismes bénéfiques.
La figure II.3 illustre justement la structure diverse de plusieurs métabolites secpndaires
produites par Pseudomonas.

Figure II.3. Structure de quelques métabolites secondaires produits par Pseudomonas sp

impliqués dans le contrôle biologique des maladies des plantes (Dowling et O’gara, 1994).

23
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

II.[Link]. Les antibiotiques du genre Bacillus

Les membres du genre Bacillus sont capables de produire des antibiotiques comme
métabolites secondaires pendant la fin de la phase logarithmique ou le début de la phase
stationnaire de la croissance des cultures en discontinu. Plus de 169 de ces métabolites
secondaires ont été mis en évidence chez les Bacillus. Il a été par exemple démontré que 68
différents antibiotiques sont produits par différentes souches de B. subtilis, pendant que B.
brevis peut produire jusqu’à 23 antibiotiques (Katz et Demain, 1977). Selon stein (2005), de
4 à 5% du génome de B. subtilis est exclusivement consacré pour la synthèse des antibiotiques
et cette espèce a le potentiel de produire une dizaine de molécules d’antibiotiques de structure
chimique variable.
Parmi la vaste gamme de molécules biologiquement actives synthétisées par Bacillus,
certains ont été reconnus pour leur activité inhibitrice contre les agents phyto- pathogènes et
cette activité antagoniste ou antibiose est probablement le mécanisme le plus connu et le plus
utilisé par ces espèces pour limiter l'invasion de pathogènes dans les tissus de la plante hôte.
En fonction de leur structure chimique, les antibiotiques peptidiques représentent la
classe prédominante des antibiotiques de Bacillus. Ils sont de différentes tailles, peuvent être
composés entièrement d'acides aminés mais certains contiennent d'autres résidus. Les
antibiotiques cycliques ou Oligopeptides linéaires et des aminoglycosidiques sont aussi
produits le plus souvent (Stein, 2005).
Une classe majeure des antibiotiques peptidiques de Bacillus sont les antibiotiques
lipopeptides cycliques qui peuvent varier en fonction du type et de la séquence des résidus
d'acides aminés ainsi que la nature de la cyclisation du peptide et dans la nature et la longueur
de la chaîne de l'acide gras (Ongena et Jacques, 2008). Dans diverses espèces de Bacillus, les
trois familles principales sont les surfactines, les iturines et les fengycines. Chacune des
familles renferment des variants structuraux selon l'origine génétique de la souche
productrice considérée et par conséquent chaque groupe d’antibiotiques peptidiques affiche
une activité antagoniste différentielle vis-à-vis des différents agents phyto-pathogènes (Cawoy
et al., 2011).
Un autre groupe d'antibiotiques peptidiques habituellement produits par Bacillus
subtilis sont les lantibiotiques (Stein, 2005). Ces composés présentent de fortes activités
antibactériennes contre les bactéries gram-positive mais leur implication dans l'activité de
lutte biologique des isolats de Bacillus associées aux plantes n'a pas été clairement démontré à
ce jour. Des molécules plus simples, tel que le bacillysine (un dipeptide) exhibent également

24
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

des effets bactéricides forts et sont apparemment impliqués dans le contrôle de certains agents
phyto-pathogènes (Chen et al., 2009).
II.1.3. Hyperparasitisme
Le parasitisme des agents pathogènes par d’autres microorganismes repose sur la production
d’enzymes dégradant les parois cellulaires des agents pathogènes. Le parasite pénètre dans les
cellules de sa cible et le détruit via la colonisation de ses organes. Le parasitisme des
champignons a été largement étudié, notamment avec Trichoderma, Gliocladium et Pythium
spp. qui figurent parmi les principaux parasites reconnus. Le champignon Coniothyrium
minitans parasite l’agent pathogène Sclerotinia sclerotiorum en produisant des enzymes qui
dégradent les parois cellulaires de l’agent pathogène cible (Elad er Stewart, 2004 ; Comby,
2011). L’usage en protection biologique d’hyperparasites a des contraintes comme la
nécessité d'un contact direct avec l'agent pathogène et la lenteur possible de la destruction de
ce dernier (Fravel, 2005).
Il faut également souligner que les enzymes hydrolytiques et les antibiotiques produits
par les agents antagonistes ont souvent une activité synergique, et qu’à l’instar des
antibiotiques, la production des enzymes et soumise à l’influence des facteurs biotiques et
abiotiques (Toumatia, 2015).

25
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

Tableau II. 1. les principaux antibiotiques produits par certaines espèces de Bacillus et leur
spectre d’action (Slepecky et Hemphil, 2006).

Espèces Antibiotiques
B. subtilis Subtilinea
Surfactineb
Bacillysinea
Difficidinec
Oxydifficidinec
Bacillomycine Fd
Mycobacillined
B. brevis Gramicidinea
Lincar gramicidinea
Tyrocidinea
B. licheniformis Bacitricinea
Proticine
B. pumilis Pumilinea
Tétaine
B. mesentricus Esperinea
B. polymexa Polymixinee
Colistinee
B. circulans Circulinea
Butirosinea
B. laterosporus Laterospuraminea
Laterosporinea
B. cereus Biocerinee
Cerexinea
A: actif contre les bactéries Gram positif
C : large spectre d’action
D : action antifongique
E : actif contre les bactéries Gram
négatif

26
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

II.1.4. Induction de la résistance de la plante hôte

En plus des barrières physiques et chimiques préformées, les plantes possèdent des
systèmes de reconnaissance et de réponses de défense induites qui sont déclenchées
immédiatement après le premier contact avec des molécules étrangères et sont renforcées par
l´interaction prolongée avec les agents pathogènes (Göhre et Robatzek, 2008). Lorsque leurs
barrières physiques et biochimiques constitutives ne suffisent plus à limiter le pouvoir
infectieux de pathogènes nécrotiques, les végétaux peuvent faire appel à l’activation d’un
spectre complexe de mécanismes de défense cellulaires. Les deux formes les mieux définies
de résistance induite sont la résistance systémique acquise (SAR) et la résistance systémique
induite (ISR) (Figure IV.10). Ces deux types de résistance peuvent être différenciés par la
nature de l´agent inducteur et les voies régulatrices impliquées (Pieterse et al., 1996; Knoester
et al., 1999; Schenk et al., 2000).
Certaines souches de PGPR peuvent protéger les plantes d´une façon indirecte par la
stimulation de mécanismes de défense inductibles dans la plante, ce qui peut rendre l´hôte
beaucoup plus résistant à l´agression future par des agents pathogènes.(Ryals et al., 1996).
Les rhizobactéries de la famille des Pseudomonaceae sont capables de synthétiser de
nombreuses molécules de différentes natures impliquées dans l’induction ou la
potentialisation des réactions de défense de la plante, conduisant à leur tour à la mise en place
d’une ISR. L’utilisation de mutants bactériens déficients en différents composés a fait preuve
de nombreuses démonstrations quant à la signification physiologique des constituants
bactériens associées à l’ISR. Parmi les composés bactériens stimulateurs des réactions de
défense et / ou inducteurs de l’ISR, on note la production de sidérophores, d’antibiotiques, de
lipopolysaccharides, d’exopolysaccherides (EPS), de flagelline (Magnin-Robert, 2007).

27
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

II.2. Mécanismes d’action impliqués dans la promotion de la croissance de l´hôte

Diverses souches de PGPR des genres Pseudomonas, Bacillus, Paenibacillus,
Rhodobacter, Azospirillum ont été récemment décrites pour leur effet direct positif sur la
croissance des plantes et l´augmentation du rendement de la culture (légumes, pomme, citron,
myrtille, mûre, abricot, framboise, betterave à sucre…) (Welbaum et al., 2004). Les PGPR
peuvent favoriser la croissance des plantes hôtes par divers mécanismes tels que : la fixation
d´azote (N2), la solubilisation d´oligo-éléments tel que le phosphate (P), l´inhibition de la
synthèse d'éthylène par la plante, la synthèse des phytohormones ou de vitamines ou par la
diminution de la toxicité des métaux lourds (Burd et al., 1998; Whipps 2001).
II.2.1. Solubilisation du phosphate inorganique
Le phosphore est l'un des principaux éléments nutritifs dans le sol. Il est souvent
désigné comme l’«énergisant», car il permet le stockage et le transfert d'énergie lors de la
photosynthèse. Il fait également partie du matériel génétique de toutes les cellules - ADN et
l'ARN. Toutes les plantes ont besoin de phosphore pendant les périodes de croissance rapide.
Sans phosphore, la croissance des plantes est retardée. Les symptômes de carence en
phosphore comprennent des racines rabougries, un pigment rouge dans les bases des feuilles,
des feuilles ternes vert-grisâtre (Abat, 2006).
Dans le sol, le phosphate se présente sous deux entités différentes : Le phosphate
totale qui désigne la quantité globale du phosphate présente dans le sol et le phosphate
assimilable (soluble) représenté par la fraction du phosphore totale susceptible d’être absorbée
par les racines des plantes (Pierzynski et al., 2000). Cette dernière représente le plus souvent
de 1 à 5% du phosphate total.
De nos jours, de grande quantité de phosphore sont présentes dans le sol suite à une
fertilisation intense par les engrais chimiques pendant de longues périodes. D’autre part une
grande part de cet élément se présente sous forme minérale, non assimilable par les plantes
(Martínez-Viveros et al., 2010). La disponibilité du phosphore pour une culture est définie
comme la quantité totale de P dans le sol susceptible d'aboutir dans la solution du sol sous
forme d'ions orthophosphates pendant une période équivalente à la durée de croissance de la
culture (Frossard et al, 2004). Dans les sols agricoles la conversion du phosphate minéral
insoluble en phosphate soluble (assimilable) est réalisée le plus souvent par les plantes ou à
travers l’activité des microorganismes présents dans la rhizosphère des plantes (Arcand et
Schneider, 2006).
La preuve de l'origine naturelle des micro-organismes rhizosphériques solubilisant le
phosphore (PSM) remonte à 1903 (Khan et al., 2007). Parmi l'ensemble de la population
28
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

microbienne du sol, les bactéries solubilisant les phosphates (BSP) constituent 1 à 50% de la
flore totale, en plus, ces bactéries sont plus efficaces dans la solubilisation de phosphore que
les champignons (Alam et al., 2002). Les souches des genres Pseudomonas, Bacillus,
Rhizobium et Enterobacter ainsi que Penicillium et Aspergillus sont des agents puissants dans
la solubilisation de phosphates (Whitelaw, 2000). L’importance et la nature de la population
des BSP dépend d’une part des propriétés du sol (propriétés physiques et chimiques, le
contenu en matières organiques et P) et d’autre part, des activités agricoles (Kim et al., 2007).
La solubilisation du phosphate se fait à travers différents processus et mécanismes
microbiens, y compris la production d'acide organique et d'extrusion de protons liée à
l’assimilation du NH4+ (Nahas, 1996; Sagoe et al., 1998). Le P inorganique est solubilisé par
l'action des acides organiques et inorganiques sécrétés par les BSP dans lequel les groupes
hydroxyles et carboxyles des différents acides chélatent les cations (Al, Fe, Ca) liés au
phosphates, ce dernier étant converti en formes solubles et les mêmes acides peuvent aussi
provoquer une diminution dans le pH du sol (Stevenson, 2005). La sécrétion par les BSP de
phosphatases (Acide ou alcaline) et de phytases peut jouer aussi un rôle dans la solubilisation
du phosphate (Aseri et al., 2009, Martínez-Viveros et al., 2010).
La libération des exsudats racinaires tels que des ligands organiques peuvent
également modifier la concentration de P dans la solution du sol (Hinsinger, 2001). Le
schéma général de solubilisation P dans le sol est illustré par la figure II.4.

Figure II.4. Schéma général des voies de mobilisation et immobilisation du phosphore dans
le sol par les bactéries (Khan et al., 2009)

29
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

II.2.2. Production des phytohormones

Les phytohormones (auxines) sont des molécules de signal agisse nt comme des
messagers chimiques et jouent un rôle fondamental en tant que régulateurs de la croissance et
de développement des plantes. Les phytohormones sont des composés organiques qui en très
faibles concentrations influencent les processus biochimiques, physiologiques et
morphologiques au sein de la plante, et leur synthèse est étroitement régulés (Fuentes-
Ramírez et Caballero-Mellado, 2006) De nombreuses espèces fongiques et bactériennes
peuvent produire des phytohormones (Tsavkelova et al., 2006).
La capacité de production de phytohormones (auxines) est largement distribuée parmi
les plantes et bactéries associées aux plantes. Leur production par les bactéries est considérée
parmi les mécanismes les plus efficaces par lesquels les rhizobactéries exercent leur effet de
promotion de la croissance des plantes (Martínez-Viveros et al., 2010). Des études ont
démontré que la PGPR peut stimuler la croissance des plantes par la production d'auxines
(acide indole-acétique) (Spaepen et al., 2007), les gibbérellines (Bottini et al., 2004) et les
cytokinines (Timmusk et al., 1999), ou en régulant les niveaux élevés de l'éthylène endogène
dans la plante (Glick et al., 1998).
II.2.2.1. Production de l’acide indole acétique (AIA):
L’AIA est l'auxine principale chez les plantes, il contrôle de nombreux processus
physiologiques chez les plantes, y compris l'élargissement et la division cellulaire, la
différenciation des tissus et les réponses à la lumière (Teale et al, 2006).
La capacité à synthétiser IAA a été détectée aussi chez de nombreuses rhizobactéries
ainsi que dans des espèces bactériennes pathogènes, libres et symbiotiques (Tsavkelova et al.,
2006). Il a été rapporté que jusqu’à 8% des microorganismes de la rhizosphère des plantes
sont capables de produire les auxines comme métabolites secondaires (Kampert et al. 1975;
Loper and Schroth, 1986). Parmi Les rhizobactéries productrices de L’AIA, les espèces du
genre Azospirillum sont les plus étudiées (Dobbelaere et al., 1999). D’autres bactéries
appartenant aussi bien aux genres Pseudomonas, Xanthomonas, et Rhizobium qu’aux espèces
Alcaligenes faecalis, Enterobacter cloacae, Acetobacter diazotrophicus et Bradyrhizobium
japonicum sont reconnues aussi pour être des producteurs potentiels de l’AIA (Patten and
Glick, 1996). Ces rhizobactéries produisent l’AIA selon plusieurs voies de biosynthèse, on
distingue principalement des voies dépendant du tryptophane (voie indole-3-acetonitrile,
acide indole-3-pyruvique et la voie tryptamine) et des voies indépendant du tryptophane mais
avec la production des concentrations de AIA plus faibles (Fig. IV.5) (Patten et Glick, 2002).

30
Chapitre II : Mécanismes d’action des PGPR

L’inoculation avec des rhizobactéries productrices de l’AIA a été utilisé pour stimuler
la germination des graines, afin d'accélérer la croissance des racines et de modifier
l'architecture du système racinaire, et d'augmenter la biomasse racinaire. Patten et Glick
(2002), ont rapporté le rôle de l’AIA produit par P. putida, chez la plante hôte, dans le
développement de son système racinaire.

Figure II.5. Aperçu des différentes voies de biosynthèse de l’AIA par les bactéries (Les noms
de voies sont indiquées par des mots soulignés) (Spaepen et al., 2007).
IAAld: indole-3-acetaldehyde; IAM: indole-3-acetamide;
IPDC: indole-3-pyruvate décarboxylase; Trp:tryptophane .

31
Chapitre III :
Plante hôte
Chapitre III : Plante hôte

III.1. Historique et Origine de la tomate

La tomate et les espèces qui lui sont apparentées sont originaires de la région des
Andes qui inclue la Colombie, l’Equateur, le Pérou, la Bolivie et le Chili (Warnock 1988). La
tomate cultivée est issue de la domestication de la forme semi sauvage S. lycopersicum var.
cerasiforme, cette dernière étant un mélange de S. lycopersicum et de l’espèce sauvage S.
pimpinellifolium (Peralta et al. 2008; Ranc et al. 2008). Elle fût introduite en Europe au début
du XVIème siècle par les espagnoles, d’abord en Espagne, puis en Italie. La plante de tomate
était considérée au début comme une plante ornementale et ses fruits n’étaient considérés
comme comestibles. Ce n’est que plus tard durant les premières décennies du siècle
précédent qu’elle a été adoptée comme fruit puis elle est devenue le légume vedette du XX ème
siécle (Blancard, 2009).
En Algérie, elle a été introduite par les cultivateurs espagnols en raison des conditions
pédoclimatiques favorable à sa culture en Algérie. Sa consommation à débuté dans le région
oranaise dès les années 1950 et par la suite elle s’est répandue vers l’est surtout dans le littoral
algérois (Latigui, 1984).
III.2. Etymologie
Parmi les noms communs utilisés pour désigner la tomate, il y a les noms suivant :
tomate (Espagnol, Français), tmati (Afrique de l’ouest), tomatil (Nahiatl, langue indigène du
Mexique), jitomate (espagnol mexicain), pomodoro (Italien) (Kambale, 2005). Le mot «
tomate » dérive du suffixe « tomatl » ou des mots « tomates » ou « miltomates » dans le
langage nahuatl (langue de la famille uto-aztèque, les anciens mexicains (Aztèques) à
l’époque de la découverte de l’Amérique) (Daunay et al. 2008), « Tomatl » désignait alors la
tomate, le Physalis ainsi que d’autres Solanacées. Introduite en Europe au milieu du XVIème
siècle, elle porta différents noms comme « mala aurea » en latin, « pomodoro » en italien, «
pomme d’amour » en français, « love apple » en anglais et « liebesapfel » en allemand.
Longtemps appelée « pomme d’amour » ou « pomme d’or », son nom de tomate n’est entré
dans le dictionnaire de l’académie française qu’en 1835. Le nom lycopersicum signifie
littéralement « pêche de loup », et fait référence au caractère toxique attribué initialement à ce
fruit.
III.3. Classification botanique
La tomate appartient à la famille des solanacées. Cette famille comprend une centaine
de genres et de l’ordre de 3000 espèces (Knapp, 2002), dont une moitié appartient au genre
Solanum (Weese et Bohs, 2007). La famille des Solanaceae abritent les principales cultures
originaires du Vieux continent (aubergines en provenance d'Asie) et la nouveau monde
32
Chapitre III : Plante hôte

(poivre, pomme de terre, le tabac, la tomate d'Amérique du Sud). Le clade Lycopersicon

contient la tomate domestique (Solanum lycopersicum) et ses 12 plus proches parents
sauvages (Peralta et Spooner 2005). On distingue parmi cette famille des plantes alimentaires
économiquement importantes telles que la tomate (Solanum lycopersicum L.), l’aubergine (S.
melongena L.), la pomme de terre (S. tuberosum L.). Elle comprend aussi le tabac
(Nicotiana tabacum L.), ainsi que de nombreuses espèces utilisées à des fins
pharmaceutiques ou ornementales (Daunay et Lester, 1989). Les espèces appartenant à la
famille des Solanaceae sont extrêmement diverses (Knapp, 2002), à la fois en termes (1) de
vigueur et biologie (des herbes annuelles aux arbres pérennes); (2) d’habitat (du déserts aux
forêts tropicales humides); et (3) de morphologie, notamment des fleurs et des fruits (Knapp,
(2002). Le centre d’origine et de diversité de la majorité des Solanaceae est concentré en
Amérique du Sud et Amérique centrale (D'Arcy, 1991).
De point de vue taxonomique, la systématique de la tomate peut être résumée comme
suit selon Gaussen et al. (1982).
Régne : Plantea
Sous régne : Trachenobionta
Division : Magnoliphyta
Classe : Magnoliopsida
Sous classe : Asteridae
Ordre : Solanales
Famille : Solanaceae
Genre : Solanum
Espèce : lycopersicum
III.4. Description botanique
La tomate est une plante herbacée vivace cultivée annuellement, à port rampant, aux
tiges ramifiées. Elle est appelée généralement Lycopersicon esculentum, appartenant à la
famille des solanacées réputées monophylitiques sur la base de la morphologie et des
caractères de l’ADN chloroplastiques (Judd et al., 2002). Elle descendrait de la variété
Lycopersicon esculentum biovar cerasforme. Elle se divise en deux sous genres : les
Eulicopersicon qui produisent des baies rouges comestibles et les Eriopersicon qui produisent
des baies vertes non comestibles, toxiques due à la présence d’alcaloïdes à effet analgésiques
voire anesthésiques (Hamini, 2011).

33
Chapitre III : Plante hôte

III.4.1. L’appareil végétatif

La racine : forte et pivotante qui pousse jusqu’à une profondeur de 50cm. La racine
principale produit une haute densité de racines latérales et adventices. En sol profond, on peut
trouver des racines jusqu’à 1 mètre de profondeur (Chaux et Foury, 1994).
La tige : la tige est de forme anguleuse, épaisse aux entre nœud pubescent, de
consistance herbacée en début de croissance, se lignifie en vieillissant. Les bourgeons
auxiliaires donnent naissance à des ramifications successives alors que les bourgeons
terminaux donnent naissance à des fleurs. Les rameaux issus des bourgeons auxiliaires
produisent des feuilles à chaque nœud et se terminent par une inflorescence (Chaux et Foury,
1994).
Le feuillage : La tomate fait partie de la famille des endicotylédons puisqu’elle
présente deux cotylédons suite à la germination des graines. L’ensemble des feuilles est
disposé en spiral, 15 à 50 cm de long et 10 à 30 cm de large. Les folioles sont ovées à
oblongues, couvertes de poils glandulaires. L’inflorescence est une cyme formée de 6 à 12
fleurs. Le pétiole mesure entre 3 et 6 cm (Chaux et Foury, 1994 ; Naika et al., 2005).
III.4.2. L’appareil reproducteur de la tomate
Les Fleurs: les fleurs sont les organes sexuels de la plante, bisexuées, régulières et
mesurent entre 1.5 et 2 cm de diamètre. Elles poussent opposées aux/ou entre les feuilles. Le
tube du calice est court et velu, les sépales sont persistants. En général, il y a 6 pétales qui
peuvent atteindre une longueur de 1cm, qui sont jaunes et courbées lorsqu’elles sont mures. Il
y a 6 étamines et les anthères ont une couleur jaune vif et entourent le style qui a une
extrémité stérile allongée (Fig. III.1). En général, la plante est autogame, mais la fécondation
croisée peut avoir lieu (Chaux et Foury, 1994 ; Naika et al., 2005).
Les Fruits : le fruit de la tomate est une baie charnue, de forme globulaire ou aplatie
avec diamètre de 2 à 15 cm. La couleur des fruits murs varie du jaune au rouge en passant par
l’orange, selon la variété. En général, les fruits sont ronds et réguliers ou côtelés (Fig. III.8)
(Chaux et Foury, 1994 ; Naika et al., 2005).
Les Graines : nombreuses, en forme de rein ou de poire, elles sont poilues, beiges, 3 à
5 mm de long, de 2 à 4 mm de large. L’embryon est enroulé dans l’albumen, 1000 graines
pèsent approximativement 2.5 à 3.5g, chaque fruit contient un nombre important de graines
qui varie entre 80 et 500 graines par fruit (Fig. III.2) (Chaux et Foury, 1994 ; Naika et al.,
2005).

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Chapitre III : Plante hôte

a b

Figure III.1. Coupe d’une fleur de tomate ([Link]/6artetscience/fleur_tomates.htm)

(S : sépales ; Pé: pétales ; Pi : pistil ; E : étamine

Figure III.2. Coupe transversale d’un fruit de tomate

([Link]/6artetscience/fleur_tomates.htm)

35
Chapitre III : Plante hôte

III.5. Culture et importance alimentaire de la tomate

La tomate neutrophile est une plante des climats tempérés et chauds. Sa température
idéale de croissance se situe entre 15°C la nuit et 25°C le jour. Elle craint le gel et ne supporte
pas les températures inférieures à 2°C. C’est une plante héliophile, elle demande une
hygrométrie moyenne, parfois un apport de CO2 (sous serre verre) est nécessaire. (Polèse,
2007).
Sa période de végétation est assez longue, il faut compter entre cinq et six mois entre
le semis et la première récolte. La multiplication se fait par semis, opération qu’il faut faire
assez tôt, vers Février-Mars, et donc sous abri en climat tempéré (en serre ou sous châssis
vitré). C’est une culture très exigeante qui demande un sol profond et bien fumé et la
possibilité d’irrigation (Polèse, 2007).
III.6. Importance alimentaire et économique de la tomate
Depuis que la tomate a été classée parmi les plantes alimentaires majeures (début 20ème
siècle), elle est devenue un des légumes les plus populaires et une des plantes fruitières les
plus consommées. La place de la tomate dans l’alimentation humaine n’est plus à démontrer.
Elle est, par son volume de production, le troisième « légume » au plan mondial, derrière la
pomme de terre et la patate douce. Sa composition chimique moyenne indique qu’elle
contient suffisamment d’éléments divers indispensables à l’organisme (Tableau III.2)
(Kambale, 2005).
III.6.1 Valeur nutritionnelle de la tomate
La Tomate est classée aux États-Unis au sommet de tous les fruits et légumes comme
source des vitamines et des éléments minéraux (Stevens, 1974). Elle joue un rôle important
dans l'alimentation humaine. C’est une excellente source de phosphore, de fer et de la
vitamine A, B et C (Tableau III.1) (Cobley et Steele, 1976 ; Varela et al., 2003; Naika et al.,
2005).
D’autre part le lycopène, parmi les composants principaux de la tomate et qui apparait
naturellement aussi dans les fruits et légumes, est considéré comme un antioxydant puissant.
En tant que tel, ce produit peut réduire le risque de certaines maladies telles que le cancer et
les maladies du cœur (Pritts, 2002). Des études ont aussi montré que le lycopène peut réduire
le développement du cancer de la prostate, du tractus digestif, du sein, du poumon et col
utérin. Il faut aussi rappeler que la tomate fraiche est un antifatigue efficace parce qu’elle
accélère la formation de sucre dans le sang et de ce fait nous redonne un grain d’énergie
(Pritts, 2002).

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Chapitre III : Plante hôte

Tableau III.1. Composition chimique du fruit cru de tomate (moyenne pour 100g de fruit) (Kambale,
2005).
Vitamines Sels minéraux (mg/100g de
Principaux composés (%) (mg /100g de fruit) fruit)

Eau 93 Vitamine A1 798 Sodium 6

Hydrate de 5 Vitamine B2 0.05 Potassium 295

carbone
Protéines 1 Vitamine B2 0.04 Calcium 13

Lipides 0.2 Vitamine B3 6 Magnesium 20

D’autres substances (mg/100g de Vitamine B5 0.3 Fer 0.5

fruit)

Acide 440 Vitamine B6 0.1 Cuivre 0.09

Citrique
Acide 35 Vitamine B9 0.04 Phosphate 25
Malique
Vitamine E 0.8 Manganese 0.1

Vitamine C 34 Zinc 0.2

Vitamine K 0.008 Chore 6

III.6.2. Importance économique de la tomate dans le monde

La tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) compte parmi les cultures légumières les
plus importantes du monde (Naika et al., 2005). Selon le Fond des Nations Unies pour
l'Alimentation et l'Agriculture (FAO), elle occupe la première place dans la production
maraîchère après la pomme de terre et elle est cultivée dans plus de 170 pays. En 2009, la
production mondiale de tomates s’élevait à plus de 141 millions de tonnes métriques (Mt).
Cette production continue d’augmenter tous les ans de plusieurs millions de tonnes, sans tenir
compte des stocks issus des cultures vivrières (Viron, 2010).
Selon le tableau III.2, les deux premiers pays producteurs mondiaux sont la Chine
avec 25,34 % suivie des Etats-Unis avec 08,84 % avec plus de 10 millions de tonnes de
tomates produites chaque année, la Turquie occupe le troisième rang mondial. De nombreux
pays tels que l’Egypte, L’Inde, l’Iran, le Brésil, le Maroc et la Grèce produisent également

37
Chapitre III : Plante hôte

chaque année plus d’un million de tonnes de tomates. Enfin, des pays comme la France et les
Pays-Bas ont une production plus modeste de quelques centaines de milliers de tonnes
(Desmas, 2005).
III.6.3. Importance économique de la tomate en Algérie
La tomate occupe une place privilégiée dans le secteur maraicher en Algérie. Elle est
considérée à juste titre comme une espèce prioritaire comme la pomme de terre, l’ail et
l’oignon. La tomate est cultivée en Algérie selon deux modes de production à savoir en
culture maraichère et en culture industrielle. La superficie totale réservée est de 32962 ha
représentée par 63,06% pour la tomate maraichère et 36,93% pour la tomate industrielle. La
tomate représente 7,94% de la superficie totale réservée aux cultures maraichères et
industrielles (Fig. III.3) (FAOSTAT, 2011). Pour ce qui est de la production de tomate
maraichère, sa production représente 08,79% par rapport à la production totale des cultures
maraichères et 08,33% par rapport à la production totale des cultures maraichères et
industrielles. Par contre, pour la tomate industrielle, le taux de représentativité est de 95,57%
par rapport aux cultures industrielles pratiquées en Algérie et 4,97% par rapport à la
production des cultures maraichères et industrielles (Fig. III.4) (FAOSTAT, 2011).

Tableau III.2. Production mondiale de la tomate en 2007 (Senouci, 2010).

38
Chapitre III : Plante hôte

201O 19,1
2009 20,789
2008 19,655
2007 20,079
2006 20,336
2005 21,089
2004 19,432
2003 18,65
2002 17,82
2001 16,76
.103 Ha
0 5 10 15 20 25

Figure III.3. Evolution de la superficie de culture de la tomate en Algérie de 2001à 2010 (FAOSTAT,
2011)

201O 0,5787
2009 0,641034
2008 5,592491
2007 5,673134
2006 5,489336
2005 5,1372804
2004 5,12195
2003 4,56933
2002 4,01364
106T
2001 3,73534

0 1 2 3 4 5 6

Figure III.4. Evolution de la production de la tomate en Algérie de 2001 à 2010 (FAOSTAT, 2011).

39
Chapitre III : Plante hôte

III.7. Les maladies de la tomate

Les maladies et les ravageurs constituent une menace grandissante pour la culture de la
tomate de la levée jusqu’à la récolte et peuvent provoquer des pertes catastrophiques (Jones
al., 2001). Elles affectent toutes les parties de la plante et sont causées par des champignons,
des bactéries et des virus.
III.7.1. Maladies d’origine bactérienne (les bactérioses)
Les bactéries sont la cause de plusieurs types de maladies, les plus importantes étant:
Moucheture bactérienne: la moucheture bactérienne est causée par le Pseudomonas
syringae pv tomato. La maladie se remarque surtout sur les fruits, où elle engendre de
nombreuses taches brun foncé, d’un diamètre de 1 à 2 mm ([Link].5A). Ces taches pénètrent à
peine plus profondément que la peau. Parfois les lésions sont plus étendues et plus
irrégulières, ressemblant beaucoup à la tache bactérienne. Sur les feuilles, la moucheture
bactérienne donne naissance à des taches qui vont du brun foncé au noir et sont un peu plus
grandes que celles qui touchent les fruits (Fig. III.5B) (Jarvis and McKeen, 1991).
Chancre bactérien : Le chancre bactérien est une maladie contagieuse et dévastatrice
de la tomate. Elle est causée par la bactérie Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis
(Smith) Davis et al. (syn. Corynebacterium michiganense (Smith) Jensen). Le premier
symptôme visible est habituellement le flétrissement des folioles inférieures qui s'enroulent
vers le haut (Richard et Boivin, 1994) (Fig. III.5D). Fréquemment, seules les folioles d'un
côté de la feuille sont affectées. Les tissus affectés meurent progressivement de la marge vers
l'intérieur et brunissent. Les graines peuvent être aussi infectées (Gilli et Heller, 2007).
De petits chancres ocellés (Fig. III. 5C) peuvent aussi se développer sur les fruits si on utilise
l'irrigation par aspersion. Au départ, ces chancres apparaissent sous forme de taches d'un
blanc neige qui pénètrent à peine en dessous de l'épiderme (Richard et Boivin, 1994).

40
Chapitre III : Plante hôte

A B

D
C

Figure III.5. Symptômes de maladies d’origine bactérienne affectant la tomate

(A : moucheture bactérienne : lésions sur des fruits de tomate, B : la moucheture bactérienne : Lésions
sur les feuilles de tomate, C : chancre bactérien : lésions sur une tomate, D : chancre bactérien :
lésions des feuilles de tomate) ([Link]

III.7.2. Maladies d’origine virale

Deux maladies importantes de la tomate sont provoquées par des virus : La mosaïque
et la déformation des feuilles. La maladie de la mosaïque est facilement transmissible par
contact et responsable de taches nécrotiques sur les feuilles et les fruits. Cette maladie a été
découvert au Pérou en 1974 sur le pépino (Solanum muricatum), un fruit comestible
communément appelé « melon-poire ». En 1999, la maladie a été découverte pour la première
fois à l'extérieur de l'Amérique du Sud, dans des cultures de tomates de serre aux Pays--Bas.
Par la suite, on a signalé sa présence dans des cultures de tomates de serre dans plusieurs
autres pays d'Europe ainsi qu'en Amérique du Nord (Fergusson, 2001). Les symptômes sont
similaires à ceux du mildiou sur les feuilles mais ce virus provoque un jaunissement rapide du
feuillage de la plante. Actuellement, l’Algérie ne dispose pas de substances chimiques
permettant de traiter les maladies d’origine virale. Seule la sélection sanitaire, suivie de
méthode prophylactique ainsi que l’utilisation des variétés résistantes sont utilisées (Senouci,
2010).

41
Chapitre III : Plante hôte

Tableau III.3. Différentes maladies virales de la plante de tomate

Maladie Symptômes
TMV (tomato mosaic virus) Virus de la mosaïque. Les plantes atteintes affichent un arrêt de
croissance au point végétatif, les feuilles peuvent comporter des taches
sombres (supérieurs) ou jaunes (inférieurs).
TSWV(tomato spotted wilt virus) Virus de la maladie bronzée de tomate. Les pieds contaminés sont
rabougris avec des feuilles jaunes, les fruits montrent des cercles de
couleur rouge caractéristique de la maladie
PVMV (pepper veinal mottle Provoque des mosaïques surtout sur la tomate, les souches virulentes
virus) peuvent provoquer des nécroses des feuilles et des tiges.
TYLCV (tomato yellow leaf curl Le virus de l’enroulement chlorotique des feuilles fait jaunir les feuilles
virus qui s’enroulent vers le haut ou vers le bas.

III.7.3. Maladies cryptogamiques

Les maladies fongiques sont très répandues et destructives (Jones et al., 2001), parmi
ces maladies. Une infection fongique est fréquemment causée par des spores qui ont pénétré
les tissus de la plante à travers les blessures, les stomates et parfois directement à travers la
peau de la plantes.
Mildiou : plus répandu chez les pommes de terre, le mildiou, causée par Phytophtora
infestens, attaque aussi les tomates si les conditions du milieu sont propices. Sur la tomate, la
maladie cause de graves pertes de feuilles et une pourriture très dommageables aux fruits. Sur
les feuilles, des taches d’aspect huileux débutent à l’extrémité ou à la marge des folioles (fig.
II.6a). Elles se développent rapidement, se nécrosent et seule leur marge garde un aspect
humide. A la face inférieure, un feutrage blanchâtre se développe en atmosphère humide. Sur
certaines tiges et quelques pétioles, de grandes taches brunes apparaissent mais ce symptôme
étant commun à d’autres maladies, il ne peut à lui seul permettre la détermination de l’origine
de la maladie (Legemble, 2008). Les symptômes sur fruits, marbrures brunes souvent
bosselées, sont caractéristiques (fig. III.13b). Si l’attaque est plus tardive, les plages marbrées
sont plus homogènes. Ces taches sont parfois recouvertes de mycélium. La tomate infectée
par le mildiou reste ferme mais des organismes secondaires (bactéries ou champignons)
peuvent causer une pourriture molle (Legemble, 2008).

42
Chapitre III : Plante hôte

La verticilliose: Verticillium dalhiae est un des champignons responsables de la

verticilliose (Verticillium wilt) sur plusieurs légumes, dont la tomate. Elle affecte aussi bien
les cultures de plein champ que sous abri. Comme pour la fusariose, il existe maintenant de
nombreuses variétés résistantes. La maladie est reconnue par un flétrissement des feuilles
accompagné d’un jaunissement unilatéral suivi de dessèchement des feuilles de la base (fig.
III.6E, F) (Blancard, 2013a).
Pour ce qui est de la PPI, il est recommandé d’utiliser des portes greffes certifiés, des variétés
résistantes et de multiplier les plantes saines, lutte contre les insectes vecteurs et pratiquer des
rotations afin d’éviter la sélection de souches agressives.
L’anthracnose : est une maladie causée par le champignon collectotrichum coccodes.
Les symptômes de la maladie sont caractérisés par des tâches circulaires de 05 à 10 mm sur
les fruits rouges. Ces lésions peuvent évoluer en taches brunâtres et des ponctuations noires
qui correspondent aux micro-sclérotes. Plusieurs taches sur les fruits peuvent évoluer et
entrainer une pourriture (Blancard, 2013b). Les infections peuvent se déclencher n’importe
quand, lorsque la température est comprise entre 10°C et 30°C. Les foyers s’étendent
rapidement durant les périodes prolongées d’humectation des feuilles. Bien que les
symptômes ne se manifestent que sur les fruits mûrs, l’infection peut débuter sur les fruits
verts.

43
Chapitre III : Plante hôte

A B

C D

E F

G H

Figure III.6. Symptômes de certaines maladies cryptogamiques de la tomate.

A : Symptômes de mildiou sur des feuilles de tomate B : fruits de tomate atteints de mildiou
C: Taches noire d’alternariose sur les feuilles de tomate D:taches noires d’alternariose sur des fruits
E : Symptômes de Verticilliose sur des plantes de tomate F : brunissement des vaisseaux de la tige

G: Aspect caractéristique du l’oïdium H : fruits de tomate atteints de pourriture grise

44
Chapitre III : Plante hôte

L’alternariose: L’alternariose, ou maladies des taches brunes, causée par Alternaria

solani, l’infection provient des fanes des vieilles cultures. Nommée à tort, par certains:
tavelure, black-rot, etc., est caractérisée par des taches brun sombre, à surface finement rodée,
puis à aspect velouté, surtout, sur la région pédonculaire des fruits ([Link].6C, D). Ces taches
sont, généralement, précédées par d’autres petites, brun sombre, sur les feuilles des jeunes
plants en pépinières, taches qui, regardées attentivement, montrent une série de cercles
concentriques (Clément, 1958).
L’Oïdium (le mal blan): L’oïdium est une maladie causée par oïdium nealycopersici.
Cette maladie est caractérisée dès les premiers stades par un feutrage blanc d’aspect farineux
sur feuilles (fig. III.13G) Par la suite ces taches peuvent se transformer en lésions marrons ce
qui provoque une perte de feuilles chez la plante infectée. L'humidité et les écarts de
température importants entre la nuit et le jour favorisent son apparition; d'où une présence
accrue en mai et en septembre.
Pour combattre cette maladie, Il est nécessaire d’utiliser des variétés résistantes ou tolérantes,
nettoyage des outils de travail, et supprimer rapidement les parties ou sujets atteints afin que
la maladie ne se propage pas trop vite.
La Pourriture grise : cette maladie est causée par Botrytis cenerea. Selon Chaux et
Foury (1994), le B. cenerea se trouve surtout sur les plantes étiolés et provoque un feutrage
gris sur les feuilles et sur les fruits (fig. III.6H). Les mesures préventives veilleront à
minimiser les facteurs de risques (Eviter les semis trop denses. Diminuer l’hygrométrie.
Eviter les blessures. En culture, Eviter tout excès d’humidité et de condensation sur les
feuilles).
La fusariose des racines et du collet : La fusariose des racines et du collet est une
maladie importante de la tomate causée par le champignon Fusarium oxysporwn f. sp. radicis-
Iycopersici W.R. Jarvis & Shoemaker. Elle affecte principalement la tomate cultivée en
serre. Elle sévit également chez les cultures commerciales en sol, dans des substrats comme la
laine de roche ou la sciure de bois et dans les cultures sur film nutritif. En pratique, la maladie
est limitée à la tomate, mais on a démontré que de nombreuses plantes sont sensibles à
l'infection lorsqu'on les contamine artificiellement avec le parasite (Richard et Boivin, 1994).
Les plantes infectées se remarquent souvent par l'amincissement marqué du sommet de leur
tige. Le flétrissement des plantes débute par les feuilles du haut: on note aussi l'apparition
d'une pourriture brun foncé des tissus du cortex à la hauteur de la ligne de terre et les tissus
vasculaires prennent une coloration brun rougeâtre. Par la suite, les feuilles inférieures

45
Chapitre III : Plante hôte

deviennent brunes fauves en commençant par la pointe, et finissent par mourir (Blancard,
2013b)
III.7.4. Stratégies de lutte
La tomate, cultivée aussi bien en plein air que sous abris serres, occupe une place
importante dans l’économie du pays tant par les surfaces cultivées que par le volume des
productions. Cette culture est attaquée par de nombreux champignons et bactéries à
dissémination aérienne et/ou souterraine. Les méthodes de lutte pour diminuer l’impact de ces
bio-agresseurs ont beaucoup évolué ces dernières années.
La stratégie de lutte peut consister à mener des mesures indirectes avant que la
maladie soit établit ou des mesures directes qui visent à éloigner et combattre l’agent
indésirable.
La plus part des moyens utilisés pour lutter contre les différentes maladies des tomates
ne sont pas durables. Des mesures culturales peuvent être très efficaces contre certaines
maladies, un bon exemple étant les mesures sanitaires et l’élimination de plants anormaux et
indésirables utilisés pour lutter contre les maladies de la tomate. Dans d’autres circonstances,
cependant, les mesures chimiques ou physiques ou même biologiques peuvent être mieux
adaptées. Le Tableau III.4 présente un résumé des différentes stratégies de lutte
recommandées pour lutter contre les maladies affectant la culture de la tomate.

46
Chapitre III : Plante hôte

Tableau III.4. Synthèse des principales stratégies de lutte contre les maladies de la tomate

Maladies Agent Stratégie de lutte

responsable
Utilisation des substrats et des plants sains, élimination des plants
Flétrissure F. oxysporum malades en cours de culture, pratique d’un buttage des plants pour
fusarienne [Link]. lycopersici l’obtention de l’émission de nouvelles racines.

utilisation des variétés tolérantes, adopter des rotations culturales

avec des plantes non hôtes, utiliser des semences saines, à éliminer
L’alterneriose Alternaria solani les restes de cultures et pulvériser régulièrement les plantes avec des
produits tels que l’azoxystrobine, le chlorothalonil, le
difénoconazole, l’iprodione, le mancozèbe. le propinèbe.
Il n’existe actuellement aucun traitement curatif contre la
La verticilliose V. albo-atrum verticilliose. La lutte ne peut être que préventive au travers de
V. dahlea mesures prophylactiques ou de pratiques culturales adaptées.
Colletotricum -utiliser des variétés résistantes, et d’appliquer un traitement au
Anthracnose coccodes préalable des semences.
-utiliser des variétés résistantes ou tolérantes,
Oïdium - nettoyage des outils de travail et suppression rapide des parties ou
Oïdium neolycopersici sujets atteints afin que la maladie ne se propage pas trop vite.
(le mal blan)

Éviter les condensations d’eau, bonne aération des serres.

Pourriture Botrytis cenerea Elimination des débris végétaux. La lutte chimique ralentit la
grise maladie mais ne permet pas l’élimination du champignon.

- Eviter les terrains infestés Aération convenable des serres Eviter

Clavobacter l’apport excessif d’azote Eviter les excès d’eau.
Chancre michiganensis -Eliminer les plants malades Appliquer des fongicides à base de
bactérien cuivre qui ont un effet bactériostatique.
-Désinfection des abris-serre avant plantation Utilisation de
semences certifiées Traitement de semences.
-Variétés résistantes.
Ralstonia Aérer au maximum les cultures sous abris, et éviter l’irrigation par
Flétrissement solanacearum l’aspersion, élimination des débris végétaux en cours ou en fin de
bactérien culture, utilisation de semences désinfectées.

47
Chapitre III : Plante hôte

48
Chapitre IV :
L’agent
pathogène
Chapitre IV : L’agent pathogène

IV.1. L’agent pathogène: Fusarium oxysporum [Link] lycopersici

Le genre Fusarium regroupe des espèces au sein desquelles existent de nombreuses
formes phytopathogènes. C’est notamment le cas de l’espèce F. oxysporum qui comporte des
formes capables de provoquer des maladies très importantes, les trachéomycoses, sur un
grand nombre de plantes cultivées (réf). Fusarium oxysporum Schlecht. Snyder et Hansen
(Snyder et Hansen 1940) est l’espèce la plus répandue du genre Fusarium. C’est un
champignon saprophyte du sol, capable de survivre longtemps sous forme de chlamydospores
(Agrios, 2005) Les F. oxysporum ont une spécialisation parasitaire très élevée. Certaines
souches ne provoquent la maladie que sur un nombre limité d’espèces, voire une seule. Ceci a
donné naissance au concept de formes spéciales. Plus de 120 formes spéciales et races ont été
ainsi identifiées, basées sur leur spécificité d’hôtes (Tableau IV.1) (Armstrong et Armstrong,
1981). Ces formes spéciales sont elles-mêmes subdivisées en races physiologiques sur la base
du pouvoir pathogène sur des cultivars d’une plante-hôte donnée. Dans quelques cas
d’interaction hôte-agent pathogène, les études montrent clairement qu’un nombre limité de
gènes gouvernent la spécificité de la réaction, les produits de ces gènes sont encore totalement
inconnus.
Les F. oxysporum présentent aussi une grande variabilité tant au niveau de leur
morphologie, qu’au niveau de leur spécificité parasitaire. En effet, au cours de la culture in
vitro, il n’est pas rare de voir une culture de Fusarium changer de morphologie graduellement
ou sous forme de secteurs. D’autre part, dans la nature, des changements au niveau de la
spécificité parasitaire ont été souvent notés.

48
Chapitre IV : L’agent pathogène

Tableau IV.1. Quelques exemples de souches de Fusarium oxysporum et leurs plantes hôtes
spécifiques (Ramírez-Suero, 2009).

Souches Plantes hôtes Genre

F. oxysporum f. sp. lycopersici Tomate Lycopersicon spp.
F. oxysporum f. sp. cucumerinum Concombre Cucumis spp.
F. oxysporum f. sp. pisi Pois Pisum spp.
F. oxysporum f. sp. cicero Pois chiche Cicer arietinum
F. oxysporum f. sp. melonis Melon Cucumis spp.
F. oxysporum f. sp. phaseoli Haricot Phaseolus vulgaris
F. oxysporum f. sp. cubense Banane Musa spp.
F. oxysporum f. sp. coffeae café Coffea spp.
F. oxysporum f. sp. asparagi Asperge Asparagus spp.
F. oxysporum f. sp. albedinis Palmier dattier Phoenix dactylifera
F. oxysporum f. sp. raphani Radis Raphanus spp.
F. oxysporum f. sp. cepae Oignon Allium spp.
F. oxysporum f. sp. niveum Pastèque Citrullus spp.
F. oxysporum f. sp. batatas Patate douce Ipomoea batatas
F. oxysporum f. sp. conglutinans Chou Brassica spp.

IV.1.1. Taxonomie du Fusarium oxysporum

Le champignon appartient aux Adélomycètes, au genre Fusarium et à l’espèce
Fusarium oxysporum. Il est très répandu dans le monde et attaque de nombreuses plantes
pérennes ou annuelles, causant leur jaunissement et leur flétrissement.
Le genre Fusarium appartient au phylum des Deutéromycètes (champignons
imparfaits, Fungi imperfecti), car la plupart des espèces étaient d’abord décrites sur la base de
caractères morphologiques et une reproduction sexuée qui n’a pas été observée. Ces formes
imparfaites (anamorphes) sont caractérisées par un mycélium septé et la production de
conidies hyalines généralement unicellulaires sur des conidiophores libres; elles sont classées
dans le groupe des Moniliales (Lepoivre, 2003). De plus, Fusarium produit des
macroconidies composées de 2 à plusieurs cellules. Leur forme recourbée typique avec une
cellule apicale plus ou moins pointue est un des critères d’identification des représentants du
genre; dans beaucoup d’espèces on observe une cellule basale en forme de pied (Seifert,
2001). La production de métabolites secondaires et notamment de toxines (mycotoxines et

49
Chapitre IV : L’agent pathogène

phytotoxines) est courante parmi les Fusarium, et le profil de ces composés peut être utilisé
pour la classification des espèces (Thrane, 2001).
Des formes sexuées (téléomorphes) ont été maintenant observées pour certaines
espèces de Fusarium. Elles font toutes partie des Ascomycètes, de l’ordre des Nectriales et
notamment des genres Gibberella et Nectria (Seifert, 2001). Sur la base de la structure, les
Fusarium spp ont la position systématique suivante (Booth, 1971).

Tableau IV.2. Position systématique du Fusarium oxysporum (Booth, 1971).

Embranchement Thallophytes
Classe Deutéromycetes
Ordre Moniliales
Famille Tuberculariaceae
Genre Fusarium
Espèce Fusarium oxysporum

IV.1.2. Biologie de F. oxysporum

Le Fusarium oxysporum se caractérise par un mycélium septé, aérien, blanc coloré de
violet, revers violet intense (Booth, 1971), la présence de phialides sont parfois portées par
des conidiophores. Les phialides sont de taille variable, solitaires (monophialides) ou
ramifiées (polyphialides) (Domsch et al., 1993). Les formes pathogènes et les formes non
pathogènes ne sont pas différentes par leur morphologie (Fravel et al., 2003). Le Fusarium
oxysporum produit trois types de fructifications (spores asexuées): microconidies,
macroconidies et chlamydospores.
Les microconidies : sont souvent fusiformes à réniformes, uni ou bicellulaires, de
forme ovale elliptique, droite ou incurvées parfois disposées en chaînettes présentant de 0 à 2
septa, de petite taille (5-12 X 2,2-3,5µm) (Fig. IV.1A), produites par de petites phialides
longeniformes dans le mycélium aérien (Keith, 1996). C’est aussi le type de spore le plus
fréquemment observé à l´intérieur des vaisseaux des plantes infectées (Ramirez-Suero, 2009) .
Les macroconidies caractéristiques du genre Fusarium, sont en forme de fuseau,
septées, de trois à cinq cloisons, fusiformes, pointus aux deux extrémités (Fig. IV.1B). Les
macroconidies de trois cloisons sont de taille de 27-46 X 3-5µm, alors que les macroconidies
de cinq cloisons sont de taille de 35-60 X 3-5µm. Les macroconidies sont portées sur des
conidiophores ou sur la surface des sporodochies (Wong, 2003). Ces spores peuvent être

50
Chapitre IV : L’agent pathogène

observés dans des sporodochiums à la surface des plantes qui ont été éradiqués par le
pathogène (Agrios, 2005).
Les chlamydospores sont des spores de résistance, entourées d'une paroi lisse ou
rugueuse (Wong, 2003). Les chlamydospores sont des spores rondes d’une ou deux cellules,
se différencient à partir d’une cellule située sur le parcours d’un filament ou à son extrémité.
Elles sont observées au milieu des hyphes ou en position terminale (chlamydospore terminale
ou intercalaire), souvent en forme de paires, quelques fois en triplets et rarement en forme
rassemblée (Fig. IV.1C) (Agrios, 2005). On les considère comme des formes de conservation
du parasite.

A B C

Figure IV.1. Les types de fructifications (spores assexuées) rencontrés chez F. oxysporum
(A : microconidies, B : macroconidies, C : chlmydospores) (Wong, 2003).
([Link]

IV.1.3. Cycle de vie du champignon Fusarium oxysporum

Le champignon se conserve dans le sol sous forme de chlamydospores, que l’on trouve
jusqu’à 80 cm de profondeur et qui subsistent au moins 15 ans (Bigre, 1980). Sa résistance à
des teneurs élevées en gaz carbonique explique cette conservation dans les couches profondes
du sol (Louvet et Bulit, 1964). Le F. oxysporum peut également demeurer latent plusieurs
mois dans les tissus de l’hôte parasité quand la température ambiante est inférieure à 15°C.
Les F. oxysporum ne sont pas des parasites obligatoires, leurs cycles de vie
commencent par une phase saprophyte en absence de la plante hôte, ils survivent dans le sol
sous forme de chlamydospores. Ces derniers restent en dormance, immobiles dans les résidus
des tissus végétaux décomposés jusqu'à la stimulation de la germination en utilisant les

51
Chapitre IV : L’agent pathogène

éléments nutritifs nécessaires libérés par les racines des différentes plantes (exsudats
racinaires) ou d’autres matières organiques (Greonwalf, 2005). Après la germination, des
conidies seront formées à partir d’un thalle en 6 à 8 heures d’incubation et des
chlamydospores dans 2 à 3 jours, si les conditions sont favorables. L’invasion des racines est
suivie d'une pénétration dans les cellules d'épiderme de l’hôte, le développement d'une
maladie vasculaire systémique survient ensuite dans la plante hôte (Fig. IV.2) (Greonwalf,
2005).
Une fois pénétré dans les plantes, le champignon produit quelques substances toxiques
pour la plante, comme l'acide fusarique qui entraîne une forte absorption de l'eau et une
augmentation de la transpiration induisant les flétrissements. L'inoculum se conserve dans le
sol sous forme de débris végétaux ou de spores de résistances (chlamydospores) pendant
plusieurs années (Pitt et Hokking, 1997). La dissémination de la maladie s’opère par les
boutures, les résidus, le sol, les poussières. Le champignon se retrouve alors dans le sol, où il
y a lyse mycélienne sous l’influence de microorganismes, qui secrètent des enzymes
extracellulaires, et formation de chlamydospores.
A côté des souches pathogènes, ils existent des isolats non pathogènes qui colonisent
les racines des plantes sans induire des symptômes de maladie.

52
Chapitre IV : L’agent pathogène

Figure IV.2. Cycle de la maladie de flétrissement vasculaire causée par [Link] f. sp

lycopersici chez la tomate (Agrios, 2005)

53
Chapitre IV : L’agent pathogène

IV.1.4. Pathogénie du Fusarium oxysporum

Durant les étapes initiales de l'interaction plante-champignon, les champignons
pathogènes doivent en premier lieu détecter les stimuli provenant de la plante et de répondre
avec changements morphologiques et biochimiques appropriées (Roncero et al. 2003). Le
processus de signalisation représente la première étape et la plus critique dans la définition de
l'issue de l'infection fongique (Roncero et al. 2003). Griffin (1969) a rapporté que les agents
fongiques pathogènes telluriques, y compris F. oxysporum, sont capables de détecter la
présence de la plante avant même le contact physique, très probablement par des composés
présents dans les exsudats racinaires.
La pénétration du mycélium dans les tissus provoque la formation de cavités au niveau
du contact xylème-phloème et xylème-moelle. Ces cavités apparaissent après l’hyperplasie et
l’hypertrophie des cellules du parenchyme du xylème, qui provoquent un amincissement des
parois cellulaires et enfin une désintégration des cellules.
La pathogénécité du Fusarium oxysporum est le résultat des réactions biochimiques
entre des substances secrétées par l'agent pathogène et des substances produites ou présentes
chez la plante hôte. Pour surmonter les barrières de surfaces, les agents pathogènes sont
capables de sécréter un mélange de substances qui sont généralement des enzymes
hydrolytiques (chitinases, cellulases, pectinases et protéases). Une fois à l’intérieur, le
champignon produit des toxines et hormones qui peuvent modifier le métabolisme de la plante
au profit de l’agent fongique (Roncero et al., 2003). Les toxines sont secrétées à différents
degrés selon les plantes infectées.
IV.1.4.1. Les enzymes
Fusarium oxysporum produit plusieurs enzymes qui agissent sur les pectines et la
cellulose composant les parois cellulaires de la plante (Agrios, 2005).
a. Pectinase: elle catalyse la dégradation des polysaccharides pectique, qui se trouvent dans
la lamelle moyenne (de la cellule végétale); cette enzyme est divisée en 3 sous-groupes
(Kawano et al., 1999).
-Pectine méthyl esterase (PME): La production de la pectine méthyl estérase est une
caractéristique générale chez les Fusarium du flétrissement vasculaire, elles sont des facteurs
biochimiques importants participants à l'apparition des symptômes de la maladie (la
fusariose). La dégradation de la pectine par cette enzyme donne naissance à des chaînes de
deméthoxylate de pectine et du méthanol (Verlent et al., 2004).
-Polygalacturonase (PGS): Ces enzymes sont secrétées par le champignon durant le
stade de l'infection et de la colonisation de l'hôte. Cette enzyme dégrade le xylème de la
54
Chapitre IV : L’agent pathogène

plante infectée (Roncero et al., 2003). Bien que les enzymes fongiques pectinolytiques
contribuent clairement à la dégradation du xylème des plantes infectées, l'activité PGS en soi
ne semble pas être nécessaire pour le développement des symptômes de la maladie (Baayen et
al. 1997).
-Pectate lyase (PLS): les pectates lyase catalysent la réaction de trans-élimination des
pectates, elles ont été suggérés pour jouer un rôle important dans le développement de
fusariose (Beckman 1987). Une PL spécifique (désigné PL1) a été purifiée et caractérisée à
partir de F. oxysporum [Link]. lycopersici, et a été retrouvée dans des racines de la tomate
infectées ainsi que dans les tissus de la tige (Di Pietro et Roncero, 1996). Ces résultats
indiquent que la PL peut être un facteur de virulence chez les Fusarium (Rogers et al. 2000).
b. Cellulase: Les cellulases, désignées C1, C2 et Cx, sont nécessaires pour dégrader la
cellulose. Les enzymes C1 et C2 agissent sur la cellulose native, insoluble pour produire des
chaînes linéaires qui sont attaquées par l'enzyme Cx pour produire la cellobiose et le glucose
(MacHardy et Beckman 1981). Husain et Dimond (1960) ont rapporté que l'action de la
cellulase produite par l’agent de la flétrissure de tomate F. oxysporum [Link]. lycopersici peut
être impliquée dans la pathogenèse de trois manières différentes. Premièrement, il est
impliqué dans l'induction du flétrissement de la plante. Deuxièmement, les produits
d'hydrolyse de l'activité cellulase peuvent fournir au Fusarium les glucides nécessaires pour la
poursuite de son développement dans les tissus l'hôte, et, troisièmement, il est impliqué dans
la migration de l'agent pathogène à partir de tissus vasculaires à des stades avancés de la
maladie.
c. Hemicellulase
Un nombre limité d’études ont été consacrées pour éclaircir le rôle des hémicellulases
dans le processus de flétrissement des plantes. Ces enzymes, cependant, pourraient être d’une
importance plus significative que les pectinases et les cellulases du fait que la plus grande
partie de la matrice amorphe dans laquelle sont intégrées les microfibrilles cellulolytiques est
composée essentiellement de matériaux de type hémicellulose, tels que les glucanes, les
xylanes et les mannanes (MacHardy et Beckman 1981). Ces enzymes dégradent les
polysaccharides pectiques en mono saccharides. Selon les monomères libérés on distingue: les
xylanases, galactanases, glucanases, arabinases et manases (Agrios, 2005).
IV.1.4.2. Les toxines
Le genre Fusarium est connu pour produire une large gamme de toxines (mycotoxines
et phytotoxines) dont quelques exemples sont illustrés en Figure IV.3. Chez F. oxysporum
deux toxines ont été identifiées capables d’induire à elles seules des symptômes. Il s’agit de la
55
Chapitre IV : L’agent pathogène

lycomarasmine et de l’acide fusarique. La production de ce dernier in planta a été démontrée

chez plusieurs plantes infectées, tels le coton, la tomate ou le pois, indiquant qu’il pourrait
jouer un rôle dans l’induction de la maladie. Cependant, la production de cette toxine ne peut
pas être corrélée systématiquement avec la pathogénie du champignon (Pegg, 1981).

Figure IV.3. Structure chimique de quelques toxines produites par Fusarium sp (Haschek et al.,
1992).

56
Chapitre IV : L’agent pathogène

IV.2. Maladies causées par F. oxysporum chez la plante de tomate

Parmi les maladies causées par F. oxysporum on trouve le flétrissement vasculaire
aussi appelé fusariose vasculaire (vascular wilt), la pourriture racinaire et du collet (root rot,
crown rot) et la pourriture des semis (damping-off).
IV.2.1. La fusariose de la tomate
La dénomination fusariose est utilisée de façon moins spécifique et peut indiquer tout
syndrome causé par un Fusarium. De ces maladies, le flétrissement vasculaire est la maladie
qui provoque les plus grandes pertes dans un grand nombre de plantes cultivées, telles que les
légumes, les fleurs et les cultures tropicales (Agrios, 2005)
La tomate peut être victime de deux maladies fusariennes différentes: soit la flétrissure
fusarienne (Fusarium wilt) causée par Fusarium oxysporum lycopersici (FOL) ou la pourriture
de la racine et du collet (Fusarium crown and root rot) causée par Fusarium oxysporum
radicis-lycopersici (F.O.R.L).
IV.2.1.1. Le flétrissement vasculaire de la plante de tomate
Le flétrissement vasculaire est plus sévère dans des conditions chaudes du sol et dans
les serres (Agrios, 2005). Les symptômes développés sont le résultat d´un stress sévère d´eau.
Ils peuvent être très variables en fonction de la plante et incluent l´éclaircissement de la
nervure, l´épinastie des feuilles, la chlorose et le dessèchement (Fig. IV.4). La plupart des
plantes flétrissent et meurent, tandis que les plantes qui ont été moins affectées deviennent
chétives et peu productives (MacHardy et Beckman, 1981; Agrios 2005). Des symptômes très
similaires peuvent être causés par d’autres champignons, comme Verticillium dahliae et V.
albo-atrum. F. oxysporum est unique parmi les champignons responsables de flétrissement
vasculaire par sa spécificité d’hôte qui a mené à la description d’un grand nombre de formes
spéciales (groupement taxonomique appliqué à un parasite fréquemment un champignon
adapté à un hôte spécifique) et races sur la base de leur plante hôte et des cultivars au sein
d’une espèce qu’elles infectent (Armstrong et Armstrong, 1981).
La fusariose vasculaire de la tomate causée par F. oxysporum [Link]. lycopersici est le cas le
plus étudié; en ce qui concerne le cycle de la maladie et son développement, il est
représentatif du flétrissement vasculaire chez d’autres plantes (Agrios, 2005). La tomate est
souvent cultivée en serre où les températures élevées du sol favorisent la maladie. Le
flétrissement vasculaire est caractérisé par un envahissement massif des vaisseaux
conducteurs dans lesquels le champignon sporule. Les microconidies sont transportées de
façon passive par le flux du xylème et peuvent ainsi infecter des parties aériennes. La
présence de mycélium et de ces conidies ainsi que les réponses locales de la plante (formation
57
Chapitre IV : L’agent pathogène

des tyloses, gommes) vont causer un blocage du transport d’eau dans les vaisseaux et donc
des symptômes de flétrissement (Klein et Correll, 2001).

Figure IV.4. Symptômes du flétrissement de la tomate causé par F. oxysporum f. sp lycopersici

([Link]

IV.2.1.2. La pourriture de la racine et du collet de la tomate

La pourriture de la racine et du collet est causée par Fusarium oxysporum radicis-
lycopersici (FORL) (Duval, 1991). La FORL est apparue dans les tomates de serre au début
des années 70 (Sato et Araki, 1974). Elle est caractéristique des cultures printanières et
s'attaque à la culture en sol ou hors sol. Les spores du champignon sont facilement
transportées par l'air et l'eau. On reconnaît la maladie aux symptômes (Tableau IV.3)

Tableau IV.3. Symptômes de la pourriture de la racine et du collet causée par F. oxysporum f. sp

radicis-lycopersici
Organes observés Symptômes
Folioles et feuilles Pas de jaunissement et flétrissement unilatéraux des folioles,
éventuellement la feuille entière. Feuilles hautes fanent avant les
feuilles basses et il y a décoloration jaune ou doré.
Tige Pas de brunissement des vaisseaux
Racine Brunissement des racines, de leurs cylindres centraux et des vaisseaux
au niveau de pivot et du collet.
Présence éventuelle d’un chancre au collet

58
Chapitre IV : L’agent pathogène

IV.3. Méthodes de lutte (Moyens de lutte) contre la fusariose de la tomate

La lutte contre Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici n’est pas aisée car ce
champignon se conserve très longtemps dans les sols et les substrats, et il les recolonise très
rapidement lorsque ceux-ci ont été désinfectés. Aussi, pour que la maîtrise du champignon
tellurique soit efficace, il conviendra d’associer toute la batterie de mesures et de méthodes,
permettant de l’éliminer ou de limiter son développement. Différentes méthodes de lutte ont
été préconisées en vue de lutter contre la fusariose.
IV.3.1. Moyens de lutte culturaux
La rotation des cultures constitue une bonne prévention contre certaines maladies des
plantes notamment celles d’origine telluriques. Ces mesures consistent principalement à
éviter les conditions qui favorisent la maladie (Duval, 1991). Le déchaumage, des dates de
semis optimales, l’élimination des mauvaises herbes ainsi que le maintien d’un sol riche en
élément minéraux constituent des méthodes efficaces dans la diminution de l’incidence de
plusieurs maladies cryptogamiques (Booth, 1971 ; Edel et al., 1995).
Les mesures préventives contre la flétrissure fusarienne consistent à éviter les conditions qui
favorisent la maladie soit: un sol léger et acide, un manque d'azote et de calcium, des
températures élevées - l'optimum pour le développement du FOL est 28°C- et un manque de
lumière en intensité et en temps (Anonyme, 1991).
IV.3.2. Moyens de lutte chimiques
C’est l’utilisation des produits chimiques pour la désinfection du sol, ces produits sont
classés suivant différents caractéristiques, tel que le spectre d’activité, la capacité de
pénétration, l’efficacité, disponibilité et facilité d’usage ainsi que le coût qui reste trop élevé
pour les petits exploitants. De plus, l’utilisation de pesticides est remise en cause en raison de
ses impacts sur l’environnement et des problèmes de santé humaine qu’elle entraîne (Ploetz et
Pegg, 2000). Il n’existe de produits chimiques ou de fongicides particulièrement efficaces
contre la fusariose vasculaire. Les fongicides les plus usités reste le triazole et ces dérivés qui
sont des composés très actifs grâce à leur noyau qui possède une activité pharmacologique,
antibactérienne, antifongique et hypoglycémique (Hamoir et al., 2001).
Les méthodes de lutte appliquées pour le contrôle des fusarioses sont généralement
limitées, comme c’est le cas pour l’ensemble des maladies parasitaires vasculaires. Il n’existe
actuellement aucun moyen réellement efficace pour contrôler totalement ces maladies, les
mesures de contrôle demeurent dans leur globalité d’ordre préventif (Rouxel et al., 1979).

59
Chapitre IV : L’agent pathogène

IV.3.3. Moyens de lutte génétiques ou résistance variétale

La résistance des plantes vis-à-vis des bio-agresseurs représente une alternative très
prometteuse dans la lutte contre les effets dévastateurs de ces agents sur la culture des plantes.
Beaucoup de recherches ont été concernées par la sélection de variétés résistantes, le but des
sélectionneurs étant la résistance aux différentes maladies.
Contrairement à la lutte chimique, La résistance génétique des variétés végétales, ne nuit
pas à l’environnement et elle est très efficace contre certaines maladies et ravageurs.
L’inconvénient de ces méthodes réside dans le fait qu’à côté des variétés améliorées et
résistantes obtenues, apparaissent en continu des agents pathogènes plus virulents (Messiaen,
1981) de même que l’obtention des variétés résistantes à un agent quelconque nécessite un
travail de longue haleine et des moyens de recherche importants.
IV.3.4. Lutte physique
La lutte physique en protection des plantes regroupe toutes les techniques de lutte dont le
mode d’action primaire ne fait intervenir aucun processus biologique, biochimique ou
toxicologique.
Elle consiste le plus souvent à éviter les conditions favorisants la maladie soit un sol
léger et acide et un manque de N, Ca+2 soit des températures élevées et un manque de lumière
en intensité et en temps (Barna et al., 1997). Anchisi et al. (1985) ont développé un traitement
à l’eau chaude pour protéger les plants dans le sol. Cette méthode consiste à traiter les racines
avec de l’eau à 48-49°C pendant 30 secondes avant de les transplanter. La stimulation de la
croissance des racines amène une protection contre la fusariose.
IV.3.5. lutte intégrée
La notion de protection intégrée a été initialisée il y a une cinquantaine d’années avec
déjà pour objectif de réduire l’utilisation des pesticides afin de minimiser l’impact
environnemental et le coût de la lutte tout en maximisant les résultats économiques de
l’agriculteur.
En Europe, la lutte intégrée est définie par la directive communautaire 91/414/CEE du
15 juillet 1991, comme suit : « L’application rationnelle d’une combinaison de mesures
biologiques, biotechnologiques, chimiques, physiques, culturales ou intéressant la sélection
des végétaux dans laquelle l’emploi de produits chimiques phytopharmaceutiques est limité
au strict nécessaire pour maintenir la présence des organismes nuisibles en dessous de seuil à
partir duquel apparaissent des dommages ou une perte économiquement inacceptables. »

60
Chapitre IV : L’agent pathogène

IV.6.5. Lutte biologique (« biological control » ou « biocontrol »)

Définition de l'OILB (Organisation Internationale de Lutte Biologique): « utilisation
d'organismes vivants (à la différence du « biopesticide », qui désigne aussi bien des
organismes vivants que des substances inertes d’origine biologique, ou encore des produits
phytosanitaires dits « biocompatibles », substances actives vivantes ou inertes d'origine
biologique ou non, qui peuvent être employées en lutte intégrée) (parasitoïdes, prédateurs,
pathogènes, antagonistes ou compétiteurs) pour prévenir ou réduire les dégâts causés aux
cultures par des ravageurs ou des maladies ». Il s’agit au fait d’utiliser la biodiversité et les
ennemis naturels des espèces nuisibles. La cible est un organisme nuisible à une plante
cultivée. Les bio-agresseurs sont pour la plupart des arthropodes ravageurs (aleurodes,
chenilles, pucerons, acariens…). Ce peut être également des mauvaises herbes ou des micro-
organismes (virus, bactéries, champignons…).
La lutte biologique permet tout d’abord de pallier les inconvénients des pesticides
chimiques, à savoir :
- Leur toxicité à la fois pour les cultures et la santé humaine ;
- La pollution des sols et de l’eau ;
- La destruction des animaux utiles, tels les vers, les insectes souterrains…, mais aussi
les petits mammifères, les oiseaux insectivores et autres auxiliaires de l’agriculture ;
- La raréfaction des insectes pollinisateurs (guêpes, abeilles…) ;
- Parfois, leur manque d’efficacité ; certains insectes deviennent résistants aux
produits utilisés ;
- Les consommateurs attendent des pratiques culturales plus respectueuses de
l’environnement et de leur santé, et souhaitent des produits « bio » ou issus de la
protection intégrée.
Le caractère épidémique des maladies cryptogamiques particulièrement les maladies
vasculaires, ajouté aux fortes potentialités de conservation des agents pathogènes dans le sol,
l’inefficacité des méthodes de lutte chimique ainsi que l’absence des génotypes végétaux
réellement résistants, imposent la considération d’autres méthodes alternatives, notamment
celles qui se basent sur l’exploitation des potentialités microbiennes antagonistes. Parmi les
microorganismes expérimentés avec succès, à l’égard des maladies d’origines telluriques, les
bactéries appartenant au genre Bacillus sont de bons candidats pour la lutte biologique, car
elles produisent des endospores tolérantes à un grand nombre de contraintes extérieures
(chaleur, dessiccation) et ils sont également connues comme des bactéries produisant un large
spectre de molécules antibiotiques (fongistatine, fongocine, bacilline…), impliquées dans le
61
Chapitre IV : L’agent pathogène

contrôle de maladies fongiques (Magnin-Robert, 2007). De même que les espèces de

Pseudomonas qui colonisent la rhizosphère d’une grande variété de végétaux et possèdent
plusieurs caractéristiques intrinsèques sont particulièrement intéressantes pour une utilisation
comme agents de lutte biologique (Lemanceau et Alabouvette, 1991). L’exploitation
l’activité antagoniste de certaines races de Fusarium oxysporum non pathogènes contre les
agents de la fusariose de différentes plantes est aussi rapportée par un nombre de chercheurs.
Bien que des articles sur la lutte biologique contre la fusariose ait été publiée dans des
journaux de renommée internationale, aucun ne donne un réel espoir sur l’efficacité d’une
telle méthode. La plupart de ces études ne concernent pas la réduction de la maladie au
champ. Elle se focalise plutôt sur l’inhibition in vitro du pathogène par des agents microbiens
(Thangavelu et al., 2004), ou sur la réduction de la maladie dans des expériences en pots dans
des serres (Saravanan et al., 2003). Les résultats des rares études sur le terrain se sont avérés
décevants.

62
Chapitre V :
Matériel
Et
Méthodes
Chapitre V : Matériel et méthodes

V.1. Méthodes d’isolement des rhizobactéries libres et endophytes

V.1.1. Echantillonnage
Les prélèvements des plantes de tomate et du sol ont été effectués dans différentes
régions de la wilaya de Mostaganem à partir des cultures de tomate de différentes variétés
hybrides ou fixes sous serre et en plein champs (Fig. V.1). Ces prélèvements ont été réalisés
durant une période de quatre années allant de 2006 à 2010.
Les microorganismes recherchés sont isolés à partir de trois zones différentes de la
rhizosphère selon les protocoles expérimentaux suivants.

Figure V.1. Carte de la localisation géographique des points de prélèvement des

échantillons de plantes et de sol dans la wilaya de Mostaganem.

[Link] des souches rhizobactériennes à partir de l’ectorhizosphère

La rhizosphère est la partie du sol qui s'étend à partir de la rhizoplane vers la masse du
sol entourant la plante (figure I.1). Comme on pouvait s'y attendre en raison de la complexité
et la diversité des systèmes racinaires, la rhizosphère n'est pas une région de taille ou de forme
bien définie, mais au contraire, se compose d'un gradient de propriétés chimiques, biologiques
et physiques qui changent à la fois radialement et longitudinalement tout au long de la racine.
La rhizosphère peut être divisée en plusieurs zones distinctes (Lynch, 1987). Ceux-ci
comprennent l’endorhizosphère (les tissus racinaires composés de l'endoderme et de couches
corticales), la rhizoplane (la surface de la racine), et l’ectorhizosphere (le sol immédiatement

63
Chapitre V : Matériel et méthodes

adjacent à la racine). En outre, les plantes qui sont colonisés par des champignons
mycorhiziens ont une zone appelée mycorhizosphère (Lindermann, 1988).
L’isolement des bactéries à partir de la rhizosphère a été effectué par la méthode
suspensions-dilutions sur deux milieux différents : Luria-bertani (LB) et King B (Annexe I)
selon la méthode décrite par Pegnoo et al. (2006). 1g du sol broyé puis tamisé de chaque
échantillon a été mélangé avec 9ml de milieu PBS (Annexe I) ; les solutions mères sont
ensuite diluées jusqu’à 10ˉ⁶. 100 µl de chaque dilution sont ensuite étalées sur la surface du
milieu King B pour la sélection des germes appartenant au genre Pseudomonas. Pour
l’isolement des souches sporulées (Bacillus sp), un volume (10 ml) de la solution mère a subi
un traitement thermique pendant 10 mn à 80°C (Walker et al., 1998). A partir de la solution
ainsi traité des dilutions décimales (10-6) seront préparées. 100 µl de chaque dilution sont
ensuite étalées sur la surface du milieu LB préalablement coulés dans des boites de Pétri. Les
boites sont incubées à 28°C pendant 48h. Pour chaque échantillon de sol et de plante,
deux boites de Petri ont été ensemencées par dilution et par groupes de bactéries.

[Link] des souches bactériennes (épiphytes) à partir de rhizoplane

La rhizoplane est la surface des racines des plantes et des particules du sol fortement adhérées
à cette surface (Kennedy, 2005).
Après élimination des particules du sol attachées aux racines des plantes de tomate,
ces dernières sont rincées deux fois par une solution de tampon phosphate salin (PBS)
stérile.1g de ces racines est immergé dans 9ml de PBS puis incubé dans un agitateur rotatif à
185 tours/mn pendant 30 minutes. La suspension obtenue est considéré comme solution mère
contenant des bactéries de la rhizoplane. Cette dernière solution est ensuite diluée avec le PBS
jusqu’à 10ˉ⁶. 100µl de chaque dilution sont étalés sur le milieu King B et LB préalablement
coulés dans des boites de Pétri. L’isolement de chaque groupe de bactéries a été effectué selon
le même protocole précédemment cité. Les boites sont incubées à 28°C pendant 48h.

64
Chapitre V : Matériel et méthodes

V.1.4. Isolement des bactéries endophytes à partir de l’endorhizosphère

Les microorganismes semblent être omniprésents dans les tissus des espèces
végétales: des bactéries appartenant à différents genres (82) ont été signalés dans un large
éventail de plantes, y compris les plantes ligneuses et les cultures arables. Les genres
bactériens Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter et Agrobacterium sont les plus fréquemment
isolés (Lodewyckx et al. 2002; Mastretta et al. 2006).
Un micro-organisme est considéré comme endophyte lorsqu’il est isolé d’un organe de la
plante dont la surface aura été préalablement stérilisée (Hallmann et al., 1997).
V.1.4.1. Stérilisation de la surface des racines
La stérilisation de la partie superficielle des racines est effectuée tout d’abord, par un
lavage minutieux d’un lot de racines sous l’eau du robinet pour l’élimination des particules
du sol fixées aux racines. 1g de ce lot est ensuite immergé dans 100 ml d’éthanol 75° pendant
3 minutes puis dans une solution d’hypochlorite de sodium (1%) pendant 3 minutes, suivi par
un lavage trois fois dans de l’eau distillée stérile (Sang –Woo et al.,2010). Cette opération a
pour but d’éliminer tous les microorganismes de la rhizoplane, c’est-à-dire de la surface
externe des racines.
V.1.4.2. Macération des tissus de racines
La macération est la méthode préférée pour l’isolement des bactéries endophytes à
partir des tissus stérilisés (Sieber, 2002). La macération des tissus stérilisés est réalisée par le
broyage des racines stérilisées à l’aide d’un mortier stérile dans 50ml de PBS stérile. Une
série de dilutions décimales est ensuite préparées à partir de cette suspension racinaire (Sang –
Woo et al., 2010).
V.1.4.2. Isolement des bactéries endophytes culturables
100µl de chaque dilution préparée sont étalés sur la surface des deux utilisés : le
milieu LB et la milieu King B préalablement coulés dans des boites de Pétri. Les boites sont
ensuite incubées à 27°C pendant 48h. Pour l’isolement spécifique des souches de
Pseudomonas sp, les boites sont incubées à 28°C pendant 24h (Ramesh et al., 2009).
V.1.5. Purification des isolats bactériens
La purification des souches obtenues après isolement a été réalisée par le transfert
successif de colonies bactériennes présentant différents aspects sur des boites de Pétri
contenant le même milieu (LB ou King B) précédemment utilisé pour l’isolement des espèces
bactériennes. Le transfert est effectué à l’aide d’une anse stérile par la méthode des stries.
Cette opération a été répétée plusieurs fois jusqu'à l’obtention d’une culture bactérienne pure.

65
Chapitre V : Matériel et méthodes

V.1.6. Caractérisation des isolats par étude des caractères microscopiques et

biochimiques
Après isolement et purification des différentes souches microbiennes, une étude
microscopique a été réalisée sur chacune des souches obtenues, afin de déterminer la forme et
le type de paroi. Cette étude est basée essentiellement sur la coloration de Gram.
L’identification des différents isolats obtenus après purification a été réalisé selon la
charte d’identification des bacilles gram négatif selon bergey’s manual of determinative
bacteriology (1984) et selon Slepecky et Hemphill (2006) pour les bacilles gram positif.
V.1.7. Conservation des isolats bactériens
Les souches purifiées sont conservées à une température de 4°C dans des tubes à
essais contenant soit le milieu KB incliné pour les souches de Pseudomonas sp ou le milieu
LB incliné pour le reste des souches. Afin de régénérer les souches, des repiquages sur milieu
vierge sont réalisés périodiquement tous les deux mois.
[Link]. Isolement et caractérisation de l’agent pathogène
[Link].1. Prospection et évaluation de l’importance de la fusariose de la tomate dans la
zone d’étude.
Plusieurs prospections ont été réalisées dans les différentes localités de production de
tomate de la région de Mostaganem, pendant les campagnes agricoles de 2006 à 2010. Des
parcelles cultivées de tomate situées dans chacune des localités suivantes : Mazagran,
Benabdelmalek Ramdhan, hadjaj et Achacha ont été inspectées toutes les semaines pendant
une période de 2 mois, depuis le mois d’avril jusqu’au mois de juin. L’estimation de
l’importance de la fusariose est effectuée en choisissant au hasard et en diagonale les plants
infectés.
Incidence de la maladie: pourcentage de plants malades par parcelle. Un plant ayant
un des organes présentant les symptômes de la fusariose est considéré comme le « seuil
minimum » pour juger qu’un plant est atteint de la fusariose.
[Link].1.2. Collecte des échantillons
Des échantillons ont été prélevés pour être analysé au laboratoire. Il s’agit dans
certains cas de prélever des plantes toutes entière présentant des symptômes de la maladie et
dans d’autres cas, quelques organes aériens (tiges) de la plante. Des prélèvements de sol de la
rhizosphère ont été également effectués. Ils sont mis dans des sachets de plastiques et ramenés
dans une glacière.

66
Chapitre V : Matériel et méthodes

[Link].2. Caractérisation de l’agent pathogène

[Link].2.1. Isolement de l’agent phytopathogène
Les isolats de Fusarium utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir des plants de
tomate présentant des symptômes de flétrissement dans des régions de willaya de
Mostaganem. Une souche de référence de F. oxysporum [Link] lycopersici nous a été
aimablement fournie par le laboratoire de microbiologie du sol et de l’environnement INRA
de Dijon - France.
La technique utilisée est celle décrite par Rappilly (1968) et Katan et al. (1991). Des
petits fragments de 5 millimètres de long sont préparés à partir de la tige des plantes de tomate
présentant des symptômes de la fusariose. Ces fragments sont superficiellement désinfectés
par trempage dans de l’eau de javel à 12 % pendant une minute. Ils sont ensuite lavés avec de
l’eau distillée stérile trois fois puis séchés dans du papier filtre stérile. 4 à 5 fragments de tige
ou de racine sont placés dans une boite de Pétri contenant le milieu de culture PDA (Annexe
I), additionné de deux antibiotiques (chloramphénicol + streptomycine à raison de
20mg/100ml) pour minimiser la contamination bactérienne. L’incubation des boites de Pétri
est effectuée à 25°C et à l’obscurité pendant 5 à 7 jours. L’observation est effectuée
quotidiennement jusqu’à apparition du mycélium caractéristique de l’agent causal.
[Link].2.2. Purification de l’agent pathogène
Après une identification primaire à l’aide d’une observation macroscopique et
microscopique, des repiquages successifs à partir des différentes cultures sont réalisés. Ces
repiquages seront répétés plusieurs fois dans des boites de Pétri contenant du milieu PDA
jusqu’à l’obtention d’une culture pure. Les cultures ainsi obtenues seront ensuite conservées à
4°C.
[Link].2.3. Préparation d’une culture monospore
Un explant de 05 mm de diamètre d’une culture de la souche fongique est prélevé à
partir de la périphérie puis introduit dans un tube contenant 9 ml d’eau distillée stérile. Après
agitation au Vortex, des dilutions décimales successives sont préparées. A partir des dernières
dilutions (10-4 et 10-5), 0,1 ml est étalée sur la surface d’une boite de Pétri contenant une
couche fine de milieu PDA. Après 24 heures d’incubation à 25°C, on procède au repérage et à
la délimitation des spores en germination à l’aide d’un microscope binoculaire. Deux à trois
conidies seront transférées sur des boites de Pétri contenant un milieu frais de PDA et
incubées pendant 5 à 7 jours à 25°C.

67
Chapitre V : Matériel et méthodes

[Link].2.4. Identification macroscopique et microscopique du pathogène

L’identification du champignon est basée essentiellement sur les caractères
morphologiques et culturaux comme: la vitesse de croissance, l’aspect du mycélium aérien,
couleurs de l’envers de la colonie. L’identification microscopique consiste à observer sous
microscope optique la présence de mycélium septé, de microconidies et macroconidies et les
chlamydospores (Booth , 1971; Nelson et al,. 1983; Leslie et Summerell, 2005).
[Link].3. Estimation du pouvoir pathogène des isolats de F. oxysporum
La pathogénie du champignon constitue un trait de caractérisation très important. Il
permet de différencier entre les formes pathogènes et non pathogènes chez un certain nombre
d’espèces fongiques de même que la détermination du degré d’agressivité de la population
étudiée. Le test conduit sur les jeunes plantules présente l’avantage de demander un espace
réduit et permet donc de tester simultanément un grand nombre d’isolats
[Link].3.1. Evaluation de la pathogénie des isolats de F. oxysporum in planta
L’estimation du pouvoir pathogène des différentes souches est réalisée sur des
plantules de tomate au stade de quatre vraies feuilles. Les plantules (de deux à trois semaines)
sont déterrées et les racines lavées sous l’eau de robinet puis rincées à l’eau distillée stérile.
Les racines de 5 plantules par isolat sont trempés dans une suspension de spore, préparée à
partir de chacun des isolats, pendant 30 minutes. Les plantules inoculées sont immédiatement
remis dans des pots remplis de sol de jardin mélangé à la tourbe stérile (Fig. V.2). Les
témoins sont trempés dans l’eau distillée stérile pendant le même temps. L’estimation du
pouvoir de pathogénie est ensuite vérifiée par l’estimation des symptômes externes de la
fusariose selon le barème de Douira et Lahlou (1989) ci-dessous par le calcul de l’indice
d’altération foliaire:
Tableau V.1. Echelle d’évaluation de l’altération foliaire selon Douira et Lahlou (1989)
Note Apparence des feuilles
0 Feuilles d’apparence saines
1 Feuilles cotylédonaires : flétrissement ou jaunissement
2 Feuilles cotylédonaires : chute
3 Feuilles vraies : flétrissement ou jaunissement
4 Feuilles vraies : nécrose
5 Feuilles vraies : chute

68
Chapitre V : Matériel et méthodes

Les notes rapportées au nombre de feuilles constituent l’indice d’altération foliaire (IAF),
calculé selon la formule ci-dessous. Un indice moyen est ensuite calculé pour chaque lot de
plantes.

Afin de vérifier l’incrimination des différents isolats du FOL dans l’infection des
plantes de tomates, le ré-isolement de l’espèce fongique est réalisé selon la méthode de
Rappilly et al. (1968) décrite précédemment et qui consiste à déposer sur la surface du milieu
PDA en boite de Pétri, de petits fragments de racines, préalablement désinfectés à l’eau de
javel à 12%, des plantules de tomate infectées et saines suivi d’une incubation pendant 7
jours. La nature des agents microbiens cultivés est par la suite déterminée.
Le champignon est ensuite conservé dans des tubes à essais à une température de 4°C,
pour une utilisation ultérieure. Le repiquage des isolats est répété chaque période de 2 à 3
mois.

69
Chapitre V : Matériel et méthodes

Culture monospore de l’agent Désinfection et germination des

pathogène 10 jours d’incubation graines de tomate (3jours)

Inondation à l’eau distillée stérile Repiquage dans des pots contenant un

mélange terre de jardin + terreau
et grattage de la culture (3 :1)

Culture des plantules jusqu’au

Stade 4 feuilles

Filtration de la suspension
(spore+mycélium)
Déterrement des plantules et rinçage
des racines

(eau robinet et eau distillée stérile)

Ajustement de la concentration de Trempage des racines bléssées dans

l’inoculum (107spore/ml la suspension sporale (30mn)

Repiquage des plantules dans

des pots (sol +terreau stérile)

Culture en serre pendant 21 jours

Estimation de I.A.F

Figure V.2. Dispositif expérimental pour l’étude de la pathogénie des isolats fongiques

70
Chapitre V : Matériel et méthodes

V.3. Etude de l’activité antagoniste in vitro des isolats bactériens vis-à-vis de F.

oxysporum f. sp lycopersici
V.3.1. production des substances diffusibles (Antibiose)
La capacité de la totalité des souches bactériennes isolées à inhiber la croissance du
champignon pathogène par la production de substances diffusibles a été testée par la méthode
de confrontation directe (dual assay) en boite de Pétri sur le milieu PDA selon la méthode
décrite par Inam-UL-Haq et al. (2003). La souche bactérienne est inoculée en trait au bord de
la boite à l’aide d’une anse stérile. Après incubation à 30°C à l’obscurité pendant 48h, une
pastille mycélienne de 5 mm de diamètre, prélevée au bord d’une jeune colonie fongique âgée
d’une semaine, est déposée au centre de la boite à environ 2.5 cm de la souche antagoniste
testée. L’incubation des boites est effectuée à 25°C et à l’obscurité pendant 7 jours (Pour
chaque essai, le dispositif expérimental est répété deux fois).
Lecture des résultats
Des mesures du rayon des colonies sont effectuées après 7 jours d’incubation.
L’inhibition de la croissance fongique a été évaluée par le calcul du pourcentage de réduction
de la croissance mycélienne selon la formule suivante (Whipps, 1987).
I% = (R1-R2) / R1×100
R1 = distance radiale (en mm) de la croissance mycélienne en absence de la souche
antagoniste (contrôle)
R2 = distance (en mm) de la croissance mycélienne en direction de l’inoculation
bactérienne.
V.3.2. Production des substances volatiles et l’acide cyanhydrique (HCN)
V.3.2.1. Test de la production des substances volatile
100 µl d’une suspension de chaque bactérie testée sont déposés au centre d’une boite
de Pétri contenant le milieu LB et KB puis étalés sur la surface, parallèlement, une pastille de
5 mm de diamètre du champion (FOL) est déposé au centre d’une boite contenant le milieu
PDA. Les couvercles des deux boites sont enlevés et les deux fonds sont scellés à l’aide d’une
bande de Parafilm afin d’éviter les pertes des substances volatiles. L’ensemble est incubé
pendant 5 à 7 jours à 28°C. Une boite de Pétri servant de témoin contenant uniquement le
milieu PDA est ensemencée par l’agent pathogène (Montelegre et al. 2003).
L’inhibition de la croissance mycélienne a été évaluée par le calcul du pourcentage de
réduction de la croissance mycélienne selon la formule de whipps (1987).
V.3.2.2. Test de la production de l’acide cyanhydrique (HCN) :

71
Chapitre V : Matériel et méthodes

La capacité des isolats bactériens pré - sélectionnés à ralentir la croissance de l’agent

pathogène par les substances volatiles a été évaluée par la mise en évidence des souches à
produire de l’acide cyanhydrique selon la méthode de Bakker et Schippers (1987). Cette
dernière consiste à ensemencer chaque souche bactérienne par stries à l'aide d'une anse stérile
à la surface du milieu de Bakker et Schippers (Annexe I). Sur le couvercle de chaque boîte
ensemencée est déposé un papier filtre stérile imprégné d'une solution de 0.5% d'acide
picrique dans une solution de 20% de carbonate de sodium (de couleur jaunâtre). Les boîtes
sont ensuite scellées à l’aide d’un Parafilm et gardées en position normale (non inversée) dans
une étuve à 28°C pendant 3 jours. Le changement de couleur du papier filtre du jaune au brun
indique la production d'HCN.
V.3. 3. Production des sidérophores
Le protocole de King et al. (1954) a été utilisé pour la mise évidence de la
fluorescence. Les différents isolats sont ensemencés par la méthode de stries sur la surface du
milieu King B en présence (50µg/L) et en absence de FeCl3. La lecture est effectuée après
incubation à 28°C pendant 48 h.
Les boites sont observées sous lumière UV pour la détection de la fluorescence. Le
pigment fluorescent formé est considéré comme indication de la production de sidérophores
(Teintze et al., 1981 ; Yasmin et al., 2009).
V.3.4. Production d’enzymes hydrolytiques
Des milieux spécifiques ont été utilisés pour la mise en évidence des différentes
activités enzymatiques des souches microbiennes sélectionnées. Chaque souche bactérienne
est ensemencée par touche sur milieu spécifique et chaque expérience est répétée trois fois.
V.3.4.1. Production de l’amylase
Le milieu spécifique utilisé pour déterminer l'activité amylolytique extracellulaire a été
préparé par l'ajout de 20 g par litre d'amidon comme seul source de carbone dans un milieu
PDA sans dextrose. Les différentes souches antagonistes ont été ensemencées par touches
dans des boites de Pétri contenant le milieu spécifique (PDA + amidon). Les boites sont
incubées à 28 °C pendant 3 jours. La mise en évidence de la présence d’amylases
extracellulaires est réalisée après inondation de la surface des boites par une solution de
Lugol. La présence de zones claires entourant les colonies bactériennes est une indication de
la présence d’une activité amylolytique (Norris et Rubans, 1971),

V.3.4.2. Production de la protéinase

72
Chapitre V : Matériel et méthodes

La recherche de l’activité protéolytique chez les différentes souches antagonistes est

déterminée par l’ensemencement par touches des bactéries à la surface du milieu Agar au lait
écrémé (Skimmed Milk Agar) (Annexe I) selon le même protocole précédemment cité. Après 2
à 5 jours d’incubation à 28°C. La présence d’une zone claire entourant la
croissance bactérienne traduit la présence d’une activité protéolytique (caséinase) dans le
milieu de culture (Smibert and Krieg 1994).
V.3.4. 3. Production de la cellulase
L’activité cellulolytique peut être quantifiée par divers procédés (cités par des références
récentes). Étant donné que la cellulose cristalline se dégrade à des taux très faibles, la plupart
des méthodes ont été adaptés pour utiliser plus facilement des dérivés de cellulose solubles,
dégradables comme la carboxyméthylcellulose (CMC). La recherche de la production de
cellulases extracellulaire par les bactéries et les champignons se réalise le plus souvent dans des
boites de Pétri contenant des milieux gélosés (différents) additionnés de CMC comme seul
source de carbone (Johnsen et Krause, 2014). Pour la mise en évidence de la production de la
cellulase, les différents isolats ont été ensemencés dans des boite de Pétri contenant le milieu
M9 (Annexe I), additionné de 10 g/l de CMC (carboxy-methyl cellulose) et de 1.2 g/l d’extrait
de levure (Cattelan et al., 1999). Les boites sont ensuite incubées à 28°C pendant huit jours.
Après 8 jours d’incubation, la présence de la cellulase est recherchée par l’inondation de la
surface de la boite pendant 30 minutes à l’aide d’une solution 0.5% de rouge de Congo. Cette
opération est suivie par un lavage avec de l’eau distillée. Un second lavage est ensuite effectué
puis répété deux fois par une solution de NaCl 1M. La présence d’un halo jaune claire
entourant la colonie bactérienne traduit la présence d’une activité cellulolytique (cellulasique)
chez la souche bactérienne testée.
V.3.4.5. Production de la pectinase
La production des pectinases a été recherchée sur le milieu M9 additionné de 10g/l de
pectine et de 1.2g/l d’extrait de levure. La souche microbienne est ensemencée par touche sur
le milieu spécifique (M9) à l’aide d’une anse stérile. Après incubation à 28°C pendant 48h, la
surface de la culture microbienne est inondée par une solution de bleu de toluidine
0.1%. La présence de zones claires entourant la croissance bactérienne traduit la production
de la pectinase par les souches bactériennes (Smibert et Krieg, 1994).

V.4. Etude des propriétés associées à l'action des isolats sur la promotion de la croissance de la
plante tomate

73
Chapitre V : Matériel et méthodes

V.4.1. Solubilisation des phosphates inorganiques

L’étude de la capacité des souches à solubiliser le phosphate a été réalisée selon un test
préliminaire. L’ensemble des souches de la collection ont été ensemencé à l'aide d'une anse
stérile par touche à raison de quatre bactéries par boîte de Pétri contenant le milieu
Pikovskaya (PVK) (Aannexe I). Les boîtes ensemencées ont été ensuite incubées à 28°C
jusqu’à 14 jours. Des observations à l’œil nu des boites de Pétri ont été effectuées à partir du
3éme jour. La présence d'un halo de clarification autour des colonies indique la production de
substances dissolvant le phosphate (Sagervanshi,, 2012).
A la suite du premier test, les isolats présentant des activités de solubilisation de
phosphates ont été testés individuellement (une souche par boite) selon le protocole
expérimental précédent. L’importance de l’activité de solubilisation est appréciée par la
détermination d’un paramètre appelé: index de solubilisation (ISP) calculé selon la formule
suivante (Premono et al., 1996):
( )
( )

L’index de solubilisation a été calculée, après repiquages des souches performantes sur le
même milieu PKV (quatre répétition par souche) et incubation pendant 14 jours à 28°C.
V. Effet du temps d’incubation sur l’index de solubilisation du phosphate (ISP)
L’effet du temps d’incubation sur la capacité des souches à solubiliser le phosphate a été
déterminé par le suivi de la variation de l’index de solubilisation du phosphate de chacune des
isolats testés pendant 14 jours à 28°C.
V.4.2. Production d’acide indole acétique (AIA)
L’acide indole acétique (AIA) appartient à la classe des phytohormones qui sont impliqués
dans la régulation de la croissance et du développement des plantes tout au long de leur cycle
de vie. Il est bien établit que plusieurs microorganismes du sol sont activement impliqués dans
la synthèse des auxines en culture pure ainsi que dans le sol (Biswas et al., 2000). L’isolement
de rhizobactéries capables de produire des auxines peut être un moyen utile dans la sélection
de souches efficaces en vue d’une application dans la promotion de la croissance des plantes
(Asghar et al., 2004).
La production de l'acide indole-acétique (AIA) a été recherchée selon la méthode
décrite par Brick et al. (1991). Cette méthode consiste, après réactivation des isolats
bactériens sur leurs milieux spécifiques (King B ou LB), à ensemencer des cultures
microbiennes jeunes dans des fioles contenant 50 ml de milieu LB ou King B, additionné de

74
Chapitre V : Matériel et méthodes

tryptophane (10 mg/ml) puis incubées à 28°C pendant 48 h. Au terme de 48 h, les cultures
subissent une centrifugation à 6000 tpm pendant 30 min. 2 ml du surnageant de chaque
culture ont été ensuite mélangé avec 4 ml du réactif de Salkowski préparé préalablement (50
ml d'acide perchlorique 35% et 1 ml FeCl3 0.5 M) avec deux gouttes d'acide ortho-
phosphorique. Le mélange est laissé à l’air libre et en obscurité pendant 20 min. Le
développement d’une couleur rose témoigne de la production de l’acide indole acétique. La
concentration de l’acide indole acétique produit est dosée par lecture au spectrophotomètre de
la densité optique à 530 nm. La concentration d’AIA est obtenue par extrapolation des valeurs
des densités optiques par rapport à une courbe standard, établie à partir d’une série de
dilutions d’AIA.
Préparation de la courbe étalon de l’AIA
Différentes solutions de concentration variables d'AIA sont préparées allant de 10
µg/ml à 100 µg/ml, 1 ml de chaque solution est mélangé avec deux gouttes d’acide
orthophosphorique et 2 ml du réactif de Salkowaski. La lecture de la densité optique de
chaque solution réactionnelle est réalisée après 20 minutes d’incubation dans l’obscurité à
l’air libre par un spectrophotomètre UV-Visible SECOMAM à une longueur d’onde de 530
nm. La courbe standard est ensuite préparée en traçant la concentration de l'IAA en µg/ml Vs
densité optique (Annexe III).
V.4.2.1. Effet de la concentration du tryptophane sur la production de l’acide indole
acétique (AIA)
L’étude de l’effet de la concentration du tryptophane est réalisée par la culture des
différentes souches productrices dans 50 ml du milieu LB ou King B contenant des
concentrations variables du tryptophane (1mg/ml jusqu’à 10 mg/ml). Le dosage de l’AIA est
effectué selon le protocole décrit précédemment après incubation des cultures à 28°C pendant
48h.
V.4.3. Production de l’ammoniaque (NH3)
Le test de production de NH3 est étudié selon le protocole expérimental suivant : à
l'aide d'une anse stérile, des tubes d’eau peptonée exempt d’indole sont inoculés par des
souches bactériennes. Les tubes sont ensuite incubés à 30 °C pendant 48h. La présence
d’indole est indiquée par l’apparition d’un anneau de couleur jaune au brun dans la phase
alcoolique après addition du réactif de Nessler à raison de 0,5 ml par tube (Cappucino and
Sherman, 1992).

75
Chapitre V : Matériel et méthodes

V.5. Evaluation in vivo de la capacité des souches microbiennes pré-sélectionnées pour

la promotion de la croissance de plants de tomate
L’évaluation in vivo de la capacité des souches microbiennes pour la promotion de la
croissance de la plante a toujours constitué une étape essentielle dans les programmes de
sélection des agents de bio-contrôle. Ces programmes se sont longtemps basés sur
l’introduction de micro-organismes provenant essentiellement de la rhizosphère de différentes
espèces végétales. L’évolution rapide des souches microbiennes ayant cette propriété au cours
des années rend ces programmes de sélection d’une importance primordiale pour faire face
aux bio- agresseurs.
La technique la plus fiable pour évaluer la capacité des souches microbiennes est
généralement celle conduite en plein champ dans des conditions naturelles. Cependant, le
déroulement et le suivi de cette méthode se heurte à différentes contraintes et par la suite
nécessite l’intégration d’un nombre élevé de paramètres qui peuvent avoir une influence sur le
résultat final: composition du sol, présence de germes compétiteurs, instabilité des facteurs
atmosphériques, etc: …. . Par conséquent, les tests de screening conduit au laboratoire ou sous
serre permettront une évaluation rapide et tolérable des souches bactériennes.
V.5.1. Protocole de désinfection des graines de tomate
Les graines de tomate d’une variété (Saint Pierre) sont désinfectées par immersion
dans une solution d’hypochlorite de sodium (15% w/v) pendant 2 minutes, elles sont ensuite
trempées dans de l’éthanol à 70% pendant 1 minute, puis rincées dans trois bains d’eau
distillée stérile. Les graines sont séchées dans des conditions d’asepsie en les déposant sur un
papier filtre stérile avant d'être utilisées dans les différents protocoles expérimentaux. Un lot
de 5 graines désinfectées seront placé dans une boite de Pétri contenant de la gélose nutritive,
puis incubé à 28°C pendant 24h, afin de vérifier l’efficacité du processus de désinfection.
V.5.2. Préparation de l’inoculum bactérien (antagoniste)
Chacune des souches présélectionnées a été ensemencées en stries à l’aide d’une anse
stérile à la surface d’un milieu gélosé (L.B). Les boites sont ensuite incubées à 28°C et à
l’obscurité pendant 24h. La surface de chaque culture microbienne est inondée par cinq
millilitres d’eau physiologique stérile. Elle est ensuite grattée à l’aide d’une spatule stérile et
la suspension microbienne obtenue est récupérée dans un tube stérile. La suspension obtenue
pour chaque souche bactérienne testée est ajustée à 106 germes/ml.

76
Chapitre V : Matériel et méthodes

V.5.3. Préparation du sol

La terre utilisée dans ce test provient d’un sol, de type sableux – argileux. Cette terre
est prélevée à une profondeur de 35 cm, d’une parcelle cultivée de tomate de la région de
Mostaganem. Le sol est d’abord séché à l’air libre pendant 10 jours, ensuite broyé et tamisé à
travers un tamis N°2 (5mm), il est ensuite mélangé au fumure à raison de 3 :1 (w:w). Le
mélange est ensuite stérilisé par autoclavage à 121°C pendant une heure trois fois de suite
(Hernandez et al., 1995). Après refroidissement, le substrat est mis dans des pots de 20 x 30
cm puis maintenu à 25°C jusqu’à son utilisation.
V.5.4. Détermination du taux de germination et l’index de vigueur
La germination directe ou indirecte des graines constitue un stade très important dans
le cycle de vie des espèces végétales. Ce caractère permet de renseigner sur le pouvoir
germinatif ainsi que la prédisposition de germination de l’espèce végétale en fonction de
différents paramètres biotiques et abiotiques.
L’étude de l’effet des rhizo-bactéries sélectionnées sur le taux de germination des
graines de tomate et l’index de vigueur correspondant a été effectuée sur 100 graines de la
variété de tomate Saint Pierre, répartis en quatre lots (25 graines/lot), pour chaque souche
microbienne testée. Chaque lot de graines est choisi au hasard et stérilisé selon la méthode
décrite en § V.1.1. Les graines ainsi préparées sont trempées dans 10 ml d’une suspension
bactérienne ajustée à une concentration de 107 [Link]-1. Un lot de 100 graines traitées à l’eau
distillée stérile est considéré comme un témoin négatif. Les différents lots de traitement sont
placés dans une étuve agitée pendant 12h.
Au bout de 12 heures d’incubation, les graines traitées et les graines témoins sont
semées dans des plaques-alvéoles en polystyrène remplie chacune par du sable stérilisée selon
la méthode de Hernandez et al. (1995). Le dispositif expérimental est laissé au laboratoire et à
température ambiante pendant 8 jours. Les semences sont arrosées régulièrement jusqu'à la
fin de l’expérience. L'expérience a été réalisée avec quatre répétitions de 25 graines chacune.
Lecture des résultats
Au bout d’une semaine, le nombre de graines de tomate ayant germé par souche
bactérienne est noté et le pourcentage de germination est ainsi calculé. Une graine germée est
celle qui parvient à émettre une radicule et les deux cotylédons.

77
Chapitre V : Matériel et méthodes

L’index de vigueur correspondant est calculé selon la méthode d’Abdul-Baki et

Anderson (1973) selon la formule suivante :

I.V = P.G *(L.R + L.C)

I.V : index de vigueur

P.G : pourcentage de germination
L.R : longueur de la racine (radicule)
L.C : longueur du cotylédon

V.5.5. Evaluation de l’effet de l’inoculation par les isolats bactériens sur la promotion de
la croissance des plants de tomate
Le test d’évaluation de l’effet des isolats bactériens sur la promotion de la croissance
des plants de tomate a été effectué dans des pots de 10 x12 cm contenant de la terre de jardin
d’un sol maraîcher mélangée à la fumure à raison de (3:1) respectivement. Le substrat est tout
d’abord séché à l’air libre pendant 10 jours puis tamisé et stérilisé deux fois pendant 20 min
à 121°C à 24h d’intervalle. Le substrat stérile est réparti dans les pots à raison de (500g/pot),
les pots sont ensuite laissés à température ambiante pendant 24h (Snissi et al., 2006). Les
graines de tomate, variété Saint Pierre désinfectées dans une solution d’hypochlorite de
sodium à 5%, afin d’éliminer toute trace de contamination superficielle préexistante puis
rincées dans trois bains d’eau distillée stérile, sont semées à raison de cinq graines par pot et
laissées à température ambiante. Les pots sont maintenus pendant 4 à 5 jours dans une
chambre de culture à une température de 22°C, arrosés régulièrement avec de l’eau distillée
stérile jusqu’à l’émergence de la première pousse.
Au bout de cinq jours de culture, 30 ml d’une suspension bactérienne provenant de
chacune des souches testées, préalablement préparées et ajustées à une concentration
avoisinant 108 à 109ufc/ml, sont déposé à la base de la tige de chaque plantule. Une deuxième
application de l’inoculum bactérien est effectuée une semaine plus tard, la densité des plantes
a été ajustée à plantes par pots (Ahmed idriss, 2007). Des arrosages réguliers à l’eau distillée
stérile ont été appliqués jusqu’à la fin de l’expérience.
L’expérience a été réalisée en bloc aléatoire complet avec trois pots par essai et trois
répétitions pour chaque souche testée.

78
Chapitre V : Matériel et méthodes

Les plantes ont été récoltées 35 jours après la plantation et 30jours après l'inoculation.
La capacité de promouvoir la croissance des isolats bactériens a été déterminée sur la base des
données recueillies sur la longueur et le poids frais et sec des tiges des racines et les
pourcentages de promotion de la croissance des racines et des tiges par rapport au témoin.

V.6. Evaluation de l’effet protecteur des plants de tomate par des isolats bactériens vis-
à-vis de l’agent pathogène (F. oxysporum f. sp lycopersici)

V.6.1. Préparation de l’inoculum fongique (agent pathogène) :

Un explant de 5 mm de diamètre d’une culture mycélienne de F. oxysporum est
prélevé d’une culture du champignon âgée d’une semaine puis déposé dans une boite de Pétri
contenant du milieu PDA. Les boites sont incubées dans une chambre de culture à 20°C
pendant 7 jours. Une suspension sporale est préparée par inondation de la surface gélosée par
5ml d’eau distillée stérile. La culture fongique est ensuite grattée à l’aide d’une spatule
stérile.. La suspension conidienne obtenue est agitée pendant 30 secondes puis filtrée sur
papier Watman N°1pour éliminer les débris mycéliens. La concentration des spores est
ajustée à 1.106 [Link]-1 à l’aide d’une cellule de Malassez (El-rifai et al., 2003).
V.6.2. Préparation du sol infecté avec [Link] f. sp lycopersici

Le sol utilisé durant cette expérience est un sol de jardin prélevé dans un champ où les
tomates sont cultivées mélangé au fumier (3 :1). Le sol est tamisé à travers un tamis N°2 et
par la suite séché. Des quantités (400g par sac palstique stérilisable) de ce mélange sont
stérilisées à l’autoclave à 120°C pendant une heure deux fois pendant deux jours et répartis
dans des pots à raison de 400g/pot.
Pour la préparation du sol infecté, les différents pots contenant le sol stérile ont été
infectés par inoculation par une solution de spore (106 spore/ml) de l’agent pathogène à
raison de 5% du poids totale du pot (Osuinde et al., 2002).
V.6.3. inoculation des plantules de tomate

Des plantules de tomate, variété Saint Pierre, sensibles à [Link] [Link].

Lycopersici et âgées de quatre semaines sont été utilisées durant cette étude. Les plantules ont
été préparées à partir de graines semées dans des plaques alvéoles en plastiques contenant de
la terre de jardin mélangé au fumier animal (3 :1) (Figure V.1) .
Avant l’inoculation, les jeunes plantules sont déterrées et leurs racines sont
soigneusement lavées à l'eau distillée stérile pour éliminer le sol adhérent sans détériorations
des racines. Le système racinaire des plants est ensuite trempé pendant 20 minutes dans une

79
Chapitre V : Matériel et méthodes

suspension microbienne obtenue à partir de chacun des agents antagonistes. Les plantules
ainsi traitées sont transplantées dans des pots en plastique contenant environ 400g de terre de
jardin mélangé au fumier (3 :1) infecté par F.O.L selon la méthode décrite précédemment. Les
lots témoins sont constitués d’une série de plantules traitées à l’eau distillée stérile et une série
de plantules cultivée dans un sol non infecté (stérile). Pour permettre une meilleure
contamination, des arrosages réguliers sont effectués afin de conserver un taux d’humidité
favorable à la croissance de l’agent phytopathogène.

Figure V.3. Culture des plantules de tomate dans des plaques alvéoles

V.6.4. Lecture des résultats

Des notations sont effectuées sur la croissance et le développement des plantes de
tomate ainsi que sur la sensibilité à la fusariose.

 Le développement des plantes : est apprécié en mesurant différents paramètre de

croissance des plantes : Poids frais des racines et de la tige ainsi que la longueur de la
racine et la tige des différents par rapport aux témoins (Perveen et al., 2007).
 L’incidence de la maladie : l’incidence de la maladie est déterminée par le calcul des
pourcentages d’infection I(%) selon la formule suivante:

I (%) = (Nombre de plantes infectées / Nombre totale des plantes) * 100

V.7. Analyses statistiques

Les résultats obtenus ont été analysés statistiquement par le test de comparaison de
moyennes (Newman et Keuls) et analyse de la variance (ANOVA) par l’utilisation de deux
logiciels informatiques Minitab 16 (Free trial) et Statbox. Les moyennes et les écart-types et
les figures ont été réalisés par le logiciel Excel 2007 (Microsft office).

80
Chapitre VI :
Résultats
Et
Discussions
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.1. Isolement des rhizobactéries libres et endophytes à partir de la rhizosphère des

plantes de tomate
La rhizosphère est la partie du sol entourant les racines et sous l’effet des différentes
activités métaboliques de ces racines. Les bactéries présentes dans cette partie du sol
présentent un groupe hautement hétérogène et pouvant coloniser la rhizosphère, la surface
des racines et même dans certains groupes les tissus internes des racines.
La rhizosphère de la tomate et d’autres plantes de la famille des solanaceae a été la
source principale des souches microbiennes utilisées tout au long de cette étude. Les
échantillons de sol ont été prélevés à partir des différents lieux de culture (sous serre et plein
champs) de la tomate dans la wilaya de Mostaganem (Algérie) (Fig.V.1). Pour chaque
prélèvement trois niveaux de la rhizosphère des plantes ont été explorés: l’ectorhizosphère, la
rhizoplane (surface des raçines) et l’endorhizophère (les tissus internes des racines).
Après ensemencement sur deux milieux différents (Lb et King B), les différentes
souches ont été purifiées puis distinguées les unes des autres par étalement en conditions
d’asepsie sur des milieux gélosés en boite de Petri. Ces manipulations ont permis la
purification de différentes souches et le regroupement des isolats identiques grâce aux
caractères morphologiques des colonies. 109 bactéries ont ainsi été dénombrées, parmi
lesquelles 46.79 % à partir de l’ectorhizosphère, 35.78% de la rhizoplane et 17.43 % de
l’endophizosphère (Fig. VI.1a).
L’étude microscopique après coloration de Gram des cellules a montré que la grande
majorité des cellules présentent une forme bacillaire à l’exception de quelques isolats qui
étaient d’une forme sphérique. Parmi les cellules de forme bacillaires, 53 % sont des cellules à
coloration Gram négatif tandis que 42 % étaient des cellules à coloration Gram positif (Fig.
VI.1b). La répartition des différents isolats en fonction de leur réaction vis-à-vis de la
coloration de Gram au sein des différents niveaux de la rhizosphère a montré une majorité
relative de souches à Gram positif parmi les souches rhizosphériques alors que les bactéries à
Gram négatif sont plus abondantes au contact des racines (la rhizosplane). A l’intérieur des
tissus racinaires, les bactéries à Gram négatif se retrouvent relativement avec un nombre égal
que les souches microbiennes à Gram négatif (Fig. VI. 2).
L’identification physiologique et biochimique des souches bacilles à Gram positif
sporulées a permis de caractériser 44 souches appartenant au genre Bacillus parmi lesquelles
21% des souches présentent les caractéristique de l’espèce B. subtilus et B.
stearothermophilus suivis de B. sphaerecus et B. mycoides représentant respectivement 13%
et 8% des souches respectivement (Fig. VI.3).
81
Chapitre VI : Résultats et discussion

La présence d’autres espèces telles que B. laterosperos, B. macerans, B. mycoides et

B. licheniformis ont été également identifiées mais en nombre réduit par rapport aux espèces
précédentes (Fig. VI.3).D’autre part, il est à noter que 13% des souches n’ont pas été
identifiées jusqu’au niveau de l’espèce et de ce fait sont considérées comme des Bacillus sp
(Annexe II).
Parmi les souches bacilles Gram négatif, isolées sur le milieu King B, 45 souches
présentent les caractéristiques morphologiques et biochimiques des espèces bactériennes
appartenant au genre Pseudomonas, parmi lesquelles les espèces P. fluorescens et P. putida
représentent respectivement chacune 25% et 15% des souches isolées. Les souches
appartenant à Pseudomonas ont été isolées principalement à partir de la rhizoplane et à un
degré moins à partir de l’ectorhizosphère pour P. fluorescens. D’autres souches appartiennent
à des espèces différentes ont été aussi détectées parmi lesquelles, l’espèce P. aerogenosa
(10%) et P. chloraraphis et P. oryzihabitans représentant chacune respectivement 7% et 8%
de la population totale des isolats. La caractérisation d’environ 25% de souches bactériennes
n’a pas été aboutit jusqu’au niveau de l’espèce malgré que leur appartenance au genre de
Pseudomonas est bien établit (Fig. VI.4) (Annexe II).

82
Chapitre VI : Résultats et discussion

17,43%
42,28%
46,79%
52,72% Gram+
35,78% Gram-

ectrhizosphère
rhizoplane
endosphère
A B

Figure VI. 1. Répartition des différents groupes de microorganismes isolés en fonction de :

A: source d’isolement ; B: coloration de Gram

8,57%
endorhizosphere 9,52%

23,81% Gram négatif

rhizoplane 13,33%
Gram positif

22,86%
ectorhizosphere 25,71%

0 5 10 15 20 25 30

Figure VI. 2. Répartition des différents isolats en fonction du type de paroi parmi les trois
sites d’isolement.

83
Chapitre VI : Résultats et discussion

Figure VI.3. Répartition et identification des espèces microbiennes appartenant au groupe

des bacilles Gram positif isolées à partir de la rhizosphère.

P. aerogenosa
10%
ND [Link]
10% 7%

Pseudomonas sp
25%
P. fluorescens
25%

P. putida
15%

P. oryzihabitans
8%

Figure VI.4. Répartition et identification des espèces microbiennes appartenant au groupe

des bacilles gram négatif isolées à partir de la rhizosphère.

84
Chapitre VI : Résultats et discussion

[Link]
En raison de son rôle crucial pour la croissance des plantes et de la fertilité des sols, la
rhizosphère a souvent été utilisée comme un environnement modèle pour cribler les agents
putatifs de lutte biologique et de stimulateurs de croissance. La rhizosphère des plantes est
connue pour être une niche écologique de choix pour divers microorganismes. Ces bactéries
colonisent la rhizosphère des plantes (rhizobactéries), la phyllosphère, la rhizoplane
(épiphytes) ainsi que l'intérieur des tissus interne de la plante (endophytes). La structure de
cette communauté microbienne est connue pour être influencée par la plante (Bergsma-Vlami
et al., 2005), le stade de croissance (Picard et al., 2000) et par le type de sol et les conditions
climatiques (Coelho et al., 2008).
Durant cette étude, la rhizosphère de la tomate a été choisie pour être un lieu
d’isolement de rhizobactéries libres ou endophytes en vue d’une éventuelle sélection de
souches capables de promouvoir et protection de la croissance de la plante. La majorité de
nos isolats ont été obtenues à partir de l’ectorhizosphère soit (46.79%) tandis que, 35.78% et
17.43% de nos isolats ont été isolés respectivement à partir de la rhizoplane et de
l’endorhizosphère.
Cette différence est probablement due à la disponibilité d’éléments nutritifs au niveau
de la zone rhizosphérique (rhizoplane + sol brut) composant les exsudats libérés par les
racines des plantes. En effet, selon Foster et Rovira (1978), la densité des bactéries est
souvent plus élevée dans la rhizosphère que dans le sol distant des racines: il s’agit de l’effet
rhizosphère. A l’inverse, la partie interne (tissus) des racines est moins riche en nombre de
bactéries (17.43%) que les autres parties de la rhizsophère, cela est peut être due à la
spécificité des lieux de colonisation à l’intérieur des tissus des plantes qui sont probablement
moins favorables que l’extérieur des racines .
Les résultats obtenus montrent une diversité de microorganismes présents dans les
différents niveaux de la rhizosphère de la plante de tomate. Le test de coloration de Gram
révèle la présence d’isolats à Gram positif ou/et à Gram négatif. La répartition des groupes
microbiens isolés selon leur réaction vis-à-vis de la coloration de Gram montre que les deux
types de bactéries, Gram positif ou Gram négatif se répartissent différemment selon le site
d’isolement. Les bactéries à Gram positif sont plus abondantes dans l’ectorhizosphère et
l’endorhizosphère, ceci est dû probablement aux conditions d’environnement qui caractérisent
surtout le sol, loin de l’effet des exsudats racinaires. Ces résultats se rapprochent de ceux
obtenus par Smalla et al. (2001), Zinniel et al. (2002) et Srivastva et al. (2014). Ces derniers
rapportent que les bactéries Gram positif sont plus abondantes dans la rhizosphère de
85
Chapitre VI : Résultats et discussion

plusieurs plantes. En revanche, ces résultats sont en contradiction avec ceux de Soderberg et
al. (2004) et qui préconisent que les bactéries Gram négatif sont plus abondantes dans la zone
en contacte directe avec les plantes, le plus souvent riche en éléments nutritifs; alors que, dans
les zones éloignées on rencontre plutôt des bactéries plus résistantes telles que les bactéries
sporulées Gram positif. Cette répartition n’est pas constante et peut varier même en fonction
du stade de croissance de la plante (Czaban et al., 2007).
Sur la base des caractères morphologiques et biochimiques un total de 109 souches
ont été identifiées comme étant des souches appartenant aux deux principaux genres
microbiens recherchés (Bacillus et Pseudomonas). La présence de ces microorganismes dans
la rhizosphère des différentes espèces végétales est bien reconnue. Leur faculté de croitre et
de se multiplier facilement sur des milieux variables et leur pouvoir antagonistes vis-à-vis des
autres microorganismes leur confère une prédominance sur les autres communautés
microbiennes présentes dans le sol (Jophef et al., 2007 ; Manikanda et al., 2010). De plus, la
capacité de formation des spores chez les bactéries membres du genre Bacillus leur accorde
d’une part, un niveau de résistance élevée à la sécheresse et aux conditions défavorables et
d’autre part, des meilleurs candidats pour le développement de produits biopesticides
efficaces (Ongena et Jacques, 2008).
Le genre Pseudomonas, de son côté, a une énorme importance en raison, de sa large
diffusion dans le sol, de sa capacité à coloniser la rhizosphère des plantes hôtes et de sa
capacité à produire un grand nombre de composés ayant une action antagoniste (inhibitrice)
vis-à-vis de divers agents pathogènes (Rangarajan et al. 2001).
Dans le sol en contact directe avec les racines on peut ainsi détecter différentes
espèces de Bacillus et de Pseudomonas. La nature des espèces rencontrées dépend
essentiellement de la plante qui détermine à son tour la nature des substrats composant les
exsudats racinaires ainsi que le type de sol. Il a été même rapporté que plusieurs espèces
bactériennes présentent une relation spécifique très étroite avec une espèce végétale donnée
ou une variété d’espèces (Zeller et al. 2007). En conséquence, le lieu d’isolement pour la
recherche d’agents promoteur de la croissance des plantes présente une grande importance du
fait qu’il permet d’isoler des souches déjà adaptées à l’environnement dans lequel elles vont
être introduites. Dans notre étude, plusieurs espèces appartenant aux genres Bacillus et
Pseudomonas ont été détectées. Chez le groupe des bacilles Gram positif, l’espèce B. subtilus
et B. stearothermophilus (actuellement dénommé Geobacillus stearthermophilus)
représentent à eux seules 42% de la population totale du genre Bacillus. Des résultats
similaires rapportés par Govidasamy et al. (2010) montrent que l’espèce B. subtilus et B.
86
Chapitre VI : Résultats et discussion

megaterium sont parmi les espèces des bactéries sporulés qui se trouvent en abondance dans
le sol et la rhizosphère des plantes. D’autres espèces du même genre (B. mycoides, B.
licheniformis et B. circulans) ont été aussi détectées mais avec un degré moins important. La
présence des ces espèces dans la rhizosphère des différentes plantes a été signalée par
différents auteurs (Garcia et al., 2004 ; Sood et al., 2007) .
La variabilité des espèces présentes dans la rhizosphère a été également enregistrée
dans le cas des isolats appartenant au genre Pseudomonas. Ces germes sont parmi les espèces
microbiennes les plus abondantes dans les sols agricoles et la rhizosphère des différentes
plantes, principalement les espèces appartenant à Pseudomonas fluorescents (Couillerot et al.,
2008 ; Saharan et Negra, 2011 ). La prédominance des espèces de P. fluorescens, P. putida a
été aussi rapporté par différentes recherches consacrées à l’étude de l’écologie microbienne
comme étant des colonisateurs majeurs du sol et de la rhizosphère soit comme agent libre ou
agent endophyte (Clays-Josserand et al., 1995; Latour et al., 1996 ; Coelho et al., 2008). La
présence également d’un certain nombre de souches présentant les caractères de P.
oryzihabitans et P. chlororaphis a été signalé par d’autres que ce soit parmi les Pseudomonas
de la rhizosphère de la tomate ou d’autres cultures (Costa et al., 2006). D’ailleurs, certains
auteurs ont signalé l’utilisation de ces deux espèces dans le contrôle biologique de différentes
maladies des plantes ce qui démontre leur capacité à coloniser la rhizosphère des plantes
(Hokeberg et al., 1998; Kapsalis et al., 2008).

87
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.2. Agent pathogène

VI.2.1. Résultats des prospections et importance de la maladie :
Les symptômes provoqués par F. oxysporum f sp lycopersici s’observent de moins au
moins chaque année dans les régions du nord ouest d’Algérie. Les prospections effectuées
dans les différentes parcelles de culture dans la région de Mostaganem (nord ouest d’Algérie)
ont permis d’observer des symptômes caractéristiques de la fusariose dans plusieurs lieux de
culture de tomate principalement sous serre. La maladie est solidement installée et seule
l’importance de l’épidémie varie d’une année à l’autre et d’une région à une autre. Il semble
que l’impact de l’utilisation de variété de tomate hybride résistante à cette agent à contribuer
dans la démunition de l’importance des dégâts provoqués par cet agent pathogène.
VI.2.2. Symptomatologie de la maladie :
Les symptômes de la maladie se traduisent par des flétrissements caractéristique soit
généralisés, soit unilatéraux. Dans certains cas, on a observé, sur les feuilles, des
jaunissements suivi de flétrissement.
On a observé également sur les tiges des stries longitudinales brunes qui exsudent le
plus souvent une gomme. Les symptômes étaient assez caractéristiques, mais toute fois à ne
pas les confondre avec d’autres champignons pouvant également être vasculaires comme
Verticillium dahliae. D’après la littérature, les symptômes de flétrissement sont plus grave
entre 18 et 25°C et assez rare à 30°C (Duval, 1991). Concernant l’état des systèmes racinaires,
de nombreux échantillons ont révélé des dégradations racinaires importantes. La qualité
d’enracinement s’est notamment montrée défectueuse. Cette mauvaise qualité se présente
sous forme d’un nombre restreint de départ de racines, pouvant avoir une orientation uni ou
pluridirectionnelle. Ce mauvais enracinement peut être un facteur favorisant des problèmes
fongiques rencontrés ultérieurement dans la culture.
VI.2.3. Caractérisation morphologique et identification de l’agent pathogène
VI.2.3.1. L’identification macroscopique
La majorité des différents échantillons utilisés dans cette étude présentaient des
symptômes de flétrissement caractéristiques des maladies liées aux Fusarium oxysporum. Sur
la base de ces résultats, un premier diagnostic a été entrepris puis complété par une analyse
des échantillons au laboratoire. La réalisation d’une coupe longitudinale dans la tige a permet
l’observation d’un brunissement des cylindres centraux typique de la forme spéciale
lycopersici.
L’étude des caractères culturaux des isolats de F. oxysporum a été réalisée après
culture sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar). Pour chaque isolat, l’ensemencement a été
88
Chapitre VI : Résultats et discussion

effectué au moyen d’un disque de 0.8cm de diamètre, prélevé aseptiquement à partir d’une
culture âgée de 07 jours et déposé sur le milieu PDA. Les cultures ont été incubées à une
température de 25°C .La disposition des boites a été modifié toutes les 24 heures de manière
aléatoire afin de réduire les variations dues à l’emplacement des cultures dans l’étuve. Les
critères étudiés sont : la couleur des colonies, l’’aspect du mycélium. L’étude macroscopique
des isolats purifiés a permis de détecter deux morphotypes avec une prédominance du
morphotype cotonneux et le morphotype ras et muqueux. La couleur des colonies varie entre
le blanc et violet avec parfois un rouge brique (Fig. VI.5). Il est à noter que la morphologie et
la pigmentation des colonies des isolats de Fusarium ont souvent été instables durant les
différentes manipulations.

Tableau VI.1. Origine et caractères macroscopiques des isolats de F. oxysporum sur milieu
PDA

Isolats organe Pigmentation Morphotype Origine

FO1 tige rose Mycélium rasant muqueux B. ramdane
FO2 tige rose Mycélium rasant Mazagran
FO3 tige blanche Mycélium cotoneux Achaacha
FO4 tige blanche Mycélium cotonneux dense S. lakhdar
FO5 sol Blanche rosâtre Mycélium rasant éparse Stidia
FO6 sol blanche Mycélium cotonneux dense Achaacha
FOL - Blanche rosâtre Mycélium rasant muqueux INRA, Dijon
FO7 collet blanche Mycélium cotonneux Mazagran
F08 collet blanche Mycélium cotonneux S, lakhdar

89
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.2.3.2. L’identification microscopique

L’observation microscopique d’une préparation des différents isolats sur lame a révélé
la présence d’un mycélium septé accompagné par des microconidies, droites ou légèrement
incurvées de petites tailles uni ou bicellulaire et une prédominance de leur nombre par rapport
aux macroconidies (Fig. VI.6) et des macroconidies en forme de cellules cloisonnées (2 à 3
cloisons) et de grande taille en forme de croissant (Fig. VI.6). Ces spores sont produites en
nombre variable selon la morphypte des souches.

A B

Figure VI.5. Aspect macroscopique des colonies de Fusarium oxysporum sur milieu PDA
(A : partie supérieure, B : revers de la boite)

Macroconidies

Microconidi
Macroconidie essssssssss
s

Figure VI.6. Macroconidies et microconidies observés au microscope optique (x400)

90
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.2.3.3. Détermination des morphotypes

La détemination des différents morphotypes a été étuduée par la culture des différents
isolats, issus d’une culture monospore, sur le milieu PDA pendant 7 à 10 jours. Au bout du
temps d’incubation, il a été noté que le champignon colonise la totalité de la boite de Petri.
Les observations effectuées sur la couleur et l’aspect mycélien sur le milieu PDA ont montré
certaines variations dans la densité et la pigmentation du thalle. Ainsi, deux morphotypes
principales ont pu être distingués parmi les différentes cultures:
Un morphotype cotonneux : caractérisé par la présence d’un mycélium aérien très
abondant dense avec une couleur blanche à blanche rosée avec une prédominance du
morphotype cotonneux de couleur blanche (FOL4 et FOL3) (Fig. VI.7).
Morphotype ras et muqueux : caractérisé par une absence du mycélium qui donne à la
culture un aspect muqueux (FOL2) (Fig. VI.7)
La morphologie des colonies Fusarium oxysporum est souvent instable. Ce
phénomène d’instabilité s’observe après trois à quatre repiquages successifs. D’ailleurs, cette
diversité morphologique a été rapportée par plusieurs auteurs (Henni et al., 1994).

91
Chapitre VI : Résultats et discussion

FOL1 FOL2

FOL3 FOL4

Figure VI.7. Les différents morphotypes de Fusarium oxysporum f. sp lycopersici sur

milieu PDA

92
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.2.4. Test du pouvoir pathogène des isolats de F. oxysporum

L’étude du pouvoir pathogène par la détermination de l’indice d’altérations foliaire a
permet de montrer que les différents isolats sélectionnés exerce un effet variable sur la
croissance des plantules de tomate. Deux groupes d’isolats peuvent être ainsi distingués. Le
premier groupe est composé de trois agents dont l’IAF est supérieure à 50% parmi lesquels
la souche de référence et les isolats FO1 et FO2. Ces agents sont capables de provoquer
l’apparition des symptômes d’altération des feuilles spécifiques au FOL (Tableau VI.2). Ces
champignons sont majoritairement isolés à partir de la tige de plantes présentant les
symptômes du flétrissement fusarienne (Fig. VI.8). Le deuxième groupe est composé de
souches présentant des IAF faibles (<50%) en comparaison avec la souche de référence. les
plantes attaquée par ces agents présentent des symptômes de flétrissement surtout dans la
partie inférieure de la plante, les feuilles supérieures ne présentent presque aucun symptôme
de la maldie (Fig. VI.8). La plupart de ces souches ont été isolés à partir du sol ou du collet
des plantes de tomates.

Tableau VI.2 : Indice d’altération foliaire des isolats de F.O.L

Isolat IAF (%)
FO1 78.4
FO2 64.3
FO3 31.3
FO4 3.2
FO5 1.3
FO6 32
FO7 5.6
FO8 12.5
FOL 89.7

93
Chapitre VI : Résultats et discussion

FO3 FO6 FO2 FO1

Figure VI.8. Schéma général montrant les différentes étapes pour la détermination de l’indice
de l’altération foliaire

94
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.2.5. Ré-isolement de l’agent pathogène

Le test de koch a été réalisé pour les deux isolats dont l’ IAF est supérieure à 50%
(FO1 et FO2). Des plantules de tomate au stade de troie vraies feuilles ont été contaminées
par les deux isolats FO1 et FO2 et cultivés dans un sol stérile pendant trois semaines. Les
tests de ré-isolement du champignon à partir des différentes parties de la plantes a révélé la
présence du pathogène dans les échantillons de 76,66 % des plants et sa migration jusqu’au
niveau de l’hypocotyle des plants alors que dans la majorité des plantes témoins le pathogène
n’a pas été détecté. L’aspect macroscopique des colonies ressemblent à celles isolées à partir
des plantes atteintes par la fusariose (Fig. VI.9).

Figure VI.9. Aspect macroscopique de certains agents pathogènes après ré-isolement sur
milieu PDA

95
Chapitre VI : Résultats et discussion

[Link]
Le Fusarium oxysporum est un agent phytopathogène ubiquiste qui provoque le
pourrissement des racines, le flétrissement vasculaire ainsi que la fonte de semis chez une
multitude de plantes hôtes (Vurro and Gressel, 2006)..
Le Fusarium oxysporum [Link] (SACC.) est l'une des maladies les plus
destructrices des cultures de la tomate en serre ou en plein champs dans les pays à climat
tempéré (Beckman, 1987). Il envahit la plante par les blessures sur les racines. Les plantes
ainsi infectées deviennent rabougries, chlorotiques et flétrissent. Décrit pour la première fois
en Europe à la fin du XIXe siècle, il est maintenant présent dans plusieurs dizaines de pays
(32) répartis sur tous les continents (Jones et al., 1991). Sa présence en Algérie a été rapporté.
par plusieurs auteurs (Henni et al., 1994 ; Benchaabane et al., 2000, Haminni, 2011). Ces
dernières années plusieurs moyens de lutte ont été appliqués pour réduire l’impact de cette
maladie sur la culture de la tomate. Ces pratiques ont conduit à une réduction importante de la
maladie au niveau des parcelles de culture. Les prospections réalisées durant cette étude ont
montré la présence encore de cette maladie dans différents lieux de la wilaya de Mostaganem
à une fréquence est plus ou moins faible. Elle ne dépasse pas le plus souvent les 5%. La
persistance de cette maladie malgré les moyens de lutte mis en œuvre pourrait être expliquée
par l’utilisation par certains agriculteurs des variétés de tomate sensibles à la maladie ou bien
l’apparition chez l’agent pathogène de races très virulentes même pour les variétés de tomate
résistante à certaines races de Fusarium. En effet le FOL est connu pour avoir plusieurs races
(Race 1, race2 et race 3) qui sont capables d’exercer un pouvoir pathogène variable (Hibar et
al., 2007). La majorité des formes spéciales du FOL appartiennent à la race 1 et race 2
auxquels plusieurs variétés de tomate résistante ont été sélectionnées, la race 3 est moins
répondus mais elle cause des dégâts considérables même chez les variétés résistantes. La
différentiation entre les différentes races est très difficile et elle est basée surtout sur des
études moléculaires (Kolak et Bicici, 2013). L’existence de nouvelles espèces de Fusarium
qui provoquent les mêmes symptômes est possible. Hamini-kadar et al. (2010) ont isolé deux
especes de Fusarium ( [Link] et F. redolens) à partir de plantes de tomates qui présentent
les symptômes de la fusariose de F. oxysporum. En plus la différentiation entre même les
deux formes spéciales lycopersici et radicis-lycopersici est complexe et pose un problème
dans le choix des méthodes de contrôle de cette maladie (Katan et al., 1997 et Gale et al.,
2003).
Les étapes d’isolement dans le laboratoire ont permet d’isoler le champignon à partir
de différentes parties de la plantes. La majorité des isolats caractéristiques ont été obtenus à

96
Chapitre VI : Résultats et discussion

partir de la tige des plantes de tomates présentant des symptômes de flétrissement spécifiques
à la fusariose. L’analyse de l’aspect morphologique des colonies a permet de montrer la
présence deux morphoypes principaux : un morphotype cotonneux à mycélium dense et un
morphotype ras muqueux, la couleur est variable entre blanche et rose violattée. Cette
diversité morphologique locale a été signalée par différents chercheurs. Henni et al., (1994) a
signalé la présence de quatre morphotypes différents chez des Fusarium oxysporum isolées à
partir des échantillons de tomates cultivées en Algérie. Ces mêmes résultats ont été confirmés
plus tard par Hamini (2011) sur des prélèvements de tomate du pourtour méditerranéen. La
pigmentation, blanche au rose, produite par les différents isolats est généralement spécifique
des formes spéciales espèces du F. oxysporum (Nelson et al. 1983, Hibar et al, . 2006).
Les observations microscopiques ont permet de mettre en évidence la présence d’un
mycélium cloisonné avec la présence de deux catégories de conidies : des microconodies en
nombre plus ou moins supérieure a des macroconidies. La présence de ces deux types de
spore est considérée le plus souvent parmi les caractéristiques principales pour l’identification
des F. oxysporum (Rozlianah et Sariah, 2006 ; Ignjatov et al., 2012). La présence ou l’absence
des chlamydospores peut être un moyen de plus dans l’identification des espèces des
Fusarium oxysporum mais ils restent moins déterminants que les critères précédents, Henni et
al. (1994) rapportent que certains morphotypes de F.O.L sont caractérisés par l’absence de la
capacité de former des chlamydospores ou parfois par une formation tardive des ces
structures.
Le FOL est champignon anamorphe qui comprend des souches pathogènes et des
souches non pathogènes. La différentiation entre les deux formes par l’étude des
caractéristiques morphologiques et microscopiques des colonies est difficile (Bao et al., 2002,
Rozlianah et al., 2006). Les essais de la pathogénie sur la plante spécifique (principe de Koch)
reste le seul moyen pour évaluer l’action nocif des souches. L’activité pathogène des souches
isolées a été évaluée par la détermination de l’indice d’altération foliaire, la majorité des
isolats ont montré des IAF plus ou moins faibles en comparaison à l’activité de la souche de
référence, seul les souches FO1 et FO2 ont montré des IAF plus ou moins élevés. Cette
différence dans la virulence pourrait être expliquée aussi bien par la différence de la
sensibilité de la variété de la plante aux différents isolats (Edel et al., 1997) ainsi que la
présence d’une vrulence variable entre les race qui composent généralement le FOL. Selon
Armostrong et Armostrong (1981), les formes spéciales du FOL sont subdivisées en races sur
la base de leur virulence vis-à-vis des cultivars hôtes.

97
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.3. Etude de l’activité antagoniste in vitro des isolats bactériens vis-à-vis de F.

oxysporum f. sp lycopersici
L’ensemble des isolats obtenus à partir des différents échantillons (109 isolats) ont été
testés pour leur capacité à réduire la croissance mycélienne de F. oxysporum f. sp lycopersici
(FOL). Une confrontation multiple avec l’agent pathogène (3 isolats bactériens / boite) a été
réalisée (Fig. VI.10). Les résultats obtenus dévoilent que 54,12 % (soit 59 isolats/109) ont
montré une activité antagoniste variable vis-à-vis de l’agent pathogène parmi lesquelles,
23.85% sont des bactéries isolées à partir de l’ectorhizosphère, 16.51% et 13.76% des isolats
appartiennent respectivement aux groupes des endophytes et des épiphytes. L’étude de l’effet
du milieu d’isolement sur l’activité inhibitrice n’a montré aucune influence sur la variabilité
de l’activité antagoniste des différents isolats.
A la suite de ces résultas, une estimation individuelle de la capacité des souches à
inhiber la croissance de l’agent pathogène a été entreprise par la culture de chacun des islots
séparement en confrontation avec l’agent pathogène.

Figure VI.10. Résultats des tests de confrontation directs préliminaire pour la sélection des
isolats inhibiteurs de la croissance de FOL (trois isolats bactériens différents par boite).

98
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.3.1. Activité antagoniste des rhizobactéries isolées à partir de l’ectorhizosphère

Le test de confrontation directe entre les différents isolats et l’agent pathogène
(Fusarium oxysporum fsp lycopersici) a montré que 51% des souches isolées de
l’ectorhizosphère sont en mesure de réduire la croissance de l’agent pathogène. Cette
réduction est traduite par la formation de zones d’inhibition variable en fonction des
différentes souches. L’analyse statistique des résultats par le test ANOVA (Annexe III,
Tableau VI.1) confirme que la nature de la souche a un effet hautement significatif (p<0,05)
sur l’activité antagoniste vis-à-vis de F. oxysporum [Link] lycopersici. Les résultats présentés
par la figure VI.11 montrent que la majorité des souches ont réduit la croissance radiale de
FOL avec des taux supérieures à 30%. Le taux le plus élevé (77,78%) a été enregistré en
présence de la souche RSML37, par contre, les souches RSMK45, RSSBL1 et RSSBK3 ont
montré des activités moins importantes de l’ordre de 66,67%, 66,67% et 66,56%
respectivement. En revanche, trois souches, RSRK3, RSRL5 et RSRK8 ont montré des
activités négligeables de l’ordre de 10%, 0,23% et 0,1% respectivement malgré que, ces
dernières ont manifesté des zones d’inhibition importantes dans le test préliminaire.

% inhibition
90

80 a

70 b b
c
cd c
60
d d d

e e
50 ef ef
fg fg
g fg g

40 h
h

30
i
i i

20

10

Figure VI.11. Pourcentages d’inhibition de la croissance de FOL par les isolats bactériens
isolés à partir de l’ectorhizosphère.

99
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.3.2. Activité antagoniste des rhizobactéries isolées à partir de la rhizoplane

La figure VI.12 présente les effets antagonistes des souches sélectionnées parmi les
isolats de la rhizoplane. Il ressort que la majorité des souches présentent des pourcentages
d’inhibition plus ou moins élevés (>30%). Les souches RPMK4 et RPMK3 présentent des
taux d’inhibition les plus élevés soit 55,89% et 53,56% respectivement. Les souches RPRL13,
RPML30 et RPMK14 exercent des effets antagonistes moins marqués que les deux souches
pré-citées avec des taux d’inhibition de 26,67%, 27,78% et 27,78% respectivement. Le milieu
d’isolement (LB ou King B) semble ne pas avoir d’influence sur la performance des souches
sélectionnées; si les deux souches les plus performantes (RPMK3 et RPMK4) ont été isolées
sur le milieu King B, une majorité de souches montrant une activité antagoniste a été isolé sur
le milieu LB (10 souches parmi 18 souches). L’analyse statistique (ANOVA) (Annexe III,
Tableau VI.2) des résultats obtenus montre que la nature de la souche a un effet hautement
significatif (p<0.05) sur le pourcentage d’inhibition de la croissance radiale du F.O.L.

% inhibition
60
a
b
c c c
50

de d d
e
f
40 g
h
h hi
i

30 j j
j

20

10

0 Strain

Figure VI.12. Pourcentages d’inhibition de la croissance de FOL par des isolats bactériens
isolés à partir de la rhizoplane.

100
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.3.3. Activité antagoniste des rhizobactéries (endophytes) isolées à partir des tissus
internes des racines
Les résultats des taux d’inhibition de la croissance de FOL par les souches rhizo-
bactériennes endophytes sont illustrés par la figure VI.13.
L’analyse de ces résultats montre que plus de 78% des isolats (soit 15 souches /19)
sont capables de réduire la croissance radiale de l’agent pathogène avec des taux variables
d’une souche à l’autre. L’analyse statistique de ces résultats démontre que ces taux
d’inhibition sont dépendants de la nature de la souche (P< 0.05) (Annexe III, Tableau VI.3).
Un taux maximal d’inhibition de 73.11% a été enregistré par la souche endophyte ERK10
isolée sur milieu LB, suivi par des taux inhibition équivalents à 68.89 % et 68% obtenus par
les isolats ERL3 et ERL11 (Fig. VI.13). La majorité des souches performantes (17/19) sont
des bactéries à coloration Gram positif isolées sur milieu LB appartenant fort probablement au
genre Bacillus. La souche ERL13 est la seule, qui a manifesté un taux d’inhibition faible
malgré que, dans la première étape de sélection, elle était parmi les souches performantes.

% inhhibition
80
a
70 b b

c
60
d

50
e
f f g
f
f g
40 h
i

30

20

10

j
0 isolat
ERL11 ERL2 ERL1 ERL3 ERL13 ERK14 ERK9 ERK10 EML57 EML59 EML56 EML60 EML61 EML62 ESL1

Figure VI.13. Pourcentages d’inhibition de la croissance de FOL par les isolats bactériens
endophytes isolés à partir des tissus internes des racines

101
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.3.4. Effet du milieu de culture sur l’activité antagoniste

Pour déterminer l’effet du milieu de culture sur l’activité antagoniste des isolats
microbiens, quatre milieux de culture (LB, King B, PDA et Gélose nutritive à base d’extrait
de malt) ont été testés par des tests de confrontation directe. Cinq souches choisies au hasard
ont été cultivé simultanément avec l’agent pathogène FOL sur les quatre milieux. Les
résultats présentés dans la figure VI.14 indiquent que l’activité antagoniste de chacune des
souches varie d’un milieu à l’autre et que la culture simultanée de l’agent antagoniste et
l’agent pathogène sur le milieu de culture King B attribue les taux d’inhibition de croissance
les plus élevés par rapport à l’ensemble des milieux testés, suivi par le milieu PDA. L’analyse
statistique des ces résultats indique qu’il n’existe aucune différence significative entre le
milieu de culture King B et le PDA pour la majorité des isolats (3/5) (Fig. VI.14).
Le milieu à base d’extrait de malt s’est montré le moins favorable avec des taux
d’inhibition plus ou moins faibles.

80 % inhibition

70 a a
a a a
a b
60 b a a b

50
PDA
b
40 Malt extract
b
c King B
30
b c LB
d c
20 b
c
10

0
RBSBL9 RPMK4 RPMK3 ERK14 RSML37

Figure VI.14. Effet du milieu de culture sur l’activité antagoniste des isolats bactériens
vis-à-vis du FOL.

102
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.3.5. Inhibition par les substances volatiles et production de l’acide cyanidrique

(HCN)
L’activité antagoniste des bactéries du sol peut être expliquée soit par la capacité de
ces microorganismes à produire des substances diffusibles dans le milieu naturel ou artificiel
ou par la production de substances volatiles à pouvoir inhibiteur. La recherche d’une activité
antagoniste dûe à la production de substances volatiles a été entreprise dans cette partie. La
figure VI.15 présente les résultats de l’activité inhibitrice des différentes souches bactériennes
par la production de substances volatiles. Cette activité a été enregistrée chez 38.98% des
isolats antagonistes testés, soit (21 souches sur 59) dont 56.52% proviennent de la partie ecto-
rhizosphériques, 39.13% des bactéries obtenues à partir de la surface des racines et 4.35%
isolées à partir de l’endopshère. Un taux d’inhibition variable en fonction de la nature de la
souche a été détecté. La souche RSSK10 et la souche RSSL5 ont présenté un taux maximal
d’inhibition avoisinant les 71.11% et 66.66% respectivement tandis que, la souche RMSK18 a
montré un taux d’inhibition moins important par rapport aux autres isolats (51.11%).
La nature des substances volatiles est variable et l’acide cyanhydrique est considéré
comme un agent principal dans l’inhibition de la croissance des microorganismes par la voie
des substances volatiles. Le virement de la couleur jaune de l’acide picrique vers le brun (Fig.
VI.16), synonyme de la présence de l’acide cyanhydrique, a été observé chez 9 souches dont,
une (01) appartient au groupe des endophytes, 06 isolats rhizosphériques et deux souches
isolées de la rhizoplane. L’intensité de la couleur est variable, elle varie entre la couleur jaune
jusqu’au rouge brique en passant par l’orange. Cette variation témoigne de la quantité de
l’acide cyanidrique produite par chacune des cellules microbiennes testées.

103
Chapitre VI : Résultats et discussion

80 % inhibition

70

60

50

40

30

20

10

0 isolat

Figure VI.15. Effet des substances volatiles produites par les isolats inhibiteurs de la
croissance de FOL.

Figure VI.16. Mise en évidence de la production de l’acide cyanidrique (HCN)

(A : production positive B : boite témoin (Production négative)

104
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.3.6. Production des sidérophores (Pyoverdines)

Les sidérophores sont des molécules à faibles poids moléculaires ayant une grande
affinité pour le fer. La production de ces métabolites par certains microorganismes de la
rhizosphère leurs confère un grand pouvoir de compétition par rapport aux microorganismes
non producteurs. La Pyoverdine, un pigment fluorescent jaune-verdâtre, est un composant
majeur des différents types de sidérophores, il est parfois utilisé pour la mise en évidence de
la capacité de production des sidérophores en général chez les microorganismes (Teintze et
al., 1981; Yasmina et al., 2009 ; Alemu, 2013) (Fig. VI.17). La production de ces pigments
jaunes verdâtres a été détectée chez 22 % des souches testées, parmi lesquelles 12 souches
ont été isolées à partir de zone externe de la rhizosphère (ectorhizosphère), 10 souches parmi
les isolats épiphytes et une seule souche appartenant aux groupes des endophytes. La
pigmentation est apparue plutôt sur les milieux séquestrés de fer que sur les milieux enrichis
par le fer. Selon les tests d’identification réalisées dans la première partie de cette étude , il
s’est avéré que l’ensemble des isolats producteurs de pyoerdine appartiennent au groupe des
Pseudomonas.

A B

Figure VI.17. Production de la pyoverdine (sidérophore) par les différents isolats

(A : croissance en absence de FeCl3 ; B : Croissance en présence de FeCl3)

105
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.3.7. Activités enzymatiques lytiques des isolats rhizobactériens

L’activité antagoniste des rhizosbactéries peut également être dûe à la production
d’enzymes dégradant la paroi cellulaire des autres microorganismes comme la cellulase, la
pectinase, la chitinase ou la protéase. D’autres activités enzymatiques peuvent être présentes
mais qui sont plutôt impliqués dans la dégradation de molécules complexes telle que la
protéase et les lipases.
Dans le de notre étude, différentes activités enzymatiques ont été détectées chez les
souches antagonistes. Des activités protéolytiques et lipolytiques (Fig. 18 B et C) ont été
détectées chez une grande partie des isolats (Fig. VI.19). La protéase a été détectée chez 68%
des souches antagonistes testées suivi par l’activité lipolytique chez 58% des isolats testés. La
répartition de ces activités parmi les trois catégoriques de bactéries est plus ou moins
identique avec une légère prédominance de la protéase chez les bactéries isolées à partir des
tissus internes des plantes (Fig. VI.19).
La CMCase La pectinase (Fig. 18 A et B) et l’amylase sont moins présentes chez les
différentes souches microbiennes. La CMCase a été détectée seulement chez 25% des isolats
alors que la pectinase et l’amylase n’ont été mis en évidence que seulement chez 19 et 12%
des isolats. La CMCase et la pectinase sont dominantes chez les bactéries isolées à partir de la
rhizoplane, tandis que l’amylase était beaucoup plus présente chez les bactéries isolées du sol
rhizosphériques (Fig. VI.20).
La concordance entre l’importance des activités enzymatiques et les taux d’inhibition
est plus ou moins faible. Les tableaux VI.3, 4 et 5 indiquent qu’aucune des enzymes n’est
privilégiée pour expliquer le taux d’inhibition d’une souche donnée. Néanmoins, Il a été
parfois noté qu’un nombre de souches sont capables d’une part de produire plusieurs enzymes
à la fois et en même temps ils présentent un taux d’inhibition élevé, le cas des RSSBK3,
RPMK26, RPMK4 et ERK9 (Tableau VI.6, VI.7 et VI.8). D’autres souches n’ont montré
qu’une faible activité enzymatique par la production d’un nombre réduit d’enzymes malgré
qu’elles ont exhibé une activité inhibitrice élevée vis-à-vis de la croissance du FOL.
Ces résultats confirment bien que le pouvoir d’inhibition de l’agent pathogène FOL
n’est pas concrètement corrélé avec l’augmentation de l’activité enzymatique globale. Ce qui
laisse à supposer que cette activité inhibitrice peut être dû soit à l’effet synergique de
plusieurs substances produites par l’agent pathogènes ou même parfois à une seule substance
douée d’une activité anti - microbienne ou activité hydrolytique importante.

106
Chapitre VI : Résultats et discussion

A B

C D

Figure VI.18. Mise en évidence de l’activité enzymatique chez les différents isolats après
culture sur milieux gélosés spécifiques (A : CMCase ; B : Protéase ; C : Pectinase : D :
Lipase).

107
Chapitre VI : Résultats et discussion

%
%
70
70
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0 Activvité enzy.
0 Lipase CMCase Pectinase Protéase Amylase Activvité enzy.
Lipase CMCase Pectinase Protéase Amylase

Figure VI. 19. Répartition des activités enzymatiques parmi les souches microbiennes isolées
à partir de différents sites de la rhizosphère des plantes de tomates.

80% souches ectorhizosphériques

souches endophytiques
70%
% souches épiphytiques
60%

S 50%
O
U 40%
C
H 30%
E
20%
S
10%

0% Activité enzymatique
Lipase CMCase Pectinase Protéase amylase

Figure VI.20. Répartition des différentes activités enzymatiques par rapport aux origines des
souches microbiennes.

108
Chapitre VI : Résultats et discussion

Tableau VI.3. Concordance entre l’Activité hydrolytiques et l’activité inhibitrice des différentes souches
microbiennes isolées à partir de l’ectorhizophere des racines de tomates.

Isolat Lipase CMCase Pectinase Protéase amylase %

RSRL1 - - + - + 55,56
RSRL2 + - + ++ - 44,44
RSRL5 0,00
RSRK7 + + - ++ - 44,44
RSRK8 + + ++ - 0,00
RSRK3 + - - +++ - 0,00
RSRK4 + - + +++ - 44,44
RSSBL1 + - + - - 44,44
RSSBL9 - - - - - 66,67
RSSBK3 - - + ++++ + 66,67
RSSBK4 + - - ++++ - 55,56
RSSBK5 44,44
RSSBK6 - + - +++ - 50,00
RSSBK8 + + - +++ - 44,44
RSSBK10 + - - ++++ - 62,22
RSML37 + - - ++ - 77,78
RSML39 + - + +++ - 46,67
RSML47 - - - - - 33,33
RSML17 - - + ++ - 50,00
RSML18 + + - + - 55,56
RSMK40 + - - ++ - 24,44
RSMK42 - - - ++++ - 44,44
RSMK43 + - - +++ - 44,44
RSMK44 - - - - - 42,22
RSML48 - - - - - 46,67
RSMK45 - - - - - 66,67

109
Chapitre VI : Résultats et discussion

Tableau VI.4. Concordance entre l’activité hydrolytiques et l’activité inhibitrices des différentes souches
microbiennes isolées à partir de la rhizoplane des racines de tomates.

isolat Lipase CMCase Pectinase Protéase amylase %

RPRL13 + + - ++ - 26,67
RPRL14 + - - + - 51,11
RPML19 - + - - - 44,44
RPML21 - - - + - 44,44
RPML29 + - - + - 50,00
RPML30 - + + + - 27,78
RPMK26 + + + ++ + 44,44
RPMK25 - - - - - 44,44
RPMK2 + - - ++++ - 55,56
RPMK3 - - - - - 33,33
RPMK4 + + - ++++ + 55,56
RPMK14 + + + +++ - 27,78
RPMK16 - - - - - 33,33
RPML23 - - - - - 49,93
RPML24 - - - +++ + 43,33
RPML10 + - - +++ + 38,89
RPML11 + - - - - 44,44
RPMK17 - - - - - 33,33

110
Chapitre VI : Résultats et discussion

Tableau [Link] entre l’activité enzymatiques hydrolytiques et l’activité

inhibitrices des différentes souches microbiennes isolées à partir de l’endorhizosphère des
racines de tomates.

Isolat Lipase CMCase Pectinase Protéase Amylase %

ERL11 - - - - - 66,67
ERL2 + - - ++++ + 60,33
ERL1 40,44
ERL3 + - + ++++ + 67,44
ERL13 + + - +++ - 0,15
ERK14 - - - +++ - 55,33
ERK9 + + + +++ - 38,22
ERK10 + - - +++ - 73,33
EML57 + - - +++ - 44,44
EML59 - - - - - 45,33
EML56 + - - ++ - 34,44
EML60 + - - +++ - 41,44
EML61 + + - - - 44,24
EML62 + + - +++ - 48,67
ESL1 + - - ++ - 45,18

111
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI. 3.8. Discussion

Les rhizobactéries promotrices de la croissance de plantes (PGPR), tels que les espèces
du Pseudomonas et Bacillus, sont les principaux colonisateurs des racines de différentes
espèces végétales (Joseph et al, 2007 ; Manikanda et al, 2010). Leur rôle dans la lutte
biologique contre les maladies cryptogamiques a été rapporté par plusieurs recherches
(Amkraz et al., 2010 ; Dalal et Kulkarni, 2013 ). Différents mécanismes ont été signalés pour
expliquer leur performance. La production d'antibiotiques, des sidérophore, des substances
volatiles tel que le cyanure d'hydrogène, l’induction de résistance systémique chez les plantes
et l'inactivation des agents pathogènes par la production d’enzymes lytiques sont autant de
mécanismes impliqués dans l’activité antagonistes de ces rhizobactéries (Liu et al., 1995;
Sadfi et al. 2001, Ruchi et al., 2012).
Durant cette étude, 109 souches ont été isolées à partir des échantillons du sol et des
racines des plantes prélevés de différents champs de culture de tomate dans la wilaya de
Mostaganem (Nord-Ouest, Algérie). La mise en évidence de leur activité antagoniste contre
l’agent de la fusariose de la tomate (FOL) a été réalisé in vitro par la technique de
confrontation directe (dual assay) dans des boites de Petri contenant un milieu gélosé (PDA).
Plus de 54% (59/109) des souches testées se sont apparues séparées de la colonie
fongique par une zone claire de diamètre plus ou moins variable selon la souche testée. La
présence de ces zones claires autour des colonies bactériennes traduit la capacité des agents
antagonistes à la production de substances diffusibles qui limitent la croissance mycélienne
de l’agent pathogène. Selon Nourozian et al. (2006), la formation de zones d’inhibition entre
l’agent pathogène et la bactérie antagoniste dans le test de confrontation est du
vraisemblablement à la production et à la diffusion dans le milieu de culture de substances
douées d’une activité antimicrobienne produites par les agents antagonistes. De plus,
l’utilisation de milieux riches en éléments nutritifs (PDA dans notre cas) exclut la possibilité
de l’apparition de cette zone dû à un phénomène de compétition pour les nutriments (Ahmed
Idriss et al., 2007).
Le taux d’inhibition de la croissance de l’agent pathogène a été calculé pour
l’ensemble des bactéries par rapport à une culture témoin de l’agent pathogène (FOL) selon la
méthode décrite par whipps (1987). Les résultats obtenus montrent que le taux d’inhibition
varie de 31% à 78%. Cette variabilité est due probablement aussi bien à la concentration de la
substance difusible produite de l’isolat antagoniste (Landa et al., 1997) qu’à la nature de cette
substance (Williams et Asher, 1996). En effet la production d’antibiotiques est largement
répandue chez les bactéries de la rhizosphère des plantes (Raaijmakers et al . 2002). Les
112
Chapitre VI : Résultats et discussion

bactéries appartenant principalement aux genres Bacillus et Pseudomonas sont capables de

produire une multitude d’antibiotiques inhibant ainsi différents types de microorganismes
(Weller, 1988 ; Whipps, 2001).
La position du site de prélèvement par rapport aux racines de la plante ne semble pas
avoir un effet déterminant dans l’importance du taux d’inhibition exercé par les agents
antagonistes. Des taux d’inhibition élevés ont été obtenus aussi bien par des souches isolées à
partir de l’ectorhizosphère qu’à partir de souches isolées de la rhizoplane ou des tissus
internes des racines (Fig. VI. 2,3 et 4). Ces résultats sont en accord avec d’autres travaux
accomplis sur des souches microbiennes appartenant à des sites différents de la rhizosphère.
Muleta et al., (2013) rapportent que des taux d’inhibition variant de 37.5% à 73.6 ont été
obtenus par des souches isolées de la rhizosphère du café testées vis-à-vis de Fusarium
oxysporum. De même, des souches de Bacillus isolées à partir de la rhizosphère de tomate
ont présenté une activité inhibitrice équivalente à 51.16% (Karimi et al., 2012). Lahlali et al.
(2007) rapportent aussi que des bactéries endophytes appartenant aux genres Bacillus et
Pseudomonas étaient capables de réduire in vitro la croissance de Rhizoctonia solani avec un
taux équivalent à 71.66%.
En plus de l’antibiose, il existe d’autres mécanismes par lesquels les rhizobactéries
sont capables de réduire la croissance des agents pathogènes. La production de substances de
nature volatiles peut être considérée parmi ces mécanismes (Voisard et al., 1989). Selon Kai
et al. (2007) plus de 200 composées organiques volatiles, produits par les bactéries et les
moisissures ont été identifiés. La majorité de ces molécules sont impliquées dans des
interactions multiples et exercent un effet antimicrobien ou modulateur sur la croissance des
microorganismes et des plantes. Cette activité a été détectée chez plus de 39% des isolats
testés, avec des taux d’inhibition de l’agent pthogène variant entre 7% et 71%.
Une mise en évidence de la nature des substances volatiles impliquées dans
l’inhibition du FOL a été entreprise par la recherche de la production de l’acide cyanidrique
(HCN). La production de cette substance a été enregestré chez 15% des isolats antagonistes
testés. Cette valeur est inférieur à celui rapporté par d’autres recherches puisqu’il est souvent
rapporté que la production de HCN est présente chez un grand nombre (>50%) de bactéries de
la rhizosphère (Bakker et schippers, 1987; Défago et al. 1990). L’absence de HCN chez les
bactéries promotrices de la croissance des plantes peut être un caractère positif du fait de son
effet négatif sur la croissance des plantes. Malgré que ce caractère est considérée par
plusieurs auteurs comme un composant principal du groupe des substances volatiles
responsables du contrôle de la croissance de plusieurs agents phytopathogènes (Blummer et
113
Chapitre VI : Résultats et discussion

Haas, 2000 ; Ramette et al. 2003), d’autres avancent que des espèces de Pseudomonas
peuvent ralentir la croissance des racines de pommes de terre à travers la production de HCN
(Bakker et al., 1989; Agrawal et Agrawal,2013).
Même si le rôle de la compétition pour l’espace ne peut être complètement exclu
comme un mécanisme d’antagonisme chez les rhizosbactéries, l’essentiel des travaux relatifs
à la compétition porte sur la compétition trophique et, en particulier, sur la compétition pour
le fer (Lemanceau, 1992). En raison de la faible biodisponibilité du fer dans l'environnement,
les micro-organismes ont développé des stratégies d'absorption spécifiques comme la
production de sidérophores. Les sidérophores sont des agents chélateurs de métaux ayant des
masses moléculaires faibles (200-2000Da) produites par des micro-organismes et des plantes,
en particulier dans des conditions de limitation du Fer (Schwyn et Neilands, 1987).
L’implication des ces substances dans les mécanismes de contrôle biologique est largement
rapporté (Ramyasmruthi et al. 2012; Bhakthavatchalu et al., 2013 ). Leur production a été
détectée chez 22% de nos isolats testés. Leur présence a été enregistrée plutôt chez les
souches qui colonisent la partie externe des racines de la plante (rhizoplane et
ectoprhizoplane). L’identification biochimique primaire des isolats producteurs a montré
l’appartenance exclusive de ces isolats au genre Pseudomonas. Ces résultats sont en accord
avec ceux de Mayor et Abdellah (1978) qui rapportent que les Pseudomonas fluorescents sont
caractérisées par la production des pigments fluorescents sous les radiations UV considérés
comme des sidérophores. Le non détection de germes producteurs de sidérophores parmi les
bacilles gram positif pourrait s’expliquer par la spécificité de la méthode de recherche utilisée.
D’ailleurs, la méthode adaptée pour nos essais est celle de Teintze et al. (1981) et Yasmin et
al. (2009) basée sur la mise en évidence uniquement d’un seul type de sidérophores (les
pyoverdines). Contrairement à nos résultats, plusieurs chercheurs confirment la capacité des
bacilles à coloration Gram positif à produire les sidérophores par leur mise en évidence par
des modifications de la technique de chromazurol (CAS) (Hu et Xu, 2011).
L’activité enzymatique des souches antagonistes a été également explorée pour
déterminer une éventuelle corrélation entre le pouvoir inhibiteur des isolats et la nature des
enzymes produits. Les activités protéolytiques et lipolytiques ont été détectées respectivement
chez plus de 67% et 57% des isolats. Une légère prévalence de ces deux activités a été mise
en évidence chez les isolats endophytes. Ces résultats sont en accord avec plusieurs études qui
ont montré que ces deux activités sont largement répandues chez les bactéries de la
rhizosphère (Bakthavatchalu et al., 2012 ; Ruch et al., 2012)

114
Chapitre VI : Résultats et discussion

L’importance de ces enzymes pour les souches productrices est appréciée

différemment selon certains auteurs. Yandri et al. (2008) mentionne que la protéase est une
enzyme qui dégrade les peptides en acides aminés de sorte qu’ils seront ensuite facilement
utilisés par les microorganismes antagonistes. Selon O’sullivan et al. (1991), la présence de la
protéase chez les microorganismes rhizosphériques contribue à l’amélioration de leur pouvoir
de colonisation ainsi qu’à leur pouvoir antagoniste contre les agents pathogènes. Certaines
protéases comme les élastases, les subtilisines et les pronases possèdent même des activités
antimicrobiennes contre différentes bactéries à coloration Gram positif et Gram négatif (Kaur
et al., 1989). Les lipases des bactéries promotrices de la croissance sont moins recherchées.
Leur absence chez certaines Pseudomonas fluorescents est parfois liée à l’incapacité de ces
germes à accumuler le polyhydroxybutirate (Arwiyanto et al. 2007). Les pectinases et les
cellulases sont des enzymes qui sont impliqués directement dans la dégradation de certains
composants de la paroi cellulaire des plantes et même de certaines moisissures comme les
oomycètes (Djuric et al., 2011). Le parasitisme et/ou la lyse des champignons par les bactéries
du sol peut être aussi facilité par la présence de ces deux enzymes. Les tests de la mise en
évidence de la production de ces deux enzymes ont montré que 25% des isolats bactériens
possèdent les cellulases et seulement 18% de la collection bactérienne testée produisent des
pectinases. Une corrélation étroite entre la présence des enzymes lytiques et l’activité
antagoniste par la voie de substances diffusibles des différents isolats n’a pas pu être
démontré à partir des résultats de nos différentes expériences. Cela peut être expliqué par le
fait que les mécanismes de contrôle chez les rhizobactéries ne sont pas dépendants l’un de
l’autre et qu’un agent de bio contrôle peut agir par plus d’un mécanisme à la fois (Alabouvette
et al. 1993).

115
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.4. Etude des propriétés associées à l'action des isolats sur la promotion de la
croissance de la plante tomate
VI.4.1. Solubilisation des phosphates inorganiques
Le phosphore est le deuxième élément important pour la croissance de la plante, il se
trouve dans la nature sous forme organique ou inorganique. Sa disponibilité pour la plante est
relativement faible à cause de sa fixation sous une forme insoluble par les éléments minéraux
tels que le fer, le calcium ou l’aluminium. L’approvisionnement du sol par des formes
solubles de phosphates à travers des moyens biologiques par la voie des bactéries ou
champignons solubilisant le phosphate a été rapporté par plusieurs auteurs (Whitelaw, 2000;
Khan et al., 2010).
La mise en évidence de la solubilisation du phosphate inorganique par les souches
isolées a été réalisée par détection visulle sur le milieu gélosé PVK (Fig. VI.21). L’apparition
d’une zone de solubilisation autour des colonies a été observée chez 41% des souches testées.
Le diamètre de ces zones varie d’une souche à l’autre. Un paramètre appelé index de
solubilisation a été retenu pour évaluer l’importance de cette solubilisation. Il mesure le
rapport entre la zone de solubilisation et le diamètre de croissance de la colonie. Les résultats
présentés dans les figures VI.22, 23 et 24 montrent que l’index de solubilisation des souches
testées varie entre 0.43 et 3.44. Chez les souches isolées à partir de la rhizosphère, la majorité
de ces dernières (11 sur 17) ont montré un index de solubilisation supérieure à 2.05 (Fig.
VI.22). En revanche, une activité maximale équivalente à 3.34 a été obtenue par la souche
RSML17, suivi par les souches RSPK7 et RSSBK3 avec des valeurs d’ISP égales à 3.31 et
3.19 respectivement. Alors qu’une valeur minimale d’ISP de 0.43 a été enregistrée par la
souche RSML18.
De leur part, les souches isolées de la rhizoplane ont démontré une activité de
solubilisation du phosphate tricalcium (PTC) moins importante que les souches
rhizosphériques. C’est ainsi que 53% des ces souches présentent un index de solubilisation
variant entre 1.93 à 2.99 avec un seul ISP maximal correspondant à 3.44 obtenu par la souche
RPMK2 (Fig. VI.23). Des valeurs d’ISP plus ou moins faibles (< 1.22) ont été obtenues par
37% des souches. La souche RPML23 a produit une valeur d’ISP minimale de 0.73.
Dans la catégorie des isolats endophytes, l’activité de solubilisation des phosphates a
été moins présente en nombre de souches par rapport aux deux autres catégories de souches.
Seules 10 souches parmi le lot ont été capables d’utiliser le phosphate tricalcium (PTC)
comme source de phosphate. Les valeurs d’ISP sont aussi plus ou moins inférieures aux
précédentes valeurs des souches rhizosphériques et épiphytes vu que la majorité des souches
116
Chapitre VI : Résultats et discussion

ont des valeurs d’ISP inférieures à 2.10 malgré que la souche ERK10 ait démontré une valeur
d’ISP maximale de 3.44 (Fig. VI.24).
Plusieurs études rapportent que l’activité de solubilisation des phosphates est souvent
variable en fonction du temps. Ce constat a été démontré par les tests réalisés in vitro par
l’utilisation de durées d’incubation variables chez différents isolats de notre collection. Les
résultats présentés dans la figure VI.25 montrent que l’ensemble des souches dévoilent une
évolution positive par rapport à leur ISP en fonction du temps d’incubation. Une valeur
maximale d’ISP de 2.71 a été obtenue par la souche RSMK43 au bout de 14 jours
d’incubation suivie par la souche RPMK26 avec un ISP de 2.69 pour une durée équivalente
d’incubation. Il est à noter que la souche RSSBK3 est la seule et l’unique souche qui a
présenté une activité maximale (IS=2.49) au bout de 12 jours d’incubation.

Figure VI.21. Halos de solubilisation du phosphate inorganique sur milieu PVK.

117
Chapitre VI : Résultats et discussion

4,0 ISP

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 souche
RSML17

RSML18

RSML37

RSML39

RSPK7

RSRK4

RSRK3
RSSBK3

RSSBK4

RSSBK6

RSSBK8
RSRL2

RSSBL1
RSSBK10

RSMK40

RSMK42

RSMK43
Figure VI.22. Index de solubilisation du phosphate chez les rhizobactéries isolées à partir de
l’ectorhizosphère.

4,0 ISP
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0 Isolat
RPMK14

RPMK2

RPMK26

RPMK4

RPML1

RPML10

RPML19

RPML21

RPML23

RPML24

RPML29

RPML30

RPRL13

RPRL14

RPML11

RPMK3

Figure VI.23. Index de solubilisation du phosphate chez les rhizobactéries isolées à partir de
la rhizoplane.

118
Chapitre VI : Résultats et discussion

4,0 ISP

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0
isolat

ERL13
EML57

EML61

EML60
ERK9
ERL1

ERL2

ERL3
ERK10

ERK14

Figure VI.24. Index de solubilisation du phosphate chez les rhizobactéries isolées à partir de
l’endorhizosphère.
Index Solubilisation

2,90

2,70

2,50

RPML19
2,30 RPMK2
RSMK43
2,10 RPMK26
ERL2
RSMK42
1,90
RSSBK3
EML57
1,70 RPML30
RSSBK10
1,50 jours
4 6 8 10 12 14

Figure VI.25. Evolution de l’index de solubilisation chez certains isolats en fonction du

temps d’incubation.

119
Chapitre VI : Résultats et discussion

[Link] d’acide indole acétique (AIA)

La mise en évidence de la production d’AIA a été réalisée chez les trois groupes de
bactéries précédemment sélectionnées (appartenant aux trois sites différents de la rhizosphère
des plantes de tomate) et présentant une activité antagoniste in vitro contre le Fusarium
oxysporum lycopercisi (FOL). Les tests ont montré que plus de 69% des souches testées sont
capables de produire l’acide indole acétique en présence de tryptophane (10mg/ml). Parmi les
souches productrices, 39% sont d’origine ectorhizosphérique, 36% proviennent de la
rhizoplane alors que seulement 25% font partie de l’endorhizosphère. La quantité produite est
variable d’un isolat à l’autre. La majorité des isolats ont ainsi produit des concentrations
d’AIA supérieure à 20 µg/ml (Tableau VI.6). Chez les bactéries épiphytes (de la rhizoplane)
les concentrations de l’AIA produit varient entre 19.67 µg/ml et 95.44 µg/ml. Les souches
RPMK26 et RPML 24 ont produits des concentrations maximales équivalentes à 95,44 µg/ml
et 94,5 µg/ml respectivement. La plus faible concentration (19,67µg/ml) a été synthétisée par
la souche RPML10 (Tableau VI.6). Les quantités de l’AIA produites par les rhizosphériques
sont globalement moins importantes que les isolats de la rhizoplane. Ces concentrations
varient entre 19.79µg/ml produite par RSMK43 et 70.5µg/ml produite par RSSBK8
(Tableau VI.6). Contrairement aux deux catégories d’isolats précédentes, plus de 66% des
isolats endophytes ont produit des quantités d’AIA ne dépassant pas 40µg/ml. Seule trois ont
produit des concentrations supérieures à 50µg/ml. Une concentration maximale de
62.28µg/ml a été obtenue par la souche ERK10 (Tableau VI.6).
L’étude de la nature des isolats producteurs de l’AIA nous a permet de constater que
l’importance des concentrations de l’acide indole acétique produites n’est pas dépendant de
la nature taxonomique de l’agent producteur. C’est ainsi que des valeurs maximales d’AIA
ont été obtenues à partir de souches microbiennes appartenant aussi bien au genre Bacillus
qu’au genre Pseudomonas. La souche RPMK26 identifiée comme appartenant à l’espèce B.
circulans a produit des concentrations d’AIA équivalente à 95.44 µg/ml de même que la
souche RPML24 dientifiée comme Pseudomonas sp a produit de même des concentrations
égales à 94.5µg/ml (Tableau VI.6). Par contre, l’appartenance à un site d’isolement donné de
la rhizosphère semble avoir une grande influence sur les quantités d’acide produites. Ceci est
essentiellement traduit dans ce travail par les concentrations de l’AIA produites par les
différentes souches isolées à partir de la surface des racines. Cette partie de la rhizosphère est
caractérisée par des échanges intenses entre les microorganismes et les exsudats racinaires
riches en éléments nutritifs qui favorisent les différentes voies métaboliques chez aussi bien la
plante que les microorganismes.
120
Chapitre VI : Résultats et discussion

La synthèse de l’AIA par les microorganismes est obtenue à travers plusieurs voies
métaboliques. Certaines de ces voies sont dites voies dépendantes du tryptophane, d’autres
sont non dépendantes du tryptophane (Patten et Glick, 1996). L’étude de la dépendance de la
synthèse de l’AIA chez nos différents isolats a été réalisée par l’étude in vitro de l’effet de la
concentration du tryptophane sur la production de l’AIA. Il ressort des différents résultats
obtenus et illustrés par la figure VI.26 que la production de l’AIA est fortement dépendante de
la concentration du tryptophane dans le milieu et ceci indépendamment de la nature de la
souche testée ou du site du prélèvement.
VI.4.3. Production de l’ammoniaque (NH3)
La production de l’ammoniaque par les microorganismes de la rhizosphère est souvent
recherchée comme un paramètre pour la sélection des bactéries promotrices de la croissance
des plantes (Srivastava et al., 2014). Les résultats présentés dans le tableau VI.7 montre que
l’ammoniaque a été détectée chez l’ensemble des souches testées.

121
Chapitre VI : Résultats et discussion

Tableau VI.6. Production de l’indole acétique et l’ammoniaque par les différentes espèces des rhizobactéries isolées des trois sites de la
rhizosphère de la tomate.
Souches rhizosphériques Souches épiphytes Souches endophytes
Isolat AIA NH3 Espèce Souche AIA NH3 Espèce souche IAA NH3 Espèce
(µg/ml) (µg/ml) (µg/ml)
RPMK14 44,5f + Pseudomonas sp RSMK40 51,94c + Pseudomonas sp EML56 32,14g + Pseudomonas sp
RPMK2 88,17d + Pseudomonas sp RSMK42 27,47k + B. stearothermophilus EML57 33,33fg + Bacillus sp
RPMK26 95,44a + B. circulans RSMK43 19,79l + [Link] EML60 29,39h + Pseudomonas sp
RPMK4 62,64e + B. polymixa RSML17 39,42f + B. licheniformis EML61 39,22e + B. sphaerecus
RPML10 19,67l + P. chlororaphis RSML18 37,58g + B. brevis EML62 33,67f + B. sphaerecus
RPML11 36,36j + B. megaterium RSML37 28,56jk + B. stearothermophilus ERK10 62,28a + B. brevis
RPML19 91,97c + B. licheniformis RSML39 34,14h + Pseudomonas sp ERL13 45,31d + Bacillus brevis
RPML21 41,39g + Bacillus sp RSRK3 32,36i + [Link] ERL2 58,22c + P. chlororaphis
RPML24 94,5b + Pseudomonas sp RSRK4 27,25k + P. putida ERL3 60,47b + B. laterosporus
RPML28 35,33k + P. putida RSRK7 31,06i + Pseudomonas sp ESK30 24,86i + Pseudomonas sp
RPML30 37,94i + B. stearothermophilus RSRL2 39,33f + Pseudomonas sp
RPRL13 23,86l + P. putida RSSBK10 47,72d + Pseudomonas sp
RPML27 40,83h + B. stearothermophilus RSSBK3 44,19e + P. fluorescens
RPMK17 70,03 P. chlororaphis RSSBK4 29,03j + [Link]
RPBK14 64,53 P. fluorescens RSSBK6 40,33f + [Link]
RSSBK8 70,5a + [Link]

122
Chapitre VI : Résultats et discussion

A B

C
Figure VI. 26. Effet de la concentration du tryptophane sur la production de l’acide indole acétique par les rhizobactéries isolées de:
A : l’ectorhizosphère, B : l’endorhizosphère , C : la rhizoplane

123
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.4.4. Discussion
Les Rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR) sont un groupe
hétérogène de bactéries qui peuvent être trouvées dans la rhizosphère, à la surface des racines
et/ou en association avec les racines, qui peuvent améliorer directement et / ou indirectement
la qualité et le degré croissance des plantes (Bloemberg et al., 2001 ; Bellishree et al., 2014).
Les mécanismes exacts par lesquels les PGPR stimulent la croissance des plantes ne sont pas
entièrement élucidés, mais on pense qu’il s’agit princiapalement de la production ou la
modification de la concentration de certains régulateurs de la croisance (AIA, gibberellines et
ethylène), la solubilsation des phosphates ou autres nutriments ou indirectement par la
limitation de la croissance des microorganismes phytopathogènes (Joseph et al., 2007 ;
Kumar et al., 2014). La capacité des souches antagonistes sélectionnées à promouvoir la
croissance des plantes de tomate a été abordé dans cette partie à travers la mise en évidence de
leur pouvoir à solubiliser in vitro le phosphate inorganique et leur potentiel de production des
phytohormones (AIA) ainsi que le métabolisme des substances azotées par la production
d’ammoniaque.
La capacité des PGPR à convertir les phosphates inorganiques insolubles sous des
formes disponibles pour la croissance des plantes est une caractéristique importante dans les
conditions où le phosphate est un facteur limitant de la croissance des cultures (Majid, 2015).
La solubilisation des phosphates est le mode d'action le plus souvent reconnu chez les PGPR
pour augmenter la disponibilité de cet élément nutritif en faveur des plantes hôtes (Gupta et
al., 1994 ; Vessey, 2003 ; Usha et al., 2012). La présence de cette activité chez les
microorganismes est mise en évidence par la formation d’un halo autour des colonies
cultivées sur un milieu gélosé (PVK) contenant le phosphate tricalcique comme seule source
de P. La mesure de degré de solubilisation est déterminée généralement par le calcul de
l’index de solubilisation qui traduit le rapport entre la zone de solubilisation et le diamètre de
croissance de la colonie. La formation de zones claires autour des colonies traduit
principalement la capacité de chacune des cellules bactériennes présentes à utiliser le
phosphate tricalcique comme source de phosphore. Cette capacité de solubilisation a été
détectée chez 41% des isolats testés. Des valeurs variables d’ISP ont été enregestrées. Des
valeurs comparables à nos résultats ont été ainsi rapportées par d’autres auteurs pour des
souches microbiennes isolées à partir de la rhizosphère de plusieurs plantes. Walpola et Yoon
(2013) rapportent que des souches microbiennes (PSB8-PSB13) isolées à partir de la
rhizosphère du blé ont montré un index de solubilisation maximale équivalente à 3.25. Les
travaux Alam et al., (2002) ont également obtenu un ISP avoisinant 3.29 chez la souche PSB-
124
Chapitre VI : Résultats et discussion

107MB isolée à partir de la rhizosphère de plante de maïs. En revanche, Islam et al. (2007) un
index de solubilisation important de 6.7 chez des souches originaires de la surface des racines
du riz. La solubilisation des phosphates a été également détectée chez les bactéries
endophytes (Baig et al., 2010). Ces bactéries présente un intérêt particulier pour l’agriculture
(Ji et al., 2014). Il est à signaler que des valeurs d’ISP allant de 2.7 jusqu’à 10 ont été
rapportés par Duangpaeng et al., (2013) pour des souches provenant des tissus internes de
plusieurs variétés de riz.
Plusieurs hypothèses sont avancées pour expliquer les mécanismes impliqués dans la
solubilisation des phosphates par voie biologique. La production d’acides organiques (acide
gluconique et acide oxalique) est le mécanisme le plus adapté (Alam et al., 2002) de même
que, la libération d’ions H+, la synthèse de substances chélatrices ou la productions d’acides
inorganiques (Khan et al., 2010 ; Marra et al., 2012).
La variation du dégré de solubilisation du phosphate par les différents isolats a été
également testée par le suivi de l’activité solubilisante des cellules pendant 14 jours. Des
index de solubilisation maximals ont été obtenus au bout de 14 jours par la majorité à
l’exception des souches RSSK3 et RPML19 qui ont montré une activité maximale après 12
jours d’incubation. Des résultats similaires ont été rapportés par Mardad et al. (2013). Ces
mêmes résultats sont en désaccord avec les résultats obtenus par d’autres études qui
rapportent des activités maximales au bout d’une période d’incubation plus courte. Les
travaux d’Alam et al. (2002) portant sur l’effet du temps d’incubation sur l’ISP, rapportent
des index de solubilisation maximaux (3.29) après seulement 7 jours d’incubation. Les
différences dans les conditions d’utilisation des méthodes d’évaluation de la solubilisation
pourraient expliquer les différences dans les résultats obtenus par les différents auteurs. En
effet, selon Fankem et al. (2006) la mesure de la capacité de solubilisation par utilisation
donnent des résultats non reporductibles et que seul le dosage du phosphate libéré dans milieu
liquide permet de déterminer la capacité réelle de la souche.
La production des phytohormones est reconnue pour être un élément clé dans la
promotion de la croissance des plantes. Les phytohormones interviennent dans plusieurs
activités physiologiques de la plante, Ils favorisent la germination des graines, allongement
les racines et stimulent l'expansion de la feuille (Sessitsch et al., 2003 ; Egamberdieva, 2008).
Divers microorganismes du sol y compris les bactéries, les champignons et les algues sont
capables de produire des quantités de phytohormones physiologiquement actives et qui
peuvent exercer des effets prononcés sur la croissance des plantes (Ahmad et al., 2005).

125
Chapitre VI : Résultats et discussion

La recherche de la production de l’indole acétique parmi chez les différents isolats

sélectionnés a permis de montrer que 69% des isolats testés sont capables de produire l’AIA.
Des concentrations variables d’AIA ont été enregistrées allant de 19.67 µg/ml jusqu’à
95.44µg/ml.
La nature des isolats producteurs a montré que des quantités élevées d’AIA ont été
obtenues aussi bien à partir des souches de Bacillus que de Pseudomonas. Plusieurs études
antérieures ont aussi rapporté que l’AIA est produit par diverses bactéries de la thizosphère.
Kumar et al. (2014) rapportent que des souches de Pseudomonas fluorescents (Ps-BK1 et Ps-
AB4) étaient capables de produire des quantités d’AIA variables allant de 95.60 à 110.00
µg/ml en présence de 200 µg/ml de tryptophane. De même que selon Starovic et al. (2013)
des quantités appréciables d’AIA allant de 20.4 μg/ml à 33.6 μg/ml ont été détectées
respectivement chez les espèces de (Bacillus RC23) et (Bacillus simplex RC19) en présence
de 25 μg/ml de tryptophane.
Il faut noter qu’il est parfois très difficile de faire une comparaison objective des
résultats obtenus par les différents auteurs dans le domaine de la production de l’AIA, cela est
probablement dû aux concentrations du tryptophane utilisé dans chaque protocole
expérimental. La concentration du tryptophane, utilisée souvent comme précurseur, influe
considérablement sur la concentration d’AIA produit. Cette constatation a été confirméé par
les résultats obtenus en variant les concentrations du tryptophane. Il est apparu que la
concentration de l’AIA dans le milieu de culture est dépendante de la concentration initiale du
tryptophane et ceci indépendamment de la souche utilisée. Ces résultats sont corroborés par
les résultas présentés dans de l’AIA les travaux d’Ali et al. (2009) et (Ahmed idriss, 2007).
Un autre trait important des PGPR et qui peut influencer indirectement la croissance
des plantes, est celui de la production d'ammoniaque à partir de substances azotées (Joseph et
al., 2007). En effet, la totalité des nos isolats sont producteurs de l’ammoniac. Ces résultats
sont en accord avec la plupart des travaux consacrés aux études des traits caractéristiques des
PGPR. Mishra et al., (2010) rapportent que les Pseudomonas sont des producteurs efficaces
de l’ammoniaque et améliorent significativement la croissance des plantes médicinales et
aromatiques. Les résultats des travaux de Joseph et al. (2007) ont aussi montré que 95% des
Bacillus étudiés sont producteurs d’ammoniaque suivis de 94.5% de Pseudomonas.

126
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.5. Evaluation in vivo de la capacité des rhizobactéries sélectionnées pour la

promotion de la croissance de plants de tomate.
VI. 5.1. Sélection des isolats utilisés dans l’évaluation in vivo
La sélection des différents isolats pour le test d’évaluation in vivo a été basé sur la
capacité des différents isolats à montrer une activité antagoniste vis-à-vis du Fol supérieure à
50% et possédant en même temps d’autres activités liées à l’activité antagonistes ou à
l’activité promotionnelle de la croissance des plantes. D’après les résultats présentés dans le
tableau VI.7, il ressort que 7 isolats différents présentent les caractères de sélection, trois
souches appartenant aux isolats rhizosphériques, deux isolats épiphytique et deux isolats
endophytes. La totalité des souches présentent une activité inhibitrice vis-à-vis de l’agent
pathogène supérieure à 50% en même temps ils sont en mesure de montrer des activités
enzymatiques variables. L’activité protéolytique est aussi présente chez l’ensemble des isolats
sélectionnées contrairement aux activités pectinolytique et cellulolytiques qui sont présentes
uniquement chez une partie des isolats. La présence d’une activité inhibitrice par la voie des
substances volaties est détectée chez deux isolats RSML19 et ERL2. L’esemble des souches
sélectionnées sont aussi capables de produire de l’acide indole acétique avec des
concentrations supérieures à 40 µg/ml en même temps la totalité de ces souches démontrent
une capacité élevée dans la solubilisation des phosphates inorganiques (ISP>2.22).

127
Chapitre VI : Résultats et discussion

Tableau VI.7. Caractéristiques des isolats sélectionnés pour l’étude de l’effet in vivo

Isolat % inh. S. V Pectine CMCase Protéase Amylase AIA (µg/ml) ISP

Isolats rhizosphériques
RSML19 50,00 28.28 + - +++ - 39.42 3.34
RSSBK3 66,67 - + - +++ + 44.19 3.19
RSSBK10 50,00 - - + ++ - 40.33 2.22
Isolats épiphytes
RPMK26 55,56 - - + ++++ + 62.64 2.72
RPMK2 53.56 - - - +++ - 88.17 3.44
Isolats endophytes
ERL2 67,44 33.33 + - ++++ + 60.47 2.86
ERK10 73,33 - - ++ - 62.28 3.44
SV : substances volatiles ; % inh : pourcentage d’inhibition ; AIA : acide indole acétique ; ISP : indice de
solubilisation du phosphate

VI.5.2. Effet de la bactérisation des semences de tomate sur le taux de germination et

l’index de vigueur
L’effet du traitement par bactérisation des graines de tomates sur le taux de
germination et l’index de vigueur par les différents isolats sélectionnés est résumé dans le
tableau VI.8. Le taux de germination est varaiblement affecté par le traitement des grains par
les différents isolats. Un taux de germination maximal (100%) a été obtenu par la souche
RSSBK10 avec un index de vigueur équivalent à 712.15. les isolats RSBK3 et RSML19 ont
de leur part amélioré nettement le pouvoir de germination des graines par rapport au témoin
avec un taux de germination de 92.32% et un index de vigueur correspondant à 688.01. La
souche isolée à partir de l’endorhizosphère (ERK10) apparait dans ce cas moins performante
que l’ensemble des isolats en provoquant un taux de germination faible de 61.53% avec un
index de vigueur équivalent à 452.48.

128
Chapitre VI : Résultats et discussion

Tableau VI.8: Effet de la bactérisation sur le pouvoir de germination des graines de tomates

Isolat Moy. Long. Moy. Long. % de Index de

Racine (cm) Tige (cm) germination vigueur
T 3,533 3,25 84,61 573,58
RPMK26 4,250 3,44 84,61 650,34
RSSBK10 3,908 3,21 100 712,15
RPMK2 3,959 4,03 84,61 675,88
RSBK3 3,493 3,96 92,32 688,01
ERK10 4,265 3,09 61,53 452,48
RSML19 4,104 3,01 92,32 656,70
ERL2 3,396 3,11 84,61 550,43

VI.5.3. Effet de la bactérsisation sur la promotion de la croissance de la plante

VI. 5.3.1. Promotion de la longueur et poids des racines
La longueur des racines des plantules de tomate traitées par les différents isolats a été
mesurée après cultures dans des pots sous serre. Les résultats présentés dans la figure VI.27
montrent que l’ensemble des isolats ont provoqué une nette amélioration de la longueur des
racines par rapport au témoin non traité. La longueur des racines des plantules traitées varie
entre 5.97 cm et 8.41 cm. La valeur maximale (8.41 cm/plante) a été obtenue par la souche
RPMK26 ce qui correspond a une amélioration de 56,26% par rapport au témoin. Des
résultats statistiquement significatifs ont été aussi obtenus après traitement par la souche
RPMK2 (8.21cm/plante), RSBK3 (7.5cm/plante) et ERL2 (7.47cm/plante) pour des
améliorations par rapport au témoin de 52.42%, 39.34% et 38.79% respectivement (Fig.
VI.27b).
De même qu’une variation significative dans le poids sec des racines a été aussi
enregistrée chez les différentes plantules traitées par les souches sélectionnées. Une
amélioration nette variable entre 51.17% et 141.56% a été obtenue par rapport au témoin (Fig.
VI.27d). Deux isolats, RPMK2 et RPMK26, ont provoqué des améliorations maximales par
rapport aux autres souches et la souche témoin avec un poids sec de racines équivalents à
333.36 mg et 271.40 mg respectivement (Fig. 27c). Les autres isolats ont produit des
améliorations moins importantes que les deux isolats précédents en étant toujours supérieures
aux résultats obtenus par le traitement témoin.

129
Chapitre VI : Résultats et discussion

Au vu des ces résultats, il apparait que les souches isolées à partir de la rhizoplane
(RPMK2 et RPMK26) étaient plus actifs dans la stimulation de la croissance du volume
racines racinaires aussi bien en termes de poids qu’en termes de longueur. La comparaison
entre l’effet des souches ectorhizosphériques et les souches endophytes est moins apparente.

130
Chapitre VI : Résultats et discussion

A B

C D

Figure VI.27. Effet de l’inoculation des plantules de tomates par les isolats sur la croissance des racines
a : longueur de la racine ; b: pourcentage de promotion de longueur de la racine ;
c : poids sec de la racine; d : pourcentage de promotion de poids de la racine

131
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI. 5.3.2. Promotion de la longueur et le poids de la tige

Les différents résultats de l’effet des rhizobactéries sur la promotion de la croissance
de la tige sont présentés dans la figure VI.28. Une amélioration significative dans la hauteur
des plantules de tomate a été enregistrée en réponse au traitement par les différents isolats.
Deux groupes homogènes seulement ont été obtenus par les différents traitements (Tableau
VI.9). Ainsi le premier groupe homogène est composé de la souche ERL2 et la souche
RSBK3 qui ont produit les tiges les plus longues de 20.81cm et 20.09 cm ce qui correspond à
une amélioration de 20.73% et 16.55% par rapport au témoin (Fig. VI.28b). Le deuxième
groupe est composé des autres souches qui produit des longueurs différentes et qui restent
statiquement non significatives entre elles.
Les différents isolats ont eu un effet moins positif sur l’amélioration du poids de la
partie aérienne (la tige) que des autres paramètres de la croissance de la plante et par rapport
au témoin (Fig. VI.28c). Malgré que les résultats présentés montrent que les différents
traitements ont enregistré des augmentations dans le poids de la tige, la figure VI.28d indique
que ces augmentations ne dépassent le plus souvent les 60% sauf dans le cas des deux souches
RSSBK10 et RPMK26 avec une amélioration de 57.97% et 46.70% respectivement.

132
Chapitre VI : Résultats et discussion

A B

C D

Figure VI.28. Effet de l’inoculation des plantules de tomates par les isolats sélectionnées sur la croissance de la tige

A : longueur de la tige ; B: % de promotion de longueur de la tige ; C: poids sec de la tige ; B: % de promotion de poids de la tige

133
Chapitre VI : Résultats et discussion

Tableau VI.9. Analyse statistique des effets de l’innoculation des plantules de tomate par les
différents isolats sélectionnés

Longueur racine Poids sec Hauteur Tige (cm) Poids sec tige
(cm) racine (mg) (mg)
Témoin 5,38c 138,10f 17,24b 241,79f
RPMK26 8,41a 271,40b 19,51ab 354,70ab
RSBK10 6,62abc 231,63cd 19,28ab 381,97a
RPMK2 8,20a 333,60a 19,69ab 270,00de
RSBK3 7,50ab 225,77de 20,09a 335,28bc
ERK10 7,13abc 246,70c 19,09ab 300,53cd
RPML19 5,97bc 208,77e 19,00ab 261,87de
ERL2 7,47ab 218,73de 20,81a 317,97bc
Moyenne 7,07 234,34 19,34 308,01
Effet 2.5/<0.05 76.72/<0.05 (H.S) 1.37/<0.05 12.65/<0.05 (H.S)
(Fisher /P) (H.S) (H.S)

134
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.5.3. Discussion
L’effet des PGPR sur la productivité et la croissance des plantes varie entre les essais
du laboratoire et ceux sur champs ou en pots. Comme le sol est un système imprévisible, les
résultats obtenus aux laboratoires ne sont pas souvent reproductibles dans des conditions non
contrôlées. Le changement climatique peut aussi avoir un grand impact sur l’efficacité de ces
PGPR (Zaidi et al., 2009). D’autre part, les différents caractéristiques des PGPR n’agissent
pas indépendamment l’un de l’autre mais le plus souvent agissent par effet synergique
(Hypothèse additive) et que les mécanismes multiples comme la solubilisation du phosphate,
fixation d’azote, activité antifongique, la production de l’AIA et les siderophores etc … sont
responsables en même temps de la promotion de la plante et l’amélioration du rendement de
la culture en général (Bashan and Holguin, 1997, Ahemad et Kibret, 2014). Le concept de
PGPR est justifié généralement par l’isolement de bactéries qui répondent au moins à deux
critères : la colonisation agressive de la rhizosphère de la plante, la stimulation de la
croissance de la plante et le biocontrôle de certains agents pathogènes (Benduzi et al., 2012).
La détermination des caractères des différents isolats, en termes d’activité antagoniste vis à
vis du FOL et en termes de caractères supposés impliqués dans la promotion de la plante, a
permet de sélectionner sept (07) souches appartenant aux trois sites de la rhizosphère en
même temps présentant des caractères multiples. La sélection de ces souches parmi les
microorganismes de la rhizosphère de la plante d’étude permet certainement d’augmenter les
chances d’installation des souches dans un environnement au quel ils sont déjà habitués.
Selon Weller (1988) l’utilisation des rhizobactéries dans le contrôle des maladies est plus
efficace quand ces bactéries sont isolées à partir de la même plante hôte. En plus de leur
activité anti-microbienne nos isolats ont été aussi choisis pour leur capacité à produire l’acide
indole acétique et leur pouvoir à solubiliser le phosphate inorganique. L’effet de l’AIA sur la
croissance des plantes est largement rapporté, il est considéré comme l’auxine le plus
caractérisé parmi les auxines produits par les rhizobactéries (Spaepen et al., 2007). Il contrôle
une large variété de processus physiologiques impliqués dans le développement et la
croissance de la plante : principalement la stimlation de l’élongation des racines primaires et
la formation des racines latérales (Spaepen et al., 2007; Remans et al., 2008). De même que la
solubilisation du phosphate inorganique, présent chez tout les isolats sélectionnés, est aussi un
caractère largement recherché chez les PGPR, il permet à la cellule microbienne d’utiliser les
sources de phosphates non assimilables par la plante en les transformant en formes
assimilables (Khan et al., 2007). L’introduction de bactéries solubilisant le phosphate a été

135
Chapitre VI : Résultats et discussion

plusieurs fois rapportée comme responsable de l’amélioration de la cultures de plusieurs

palntes (céréales, légumes, hornomentales, etc..) (Awasthi1 et al., 2011).
L’évaluation primaire de l’efficacité des souches sélectionnées à promouvoir la
croissance des plantes de tomate a été étudiée en premier à travers la détermination de leur
pouvoir d’amélioration du taux de germination ainsi que l’index de vigueur. Nos résultats
montrent que la majorité des souches ont nettement amélioré le pouvoir de germination des
graines inoculés. L’effet positif des PGPR sur le pouvoir de germination est aussi rapporté par
d’autres études. Selon Subramanian et Satyan (2014), le traitement des graines de tomate par
des PGPR à caractères multiples a contribué nettement dans l’amélioration du taux de
germination de graines de toamts. Des résultats similaires ont été aussi rapportés par kaur et
sharma (2013) après traitemnts des graines de deux variétés de pois chiches (Desi PBG1 et
Kabuli BG1053). Dey et al. (2004) rapportent aussi que les PGPR améliorent la croissance et
l’émergence des plantes d’arachides. Si le taux de germination reflète généralement la
viabilité des graines en culture, l’index de vigueur est considéré comme un indicateur de la
capacité des graines à donner naissance à des plantules capables à terminer leur cycle de vie.
Il est rapporté que les graines commencent à perdre leur vigueur avant leur pouvoir de
germination (Anonyme, 2009). L’inoculation des graines par certaines PGPR peut varier la
valeur de l’index de vigueur des ces graines par rapport à témoin. Nos résultats montrent que
la majorité des souches ont provoqué une amélioration dans l’index de vigueur à l’exception
de deux souches endophytes (ERK10 et ERL2). Ces résultats avec en accord avec ceux
rapportés par différentes études. Subramanian et Satyan (2014) rapportent que le traitement
des graines de tomates par des souches de Pseudomonas a provoqué une amélioration de
germination et l’index de vigueur avec des taux assez élevé (100% et 1363 respectivement)
pour indiquer l’effet significatif du traitement par les différentes souches. Cette amélioration a
été aussi constatée par Anitha et Kumudini (2013) après des graines de tomate dans
conditions normales et salines.
Quand les différentes souches ont été testées in vivo pour le pouvoir de promotion,
l’ensemble des paramètres de croissance mesurés ont marqué une amélioration par rapport
aux plantes témoins. Des pourcentages d’améliorations variables ont été enregistrés pour
chacun des isolats testés : longueur de racines (45%-145%), poids sec de racines (10%-60%),
longueur de la tige (110%-120%) et poids sec de la tige (100%-160%). Plusieurs recherches
ont montré les effets bénéfiques des bactéries sur la croissance des plantes et leur protection
contre certains agents pathogènes. Différents mécanismes d’action de ces bactéries ont été
proposés. La production des auxines, principalement l’AIA, est parmi les modes d’action les
136
Chapitre VI : Résultats et discussion

plus cités. La production de ce métabolite a été détectée dans l’ensemble des isolats
sélectionnés. Des concentrations plus ou moins élevées ont été même détectées. Cette
présence pourrait expliquer les améliorations notées surtout au niveau des racines. Selon
Vacheron et al. (2013), l’AIA exogène (d’origine microbienne principalement) contrôle une
large variété de processus de développement chez la plante principalement au niveau des
racines. Des observations similaires ont été aussi signalées par Anitha et Kumidini (2014) qui
rapportent que la production de l’AIA par les bactéries en présence des plantes provoque le
déclenchement d’un effet cascade dans le développement de la plante. La présence d’un AIA
exogène au niveau des racines des plantes ne peut à lui seule expliquer l’effet des PGPR sur la
croissance végétale et l’effet synergique de plusieurs paramètres est largement plus adaptés
(Burd et al. 2000). La solubilisation du phosphate inorganique du sol par les microorganismes
est le plus souvent citée parmi les mécanismes impliqués dans la promotion de la croissance
des plantes. A travers ce mécanisme le phosphate insoluble présent dans la rhizosphère est
transformé en phosphate disponible pour le développement de la plante. Les isolats
sélectionnés sont tous capable de solubiliser le phosphate inorganique démontré par la
formation d’un halo de solubilisation sur milieu riche en phosphate tricalcique (milieu PVK).
L’effet bénéfique des bactéries solubilisant le phosphate sur l’amélioration des paramètres de
croissance de différentes cultures est rapporté par plusieurs recherches de notamment : le maïs
(Hameeda et al., 2006), le blé (Jisha et Mathur, 2005), la tomate (Tantawy et al., 2009), la
canne à sucre (Sundara et al., 2002).

137
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.6. Evaluation de l’effet protecteur des plants de tomate par des isolats bactériens vis-
à-vis de l’agent pathogène (F. oxysporum f. sp lycopersici)
VI.6.1. Evaluation de l’effet de protecteur des isolats antagonistes sur l’incidence de la
maladie
L’effet protecteur des différents isolats sélectionnés contre la maladie de la fusariose
chez la plantes de tomates a été évalué en première étape par la mesure du pourcentage de
l’incidence de la maladie chez des plantules traitées préalablement par immersion dans des
suspensions bactériennes. L’analyse statistique des résultats (ANOVA) montre que le
traitement par les agents antagonistes exerce un effet significatif sur la diminution de
l’incidence de la maladie par rapports aux témoins (Annexe III, Tableau VI.4). Malgré
qu’aucun des isolats n’a provoqué une éradication totale de la maladie, une réduction
significative de la maladie, variable entre 82% et 38%, a été enregistrée chez l’ensemble des
agents antagonistes (Fig. VI.29). Une réduction maximale (82%) de la maladie a été
démontrée par la souche RSSBK10 pour une valeur d’incidence de 16.2% suivi par la souche
RSBK3 avec un taux de réduction de 61%. Les souches ERK19, RPMK26 et RSML29 ont de
leur part provoqué une réduction de la maladie avec des taux supérieure à 55%.

120 %
% incidence
100 % reduction a

80

60
b
b
c c c
40 c

20 d

0
T (-) RPMK26 RSSBK10 RPMK2 RSBK3 ERK10 RSML19 ERL2 T (+)

Figure VI.29. Effet du traitement par les agents antagonistes sur l’incidence de flétrissement
des plantules de tomates.

138
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.6.2. Evaluation de l’effet de protecteur des isolats antagonistes sur les paramètres de
croissance des plantules de tomate
VI.6.2.1. Effet sur la longueur de la tige et des racines
L’estimation de l’effet protecteur des plantes contre la fusariose par les antagonistes a
été réalisé par la culture des plantules de tomates traitées dans des sols infectés par l’agent
pathogène de la fusariose (FOL). La comparaison des paramètres de croissance chez les
différentes plantules traitées ou témoins (positif et négatif) a permet de détecter une
différence significative entre les différents traitements (Annexe III, Tableau VI.5, 6). La
figure VI.30 présente la variation de la longueur des racines et de la tige des plantules en
fonction de la nature de la souche antagoniste. Il est clairement démontré que la valeur des
résultats varie d’une souche à l’autre. Des longueurs de tige variables entre 110.4mm et
384.5mm. La souche RSBSBK10 a montré une amélioration maximale de la croissance de la
partie aérienne supérieure même à la longueur de la moyenne du témoin négatif (sol non
infecté). Seule la souche ERL2 était incapable de provoquer une protection efficace traduite
par une longueur de la tige moins importante que les autres plantes. La longueur des racines a
été également affectée par le traitement. L’analyse statistique des résultats montre que
plusieurs groupes homogènes sont présents, une longueur de 107.7mm a été également
obtenue après traitement par la souche RSSBK10 suivi par la souche RPMK2. Il est à noter
que dans ce cas malgré que les valeurs obtenus sont supérieures aux celles obtenues dans le
lot témoin positif, elles sont néanmoins moins importantes que les valeurs du lot témoin
négatif.
450 mm

400 Long. Tige (mm)

b
350 long. racine(mm)

300
d
250 c e
g f
200
h
150 a
b i
c
100 d
g f e e
h
50

0
T (-) RPMK26 RSSBK10 RPMK2 RSBK3 ERK10 RSML19 ERL2 T (+)

Figure VI.30. Effet du traitement par des isolats antagonistes sur la longueur de la tige et des
racines des plantules de tomates.

139
Chapitre VI : Résultats et discussion

VI.6.2.2. effet sur le poids sec de la tige et des racines

L’effet protecteur des plantes par les isolats antagonistes a été aussi examiné par la
détermination du poids sec des plantes traitées par la mesure des poids de leurs racines ou de
leurs tiges. Les résultats présentés dans la figure VI.30 montrent que des poids variables ont
été obtenus pour l’ensemble des isolats. L’analyse statistique de ces résultats a permet de
vérifier l’effet hautement significatif du traitement par les agents antagonistes sur la
variabilité du poids sec de la tige et la racine des plantules traités (Annexe III, Tableau VI.7,
8). Dans le cas du poids de la tige, des poids supérieures au poids de la plante témoin positif
(non traité+infecté) ont été obtenus par l’ensemble des traitements. Le traitement par la
souche RSSSBK10 a permet l’obtention de plantes dont le poids est supérieure même aux
témoins non traités et en absence de l’agent pathogène. Les souches RSML19 et La souche
RPMK26 ont de leur part été capables de montré un effet protecteur contre la maladie en
permettant le développement de plantes dont le poids est nettement supérieure aux poids des
plantes infectées.
Le traitement des plantes par les bactéries antagonistes a permet également une
augmentation du poids racinaire chez l’ensemble des lots par rapport aux lots témoins positifs.
Deux souches isolées de la partie externe de la rhizosphère, RSML19 et RSSBK10, ont été
les plus performantes avec des racines de poids équivalent à 232.7 mg et 177.63mg.

mg
500
P.S tige
450 a
400 c b P.S. racines

350 d
300
f a
250 e g
200 b

150 c h
d e
100 f g
h i
50
i
0
T (-) RPMK26 RSSBK10 RPMK2 RSBK3 ERK10 RSML19 ERL2 T (+)

Figure VI.31. Effet du traitement par des isolats antagonistes sur le poids sec de la tige et des
racines des plantules de tomates

140
Chapitre VI : Résultats et discussion

[Link]
L’utilisation des microorganismes comme des bio-pesticides pour réduire les maladies
de plusieurs cultures agronomiquement importants est considérée comme l’une des méthodes
les plus prometteuses pour le management et la gestion des grandes cultures (Bashan and de-
Bashan, 2002; Compant et al., 2005; Toua et al., 2013). Durant cette partie de notre étude, il
est question d’évaluer le pouvoir protecteur des plantes de tomates par plusieurs souches
microbiennes, isolées de différents sites de la rhizosphère de la tomate, contre l’infection par
l’agent pathogène de la fusariose (F. oxysporum [Link] lycopersici).
Les résultats obtenus montrent que la majorité des isolats ont été capables de réduire
l’incidence de la maladie et de promouvoir la croissance des plantes en présence même de
l’agent pathogène. La maladie en termes d’incidence a été réduite avec des taux qui
dépassent dans la plupart des cas 50%. La souche RSSBK10 a été potentiellement la plus
performante par la réduction de l’incidence de la maladie avec un pourcentage de réduction
équivalent à 80%. Ces résultats sont en accord avec plusieurs d’autres études qui rapportent
dans leur ensemble que les rhizobactéries sont capables de réduire l’infection de la tomate par
le FOL (El-rifai et al., 2003 ; Karimi et al., 2012 ; Amkraz, 2013). Toua et al. (2013) ont
montré que le traitement par des souches de Pseudomonas de plantes de tomate permet la
réduction de la sévérité de la fusariose de 4.86% à 74.49%. Ces résultats sont en accord avec
aussi ceux rapportés par Priou et al. (2005) qui ont enregistré une réduction de 80% de la
maladie causé par R. solanacearum après traitement par des souches de Pseudomonas sp. Les
mêmes observations sont publiées par Soad et al. (2005) rapportent que le traitement de
plantules de tomate par une souche de Bacillus endophyte a permet l’éradication de
l’infection par le FOL après l’inoculation de l’agent antagoniste.
La réduction de l’incidence de la maladie après traitement par les antagonistes est le
plus souvent accompagnée chez la plante par une amélioration de la croissance de la palnte
par rapport aux témoins infectés (Kamal et al., 2009 ; Karimi et al., 2012). Dans le cas de
notre étude des résultats qui confirment ces observations ont été enregistré. Une amélioration
significative (P< 0.05) des différents paramètres de croissance a été observée. La longueur de
la tige et de la racine des plantules de tomate ont été nettement améliorés après traitement par
la majorité des isolats. La souche RSSBK10 a été la plus performante par rapport aux autres
isolats. Le poids sec des racines et de la tige des plantes ont été également améliorés et les
souches RSML19 et RSSBK10 ont été plus efficaces. La promotion de la croissance des
plantes en présence de l’agent pathogène peut être attribuée à la limitation de la croissance de
ce dernier par les agents antagonistes. En effet les PGPR sont reconnus par leur capacité à
141
Chapitre VI : Résultats et discussion

exprimer plusieurs mécanismes qui contribuent à ralentir la prolifération de l’agent pathogène

dans le sol. Cette inhibition de la croissance des phytopathogènes soutient la promotion de la
santé et de la croissance des plantes.
L’étude de la correlation entre l’effet protecteur (en terme de % d’incidence) in vivo et
le pouvoir antagoniste des isolats in vitro montre une faible correlation ce qui laisse à penser
que l’activité protectrice des isolats n’est pas seulement à un seul mécanisme mais plutôt à la
synergie de plusieurs paramètres (Karimi et al., 2012). Bien que les effets des PGPR soient
séparés en deux catégories distinctes : effets promotionels de la croissanace et effets de
contôle biologique, il existe toujours une liaison étroite entre les deux (Liu, 2015). Les PGPR
promeuvent la croissance de la plante entière, ce qui peut entraîner dans la plante une
tolérance accrue à la maladie, et, inversement, la lutte biologique contre les maladies des
plantes par PGPR peuvent conduit indirectement à la promotion de la croissance des plantes
(Beneduzi et al. 2012). Plusieurs recherches ont montré que l’effet protecteur des PGPR est le
plus souvent le résultat de la présence de plusieurs caractères qui peuvent agir directement ou
indirectement sur le développement de la maladie chez la plante. En plus de l’action des
antibiotiques , des substances volatiles ou les siderophores comme agents principals dans la
réduction de la croissance des agents pathogènes, la promotion de la croissance de la plante
via la synthèse de régulaturs de croisance et la mise à la disposition de la plante d’éléments
minéraux peuvent aussi contribuer indirectement à l’empèchement de l’installation de l’agent
pathogène dans la rhizosphère de la plante (Alwathnani et Perveen, 2012 ; Liu, 2015).

142
Conclusion
Et
Perspectives
 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

La rhizosphère est la partie du sol en contact direct avec les racines de la plante, elle
soutient le développement et l'activité d'une communauté microbienne nombreuse et
diversifiée. Parmi ces derniers, les rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR)
sont un groupe de bactéries colonisant les racines des monocotylédones et des dicotylédones
et capable d’améliorer la croissance de la plante par des mécanismes directs et indirects.
L’utilisation d'inoculants microbiens en général ou les PGPR en particulier pour une
amélioration durable de la production agricole est de plus en plus largement comme une
pratique générale dans l'agriculture intensive dans de nombreuses parties du monde.
La réussite de leur utilisation comme inoculats du sol dépend principalement sur la
capacité de ces cellules à coloniser efficacement la rhizosphère ainsi que leur pouvoir à
synthétiser des métabolites à effet direct ou indirect sur la croissance du végétal.
L’étude entreprise avait pour objectif, la sélection et l’étude des caractères
antagonistes et physiologiques de rhizobactéries endophytes et libres associés aux plantes de
tomate cultivées dans différents zones de la wilaya de Mostaganem. Dans ce contexte un
ensemble de 109 isolats ont été sélectionnés à partir des différents sites de la rhizosphère des
plantes de tomates. L’isolement a été effectué à partir de trois niveaux différents de la
rhizosphère des plantes de tomates. Les résultats obtenus ont montré une prédominance
relative des bactéries à Gram positif (Bacillus) dans les zones de l’ectorhizosphère et
l’endorhizosphère. Au niveau de la rhizoplane, la présence des bactéries à Gram négatif
(Pseudomonas spp) a été plus importante. L’identification des souches sur la base de leurs
caractères culturaux et biochimiques nous a permet de vérifier leur appartenance aux espèces
du genre Bacillus et Pseudomonas. Une variété d’espèces appartenant aux deux genres a été
mise en évidence ce qui témoigne de la richesse des zones rhizosphériques en
microorganismes.
L’activité antagoniste des souches isolées a été testée vis-à-vis de l’agent causal de la
fusariose de la tomate. Le choix de l’agent pathogène est justifié par le fait que ce
champignon occupe généralement le même espace que les rhizobactéries (la rhizosphère)
ainsi que sa capacité de pathogénicité par la présence de plus races différentes chez le
champignon. Les prospections réalisées ont montré la présence d’un nombre réduit des foyers
de la maladie. La présence du champignon dans ces cultures a été dévastatrice pour la plante
sur de grandes superficies. 08 isolats fongiques de morphotypes différents ont été isolés

143
durant cette étude à partir de plantes de tomate présentant les symptômes de flétrissement
fusarienne. L’étude de leur caractère macroscopique et microscopique nous a permet de les
classer parmi les espèces de F. oxysporum. La pathogénicité de ces espèces vis-à-vis des
tomates était variable en comparaison avec une souche de référence. Seules deux isolats ont
montré un indice d’altération foliaire plus ou moins élevées par rapport à l’ensemble (78.4%
et 64.3%). Il reste à noter que la confirmation de l’appartenance des isolats aux différentes
formes spéciales n’a pas été confirmée et que des techniques moléculaires étaient nécessaires
pour atteindre cet objectif.
Les mécanismes de lutte biologique investies ont porté sur l’étude du pouvoir
antagoniste (inhibiteur) des isolats par la technique de contacte directe en présence d’une
culture de Fusarium oxysporum f. sp lycopersici. Plus de 55% des isolats ont montré une
activité inhibitrice variable de la croissance mycélienne du FOL. Parmi les isolats
antagonistes, Les souches isolées à partir de l’ectorhizosphère ont été majoritaire (23.85%)
suivi par les bactéries endophytes et epiphytiques avec 16.51% et 13.76% respectivement. La
présence d’autres substances diffusibles dans le milieu a été testée par la recherche
exclusivement des siderphores (pyoverdines). 22% des isolats testés étaient producteurs de
cette substance et l’ensemble appartient au groupe des Pseudomonas.
D’autres modes d’antagonisme ont été également explorés. La production de
substances volatiles (HCN) et la production d’enzymes hydrolytiques impliqués la
dégradation de plusieurs types de macromolécules composants les parois microbiennes.
L’inhibition de la croissance mycélienne par la production de l’acide cyanhydrique était
présente chez 15% des isolats alors que la production. Une activité enzymatique diversifiée
chez les différents isolats a été mise en évidence. Tandis que la protéase a été détecté chez
68% des souches antagonistes testées suivi par l’activité lipolytique chez 58% chacune, les
cellulases, les pectinases et les amylases étaient présentes dans 25%, 19% et 12% des isolats
respectivement. La concordance entre l’activité antagoniste via les substances diffusibles et le
taux de présence des activités enzymatiques s’est avérée relativement faible ce qui laisse à
penser que différents isolats possèdent plus d’un mécanisme d’action possible vis-à-vis des
autres microorganismes cohabitant dans le même environnement.
L’évaluation des caractères liés à l’effet PGP des isolats potentiellement antagonistes a
été réalisée par la recherche de la capacité des isolats à produire l’acide idole acétique et à
solubiliser le phosphate inorganique. Au moins 69% des isolats sont producteurs d’AIA. Des
concentrations variables d’AIA ont été enregistrées allant de 19.67 µg/ml jusqu’à 95.44µg/ml.
L’identification biochimiques et phénotypiques des isolas producteurs a montré que des
144
quantités élevées d’AIA ont été obtenues aussi à partir des souches de Bacillus que de
Pseudomonas. L’étude de l’effet du tryptophane sur les concentrations d’AIA produites a
démontré que la synthèse de cette acide est fortement dépendante des quantités de l’acide
aminé présentes dans le milieu. La solubilisation du phosphate inorganique a été aussi mise en
évidence par la culture des différents isolats sur le milieu PVK. L’apparition d’une zone de
solubilisation autour des colonies a été observée chez 41% des souches isolées. L’estimation
de l’importance de cet activité par la mesure de l’index de solubilisation a permet de détecter
des souches capables de solubiliser efficacement les phosphates inorganiques.
Une sélection des souches les plus performantes a été réalisé en vue de choisir des
isolats en même temps d’une part capables d’inhiber la croissance des agents
phytopathogènes par la production de substances diffusibles dans le milieu (antibiotiques)
avec la possibilité de présence d’autres mécanismes d’antagonisme (HCN, siderophore,
activité enzymatique) et d’autre part doués d’activités liées à l’effet PGP des souches (AIA,
solubilisation de phosphate). Cette étude nous a permet de sélectionner sept (07) isolats qui
répondent aux critères précédents. Ces isolats appartiennent aux trois sites de la rhizosphère
ce qui laisse à dire que l’appartenance à un niveau donné de la rhizosphère ne détermine pas à
priori les pouvoirs antagonistes et promotionnels des germes.
Les effets des isolats PGPR sélectionnés sur la protection et la promotion des plantes
ont été examinés après inoculation de plantes de tomate et leur culture en pots sous serre. Le
taux de germination des graines de tomate a été amélioré par l’inoculation des graines par
plusieurs isolats par rapport au lot témoin. De même que l’index de vigueur, qui traduit la
capacité des graines à donner une plantule normale, a été nettement améliorée après
traitement notamment par les isolats RPMK26, RPMK2 et RSML19. L’inoculation des
plantules de tomate cultivé dans un sol de jardin stérile par les différents isolats a permet
également d’enregistrer des pourcentages de promotion considérables chez les différents
paramètres de croissance mesurés. En exemple la souche RSBK10 et RPMK26 ont provoqué
des améliorations dans la longueur et le poids sec de la tige dépassant les 100% et 140% par
rapport aux témoins. De même que le poids et la longueur des racines qui ont enregistré des
améliorations par rapport au témoin non inoculé. Une amélioration de poids dépassant les
50% a été enregistré après inoculations par la souche RPMK26, tandis qu’une amélioration
supérieure à 120% a été enregistré dans la longueur de la racine après inoculation par la
souche RPMK2.
L’effet protecteur des plantes par les isolats contre la maladie de la fusariose a été
également investi par la culture des plantules de tomate dans des sols infectés. Le traitement a
145
permet la réduction de l’incidence de la maladie chez la majorité des plantes. Un taux de
réduction maximal (82%) est obtenu après traitement par la souche RSBK10. La réduction de
l’incidence de la maladie est accompagnée par une amélioration nette des paramètres de
croissance chez l’ensemble des plantes traités. La longueur de la tige et les racines chez la
l’ensemble des plantes inoculées est significativement (P<0.05) affecté par le traitement
microbien, la souche RSBK10 a provoqué une promotion de la plante plus importante que le
témoin positif (non infecté). La biomasse végétale a également enregistrée une amélioration
positive après traitement par les isolats PGPR, les isolats RSBK10, RSML19 et RPMK26 ont
été plus performantes que les autres isolats surtout dans la promotion de la biomasse de la
partie aérienne.

Les perspectives qui découlent de ce travail sont nombreuses et multiple.

 En premier lieu il est à rappeler que la réussite dans l’utilisation des PGPR
dans la lutte biologique et la promotion de la croissance repose sur la capacité
des germens à coloniser efficacement la rhizosphère de la plante, Il serait
intéressant de suivre l’évolution de la biomasse des cellules dans le sol après
inoculation.
 Du point de vue activité antagoniste il est évidemment nécessaire de pouvoir
identifier et caractériser les substances impliquées dans l’inhibition de la
croissance du FOL de même que d’explorer le spectre d’action de ces
substances contre d’agent pathogène.
 La confirmation de la nature des sept souches sélectionnées par des outils
moléculaires est évidemment nécessaire pour pouvoir déterminer la variabilité
des rhizobactéries sélectionnées pour les applications in vivo.
 Il serait intéressant d’étudier l’effet combiné des souches sur le contrôle de
certaines maladies des plantes ainsi que leur effet combinés dans la promotion
de la croissance des plantes afin de proposer un formulation de bactéries qui
peut engendrer un effet meilleur.

146
 Références
bibliographiques
Abat, B. 2006. Growth of agriculturally important pseudomonas spp. and azotobacter
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177
ANNEXES
 Annexe I
Milieux de culture

Solution Tampon phosphate saline (PBS) (g/l)

NaCl 8
KCl 0.2
Na2HPO4 1.44
K2HPO4 0.24

Milieu King B (g/L)

Pepetone 20

MgSO4 1.5

K2HPO4 1.5

Glycérol 10

Agar Agar 15

Eau distillée 1000 ml

pH 7.2

Milieu Luria-Burtani (LB) (g/L)

Hydrolysat de caséine 10

NaCl 5

Extrait de levure 5

Agar agar 15

Eau distillée 1000 ml

pH 7

178
Milieu PDA (g/L)

Pomme de terre 200

Glucose 20

Agar Agar 20

Eau distillée 1000 ml

pH 5.2

Milieu Bakkers et schippers (g/L)

Hydrolysat de caséine 10

NaCl 5

extrait de levure 5

Glycine 4.4

Eau distillée 1000 ml

pH 7.2

Milieu agar au lait écrémé (Skimmed milk agar) (g/L)

Peptone pancréatique 5

Extrait de levure 2.5

Glucose 1

Lait écrémé 7%

Agar Agar 15

Eau distillée 1000 ml

pH 7.2

179
Milieu M9 (g/L)

Na2HPO4 6

KH2PO4 3

NaCl 0.5

NH4Cl 1

MgSO4 0.5

CaCl2 0.015

Glucose 2

Eau distillée 1000 ml

pH 7.2

Milieu Pikovskaya (PVK) (g/l)

Extrait de levure 0.5

Glucose 10

Ca3(PO4)2 5

(NH4)SO4 0.5

KCl 0.2

MnSO4, 7H2O 0.1

FeSO4 0.0001

Agar Agar 15

Eau distillée 1000 ml

pH 7.2

180
 ANNEXE II

Origine et nature des rhizobactéries

Tableau VI. 1 : Origine et caractères des rhizobactéries endophytes

N° souche Lieu origine milieu forme Gram Espèces

d’isolement
163 EBK38 Bouski endo KB B - P. oryzihabitans
77 EML56 Mazagran endo LB B - Pseudomonas sp
72 EML57 Mazagran endo LB B + Bacillus sp
74 EML59 Mazagran endo LB cocci - ND
78 EML60 Mazagran endo LB B - Pseudomonas sp
79 EML61 Mazagran endo LB B + B. sphaerecus
80 EML62 Mazagran endo LB B + B. sphaerecus
50 EMK41 Mazagran endo KB B + B. mycoides
41 EML36 Mazagran endo LB B + B. mycoides
22 ERK10 Radar endo LB B + B. brevis
20 ERK14 Radar endo KB B - P. oryzohabtans
21 ERK9 Radar endo KB B - Pseudomonas sp
15 ERL1 Radar endo LB B + B. pumilis
12 ERL11 Radar endo LB B + B. mycoides
19 ERL13 Radar endo LB B + B. brevis
14 ERL2 Radar endo LB B - P. chloroaphis
16 ERL3 Radar endo LB B + B. laterosporus
112 ESK30 Stidia endo KB B - Pseudomonas sp
95 ESL1 Stidia endo LB B - ND

181
Tableau VI. 2 : Origine et caractères des rhizobactéries isolées à partir de la rhizoplane

N° souche Lieu origine milieu forme Gram Espèces

d’isolement
135 RPBK14 Bouski Rplane KB B - P. fluorescens
158 RPBK33 Bouski Rplane KB B - P. putida
160 RPBK35 Bouski Rplane KB B - P. fluorescens
153 RPBK39 Bouski Rplane KB B - P. fluorescens
149 RPBK42 Bouski Rplane KB B - P. fluorescens
150 RPBK43 Bouski Rplane KB B - N.D
152 RPBK45 Bouski Rplane KB B - Pseudomonas sp
136 RPBL15 Bouski Rplane LB B - Pseudomonas sp
137 RPBL16 Bouski Rplane LB B - P. putida
141 RPBL22 Bouski Rplane LB B - Pseudomonas sp
69 RPMK14 Mazagran Rplane KB B - Pseudomonas sp
71 RPMK16 Mazagran Rplane KB B - ND
103 RPMK17 Mazagran Rplane KB B - P. chlororaphis
66 RPMK2 Mazagran Rplane KB B - Pseudomonas sp
64 RPMK25 Mazagran Rplane KB B - Pseudomonas sp
63 RPMK26 Mazagran Rplane KB B + B. circulans
67 RPMK3 Mazagran Rplane KB B + B. circulans
35 RPMK30 Mazagran Rplane KB B + Paenibacillus macerans
68 RPMK4 Mazagran Rplane KB B + B. polymixa
90 RPML10 Mazagran Rplane LB B - P. chlororaphis
91 RPML11 Mazagran Rplane LB B + B. megaterium
52 RPML19 Mazagran Rplane LB B + B. licheniformis
54 RPML21 Mazagran Rplane LB B + Bacillus sp
105 RPML25 Mazagran Rplane LB B - N.D
87 RPML23 Mazagran Rplane LB B - Pseudomonas sp
88 RPML24 Mazagran Rplane LB B - Pseudomonas sp
106 RPML26 Mazagran Rplane LB B - P. putida
107 RPML27 Mazagran Rplane LB B + B. stearothermophilus
33 RPML28 Mazagran Rplane LB B - P. putida
56 RPML29 Mazagran Rplane LB B - ND
57 RPML30 Mazagran Rplane LB B + B. stearothermophilus
10 RPRL13 Radar Rplane LB B - P. putida
11 RPRL14 Radar Rplane LB B - ND
116 RPSK45 Stidia Rplane KB B + B. sphaerecus
159 RPSL10 Bouski Rplane KB B + B. subtilis
114 RPSL13 Stidia Rplane LB B - Pseudomonas sp
115 RPSL15 Stidia Rplane LB B + B. brevis
81 RPSL22 Stidia Rplane LB B + B. stearothermophilus
82 RPSL60 Stidia Rplane LB B + B. macerans

182
Tableau VI.3 : Origine et caractères des rhizobactéries libres isolées à partir de l’ectorhizosphère

N° souche Lieu Origine milieu forme Gram Espèce

d’isolement
125 RSBK49 Bouski rhizph KB B - P. fluorescens
128 RSBK52 Bouski rhizph KB B - P. fluorescens
130 RSBK54 Bouski rhizph KB B - P. fluorescens
132 RSBK56 Bouski rhizph KB B - Pseudomonas sp
48 RSMK40 Mazagran rhizph KB B - Pseudomonas sp
51 RSMK42 Mazagran Rhizph KB B + B. stearothermophilus
96 RSMK43 Mazagran rhizph KB B - P. aerogenosa
98 RSMK44 Mazagran rhizph KB B - ND
104 RSMK45 Mazagran Rhizph KB B + B. megaterium
97 RSML1 Mazagran Rhizph LB B + B. megaterium
102 RSML10 Mazagran Rhizph LB B + B. megaterium
103 RSML15 Mazagran Rhizph LB B + B. megaterium
43 RSML17 Mazagran rhizph LB B + B. licheniformis
18 RSML18 Mazagran Rhizph LB B + B. brevis
44 RSML18 Mazagran rhizph LB B - P. fluorescens
98 RSML2 Mazagran Rhizph LB B + B. stearothermophilus
104 RSML21 Mazagran rhizph LB B + B. subtilis
3 RSML3 Mazagran Rhizph LB B + [Link]
34 RSML37 Mazagran Rhizph LB B + B. stearothermophilus
36 RSML39 Mazagran rhizph LB B - Pseudomonas sp
4 RSML4 Mazagran Rhizph LB B + B. brevis
42 RSML47 Mazagran rhizph LB B + [Link]
100 RSML48 Mazagran rhizph LB B - ND
99 RSML6 Mazagran rhizph LB B - N.D
100 RSML7 Mazagran Rhizph LB B + B. stearothermophilus
101 RSML9 Mazagran Rhizph LB B + B. megaterium
8 RSRK3 Radar Rhizph LB B + B. stearothermophilus
9 RSRK4 Radar rhizph KB B - P. putida
6 RSRK7 Radar Rhizph KB B - Pseudomonas sp
7 RSRK8 Radar rhizph LB B + [Link]
1 RSRL1 Radar Rhizph LB B - ND
2 RSRL2 Radar Rhizph LB B - Pseudomonas sp
5 RSRL5 Radar Rhizph LB B + B. sphaerecus
32 RSSBK10 Sablette rhizph KB B - Pseudomonas sp
26 RSSBK3 Sablette rhizph KB B - P. fluorescens
27 RSSBK4 Sablette rhizph KB B - P. aerogenosa
28 RSSBK5 Sablette rhizph KB B - Pseudomonas sp
29 RSSBK6 Sablette rhizph KB B - P. aerogenosa
31 RSSBK8 Sablette rhizph LB B + [Link]
23 RSSBL1 Sablette rhizph LB B - Pseudomonas sp
25 RSSBL9 Sablette Rhizph LB B + B. sphaerecus
61 RSSK10 Stidia rhizph KB B - P. aeroginosa
113 RSSK34 Stdia rhizph KB B - N.D
70 RSSK37 Stidia Rhizph LB B + B. stearothermophilus
60 RSSK9 Stidia rhizph LB B + B. subtilis
108 RSSL3 Stidia rhizph LB cocci + N.D
55 RSSL4 Stidia rhizph LB B - P. fluorescens
109 RSSL5 Stidia rhizph LB B + Bacillus sp
110 RSSL6 Stidia Rhizph LB B + B. brevis
58 RSSL7 Stidia Rhizph LB B + B. stearothermophilus
59 RSSL8 Stidia rhizph LB B + B. subtilis

183
 ANNEXE III

ANALYSES STATISTIQUES

Tableau VI.1. Analyse de la variance de l’effet inhibiteur des souches rhizosphériques sur la
croissance radiale de FOL

Source DDL SC MC F P
souche 25 32161,81 1286,47 930,84 <0,05**
Erreur 52 71,87 1,38
Var. totale 77 32233,68

Tableau VI.2. Analyse de la variance de l’effet inhibiteur des souches épiphytiques sur la
croissance de FOL

Source DDL SC MC F P
souche 17 4365,834 256,814 908,07 <0,05**
Erreur 36 10,181 0,283
Var. totale 35 4376,016

Tableau VI.3. Analyse de la variance de l’effet inhibiteur des souches endophytes sur la
croissance radiale de FOL

Source DDL SC MC F P
souche 14 12816,05 915,43 3966,61 <O.05**
Erreur 30 6,92 0,23
Var. totale 44 12822,97

184
Tableau VI. 4. Analyse de la variance de l’effet du traitement par les isolats sur l’incidence
de la maladie de la fusariose chez les plantes de tomates

S.C.E DDL C.M. TEST F PROBA

var. totale 15446,5 26 594,096
Isolat 15308,33 8 1913,542 249,291 0
Erreur 138,167 18 7,676

Tableau VI. 5. Analyse de la variance de l’effet du traitement sur la longueur de la tige chez
les plantes de tomates cultivées dans un sol infecté

S.C.E DDL C.M. TEST F PROBA

var. totale 177572,7 26 6829,721

Isolat 177568,5 8 22196,06 93320,65 0

Erreur 4,281 18 0,238

Tableau VI. 6. Analyse de la variance de l’effet du traitement sur la longueur de la racine

chez les plantes de tomates cultivées dans un sol infecté

S.C.E DDL C.M. TEST F PROBA

var. totale 14610,81 26 561,954

Isolat 14607,72 8 1825,965 10633,87 0

Erreur 3,091 18 0,172

Tableau VI. 7. Analyse de la variance de l’effet du traitement sur le poids de la tige chez les
plantes de tomates cultivées dans un sol infecté

S.C.E DDL C.M. TEST F PROBA

var. totale 295474,2 26 11364,39

Isolat 295469 8 36933,62 128155,2 0

Erreur 5,188 18 0,288

185
Tableau VI. 8. Analyse de la variance de l’effet du traitement sur le poids de la racine chez
les plantes de tomates cultivées dans un sol infecté

S.C.E DDL C.M. TEST F PROBA

var. totale 96223,47 26 3700,903

Isolat 96221,59 8 12027,7 115465,9 0

Erreur 1,875 18 0,104

186
Figure VI.I . Courbe étalon pour la détermination de la concentration d’AIA

187
Publication
Asian Jr. of Microbiol. Biotech. Env. Sc. Vol. 17, No. (1) : 2015 : 17-26
© Global Science Publications
ISSN-0972-3005

SCREENING OF FREE-LIVING AND ENDOPHYTIC

RHIZOBACTERIA WITH POTENTIAL ANTAGONISTIC ACTIVITY
AGAINST F. OXYSPORUM F. SP LYCOPERSICI FOR THEIR
POTENTIAL AS PLANT GROWTH PROMOTERS
A. BOUZNAD1 AND M. BELLAHCENE2

1. Laboratoire de Microbiologie et Biologie végétale, université de Mostaganem, Algeria.

2. Centre universitaire d’Ain-timouchent, Algeria

(Received 30 September, 2014; accepted 25 October, 2014)

Key words : PGPR, Tomato, Antagonism, Phosphate solubilization, IAA, Growth promotion

Abstract–Plants can benefit from soil microbes in many ways. Certain microbes stimulate plant growth,
enrich soils, degrade pollutants, or protect plants against pathogens. Plant growth-promoting rhizobacteria
(PGPR) are free-living, soil-borne bacteria, which, when applied to seeds or crops, enhance the growth of
the plant or reduce the damage from soil-borne plant pathogens. In the present work a total of one hundred
and nine bacterial strains have been isolated from the rhizosphere, surfaces root (rhizoplane) and the inner
roots tissues (endophytic bacteria) of tomato plant cultivated in different locations of semi-arides zones in
west of Algeria. Out of these, 53% of the total isolates exhibited a variable antagonistic activity against
tomato wilt agent (F. oxysporum [Link] lycopersici). The endophytic strain ERL3 has exhibited the maximal
inhibition rate equivalent to 78%. Effective antagonist isolates have been further screened for their plant
growth promoting (PGP) activity viz., production of plant growth regulators (IAA), siderophores, HCN,
inorganic phosphate solubilization, Ammonia and catalase production. Indole acetic acid has been detected
in 72%, 66% and 61% epiphytic, endophytic and rhizospheric strains respectively. 47.45% among antagonist
strains are of solubilization inorganic phosphates capacity. A maximal solubilization index (SI) of 2.48 has
been obtained after 14 days of incubation with RMSK43 and RPMK26. Evaluation of Seven strains, each with
multiple plant growth promoting activities, to enhance tomato plant growth was carried out in pots
experiments under greenhouse conditions. All the isolates have significantly (P<0.01) increased shoot length,
root length, shoot dry weight, root dry weight of the inoculated plant. The percentage increase of root
weight was up 141.56% with RPMK2 and shoots weight up to 57.98% with RSBK10 over uninoculated
control.

INTRODUCTION in the rhizosphere, on root surfaces (rhizoplane) and

in association with roots (such as endophytic
Bacteria as biofertilizers, that can improve plant bacteria) (Joseph et al. 2007).
growth, have been known for decades and have Mechanisms by which PGPR promote plant
been introduced into soil, on seeds or roots to growth are not fully understood but are thought to
improve plant growth and health (Raaijmakers et al., include (i) antagonism against phytopathogenic
2002). Those bacteria that are beneficial for plant microorganisms by production antibiotics and
growth are called Plant Growth Promoting cyanide (Flaishman et al., 2001) and siderophores
Rhizobacteria (PGPR) (Kloepper et al., 1980). This (Scher and Baker, 2006) (ii) the ability to produce or
term includes those bacteria that induce plant change the concentration of plant growth regulators
growth, improving plant nutrition or producing like indole acetic acid, gibberellic acid, cytokinins
plant growth regulators (Gutierrez-Manero et al., and ethylene (Arshad and Frankenberger, 1992) (iii)
2000) as well as those preventing the attack of asymbiotic N2 fixation (Boddey and Dobereiner,
pathogenic microorganisms (Bowen and Rovira, 2000), (iv) solubilization of mineral phosphates and
1999; Van Loon et al., 1998). They are a other nutrients (De Freitas et al., 2007). Most popular
heterogeneous group of bacteria that can be found bacteria studied and exploited as PGPR agent

*Corresponding author’s email: Bouznadahcene@[Link]

18 BOUZNAD AND BELLAHCENE

belongs to the species of fluorescents Pseudomonas cultural conditions, morphological and biochemical
and Bacillus spp. characteristics tests.
In order to make its cultivation sustainable and
In vitro antagonism test
less dependent on chemical fertilizers it is highly
important to master the use microorganisms that All the isolated bacteria (rhizospheric, epiphytic and
can contribute to the improvement of plant growth. endophytic) were evaluated for their in vitro
Tomato (Lycopersicon esculentum L) is the most antagonistic activity against F.O.L. Bacterial isolates
important staple food in Algeria, and chemical were incubated in broth medium (LB or KB based
fertilizers are the most important input required for on the medium from which they were isolated) at
its cultivation (Snoussi, 2010). The cultivation of this 25°C during 24 h. Aliquots of 100 μL of each
plant occupies 63.06% of the area of arable land in growing bacterial culture were placed at
Algeria representing 8.33% of the national approximately 3 mm on the edge of the plate and
production of vegetable cultures (Anonymous, incubated for 24 h. A 5-mm plug from the leading
2009). This culture is also affected by a set of edge of a 5-days-old culture of the fungal pathogen
bacterial and fungal diseases that generates large (F.O.L) was placed at the centre of a 9-cm diameter
losses in crops. Although wilt resistant cultivars Petri dish containing PDA.
have been available for decades and provide some Percentage of growth inhibition was calculated
degree of control, the occurrence and development by the following equation: 100*(R1-R2)/R1, where
of new pathogenic races is a continuing problem. R1 represents the radius of the colony of F.O.L in the
The treatment of these diseases is most often direction with no bacterial colony and R2 is the
achieved through the use of phyto-chemicals that radius of the fungal colony in the direction of the
even if they give immediate results can cause long- bacterial colony.
term harm to soil and the consumer. In order to
Production of HCN
make its cultivation sustainable and less dependent
on chemical fertilizers it is highly important to The production of HCN was determined according
master the use microorganisms that can contribute to the method of Liu et al., (2010). Briefly, overnight
to the improvement of plant growth. culture of each strain was spread on LB agar
Hence, the present study, aimed at isolating free containing glycine (4.5 g L-1). A sterilized filter paper
living and endophytic rhizobacteria (Pseudomonas saturated with 1% solution of picric acid and 2%
and Bacillus species) from rhizosphere soils, root sodium carbonate was placed in the lid of the Petri
surface and inner tissues of tomato root with dish. The Petri dish was then sealed and incubated
antagonistic activity towards Fusarium oxysporunm f. at 28°C for 4 days. A change in color of the filter
sp lycopersici (FOL) bearing multiple plant-growth paper from yellow to reddish brown is an indication
promoting traits and further asses their inoculation of cyanogenic activity.
effect on growth of tomato seedlings under
Screening for siderophore producing activity
greenhouse conditions.
The protocol of King et al. (1954) was used for
MATERIAL AND METHODS fluorescence production. Bacteria were streaked on
King’s B agar and incubated at 28°C for 48 h. At the
Isolation of rhizobacteria end of the incubation, the plates were observed
under UV light for production of fluorescence.
Rhizospheric, epiphytic and endophytic bacteria
Fluorescence pigment formed was considered as an
were isolated according to the procedures of Han et
indication of siderophore production (Teintze et al.,
al. (2009). Heat treatment method described by
1981; Yasmin et al., 2009). Each test was replicated
Walker et al. (1998) was used for isolation of Bacillus
three times.
to bias the selection towards spore-forming bacteria.
In all cultivation experiments, the agar plates Characterization of rhizobacteria PGPR traits
were incubated in the dark for 3 days at 28°C. Based
Production of indole acetic acid
on the colony characteristics, single colonies were
selected and stored in 15% glycerol at 20°C for Indole acetic acid (IAA) production was detected as
further study. described by Brick et al., (1991). Bacterial cultures
The bacterial isolates were afterward were grown for 48h at 28ºC on Luria-burtani
characterized to the species level on the basis of medium supplemented with 10 mg/ml of L-
 Screening of Free-living and Endophytic Rhizobacteria with Potential Antagonistic Activity 19

tryptophan. The cultures were centrifuged at 6000 sterilized for 30 s in ethanol (75°) and this was
rpm for 20 min. The supernatant (2ml) was mixed followed by 3 min dipping in 2% NaClO. They were
with two drops of orthophosphoric acid and 4ml of then washed three times in sterile water. Three
the Salkowski reagent (50ml, 35% of perchloric acid, surface sterilized seeds/pot were sown in a 12cm x
1 ml 0.5M FeCl3 solution). Development of pink 10 cm diameter pot containing steam-pasteurized
colour indicates IAA production. The absorbance of soil-manure mixture (3:1). Three repetitions were
the pink color was measured spectro- made per strain.
photometrically at 530 nm. The IAA concentration The sown seeds were watered regularly until the
in the culture was determined by using a calibration emergence of the first shoot. Five days later, 30ml of
curve of pure IAA (Hi-media) as a standard the bacterial inoculum (108-109cfu/ml, concentration
obtained in the range of 10–100 mg/ml. There were was adjusted with a spectrophotometer, to OD540 =
three replicates in this experiment. 0.2) was applied to the pots as a soil drench and a
second application was made one week later. Until
Phosphate solubilization and phosphate
the starvation, the pots were watered daily. Growth
solubilizing index (PSI)
promoting ability of the bacterial isolates was
All the isolates were screened for their phosphate- determined based on the data collected on shoot
solubilizing ability on Pikovskaya agar (Pikovskaya, height, shoot dry and fresh weight, root length and
1948). Bacterial isolates were streaked on root dry weight.
Pikovskaya agar and incubated for 72 h at 28°C.
Statistical analysis
Appearance of clear halo zone indicates positive
phosphate solubilization ability. Analysis of variance (ANOVA) and means
The solubilizing activity of the most effective comparison tests were performed using Mintab
strains was expressed as phosphate solubilization version 14 statistical package (free trial).
Index (PSI) calculated from the following formula:
PSI = total diameter (colony + halo zone) / colony RESULTS AND DISCUSSION
Diameter.
Use of the rhizosphere microorganisms to promote
Production of ammonia
plant growth and to control plant diseases continues
Bacterial isolates were tested for the production of to be an area of rapidly expanding research in
ammonia in peptone water. Freshly grown cultures agriculture as it is of the most appropriate
were inoculated in 10ml peptone water in each tube alternative to usage of chemical fertilizers,
and incubated for 48-72h at 28°C. Nessler’s reagent pesticides. In this study, one hundred and nine
(0.5 ml) was added in each tube. Development of strains have been isolated from three levels sites of
brown to yellow colour was a positive for ammonia the tomato rhizosphere. The rizospheric strains were
production (Cappuccino and Sherman, 2005). represented by 23% while the epiphytic and the
endophytic were represented by 22% and 40%
Phytopathogen agents
respectively (Tables 1,2,3). The distribution of
The fungal phytopathogen of tomato plant, FOL isolated strains according to their origin and their
used for the present investigation was obtained reaction vis a vis the Gram stain are presented in
from Micobiology and plant biology laboratory Fig. 1 and the results don’t show the dominance any
(Mostaganem university, Algeria). The culture was of the groups. On the other hand, according to the
maintained on potato dextrose agar medium at 28°C morphological and biochemical tests, 43% of the
with regular subculturing at an interval of 1 month. total number has been identified as Pseudomonas sp
and 56% belonging to Bacillus species. Isolation of
Evaluation of bacterial isolates for growth
bacteria from within the rhizosphere of the target
promotion
crop is essential for successful identification of
The effect of isolated strains on plant growth was potential PGPR agents (Williams and Asher, 1996).
studied in pot experiments. The inoculation This approach may also provide an opportunity to
treatments were setup in a randomized design with select effective PGPR strains capable of the roots
three replicates. colonization at population densities efficient to
Tomato seeds, from the Saint Pierre cultivar produce the beneficial effects and antagonizing soil-
purchased from a local agency, were surface borne pathogens in the same environment where
20 BOUZNAD AND BELLAHCENE

they will be used commercially (Landa et al., 1997). F.O.L (Fig. 2). The degree of inhibition observed
The bacterial strains previously isolated were varies depending on the nature of strains, ranging
screened in a preliminary test for their antagonistic between 31% for RPSK45 isolate and 78% for
activity against FOL by plate assay technic with [Link] suggests that not only the nature of the
three different strains by plate. For 54% of the total antifungal metabolite produced by the isolate may
strains tested there was no direct contact between be chemically different from one strain to strain but
fungal mycelium and bacterial colonies. The PDA also that the producing bacterial isolates are
medium used for dual cultures is rich in nutrients taxonomically different (Williams and Asher, 1996).
thus the competition for nutriment might be The in vitro antagonistic activity of the rhizospheric
excluded, so that the clear inhibition zone observed isolates, vary from 0.23% to 77.78% (Fig. 2), of which
might be linked to production of substances that the best performing strains were RSML37,
diffused into the agar medium (Ahmed idriss et al., RSMK45, RSSBL3 and RSSBK9. The antagonistic
2007). For the calculation of the inhibition rate, each activity of the strains isolated from the rhizoplane is
antagonist strain was individually tested against presented in the (Fig. 3). In this case the majority of
the strains have shown an inhibitory effect ranging
Bacteria between 40% and 56.56%. The most active of them
9% were RPMK3 and RPMK4 with 56.56%. The
endophytic 10 % endophytic strains have shown higher activities than
presented either by the rhizospheric or by the
18 % epiphytic strains, the most important of them were
epiphytic Gram-
15 %
Gram+ ERL3 and ERK10 with an inhibition percentage of
23 %
78% and 73.11% respectively (Fig. 4). These results
rhizospheric 25 %
are in line with the results of Yang et al. (2011) who
found that from 72 strains isolated from the tomato
0 5 10 15 20 25 30 rhizosphere, 48 isolates have had an inhibition rate
ranging between 50% to 78%.
Fig. 1. Distribution of the microbial strains according to HCN (cyanhydric acid) and siderophore are
the Gram staining in the three rhizosphere levels. other mechanisms by which rhizobacteria exert their

Table 1. Origin and screening of PGPR activities of microbial strains isolated from the rhizoplane of tomato.
Strain Culture Gram shape Sidero- [Link] IAA HCN NH3
medium Stain phore (μg/ml)
RPRL13 LB - rod + + 23,86l - + P. putida
RPRL14 LB - rod - - 40,83h - + B. stearothermophilus
RPML19 LB + rod - + 91,97c - + B. laterosperus
RPML21 LB + cocci - + 41,39g - + ND
RPML29 LB - rod - - 35,33k - + ND
RPML30 LB + rod - + 37,94i - + B. stearothermophilus
RPMK26 KB + rod - - 95,44a + + B. stearothermophilus
RPMK25 KB - rod - - - - + Pseudomonas sp
RPMK2 KB - rod + + 88,17d - + Pseudomonas sp
RPMK3 KB + rod - + - - + ND
RPMK4 KB + rod - - 62,64e - + ND
RPMK14 KB - rod - - 44,5f - + Pseudomonas sp
RPMK16 KB - rod - + - - + ND
RPML23 LB - rod - + - - + Pseudomonas sp
RPML24 LB - rod - - 94,5b - + Pseudomonas sp
RPML10 LB + rod + + 19,67l - + P. fluorescens
RPML11 LB + rod - + 36,36j - + B. stearothermophilus
RPMK17 KB - rod + - - - + P. putida
*Means (of three replications) that do not share a letter are significantly different
+: production, — : absence of the character, ND: not identified, KB: king, P. sol: phosphate solubilization
 Screening of Free-living and Endophytic Rhizobacteria with Potential Antagonistic Activity 21

Fig. 2. Extent of antagonistic activity of isolates isolated from the rhizospheric soil of tomato plant against FOL.

Fig. 3. Extent of antagonistic activity of isolates isolated from the rhizoplane of tomato plant roots against FOL.

suppressive action on soil-borne pathogens. These many rhizobacteria including Pseudomonas and
two characters were detected in 15.25% of strains Bacillus species (Bakker and Schippers, 1987) and it
exhibiting for HCN production (Fig. 2) and 22.03% has been proposed as a defense regulator against
for the production of siderophores (Fig. 2f). Several many phytopathogens (Blumer and Haas,2000). The
authors have reported that HCN is produced by lack of the HCN is sometimes considered as PGPR
22 BOUZNAD AND BELLAHCENE

traits because these substances as harmful for plant results for the production of IAA indicate that the
growth promotion (Agrawal and Agrawal, 2013). substance is present in 61%, 72% and 80% for the
The production of siderophore detected in 22.03 % rhizospheric, endophytic and epiphytic strains
of the total isolates was mainly present in strains respectively (Table 1,2,3). These results have been
belonging to the Pseudomonas genus. The role of also mentioned by Patten and Glick (2002) who
siderophore in biocontrol activity is well established reported that 80% of soil bacteria possess IAA
since considered as the main tools used in nutrient producing potential. The prevalence of the epiphytic
competition in the rhizosphere. The presence of a strains, in our case, as good producers of the
few number of HCN and siderophore producers phytohormone may be explained by the availability
may suggest that the production of antibiotics like of the IAA precursors in vicinity of the plant root
substances may be the main mechanisms involved system Although Glick and Bashan (1997) reported
in the antagonism activity exhibited by the majority that isolates from rhizosphere are more efficient
of the isolates. auxin producers than isolates from the bulk soil.
In addition to their antagonistic activity towards Varying amounts of bacterial IAA have been
pathogen agents, the rhizobacteria are often studied obtained during this study. The highest IAA value
for their plant promotion traits including (94.5μg/ml) has been produced the epiphytic
production of phytohormones, fixation of RPML24 strain (Table 1) and the lowest (19.79 μg/
atmospheric nitrogen and solubilization of minerals ml) obtained by RSMK43 of rhizospheric origin
such as phosphorus and iron. The exploration of (Table 2). Different concentrations of IAA, produced
these traits has been achieved on strains presenting by a myriad of PGPR strains, have been reported by
such an antagonistic activity towards FOL. The many researchers (kaur and Sharma, 2013).

Table 2. Origin and screening of PGPR activities of microbial strains isolated from the rhizosphere of tomato.
Isolate Culture Gram Cell Sidero- [Link]. IAA HCN NH3
medium stain shape phore (μg/ml)
RSRL1 LB - cocci - - - - + ND
RSRL2 LB - rod - + 39,33f - + Pseudomonas sp
RSRL5 LB + rod - + - - + B. stearothermophilus
RSRK7 KB - rod + + 31,06i - + Pseudomonas sp
RSRK8 KB + rod - + - - + ND
RSRK3 KB + rod - + 32,36i - + ND
RSRK4 KB - rod + - 27,25k - + P. putida
RSSBL1 LB - rod - + - - + Pseudomonas sp
RSSBL9 LB + rod - - - - + B. stearothermophilus
RSSBK3 KB - rod + + 44,19e + + P. fluorescens
RSSBK4 KB - rod + + 29,03j + + [Link]
RSSBK5 KB - rod - + - - + Pseudomonas sp
RSSBK6 KB - rod + - 40,33f + + [Link]
RSSBK8 KB + rod - - 70,5a + ND
RSSBK10 KB - rod - + 47,72d + + Pseudomonas sp
RSML37 LB + rod - - 28,56jk + B. stearothermophilus
RSML39 LB - rod - - 34,14h + Pseudomonas sp
RSML47 LB + rod - - - + [Link]
RSML17 LB + rod - - 39,42f + B. laterosperus
RSML18 LB - rod - + 37,58g + [Link]
RSMK40 KB - rod - + 51,94c + Pseudomonas sp
RSMK42 KB + rod - + 27,47k + B. stearothermophilus
RSMK43 KB - rod + + 19,79l + + [Link]
RSMK44 KB - rod - - - + Pseudomonas sp
RSML48 LB - rod - - - ND
RSMK45 KB + rod - ND
*Means ( of three replications) that do not share a letter are significantly different.
+: production, — : absence of the character, ND: not identified, KB: king, P. sol: phosphate solubilization
 Screening of Free-living and Endophytic Rhizobacteria with Potential Antagonistic Activity 23

Ashrafuzzaman et al. (2009) has reported that the source of insoluble phosphate medium with respect
IAA production was influenced by cultural to the roots inside tissues where the substrate is less
conditions, growth stage and tryptophan available. It is reported that the phosphate
availability. solubilization activity is affected by time and
The phosphate solubilization ability was detected conditions of microorganisms’ growth (Nahas,
in 33%, 55% and 57% of the endophytic, epiphytic 2003). Thus, fifteen phosphate solubilizing strains
and rhizospheric isolates respectively (Table 1,2,3). have been selected to measure the effect of
It appears that the rhizosphere and epiphytic incubation period on the variability of the
isolates are more effective in the solubilization of solubilzation ability (in term of PSI) of the different
phosphate than endophytic ones, probably due to an isolates. The results demonstrate that all the strains
adaptation acquired by their presence in a rich selected displayed a PSI ranging between 1.5 and

Fig. 4. Extent of antagonistic activity of isolates isolated roots against FOL

Table 3. Origin and screening of PGPR activities of endophytic strains isolated from the tomato roots.
Isolate Culture Gram shape Sidero- [Link]. IAA NH3 HCN
medium stain phore (μg/ml)
ERL11 LB + rod - - - + - [Link]
ERL2 LB - rod + - 58,22c + - P. putida
ERL1 LB + rod - + - - - ND
ERL3 LB + rod - - 60,47b + - Bacillus sp
ERL13 LB + rod - - 45,31d + - Bacillus sp
ERK14 KB - rod - - - + + P. oryzohabitans
ERK9 KB - rod - + - + - Pseudomonas sp
ERK10 KB - rod - + 62,28a + + Pseudominas sp
EML57 LB + rod - + 33,33fg + - Bacillus sp
EML59 LB - rod - - - - - ND
EML56 LB - rod - - 32,14g + - Pseudomonas sp
EML60 LB - rod - + 29,39h + - Pseudomonas sp
EML61 LB + rod - - 39,22e + - Bacillus sp
EML62 LB + rod - - 33,67f + - Bacillus sp
ESL1 LB - rod - - 24,86i + - Bacillus sp
*Means (three replications) that do not share a letter are significantly different.
+: production, — : absence of the character, ND: not identified, KB: king, P. sol: phosphate solubilization
24 BOUZNAD AND BELLAHCENE

2.78 (Fig.3) and this parameter is dependent on trait of PGPR that may indirectly influence the plant
incubation period. The max value has been reached growth. The accumulation of ammonia in soil may
after 14 days of incubation. Similar results have been increase in pH creating alkaline condition of soil at
obtained by Kaur and Sharma (2013) who reported pH 9-9.5. It suppresses the growth of certain fungi
that maximum amounts of phosphorus (6.40 mg/ and nitrobacteria due to it potent inhibition effect.
100ml) have been obtained by a reference Study of tomato plant growth under the
Pseudomonas sp. LK884 strain after 12 days after influence of seven PGPR isolates has been
which a decline in the production was observed. All undertaken to investigate the effect of these PGPR
the isolates were able to produce ammonia and on the promotion of the plant growth. All the PGPR
catalase. Ammonia is often considered an important isolates shown increased growth of plant in term of
root length, shoot length, and dry weight (Table 4).
The highest percentage increase in root weight over
control has been observed with RPMK2 (141%)
followed by RPMK26 (96%). Both strains are
epiphytic and are high-producers of IAA, 88.17μg/
ml and 95.44μg/ml respectively. A positive effect of
the RPMK26 strain over the shoot length has been
also recorded. The effect of IAA over the promotion
of the root growth is reported by many
investigations (Agrawal and Agrawal, 2013;
Malleswari and Bagyanarayana, 2013). Ahmad and
al. (2005) reported that the effects of auxins on plant
seedlings are concentration dependent and different
plant seedlings respond differently to variable auxin
concentrations and type of microorganisms. The
percentage of shoot dry weigh increase was less
significant and it varies between 21% and 58%. The
highest percentage increase was recorded with
RSBK10 (57.98%) followed by RPMK26 (46.70%).
Fig. 5. Different plant growth promoting activities of The length of shoot plants was the parameter less
rhizobacteria isolated from tomato rhizosphere affected by isolates inoculation (F=1.37), it ranges
(a: HCN production , b: HCN production control, from 19cm to 28.81cm. These results show that the
c, d: antagonistic activity vs FOL, e: inorganic effect of bacterial inoculation on the growth
phosphate solubilization, f: fluorescence parameters is not mainly due to the IAA production
production).

Table 4. Evaluation of the most potential rhizobacteria isolates for their growth plant promoting effects on tomato plants
under greenhouse conditions
Root Shoot Shoot dry Root dry % shoot % root
lenght height Weight Weight weight weight
(cm) (cm) (mg) (mg) increase increase
over control over control
Control 5,38c 17,24b 241,79f 138,10f
RPMK26 8,41a 19,51ab 354,70ab 271,40b 46,70 96,52
RSBK10 6,62abc 19,28ab 381,97a 231,63cd 57,98 67,73
RPMK2 8,20a 19,69ab 270,00de 333,60a 11,67 141,56
RSBK3 7,50ab 20,09a 335,28bc 225,77de 38,67 63,48
ERK10 7,13abc 19,09ab 300,53cd 246,70c 37,92 78,64
RPML19 5,97bc 19,00ab 261,87de 208,77e 21,92 51,17
ERL2 7,47ab 20,81a 317,97bc 218,73de 48,04 58,39
Mean 7,07 19,34 308,01 234,34
Effect 2.5/<0.05 1.37/<0.05 12.65/<0.05 76.72/<0.05
(Fisher value/P) (H.S) (H.S) (H.S) (H.S)
 Screening of Free-living and Endophytic Rhizobacteria with Potential Antagonistic Activity 25

PSI
2,9 0

2,7 0

2,5 0

RPML1 9
2,3 0
RPMK2
R SMK43

2,1 0 RPMK2 6
ERL2
R SMK42
1,9 0
RSSBK 3
EML57
1,7 0 RPML3 0
RSSBK 10

1,5 0 Days
4 6 8 10 12 14

Fig. 6. Effect of incubation time on the solubilization index of microbial isolates solubilizing inorganic phosphate

but also to the other traits such phosphate Biological Control. 40 : 97-106.
solubilzation ability, production of ammonia or Arshad, M. and Frankenberger, Jr.W.T. 1992. Microbial
antagonistic activity towards deleterious production of plant growth regulators, In: Soil
Microbial Ecol. Ed. Metting FB Jr, Marcel Dekker Inc.,
microorganisms. It seems also that the origin the
New York. pp 307-347.
PGPR isolation has not shown a significant effect on Ashrafuzzaman, M., Hossen, F.A., Ismail, M.R., Hoque,
the strain performance since either rhizospheric or M.A., Islam, Z.M., Shahidullah, S.M. and Meon, S.
epiphytic and endophytic PGPR have exhibited the 2009. Efficiency of plant growth-promoting
same growth promotion effect on the tomato plant. rhizobacteria (PGPR) for the enhancement of rice
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