Ecole Nationale Supérieure en Biotechnologie
Master en Biotechnologie de l’Environnement
Module : Traitement des sols
TP N°2 : Dénombrement de la microflore bactérienne dans le sol
Introduction
Afin de dénombrer la microflore bactérienne existant dans les différents échantillons de sol,
nous allons procéder à une culture sur milieu de gélose nutritive. Pour ce faire, une série de
dilution variant de 10-1 à 10-6 doit être préparée. Le dénombrement après culture concerne,
évidement les cellules viables de l'échantillon, autrement dit, les cellules capables de croitre.
Il est basé sur l'aptitude de chaque bactérie, fixée par la solidification du milieu gélosé, à
former une colonie visibles à l'œil nu.
1. Objectif du Tp
L’objectif du Tp est de déterminer la concentration en bactéries contenues dans le sol témoin
et dans les différents traitements préalablement effectués sur des sols contaminés par le diesel.
2. Matériel
- Eau physiologique stérile contenant 9 ‰ d’NaCl.
- Tubes à essai contenant 9 ml d’eau physiologique stérile.
- Micropipettes (P1000 et p100).
- Embouts stériles de 1 ml.
- Un vortex.
- Gélose nutritive.
- Boites de Pétri.
- Pipettes pasteur.
- Compteur de colonies.
- Balance.
3. Protocole expérimental
1. Préparation de la solution mère
- Peser 1g de sol.
- Introduire le sol dans un tube à essai contenant 9 ml d’eau physiologique stérile.
- Agiter le tube énergiquement pendant 2 minutes à l’aide d’un vortex. Ce contenu
représente la solution mère.
2. Préparation des dilutions décimales
- Ouvrir et flamber l’ouverture du tube de la solution mère.
- Prélever 1 ml de cette suspension à l’aide d’une micropipette (P1000).
- Flamber et refermer le tube.
- Ouvrir le tube de 9 ml de diluant, flamber l’ouverture, y introduire le volume prélevé.
- Flamber et refermer le tube, jeter l’embout souillée dans le bac à eau de Javel.
- Bien agiter le tube au vortex. Ce mélange représente la dilution 10-1.
- Prélever 1 ml de la dilution 10 -1, et introduire ce volume dans un autre tube à essai
contenant 9 ml d’eau physiologique stérile. Ce mélange représente la dilution 10 -2.
- Continuer la procédure tout en prenant 1 ml de la dilution précédente jusqu’à avoir
une dilution de 10-6.
3. Ensemencement et incubation
- Répartir la gélose nutritive maintenue en surfusion, mais légèrement refroidie, dans
des boites de Pétri à une hauteur d’environ 3 à 4 mm, et laisser se solidifier.
- Homogénéiser la dilution à prélever.
- Prélever un volume de 0,1 ml de chaque dilution à l’aide d’une micropipette, et
déposer le au centre de la surface de la gélose.
- Étaler à l’aide d’une pipette râteau, le volume sur toute la gélose.
- Incuber les boites ensemencées pendant 24 à 48 heures à 30°C.
4. Dénombrement
- Dénombrer les colonies développées, dans les boites contenant entre 30 et 300
colonies, à l'aide d'un compteur de colonies.
5. Calculs et interprétation
- Le nombre de microorganismes en UFC/ml, est calculé à partir des boites retenues au
niveau de deux dilutions successives à l’aide de la formule suivante :
N:
nombre de microorganismes en UFC/ml.
Ƹc : somme totale des colonies des boites comptées.
n1 : nombre de boites comptées dans la première dilution (la plus faible).
n2 : nombre de boites comptées dans la seconde dilution (la plus forte).
d : taux de dilution à partir du quel les premiers comptages ont été obtenus.
v : volume ensemencé (0,1ml).
- Calculer le nombre de microorganismes en UFC/ml, dans chaque sol traité ainsi que
dans le témoin.
- Interpréter les résultats obtenus.