Nome et prénom :Omara Kawther 16/10/25
Nome et prénom : Sekhri Safa
Groupe :02
Compte rendu :
Extraction, Amplification et
Visualisation de l’ADN Bactérien ([Link]) par
PCR et Électrophorèse
Note Observation
1. But
L’objectif de cette manipulation est d’acquérir les techniques fondamentales de
la biologie moléculaire, notamment :
• L’extraction de l’ADN génomique à partir d’une bactérie à Gram
négatif (Escherichia coli).
• L’amplification d’un fragment spécifique du gène ADNr 16S par la
technique de PCR (Polymerase Chain Reaction).
• La vérification du produit d’amplification par électrophorèse sur gel
d’agarose.
2. Principe
L’extraction de l’ADN repose sur la lyse des cellules bactériennes, la
dégradation de l’ARN par la RNase, et la précipitation des protéines pour
obtenir un ADN purifié.
La PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d’amplifier in vitro un fragment
spécifique d’ADN grâce à :
• des amorces complémentaires de la séquence cible,
• une ADN polymérase thermostable,
• et un thermocycleur.
La réaction se déroule en trois étapes cycliques :
1. Dénaturation (94–95°C) : séparation des deux brins d’ADN.
2. Hybridation (≈55°C) : fixation des amorces sur les séquences complémentaires.
3. Élongation (72°C) : synthèse du nouveau brin d’ADN par la Taq polymérase.
Enfin, l’électrophorèse sur gel d’agarose permet la séparation des fragments d’ADN
selon leur taille sous l’action d’un champ électrique.
La visualisation se fait sous lumière UV après coloration au bromure d’éthidium (BET).
3. Matériel utilisé
• Micropipettes et cônes stériles
• Microcentrifugeuse
• Bain-marie (37°C, 65°C, 80°C)
• Thermocycleur (PCR)
• Cuve et peigne d’électrophorèse
• Transilluminateur UV
• Tubes Eppendorf 1,5 mL
• Vortex, support de gel
• Gants nitriles, masque UV
Réactifs utilisés
a. Pour l’extraction de l’ADN
• Solution de lyse
• RNase
• Solution de précipitation des protéines
• Isopropanol
• Éthanol 70 %
• Solution de réhydratation de l’ADN
b. Pour la PCR
• Tampon PCR 10X
• dNTP (2,5 mM)
• MgCl₂ (25 mM)
• Amorces A1 : 5’-TCA AAG TGA ATT GAC GGG GGC-3’
• Amorces A2 : 5’-GCC CGG GAA CGT ATT CAC-3’
• ADN polymérase (5 U/µL)
• ADN matrice (extrait)
• Eau stérile
c. Pour l’électrophorèse
• Agarose 3 %
• Tampon TBE 0,5X
• Bromure d’éthidium (BET)
• Tampon de charge
• Marqueur de taille moléculaire (DNA ladder)
4. Mode opératoire:
I. Extraction de l’ADN génomique
L’extraction de l’ADN a pour objectif d’isoler l’acide désoxyribonucléique (ADN) contenu
dans les cellules bactériennes tout en éliminant les constituants indésirables tels que les
protéines et les ARN.
1. Lyse cellulaire:
• Une colonie d’Escherichia coli a été prélevée à l’aide d’une anse de platine et
suspendue dans 600 µL de solution de lyse.
Cette étape permet la rupture de la paroi et des membranes bactériennes, libérant ainsi le
contenu cellulaire.
• La suspension est ensuite incubée 5 minutes à 80°C, afin de dénaturer les Dnases
(enzymes dégradant l’ADN).
• Après refroidissement, 3 µL de Rnase sont ajoutés pour dégrader l’ARN présent.
• L’incubation se poursuit 30 minutes à 37°C, ce qui permet d’obtenir un extrait
exempt d’ARN.
2. Précipitation des protéines
• Pour éliminer les protéines, 200 µL de solution de précipitation (utilisé protéinase
K)des protéines sont ajoutés à l’échantillon.
• Après un mélange énergique (vortex 20 secondes) et une incubation sur glace pendant
5 minutes(Pour ralentissement l’effet de protéinase K),les protéines précipitées
sont éliminées par centrifugation à 13 000 rpm pendant 3 minutes.
• Le surnageant, contenant l’ADN soluble, est ensuite soigneusement récupéré.
3. Précipitation et lavage de l’ADN
• Le surnageant obtenu est transféré dans un tube propre, puis mélangé à un volume
égal d’isopropanol (600 µL).
• L’inversion douce du tube entraîne la formation d’un culot blanc visible,
correspondant à l’ADN précipité.
• Après centrifugation à 13 000 rpm pendant 2 minutes, le surnageant est éliminé et le
culot lavé avec 600 µL d’éthanol 70 % pour retirer les impuretéset sels résiduels.
• Le culot d’ADN est ensuite séché 15 à 30 minutes à température ambiante, puis
réhydraté avec 100 µL de solution de réhydratation et incubé 1 heure à 65°C pour
obtenir un ADN pur et stable.
• Les tubes de PCR, y compris le témoin négatif et celui contenant directement une
colonie d’E. Coli, ont été conservés toute la nuit à 4 °C afin de permettre la
diffusion et le relargage progressif de l’ADN avant la réaction d’amplification
II. Amplification de l’ADN par PCR
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) permet d’amplifier spécifiquement un fragment
du gène ADNr 16S à partir de l’ADN génomique extrait
1. Préparation du mélange réactionnel
Le mélange de PCR a été préparé dans des conditions stériles selon la composition suivante :
Composant Volume (µL) Remarques
Tampon PCR 10X 5 µL Fournit les conditions
optimales pour la réaction
dNTP (2,5 mM) 4 µL Source des quatre bases
nécessaires à la synthèse de
l’ADN
MgCl₂ (25 mM) 3 µL Cofacteur essentiel de la
Taq polymérase
Amorce A1 (10 µM) 2 µL Amorce sens
Amorce A2 (10 µM) 2 µL Amorce antisens
ADN polymérase (5 U/µL) 0,2 µL Enzyme thermostable Taq
ADN matrice 2 µL ADN génomique e
• Preparation du Mix :
Préparation du mélange maître (Master Mix PCR):
Avant la préparation, le mélange de PCR a été placé sous lampe UV pendant quelques
minutes afin de stériliser le matériel et éviter toute contamination.
Un témoin négatif (sans ADN matrice) a également été préparé pour vérifier l’absence de
contamination du mélange réactionnel.
Le mélange maître a été préparé pour 10 postes afin d’obtenir une solution homogène et de
limiter les erreurs de pipetage.
Les volumes ont été multipliés par 10 à partir du protocole de base :
Composant Volume pour 1 réaction (µL) Volume pour 10 réactions (µL)
Tampon PCR 10X 2,5 25
dNTP (2,5 mM) 2,5 25
Amorce A1 (forward) 0,5 5
Amorce A2 (reverse) 0,5 5
Taq polymérase 0.25 2,5
Total partiel 6,25 µL 62,25 µL
Le volume final souhaité pour le Master Mix étant de 250 µL (25 µL × 10 réactions), la
différence est complétée avec eau stérile (Véphénal) :
250 µL – 62,5 µL = 187,5 µL d’eau stérile.
Ainsi, le volume final du Master Mix complet pour 10 réactions est de 250 µL, contenant
tous les réactifs nécessaires sauf l’ADN matrice.
Distribution du mélange
Pour chaque tube individuel :
• 23 µL de Master Mix
• 2 µL d’ADN matrice
Le témoin négatif (T.N) a reçu 23 µL de Master Mix + 2 µL d’eau stérile à la place de
l’ADN.
Le volume final par tube est donc de 25 µL.
Un autre tube de PCR sur colonie a été préparé en ajoutant directement une colonie d’E.
Coli dans le mélange réactionnel.f
Séquences des amorces utilisées
Amorce sens (A1) : 5’-TCA AAG TGA ATT GAC GGG GGC-3’
Amorce antisens (A2) : 5’-GCC CGG GAA CGT ATT CAC-3’
Ces amorces ciblent une région hautement conservée du gène 16S, caractéristique des
bactéries.
2. Programme du thermocycleur
Étape Température (°C) Durée Nombre de cycles
Dénaturation initiale 94°C 10 min 1
Dénaturation 94°C 30 s 30
Hybridation 55°C 1 min 30
Élongation initial p 72°C 1 min 30
Élongation finale 72°C 10 min 1
3. Principe de la réaction
La PCR repose sur une succession de cycles thermiques permettant de multiplier le fragment
ciblé de manière exponentielle :
1. Dénaturation (94°C) : séparation des deux brins d’ADN.
2. Hybridation (55°C) : fixation des amorces sur les séquences
complémentaires.
3. Élongation (72°C) : synthèse du nouveau brin par la Taq polymérase.
Après environ 30 cycles, la quantité du fragment ciblé atteint plusieurs millions de copies,
prêtes à être visualisées par électrophorèse sur gel d’agarose
III. Visualisation par électrophorèse sur gel d’agarose
Cette étape a pour but de vérifier la présence, la pureté et la taille de l’ADN extrait ainsi que
du produit d’amplification obtenu par PCR.
1. Préparation du gel :
• Une solution d’agarose à 1,5 % a été préparée en dissolvant 0,75 g d’agarose dans 50
mL de tampon TBE 0,5X.
• Après chauffage et dissolution complète, la solution a été laissée à refroidir
jusqu’à environ 55 °C, puis 2 gouttes de bromure d’éthidium (BET) ont été ajoutées
pour colorer l’ADN.
• La solution tiède a ensuite été versée dans un moule muni d’un peigne pour former les
puits.
• Après 30 minutes de polymérisation, le gel est devenu solide et prêt à être utilisé.
2. Migration de l’ADN :
• Les échantillons de PCR (10 µL) ont été mélangés à 2 µL de tampon de charge, puis
déposés dans les puits du gel, en parallèle d’un marqueur de taille moléculaire (DNA
ladder).
La migration a été effectuée à 100 V pendant environ 30 à 40 minutes dans la cuve contenant
le tampon TBE 0,5X.
IV. Résultats et interprétation
L’analyse des produits de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 % a révélé
l’apparition d’une bande nette d’environ 450 pb uniquement dans le puits correspondant à la
colonie d’Escherichia coli.
• Cette bande correspond à la taille attendue du fragment amplifié du gène ADNr
16S, confirmant que la PCR sur colonie a été réussie.
Cela indique que la colonie testée contient bien le matériel génétique cible et que les
conditions d’amplification étaient adéquates pour permettre la synthèse spécifique du
fragment recherché.
En revanche, aucune bande n’a été observée dans le témoin négatif, ce qui confirme
l’absence de contamination dans la réaction PCR.
Cependant, de faibles bandes secondaires ont été observées dans certains puits, ne
correspondant pas à la taille attendue.
Ces produits d’amplification non spécifiques peuvent résulter :
• D’une hybridation partielle ou non spécifique des amorces sur d’autres régions du
génome,De la formation de dimères d’amorces ou d’amplifications parasites,
Ou encore de conditions de PCR légèrement suboptimales, notamment une température
d’hybridation trop basse ou une concentration en MgCl₂ trop élevée.
La bande principale à 450 pb reste la seule à considérer comme résultat positif et significatif,
attestant du bon déroulement de la PCR sur colonie.
Pour améliorer la spécificité de la réaction et réduire les produits secondaires, il serait
pertinent de répéter la PCR en optimisant certains paramètres tels que :
La température d’hybridation, La concentration en MgCl₂,Et la quantité d’amorces
utilisées.