LA PCR
Polymerase Chain Reaction
ou réaction de polymérisation en
chaîne.
Dr. ATTAB K.
• méthode de Biologie Moléculaire mise au point en
1985 par Kary Mullis,
( prix Nobel,1993).
• permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un
acide nucléique donné afin d' obtenir une quantité
suffisante pour le détecter et l’étudier.
• Cette technique permet d’obtenir un nombre
important (jusqu’à un million) de copies d’une
séquence choisie d’ADN.
• Il s’agit d’une méthode d’amplification enzymatique
in vitro,
• c’est une réaction enzymatique qui permet de
sélectionner puis d’amplifier en une très grande
quantité un fragment d’ADN particulier, présent en
très faible quantité au départ.
But
• La PCR permet d’obtenir par réplication in vitro de
multiples copies d’un fragment d’ADN à partir d’un
extrait.
• L’ADN matriciel peu être:
L’ ADN génomique
l’ADN complémentaire obtenu par RT-PCR à partir
d’un extrait d’ARN messagers
l’ADN mitochondrial.
L’ADN plasmidique
Principe
• Le principe de la PCR s'agit de réaliser une succession
de réactions de réplication d'une matrice double brin
d'ADN qui se répètent en boucle, comportant chacun
trois paliers de température.
• L'astuce consiste à utiliser les produits de chaque
étape de synthèse comme matrices pour les étapes
suivantes.
Principe
• En moyenne une PCR comporte entre 20 et 40 cycles.
Et chaque cycle est composé de 3 étapes:
Étapes de La PCR
Dénaturation
Étapes de La PCR
Dénaturation
• La première période s’effectue à une température de
94°C - 95°C, dite température de dénaturation.
• À cette température, l’ADN matriciel, qui sert de
matrice au cours de la réplication, est dénaturé (les
liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double
hélice d'ADN sont rompues).
Hybridation
Étapes de La PCR
Hybridation
• la température est descendue à la température dite
d’hybridation. Cette dernière est généralement
comprise entre 50°C et 68°C et elle est fonction de la
composition en désoxyribonucléotides (dATP, dTTP,
dGTP, et dCTP) des amorces.
• Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs
séquences complémentaires en reformant des liaisons
hydrogène.
• Plus la température d’hybridation est élevée, plus
l’hybridation est sélective, plus elle est spécifique
Choix de la température
d’hybridation
Tm: t° où 50% de l’ADN est double
brin
– formule empirique
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
– Température d’hybridation:
Tm - 4°C
Élongation
Étapes de La PCR
Élongation
• La troisième période s’effectue à une température de
72°C, dite température d’élongation. température
idéale pour l’activité de la Taq polymérase.
• Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de
départ , à la polymérisation du brin d'ADN
complémentaire de l'ADN matrice.
• La polymérisation se fait par ajout successif des
désoxyribonucléotides Chaque base ajoutée est
complémentaire de la base correspondante du brin
matrice.
• Le premier cycle est fini et voilà qu’un nouveau cycle
recommence. Cela se reproduira 30 fois (en fonction
du protocole de PCR)
• Au cycle suivant, les nouveaux fragments synthétisés
servent à leur tour de matrice pour la synthèse de
nouveaux fragments d’ADN.
• à la fin de chaque cycle la quantité d’ADN cible est
doublée.
• A partir d’une copie d’ADN cible, on pourra donc
obtenir 1 milliard de copie d’ADN cible.
Les acteurs de la PCR
• 2 Amorces couvrant le
fragment d’intérêt.
• Taq Polymerase.
• Tampon 10X (cotenant MgCl2,
KCl et Tris-HCl )
• dNTPs.
• L’ADN matriciel.
1- Les amorces
• Ce sont des fragments courts d'ADN,
capables de s'hybrider de façon spécifique,
grâce à la complémentarité des bases, sur
l’un des deux brins d'ADN.
• Les amorces sont choisies de façon à
encadrer la séquence d'ADN à amplifier.
1- Les amorces
Choix des séquences d’amorces
• Les amorces utilisées sont de 20 – 30 nt de longueur.
• Ont des Tm comparables.
• Des séquences qui ne soient pas complémentaires
entre elles.
• L'extrémité 3‘ de l'amorce devrait être riche en bases
G et C.
• La distance entre les amorces devrait être moins de 10
KBS de longueur .
• [Amorces] = 0.2-1uM
Tampon
Concentration du stock: 10X
• 10-50mM Tris-HCl (pH 8.3-9).
• 50mM KCl.
• 100ug/ml BSA.
• 25mM ou plus MgCl2.
Effet de la [Mg++] sur le produit
d’amplification
dNTPs
• Les dNTPs (Désoxyribonucléotides-Tri-Phosphates)
sont des molécules de base, qui constituent l’ADN,
utilisés par la Taq polymérase pour la synthèse du
nouveau brin d’ADN complémentaire.
• dGTP, dCTP, dATP, dTTP.
• Concentration finale: 200µM.
ADN Polymerase
• ’ADN polymérase permet la réplication
• Taq polymerase Thermus aquaticus.
• T˚ optimale = 70˚.
• synthétiser un nouveau brin d’ADN à
partir du brin d’ADN matrice après s’être
fixée à une amorce.
• Concentration du stock: 5 à10 U/µl
• Concentration finale: 1-2 U/ 25µl
L’ADN matriciel
• Avant la réaction de PCR, l’ADN est extrait à partir de l’échantillon
que l’on veut analyser (salive, cheveux, cellules, fossile…).
• Puis, cet extrait purifié en ADN, contenant le fragment d’ADN que
l’on souhaite amplifier, peut être utilisé en PCR.
• En théorie une copie ADN de la séquence recherchée est
suffisante pour avoir une amplification.
• Dans la pratique plusieurs copies sont nécessaires pour avoir un
résultat correct.
• La quantité d’ADN/ réaction:
50ng - 500ng.
Thermocycleur
• Pour effectuer ces transitions de températures, les
microtubes contenant le mélange réactionnel sont
placés dans un appareil programmable : un
thermocycleur.
• Cet appareil permet d’exposer les tubes à des
températures choisies et pour des durées
déterminées par l’expérimentateur.
• Ces deux paramètres, température et temps,
dépendent de la taille de la séquence à amplifier de
la taille et de la composition en
désoxyribonucléotides des amorces.
Applications de la PCR
• En médecine:
Pour le diagnostic des:
Maladies génétiques (myopathie, mucoviscidose, etc).
infections virales (SIDA, Hépatite C, SRAS),
bactériennes (tuberculose) ou parasitaires
(toxoplasmose).
des cancers.
En médecine légale:
pour identifier une personne par son empreinte
génétique dans le cadre d’une enquête judicaire.
pour un test de paternité.
Applications de la PCR
• En agroalimentaire:
pour identifier des variétés ou des espèces végétales et
animales.
pour sélectionner de nouvelles variétés de fruits et
légumes.
pour le contrôle de la qualité des produits
agroalimentaires (détecter la présence d’OGM dans un
aliment par exemple).
Applications de la PCR
• En histoire:
• pour des études phylogénétiques sur des squelettes
fossiles (ADN fossile).
• pour l’étude des migrations des populations humaines
et animales
• pour la détection d’infections virales, bactériennes et
parasitaires sur des momies égyptiennes