ACTIVITÉ 5

CHROMATOGRAPHIE EN PAPER: Séparation chromatographique des pigments végétaux

Valiente, K., Apostol, D., Palaya, J.

Jimenez, F., Banganan, K., Dolcho, K.
Département de biologie, École des sciences naturelles, Université Saint-Louis
October 9, 2019
RÉSUMÉ (5 points)
L'objectif de l'expérience était de corréler l'affinité des différents pigments végétaux avec le mobile et
phase stationnaire par séparation et identification en fonction de leur couleur et par le biais de calcul
et comparaison du débit des pigments de la plante. Les pigments variés sont devenus plus visibles lorsqu'il
s'est accrochée au papier de chromatographie. Le papier de chromatographie était le support utilisé pour absorber le
différents pigments dans la plante qui ont facilité la comparaison et l'élaboration. RÉSULTATS. Dans
conclusion

INTRODUCTION (10 points)

La chromatographie est une technique largement utilisée avec divers types qui sont utilisés pour analyser chacun.

composants d'une certaine substance. Il y a deux facteurs principaux selon lesquels le mélange d'échantillons a été réalisé, le

phase mobile et phase stationnaire. La phase mobile est un solvant qui transporte l'échantillon à travers le
la phase stationnaire tandis que cette dernière, d'autre part, est l'objet responsable de la séparation des composés
dans l'échantillon en profitant de la capacité d'une molécule à réagir avec une autre pour former un produit chimique
composé ou connu sous le nom d'affinité.

Dans cette expérience, les expérimentateurs ont utilisé la technique de chromatographie sur papier dans laquelle,

Le papier de chromatographie agissait comme la phase stationnaire et était suspendu dans un solvant approprié qui est le
phase mobile. Un mélange d'échantillons serait encré ou repéré dans la partie inférieure du papier, ce qui permettrait
la phase mobile pour s'écouler dans la phase stationnaire où les composés dans l'échantillon sont séparés en fonction de
leur affinité. Les composés ayant une plus grande affinité pour la phase mobile ont voyagé plus rapidement par rapport à
les composés qui avaient une plus grande affinité pour la phase stationnaire.

Cette étude est réalisée afin que les expérimentateurs, grâce à la séparation, puissent identifier les différents plants.

pigments en fonction de sa couleur, et illustrer la structure des différents pigments végétaux. L'objectif de la
Les expérimentateurs dans cette expérience cherchent à corréler l'affinité des pigments végétaux avec la phase mobile et la phase stationnaire.

phase, calculez et comparez la valeur du débit de différents pigments de plantes.

PROCÉDURE (10 points)

Les expérimentateurs ont couvert le bécher de 1000 mL avec un papier noir afin que la lumière ne pénètre pas.
Ils ont broyé les feuilles en utilisant un mortier et un pilon avec une petite quantité d'eau distillée qui était
ajouté pour extraire le liquide nécessaire. Ensuite, ils ont ajouté trois gouttes d'encre du jus de la plante et l'ont plongé.
au papier de chromatographie en utilisant un tube capillaire dans la partie inférieure du papier (1 cm à partir du)
en bas) où ils ont marqué avec des cercles et des lignes, chacun des trois colonnes. Placer la chromatographie
du papier dans le bécher de 1000 mL couvert et ajouté un solvant en vapeur et attendu pendant 2 minutes avant de plonger
la partie inférieure du papier de chromatographie au vaporisateur de solvant où elle était instantanément couverte par un

papier aluminium. Les expérimentateurs ont attendu une heure et quelques minutes (Heure de début : 13h57, Heure de fin :

15h06). Le papier de chromatographie a été retiré du bécher et mesuré. Les résultats ont été documentés.
et un rapport de laboratoire a été fait.

RÉSULTATS ET DISCUSSIONS (30 points)

Les pigments sont définis comme des substances dans les plantes capables d'absorber la lumière visible. Ceux-ci peuvent être classés
en trois groupes de base.

Les premiers sont les chlorophylles, qui sont des pigments verdâtres contenant un anneau de porphyrine. L'anneau contient
plusieurs doubles liaisons qui le rendent stable, et en même temps permettent une libre migration des électrons. Dans
de cette manière, lorsque la lumière du soleil frappe la surface de la plante, les électrons dans les molécules de pigment des chloroplastes
les thylakoïdes deviennent excités, ce qui à son tour transmet cette excitation aux photosystèmes qui commencent la série
d'événements cellulaires qui génèrent de l'oxygène et du sucre.

Quatre espèces de chlorophylle – a, b, c et d – sont connues. La chlorophylle a est la principale photosynthétique.

pigment dans toutes les plantes supérieures, algues et les cyanobactéries. La chlorophylle b se trouve pratiquement dans toutes les supérieures
les plantes et les algues vertes, se différenciant des premières seulement par le fait qu'un groupe formyle remplace le méthyle
groupe dans l'anneau II. La chlorophylle c se trouve entre-temps dans les diatomées, les dinoflagellés et les algues brunes et
manque la queue de phytol de chlorophylle a. Enfin, la chlorophylle d se trouve uniquement dans les algues rouges et a un (-O-
Le groupe CHO à la place du groupe (-CH=CH2) sur l'anneau I de la chlorophylle a.

La deuxième classe de pigments est celle des caroténoïdes. Ils sont généralement des pigments rouges, orange ou jaunes.
composed of two small six-carbon rings connected by a chain of carbon atoms. Their high carbon content
les empêche de se dissoudre dans l'eau et ainsi ils doivent être attachés à des membranes à l'intérieur de la cellule.
Ils ont plusieurs fonctions, y compris l'élargissement du spectre des couleurs capables de conduire.
la photosynthèse (surtout en saisons avec des jours raccourcis comme l'automne et l'hiver), et dans la photoprotection;
ils sont capables d'absorber et de dissiper une énergie lumineuse excessive qui pourrait autrement endommager la chlorophylle ou
interagir avec l'oxygène pour produire des molécules oxydatives réactives qui peuvent endommager la cellule.

La troisième classe de pigments est celle des phycobilines. Ce sont des pigments solubles dans l'eau que l'on trouve dans les chloroplastes.
stroma ou le cytoplasme cellulaire. Se produisant uniquement chez les Cyanobactéries et les Rhodophytes, ils sont efficaces dans
absorber des longueurs d'onde de lumière qui ne sont pas bien absorbées par la chlorophylle a. Ces pigments sont liés à
phycobiliprotéines qui transmettent l'énergie lumineuse absorbée aux chloroplastes pour la photosynthèse.

La connaissance des types de pigments présents dans une plante est utile dans le domaine de l'agriculture. Utiliser
cette information, des lumières qui favorisent la croissance optimale des plantes ayant certains pigments peuvent être
développés, augmentant leur rendement. De plus, les pigments extraits des plantes peuvent être utilisés comme teintures dans
recherche scientifique.

Une façon de déterminer les pigments présents dans un échantillon de plante est la chromatographie sur papier. Papier
la chromatographie sépare les pigments présents dans l'échantillon de plante en fonction de leur solubilité dans le solvant;
Les composés très solubles se déplacent avec le front du solvant en progression, tandis que les moins solubles
Les composés se déplacent lentement à travers le papier, bien derrière l'avant du solvant. La chlorophylle a est légèrement
soluble dans un mélange 3:1:1 d'éther de pétrole, d'acétone et d'eau (qui était le mélange résultant utilisé dans
l'étude), tandis que les caroténoïdes sont très solubles dans ce système. Cette différence de solubilité devrait permettre le
séparation de la chlorophylle a des caroténoïdes et de la chlorophylle b, qui est moins soluble que la chlorophylle
a.

Le chromatogramme suivant a été obtenu à partir de la chromatographie réalisée dans l'étude.

Le « front de solvant » est la position du solvant liquide sur la chromatographie.

le papier à tout moment donné. le solvant se déplacera progressivement du bas vers
le haut du papier, emportant avec lui des pigments dissous. Le chromatogramme était
arrêté avant que la front de solvant n'atteigne le haut du papier et marqué le
emplacement. Les chercheurs utiliseront cette distance pour calculer Rf

Chlorophylle B

Chlorophylle A

caroténoïde

origine (où l'extrait de pigment a été appliqué)

Chromatogramme obtenu à partir de la chromatographie sur papier des extraits de feuilles. Une seule expérience a été utilisée dans le
identification des pigments, avec la bande supérieure déterminée comme étant un caroténoïde, suivie de la chlorophylle
A et chlorophylle B.

La première bande de pigment a été identifiée comme un caroténoïde en raison de sa couleur jaune-orange, la deuxième bande
identifié comme chlorophylle A en raison de sa couleur verte plus foncée, et la troisième bande identifiée comme chlorophylle B
en raison de sa couleur jaune-vert. L'étude est considérée comme un succès à cet égard car les résultats obtenus
correspond à des résultats théoriques.

De plus, les pigments peuvent également être identifiés en fonction de la valeur de leur facteur de rétention; le rétention
Le facteur (Rf) est calculé comme la distance que le pigment parcourt (en centimètres) divisée par la distance le
le solvant se déplace (en centimètres). Les valeurs standards de Rf sont comparées aux valeurs calculées et le
la valeur standard la plus proche qui correspond à la valeur calculée est utilisée pour identifier le pigment. Cette étape
cependant, n'était plus fait dans l'étude.

La spectrophotométrie peut être utilisée pour mesurer le contenu en chlorophylle d'une feuille en mesurant le
les absorbances de l'extrait de plante dans les régions rouge et rouge lointain du spectre lumineux visible. L'absorbance de
l'extrait est directement proportionnel à son contenu en chlorophylle. L'expérience a mesuré les absorbances de
des feuilles anciennes et jeunes provenant de la même plante afin de comparer leur teneur en chlorophylle. Dans le
expérience, les pigments des plantes anciennes et jeunes ont été soumis à la spectrophotométrie pour identifier
quelle longueur d'onde donnerait la plus haute absorption identifiant ainsi les pigments présents, et aussi
comparez à quel niveau de maturité les plantes produiraient plus de chlorophylle. Cela est possible parce que
Les pigments végétaux participent à la photosynthèse en absorbant la lumière, et il existe une longueur d'onde optimale.
où ils peuvent absorber le plus de lumière et peuvent donc améliorer le processus de
photosynthèse.

Les pigments des plantes à graines peuvent être présents sous forme de chlorophylle a, b, et de caroténoïdes, tous avec des abondances variables.
Pour les échantillons de vieux et de feuilles, on peut constater que les absorbances mesurées ont atteint un maximum à deux longueurs d'onde.
(Figure 2). Le premier pic se situe autour de 450-470 nm tandis que le deuxième pic se situe autour de 663 nm. Ces données
implique que la plupart des pigments extraits doivent provenir de la chlorophylle a et b, puisque théoriquement, ces
les pigments atteignent leur maximum à 430-450 nm et 640-660 nm. Il convient également de rappeler que les pics dans une absorbance
vs. le spectre de longueur d'onde des pigments signifie que ces pigments absorbent et utilisent la lumière au mieux dans ces
longueurs d'onde. Dans la figure 3 ci-dessous, les autres pigments et les longueurs d'onde de pic correspondantes peuvent être vus.

En plus de connaître les pigments présents dans les feuilles, le graphique pourrait également montrer la quantité relative de
la chlorophylle présente dans les feuilles. Théoriquement, les feuilles plus âgées contiennent beaucoup plus de chlorophylle que les jeunes.
feuilles; cela va à l'encontre des résultats. Ces résultats ne peuvent avoir de sens que si la plante dont l'extrait
a été prise d'une carence en magnésium, en supposant qu'aucune erreur méthodologique n'a été commise. Plante
avec une carence en Mg ont tendance à séquester le Mg des vieilles feuilles en dégradant la chlorophylle puis en transportant
le Mg récupéré vers les jeunes feuilles qui ont des besoins photosynthétiques plus élevés.

D'autres méthodes de mesure du contenu en pigments des feuilles incluent l'utilisation de compteurs de contenu en chlorophylle,
qui ne nécessitent pas de préparation d'extrait, et la technique supérieure connue sous le nom de chlorophylle
fluorescence où le rapport de la fluorescence de la chlorophylle à certaines longueurs d'onde donne une ligne
estimation proportionnelle du contenu en chlorophylle.

Les expérimentateurs ont recouvert l'ensemble du corps d'un bécher de 1000 mL avec un papier noir parce que la lumière

pénétrerait facilement à travers l'appareil et aurait rendu l'expérience dénuée de sens parce que
la chlorophylle et le chromoplaste réagiraient facilement avec la lumière dans laquelle ils disparaîtraient facilement, ayant

une faible visibilité rendrait difficile la comparaison des pigments bruts et prendrait tout l'expérience
plus long.
 Le bécher a été rempli de 15 mL de solvant chromatographique et a été saturé avec le solvant
vapeur en le couvrant avec du papier aluminium pendant 2 minutes. Après cela, il est ensuite ouvert et le
Le papier de chromatographie avec le jus de la plante trempée est placé à l'intérieur avec une ficelle en haut et en bas.
la partie est plongée dans le solvant chromatographique où la partie du jus trempé est imbibée. Elle est à nouveau
couverte d'une feuille d'aluminium et placée dans le coin sombre entre les armoires où la lumière n'est pas
présent.

CONCLUSION (10 points)

La chromatographie sur papier a été utilisée pour séparer et identifier les pigments de couleur de l'Iresine.
Feuilles d'Herbstii. L'expérience montre que les pigments se sont déplacés vers le haut. Les couleurs ont été observées.

mesuré et enregistré. Les expérimentateurs ont commencé à 13h57 et ont terminé à 15h06. Il y a 3 couleurs
divisé sur du papier filtre. La couleur en haut était vert clair, qui est la chlorophylle, ayant une mesure de
(*) pour les deux côtés et (*) au milieu, le jaune-orange ou indiqué comme caroténoïde a une mesure de
(**) des deux côtés et au milieu qui voyagent le plus loin, la couleur rouge-violet a une mesure de (*) où
c'est en bas ce qu'on appelle les anthocyanes. Ces trois pigments jouent un grand rôle pour les plantes.
la polarité du pigment des feuilles de plantes a été observée, sur la façon dont elle interagit avec le papier filtre et ceux

pigment qui a été séparé par chromatographie. Le résultat global est qu'il est polaire car le résultat
était 10,5,10. Les pigments végétaux seront absorbés par le solvant chromatographique qui agit comme la phase mobile.
qui était coincé dans la phase stationnaire qui est le papier filtrant. Les trois d'entre eux vont interagir les uns avec les autres

autre, le pigment sera séparé en raison du solvant utilisé en fonction de la polarité. Polarité de la
Les composés dictent leurs affinités envers les phases stationnaire et mobile.

LITTÉRATURE CITÉE (5 points)

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