TECHNIQUES DE D’ÉTUDES DES BIOMOLÉCULES DES PROTÉINES
Programme du cours :
Protéines
Acides nucléiques
Parcours : S6 / Biologie Moléculaire et Physiologie (BMP)
Département de Biologie
FST - Université de Nouakchott
2024-2025
Techniques de purification des protéines
Il existe plusieurs étapes à suivre dans le but de purifier et caractériser une protéine :
1- Extraction:
Solubilisation
Centrifugation
Précipitation
Centrifugation
Dialyse
2- Séparation et purification (Chromatographie)
Filtration sur Gel (exclusion par taille)
Echange d’ions (cations ou anions)
affinité
HPLC 2
Techniques de purification des protéines
3-Caractérisation : analyse et détection :
Electrophorèse:
Milieu dénaturant Gel SDS
Milieu non dénaturant
Electrophorèse 2D
Iso électrophorèse
Transfert (élctroblotting)
Marquage froid et radioactif
Concentration
(Amicon, lyophilisation, …)
Quantification:
Dosage en UV
Méthodes colorimétriques (biuret, Bradford, …)
3
Techniques de purification des protéines
4- Etude structurale: (notions générales)
Centrifugation analytique
Cristallographie
RMN
Séquençage
Spectroscopie de Masse
5- logiciels d’étude: (notions générales)
Prédiction de séquence
Recherche
Recherche et comparaison de séquences
Prédiction de la conformation et des séquences
4
Rappels sur les fonctions structures et des protéines
Fonctions:
Contraction musculaire (actine, myosine)
Respiration (hémoglobine)
Immunité (anticorps)
Enzymologie (enzymes)
Définition:
Chaine d’acides aminés liés par des liaisons peptidiques (amide)
Extrémités N-terminale et C-terminale
Origine :
Transcription : ADN ARNm
Traduction : ARNm protéine
5
La liaison peptidique
Il y a 20 acides aminés dits standards.
Dans une protéine, la liaison peptidique est formée durant l'étape de
traduction.
C’est une liaison covalente de type amide entre un groupement α-aminé
d'un acide aminé et le groupement carboxylique d'un autre acide aminé.
Une molécule d'eau est éliminée.
6
Les grands types d'interactions régissant le repliement de
la chaîne polypeptidique
Liaison ionique Effet hydrophobe Ponts disulfure Liaisons hydrogène
7
Les structures Primaire et Secondaire
Structure primaire : ordre de succession des acides aminés dans la protéine
Structure secondaire : repliements locaux dans la chaine protéique
Liaison H: CO-NH
Hélice Alpha Feuillet β
Les hélices α : L'hélice α est caractérisée par une translation le long de l'axe central parallèle au grand
axe de l'hélice de 5,4 Å par tour d'hélice. Il y a environ 3,6 résidus par tour d'hélice
Les feuillets β : Les résidus acides aminés sont placés face à face dans 2 chaînes qui peuvent se
déployer, soit en sens contraire (chaînes antiparallèles), soit dans le même sens (chaînes parallèles)
8
Les structures Tertiaire et Quaternaire
Structure quaternaire : nombre de sous unités
Structure tertiaire :
conformation globale de la protéine
9
Procédure générale de la
Purification et étude des protéines
Extraction
Tissu
brut
Centrifugation
Dialyse
Etude structurale
Caractérisation Purification
10m
Techniques de purification des protéines
1- Extraction
Protéines musculaires Protéines recombinantes Protéines du sang
(Myosine, Actine) (bactéries) (hémoglobine)
1- Homogénéisation 1-Cultures bactériennes
1- Préparation des
Le tissu (muscle) est mis hématies
dans un tampon donné
puis broyé dans un
blender 2- Centrifugation de la 2-centrifugation
culture
2- Centrifugation 3- lavage du culot et
3 – Resuspension du culot
lyse des hématies
3 – Resuspension du bactérien et lyse des
culot cellulaire et lyse bactéries
des celllules
Les membranes des cellules sont cassées pour libérer le contenu
de la cellule contenant notre protéine.
11
Techniques de purification des protéines
1- Extraction
Méthodes de lyse cellulaire
1- Broyage :
Application : muscle
Processus : Le muscle est coupé en
petits morceaux puis repris dans un
tampon.
Le broyage se fait :
- Mixeur de cuisine (blender) : cassure
des membranes cellulaires par la lame
du mixeur et libération des protéines
musculaires.
- Billes de verre : cassure des membranes
cellulaires par la rotation des billes de
verre et libération du contenu cellulaire.
12
Techniques de purification des protéines
1- Extraction
Méthodes de lyse cellulaire
2- Choc osmotique :
Application : hémolyse
Processus : Les cellules sont
incubées dans un tampon de
concentration saline plus faible
(hypo osmotique).
L’entrée d’eau dans les cellules pour
rétablir l’équilibre de concentration
saline va éclater la paroi
membranaire.
Une petite agitation mécanique peut
aider le processus.
13
Techniques de purification des protéines
1- Extraction
Méthodes de lyse cellulaire
3- Sonication:
Application : générale
Processus :
La destruction des membranes cellulaires
par les ultrasons.
Les vibrations ultrasoniques causent une
augmentation locale de la pression et de la
température entrainant la cassure des
membranes cellulaires.
la sonication doit se faire très rapidement et
en mettant le tube dans un bac de glace
(refroidissement).
14
Techniques de purification des protéines
1- Extraction
Méthodes de lyse cellulaire
4- Détergents :
Application : réduite
Processus :
Alternative à la technique mécanique. les détergents détruisent la
barrière lipidique
Les détergents non ioniques (comme le Triton, CHAPS) entrainent moins
de dénaturation protéique et sont donc le premier choix quand il est
nécessaire de maintenir les fonctions et les interactions protéiques.
Les détergents ioniques (SDS) sont de bons solubilisateurs mais augment
les chances de dénaturations des protéines.
15
5- autres processus de lyse : cycles de congélation-decongélation
Techniques de purification des protéines
1- Extraction
Méthodes de lyse cellulaire
5- autres processus de lyse : cycles de congélation-decongélation
Précautions à prendre pendant ou après la lyse cellulaire :
- Utiliser si nécessaire des inhibiteurs de protéase juste après lyse
- Ajouter des DNAses pour réduire la viscosité dûe à l’ADN
- Faire la centrifugation rapidement
- Garder l’extrait au froid
16
Techniques de purification des protéines
Traitement du lysat cellulaire :
1- Filtration :
elle permet de séparer les constituants de la lyse cellulaire :
* la phase liquide formée des constituants de la cellule y compris les protéines et
qui traversera les spores du filtre : filtrat
* la phase solide formée des membranes cellulaires et qui est retenue par le filtre
filtration
Produit de
la lyse
cellulaire
17
Techniques d’analyse des Biomolécules
Traitement du lysat cellulaire :
2-Centrifugation
On observe que les particules des molécules ou toutes substances solide qui repose
dans une phase liquide, se trouvant sous l'action de la pesanteur et de la poussée
d'Archimède (et parfois agitation moléculaire), tendent à tomber vers le fond
(sédimentation) ou à remonter vers la surface, selon leur densité et leur taille.
Forces s’exerçant sur une particule en suspension dans
un liquide. La force de gravité et la poussée d’Archimède
sont faible comparées à l’agitation moléculaire
Poussé d’Archimèdes
Forces s’exerçant sur une particule en suspension dans un
Gravité liquide soumis à centrifugation. La force de gravité et la
poussée d’Archimède sont augmentées au contraire de
Agitation moléculaire
l’agitation moléculaire, et elle ne sont plus négligeables
On peut donc d’augmenter le pouvoir séparateur du champ de pesanteur vertical en
lui substituant un champ centrifuge radial: centrifugation 18
Techniques de purification des protéines
Traitement du lysat cellulaire :
2- CENTRIFUGATION
19
Techniques d’analyse des Biomolécules
La centrifugation
Appareillage e force de centrifuge
Une centrifugeuse est constituée de une chambre de
centrifugation dans laquelle sort l’axe de rotation, qui est relié
au moteur. Sur l’axe on fixe le rotor et dans les emplacements
du rotor on met les éprouvettes contenants l’échantillon à
centrifuger.
L’accélération centrifuge ou champ centrifuge, généré par le
mouvement circulaire uniforme, est dirigé radialement vers
l'extérieure et dépend de la vitesse angulaire (ω) et de distance
(r en m) de l’axe de rotation, selon l'équation:
f = ω2 r avec ω = 2πn
r rayon moyen du rotor (m)
n = nombre de rpm (rotation par minute) soit n
rpm/60 ( rotation par seconde)
ω = 2π rpm/60
on a donc : f = (2 π rpm/60 )2 r
20
Techniques d’analyse des Biomolécules
La centrifugation
Appareillage e force de centrifuge
Une centrifugeuse est constituée de une chambre de
centrifugation dans laquelle sort l’axe de rotation, qui est relié
au moteur. Sur l’axe on fixe le rotor et dans les emplacements
du rotor on met les éprouvettes contenants l’échantillon à
centrifuger.
L’accélération centrifuge ou champ centrifuge, généré par le
mouvement circulaire uniforme, est dirigé radialement vers
l'extérieure et dépend de la vitesse angulaire (ω) et de distance
(r en m) de l’axe de rotation, selon l'équation:
f = ω2 r avec ω = 2πn
r rayon moyen du rotor (m)
n = nombre de rpm (rotation par minute) soit n
rpm/60 ( rotation par seconde)
ω = 2π rpm/60
on a donc : f = (2 π rpm/60 )2 r
21
Techniques d’analyse des Biomolécules
La centrifugation
La force centrifuge relative
La force centrifuge (Fc) qui agit sur l’échantillon dépend de sa masse (m), de la vitesse
angulaire (ω) et de distance (r) de l’axe de rotation, selon l'équation:
Fc = m ω2 r
Etant donné que tout les corps sur terre sont soumis à la force de gravité on peut définir le
Champ Centrifuge Relative (RCF, relative centrifugal field) comme le rapport entre la force
centrifuge appliquée par la centrifugeuse sur la particule et la force de gravité (Fg = mg où g =
9.81m sec-2 ).
RCF = Fc/Fg = m ω2 r/mg = ω2 r/g
Le Champ Centrifuge Relatif est exprimé en nombre de g et il n’a pas de dimension (NB. le rad
n’a pas de dimension). Il nous indique le nombre de g nécessaire pour sédimenter ou séparer
une particule. Si l’on exprime la vitesse angulaire en tours par minute (rpm) et on substitue à g
sa valeur (9.81 m sec-2), on obtient:
RCF = (2π rpm/60)2 r/9.81 = 1.118 x 10-3 x rpm2 x r
Le Champ Centrifuge Relatif nous dit donc de combien de fois le champ d’accélération
centrifuge doit être multiplé de l’accélération gravitationnelle, il est donc une valeur absolue à
laquelle je soumet la particule pour la séparation. Par la formule nous mettons cette valeur en
relation avec la vitesse de la centrifugeuse (vitesse de rotation en rpm) et le rayon du rotor. 22
Techniques d’analyse des Biomolécules
La centrifugation
Le nomogramme de la centrifugation
Bien que il soit possible de calculer facilement la
valeur de RCF avec la formule:
RCF = 1.118 x 10-3 x rpm2 x r r en m
Il est possible d’utiliser un nomogramme pour
calculer la valeur de RCF en g en connaissant le
rayon de rotation d’un déterminé rotor et la
vitesse de rotation en rpm.
Ex. rayon de rotation 9 cm = 0.06 m; vitesse de
rotation
12000 rpm
Réponse :
RCF = 15000 g
23
Techniques de purification des protéines
1- Extraction
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Objectif : C’est la séparation des protéines du reste des autres constituants cellulaires.
Définition : Conversion des molécules/protéines d’un état soluble vers un état
insoluble puis séparation.
Processus :
Altération des conditions du solvant qui changent la solubilité des protéines par
rapport aux autres macromolécules de l’extrait.
Mécanisme :
- Les protéines se lient entre elles divers types de liaisons
- Le mode de liaison le plus commun : liaisons hydrophobes
- La solubilité des protéines va dépendre des facteurs qui vont interagir sur ces liaisons
(liaisons hydrophobes) et donc sur la solubilité des protéines
Agents de précipitation :
Sels : sulfate d’ammonium, NaCl…
Solvants organiques : éthanol, acétone
24
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Utilisation des Sels
SALTING IN ET SALTING OUT
• Le degré de solubilité d’une protéine dépend du nombre d'acide amines hydropihliques à
la surface de la protéine. Le principe de la précipitation des protéines par le sel est basé
sur la suppression/compétition des interactions entre ces acides aminés hydrophiliques
dans la protéine d’une part et les molécules d’eau d’autre part. Donc de façon générale :
• Les faibles concentrations en sels favorisent la dissolution (non précipitation) des
protéines. les molécules de sel stabilisent les molécules de protéines en diminuant
l’énergie électrostatique entre les molécules de protéines, ce qui augmente l’interaction
avec les molécules d’eau et donc a solubilité des protéines : SALTING IN
• * A forte concentration, les molécules de sel rivalisent avec les molécules de protéines
pour se lier à l’eau. Ce phénomène favorisera l’agrégation et la précipitation des protéines
: il y a contact entre les surfaces hydrophobes des protéines : précipitation des
protéines : SALTING OUT
25
H2O
Protéine
26
27
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 )
Avantage sur les autres sels :
* Réversible
* Non dénaturante : Sa solubilisation n'affecte pas la
température de la solution (au contraire du NaCl, dont la solubilisation est
exothermique.
* Grande solubilité (3.6 M)
Techniques de purification des protéines
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 )
Précautions: Addition lente et sous agitation ; Connaitre la
concentration requise pour chaque protéine ; Travailler à basse
température (4°C)
Les protéines généralement solubles à une concentration
similaire à celle du cytoplasme :
0.15 - 0.25 M (eucaryotes) 0.3 - 0.6 M (bactéries)
Les protéines insolubles à très faible concentrations :
précipitation par dessalage (dialyse ou gel filtration)
29
B - Précipitation des protéines par les sels:
Les protéines selon leur composition en acides aminés ont des propriétés de
solubilité différentes.
• Leur salting out (précipitation) dépendra donc de la concentration de sel : on
peut donc utiliser la concentration en sel pour faire un fractionnement
(séparation ) des proteines
•
Techniques de purification des protéines
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Solvants organiques : éthanol, acétone...
Mécanisme similaire à l’effet du (NH4)2SO4 :
• Ethanol : CH3-CH2-OH
• L’ajout d’éthanol à la solution réduit l’hydratation de la protéine, en éliminant l’eau et
les protéines environnantes, ce qui conduit à l’agrégation et à la précipitation.
• l’éthanol s’associe plus fortement avec les molécules d’eau que les protéines:
– Inconvenient : Grand volume d'EtOH à utiliser: au moins 4 fois celui de la
solution protéique aqueuse.
• Protocole général de précipitation de l'éthanol :
* Ajoutez 9 volumes d'éthanol à 1 volume de solution protéique aqueuse.
* Laisser refroidir à -80 °C pendant au moins 2 heures, puis centrifuger pendant 30
minutes à > 14 000 tr/min dans une centrifugeuse réfrigérée. 31
Techniques de purification des protéines
B - Précipitation des protéines du surnageant :
Solvants organiques : éthanol, acétone...
• Acétone : CH3-CO-CH3
• plus efficace que l’éthanol mais re-dissolution plus difficile
– Précautions :
Basse température (0 à -20°C)
Eviter la dénaturation
32
Techniques de purification des protéines
B - Précipitation des protéines du surnageant :
L’effet du pH
La variation du pH du tampon peut conduire à la précipitation des protéines :
pH inférieur à pHi : les protéines ont une charge nette globale positive
pH supérieur à pHi : les protéines ont une charge nette globale négative
pH=Phi la charge nette est = 0 : réductions d’interactions entre les protéines
donc réduction de solubilité : Précipittaion
Précautions :
Certaines protéines dénaturent à leur pHi
33
Effet du pH sur la précipitation des protéines34
35
Dialyse :
Parce que le sel ajouté pour le « salting out » inhibe l’activité des protéines,
il doit être enlevé avant de continuer la purification. Ceci est fait par
dialyse;
Heures
La solution de protéine est simplement introduite dans un sac fabriqué
d’une membrane semi-perméable:
– Perméable aux petites molécules (e.g. sels);
– Imperméable aux protéines;
36
Techniques de purification des protéines
Filtration:
Dans certains cas, on peut éliminer les sels par la technique de filtration.
La filtration est aussi fréquemment employée en biochimie pour un grand
nombre d'applications : stérilisation, isolement de précipité, élimination
de sels de solutions, concentration de macromolécules,
Membrane de type « en profondeur »
Membrane de type « écran »
37
RESUME DES ETAPES DE L’EXTRACTION DES PROTEINE
HOMOGÉNÉISATION
LYSE CELLULAIRE
CENTRIFUGATION
PRÉCIPITATION
PRÉCIPITATION
CENTRIFUGATION
DIALYSE
PURIFICATION DES PROTEINES
Apres extraction , précipitation et dialyse, on obtient en général, un
mélange de plusieurs protéines de caractéristiques biochimique
différentes. La purification de la protéine recherchée peut alors
commencer. Plusieurs techniques dites de chromatographie
(séparation) peuvent être utilisées.
* Chromatographie de taille :
La séparation se fait sur la base de différence de PM (nombre
d’acides amines) des protéines.
* Chromatographie de charge :
La séparation se fait sur la base de différence des charge 39 des
protéines.
Techniques de purification des protéines
Chromatographie de taille
Aussi appelée Chromatographie d’exclusion ou chromatographie par tamisage
moléculaire ou simplement gel-filtration. Pour réaliser une chromatographie
d’exclusion, on a besoin de :
* Gel de migration (phase stationnaire) * Colonne
Souvent polysaccharidique :
• Dextran (glucose/Séphadex) ou
Éluant (phase mobile )
• Agarose (galactose/Sépharose)
– Parfois, polyacrylamide (Séphacryl)
échantillon (protéines)
Gel de migration (phase stationnaire)
Éluat (protéines)
40
Mécanisme de séparation par gel filtration :
oLes billes du gel ont des pores de taille qui doit être voisine des macromolécules à séparer. Ainsi,
Les protéines plus
petites que les
pores vont entrer
dans les billes :
leur sortie/élution
sera retardée par
rapport aux
protéines qui ne
Les protéines plus grosses que les sont par entrées
pores n’entrent pas dans les billes,. dans le geL
Donc, ces protéines ont moins de
volume à traverser et vont sortir/éluer
en premier;
* CONCLUSION : LES PROTÉINES SONT SÉPARÉES SELON LEUR POIDS MOLÉCULAIRE : LES PROTEINES DE PM
41
PLUS GRAND SORTIRONT AVANT LE PROTÉINES DE PM PLUS FAIBLE :
Techniques de purification des protéines
Chromatographie
Chromatographie d’exclusion de taille (gel-filtration)
LES PROTÉINES SONT SÉPARÉES SELON LEUR POIDS MOLÉCULAIRE : LES PROTEINES DE PM
PLUS GRAND SORTIRONT AVANT LE PROTÉINES DE PM PLUS FAIBLE :
42
Le choix du type de gel de purification est important car il tient compte de la
taille (Mr) des protéines à fractionner
43
Paramètres d’une chromatographie d’exclusion Vo : volume
d’exclusion du gel :
volume d’élution
d’une molécule non
Vt : volume total du gel.
Ve est le volume nécessaire de phase mobile pour éluer un retardée par le gel. Le
Volume d’élution d’une molécule
composé de la colonne après son dépôt sur le gel. Mr de cette molécule
retardée par le gel et qui diffuse
la masse
complètement dans le gel. Le Mr V0< Ve < Vt
moléculaire est
de cette molécule est inferieur à la Si la molécule peut entrer dans les pores du gel,
sa répartition entre la phase interne et la phase externe est supérieure à la
limite d'exclusion du gel. En
donnée par le coefficient de partage entre la phase liquide et la limite d'exclusion du
pratique, Vt représente le volume
phase gel noté Kav : gel. En pratique, V0
des billes du gel + le volume entre
Kav= (Ve - V0 ) / (Vt – V0 ) log MM = f (Kav) représente le volume
les billes du gel.
Avec 0 ≤ Kav ≤ 1 entre les billes.
44
45
La courbe suivante représente log (PM) en fonction du Ve .
.
Protéine X (89 ml)
En utilisant la partie linéaire de la courbe, on peut déterminer la masse moléculaire de la protéine X
à partir de son Ve.
46
Techniques de purification des protéines
Chromatographie
Chromatographie d’échange d’ions (C.E.I.)
• A un pH donné, chaque protéine a sa propre charge globale en fonction
de sa structure primaire et donc de son pHi:
– La protéine est chargée (-) dans un tampon de pH supérieur à son pHi.
– La protéine est chargée (+) dans un tampon de pH inférieur à son pHi.
Deux types de chromatographies d’échange d’ions :
- Chromatographie d’échange de cations C.E. C :
La charge immobilisée est (-) : et les ions (ici des protéines) sont (+)
- Chromatographie d’échange d’anion C.E.A :
La charge immobilisée est (+) : et les ions (ici des protéines) sont (-) 47
Techniques de purification des protéines
Chromatographie d’échange d’ions
• Les échangeurs d'ions sont des groupements chargés liés de façon covalente à une matrice-
support (résine) qui est aussi phase stationnaire.
– L'échangeur d'anions le plus utilisé est le (DEAE)-cellulose
– L'échangeur de cations le plus utilisé est le (CM)-cellulose
cellulose
• Le principe de la C.E.I. : repose sur l’interaction entre les charges des protéines de l’échantillon
et la charge immobilisée sur la résine :
• Plus les composés interagissent avec l'échangeur d'ions, plus ils sont retenus par la colonne.
Les composés qui n'interagissent pas avec l'échangeur d'ions ne sont pas retenus.
48
Techniques de purification des protéines
Chromatographie d’échangeuse d’anions (CEA)
Les protéines chargées selon leur pHi
1 2 3
Procédure :
Fixation :
• Le mélange de protéines après 4
dialyse est mis dans un pH
supérieur au pHi de la
protéine recherchée (exemple
pHi=7.8). La résine chargée
(+) est neutralisée par les ions
(-) de sels (1).
• Après addition du mélange
protéique (2), les protéines de
pHi inferieur au pH utilisé (ici
pH 9, par exemple) seront
chargées négativement (y
compris la protéine
recherchée). Elles vont se fixer
sur la colonne chargée
positivement: elles
remplacent les ion (-)
Rétention (3).
• Les protéines (A) chargées positivement Élution
(de pHi supérieur au pH de lavage) qui • La protéine chargées fixées est alors
n'interagissent pas avec l'échangeur d'ions éluée (purifiée) en lavant la colonne
ne sont pas retenues : elles vont sortir de la avec un tampon de pH inferieur 49au
colonne (4). pHi de la protéine fixée (B).
Techniques de purification des protéines
Chromatographie d’échangeuse de cations (CEA)
– L'échangeur de cations le plus utilisé est le (CM)-cellulose
- Le principe de la procédure st l’opposé de la Chromatographie
d’échangeuse d’anions (voir TD).
50
Techniques de purification des protéines
(1). Chromatographie d’affinité (ou d’adsorption)
Cette méthode repose sur la spécificité et la réversibilité de l’interaction entre la
macromolécule recherchée (ici la protéine à purifier) et son ligand spécifique (un
récepteur, un anticorps, un substrat….)
•Principe :
•le ligand spécifique est immobilisé sur le
support de la colonne constituant la phase (1).
stationnaire (1).
2-Fixation : le mélange protéique (y compris la (2).
protéine recherchée) protéines est ajouté au
support –ligand :seule la protéine
structuralement convenable se fixera sur le
ligand. Les autres protéines (impuretés) ne sont
pas fixées (2). (3).
3- Elution : la colonne est alors lavée par avec un
tampon qui dissocie l’interaction ligand -
protéine fixée. Souvent le tampon 0.1M Glycine
51
pH 2.5 – 3.0 (3)
Le solvant est la phase liquide mobile qui La pompe
entraine les molécules à travers la pousse le
solvant travers La colonne contient le
colonne gel de séparation
la colonne
Le détecteur est un
spectrophotomètre qui
lit la DO des molécules
à la sortie de la colonne
Le système de
chromatographie
Collecteur des fractions
52
Enregistreur qui affiche les pics de DO sur écran pour impression protéiques
Techniques de purification des protéines
Chromatographie
Appareillage HPLC
Chromatographie en phase Liquide à Haute Performance
53
Techniques de caractérisation des protéines
Électrophorèse
Principe : une molécule chargée placée dans un champs électrique migre vers
le pole (+) ou (-) selon sa charge.
Le déplacement de l'ion dans un champ électrique sera soumis à deux forces :
➢ La force électrique, Félectrique, qui s'exerce sur un ion porteur d'une charge
q dans un champ électrique de potentiel E est : Félectrique = qE
➢ La force de friction s'oppose au déplacement électrophorétique:
Ffriction = vf
• v est la vitesse de déplacement de l'ion et f est son coefficient de
friction.
• f: dépend de la taille, de la forme et de l'état de solvatation de l'ion
ainsi que de la viscosité de la solution.
Utilisation: Séparation des macromolécules : Protéines et Acides nucléiques54
Techniques de caractérisation des protéines
Application de l’électrophorèse
Les protéines sont des molécules amphotères/chargées
L’électrophorèse peut donc être utilisée pour :
- Déterminer le degré de pureté d’une protéine : présence ou non d’autres
protéines non désirées après la purification.
- Déterminer la taille dune protéine et le nombre de sous unités dans cette protéine
(structure quartenaire).
- Séparer et identifier des protéines par western blott (dire plus loin)
55
Techniques de caractérisation des protéines
Types d’électrophorèse
1- Électrophorèse sur papier
• papier filtre ou acétate de cellulose
• champ électrique: env. 20 V/cm
• cathode (-): attire les cations (+)
• anode (+): attire les anions (-)
• Dans l'électrophorèse sur papier: Les
molécules sont séparés en fonction de
leurs masses molaires et leurs charges
56
Techniques de caractérisation des protéines
Types d’éléctrophorèse
➢ Le papier est remplacé par un gel avec pores de dimensions variables.
• Polyacrylamide est le gel le plus utilisé pour les protéines
• Agarose: essentiellement pour les protéines de très grand PM et les Acides
Nucléiques
➢ La séparation des molécules repose sur le fait que sous l’effet du courant
électrique, la migration des petites protéines à travers le gel est plus rapide que
celle des protéines de grand PM.
57
Techniques de caractérisation des protéines
Types d’éléctrophorèse des protéines
Eléctrophorèse en milieu SDS ou SDS-PAGE : Sodium Dodecyl-Sulfate polyacrylamide
gel électrophorèse (SDS-PAGE)
o Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est un composé capable de se fixer sur
la périphérie des chaines de protéines en leur conférant une charge
négative. la charge réelle des protéines n’est donc plus mise en jeu et
toutes les protéines auront une charge négative. Elles vont migrer
toutes vers l’anode (+) et seule leur PM influencera cette migration.
o Comme toutes le protéines auront une charge négative différente de
leur charge réelle, le SDS-PAGE est aussi appelé électrophorèse en
milieu dénaturant.
o Le SDS-PAGE est la technique d’éléctrophorèse la plus utilisée pour les
protéines.
58
Techniques de caractérisation des protéines
Application du SDS-PAGE
1- Confirmer la pureté d’une protéine après purification.
Suivi de l’état de pureté lors des étapes d’extraction et de purification de la protéine His-hGH
59
Application du SDS-PAGE
2- Estimer le PM d’une protéine inconnue : on utilise le principe que la migration d’une protéine dans
un gel SDS-PAGE est promotionnelle au PM. la courbe utilisée est souvent d = f(log PM). d est la mobilité
[Link] utilise des protéines de PMs connus (marqueurs de taille). Les bandes de protéines sont en bleu car après
électrophorèse, le gel est coloré avec du bleu de Coommassie (G250) puis décoloré avec avec de l’eau chaude ou un
mélangé de solvants organiques (eau/méthanol/acide acétique)
60
Techniques de caractérisation des protéines
Application de l’électrophorèse
3- Préciser le nombre de sous unités d’une protéine (structure quartenaire).
* β -mercaptoenathnol ou dithiothréitol (DTT)
Le bêta-mercaptoéthanol et le DTT sont de puissants agents réducteurs qui clivent et réduisent
efficacement les liaisons disulfures . Ils perturbent les structures protéiques tertiaires et sont
souvent utilisé pour déplier les protéines natives (A). Ils sont aussi utilisées pour déterminer
le nombre de sous unités formant une protéines (B).
(A). (B).
β -mercaptoenathnol
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Dithiothréitol (DTT)