Les enzymes de restriction-
modification (R-M)
Dr S. LAHCENE
Maitre de conférence
Département B-M
UMMTO
Introduction
• Système R-M se définit par un double système
enzymatique:
• 1: Une endonucléase= enzyme de restriction
ou endonucléase de restriction
• 2: Une méthylase ou méthyl-transférase
• Ces deux enzymes définissent le système de
défense chez les bactéries
Définition
• Une enzyme de réstriction est exclusivement
synthétisée par les bactéries;
• Capable de cliver (couper) ADN étranger qui
l’envahie;
• La coupure se fait au niveau d’une séquence
précise de l’ADN étranger appelée site de
restriction ou site de coupure ou palindrome
• La méthyle transférase est synthétisée par la
bactérie;
• Elle reconnait le même site de restriction que
l’endonucléase;
• Son action consiste à ajouter un résidu méthyl
(-CH 3) à au moins une base azotée du site de
coupure (Base A ou C).
Pourquoi?????
Les enzymes de restriction
• La souche Escherichia coli B synthétise une
endonucléase EcoRI qui reconnait de manière
spécifique la séquence :
5’GAATTC3’
3’CTTAAG5’
• Les enzymes de restriction sont de véritables
ciseaux biologiques (moléculaire);
• Qui permettent de pratiquer sur des
séquences génomiques des manipulation de
type COUPER-COLLER;
• Ce sont des outils remarquables dans le
domaine de l’ADN recombinant
• Tous les ADN quelque soit leur origines
possèdent des sites de coupures ou des sites
de restriction ou des palindromes répartie de
manières aléatoire le long de la molécule;
• Les endonucléases coupent de définies et
reproductibles l’ADN quelque soit son origine;
• La coupure consiste en une hydrolyse des
liaisons phoshodiester.
Palindromes
Un palindrome est une séquence génomique
au niveau de laquelle les deux brins possèdent
la même séquence mais suivant une
orientation antiparallèle:
5’GAATTC3’
3’CTTAAG5’
Ou RADAR
• Palindromes : 4 à 6 pdb
Convention d’écriture des enzymes
de restriction
• Exemple: EcoRI:
• E: Escherichia
• co: coli
• R Souche RY 13
• I: 1ère endonucléase isolée
Suite diapo 10
• Hind II a été isolée à partir de Haemophilus
influenzae, sérotype d, 2ème enzyme isolée ;
•
• Hind III a été isolée à partir de Haemophilus
influenzae, sérotype d, 3ème enzyme isolée
• Les lettres doivent être écrites en italique.
Type de coupure
Coupure à bouts francs réalisée par Hae III
Extrémités franches
Suite Diapo 12
Les fragments à extrémités cohésives débordant du
.
coté du coté 5’P : Dans ce cas les extrémités 5’P sont
débordantes ou sortantes, c’est le type de coupure
réalisé par EcoRI
Extrémités collantes ou cohésives
Suite diapo 13
Les fragments à extrémités débordantes du coté 3’OH :
C’est le type de coupure obtenu par l’enzyme Pst I.
Extrémités collantes ou cohésives
Exepmlesde sites de restriction
CARTE ET FRAGMENTES DE RESTRICTION
(RFLP)
• L’hydrolyse d’un ADN par une endonucléase de
restriction conduit à une série de fragments dits de
restriction dont le nombre est fonction du nombre de
sites de restriction présent sur cet ADN. La longueur des
fragments est déterminée par la distance séparant les
séquences de restriction reconnues par cette
endonucléase.
• On obtient pour un ADN donné, toujours le même
nombre de fragments qui donne ce qu’on appelle RFLP
(pour longueur des fragments de restriction
polymorphiques ou Restriction Fragments Lengh
Polymorphism). Une molécule d’ADN déterminée, donne
toujours les mêmes fragments et cette série de fragments
constitue une empreinte caractéristique de l’ADN
hydrolysé. On parle alors de carte d’identité de la
molécule.
Suite diapo 17
• Une carte de restriction indique le nombre de sites
de restriction présents, leur ordre et les distances qui
les séparent sur le fragment d’ADN dont elle est issue.
Rappelons que les unités des cartes de restriction sont
exprimées en paires de bases (pdb), ou pour de plus
grands fragments en paires de kilobases (kb).
• Les cartes de restriction fournissent des informations
sur la longueur d’un insert cloné et sur la position des
sites de coupure des enzymes de restriction.